NO860710L

NO860710L - Merking av oligonukleotider.

Info

Publication number: NO860710L
Application number: NO860710A
Authority: NO
Inventors: Nanibhushan Dattagupta; William Knowles
Original assignee: Molecular Diagnostics Inc
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1986-02-26
Publication date: 1986-09-16
Also published as: AU5443186A; FI861039A0; DK119086A; EP0194545A3; AU592777B2; ES8705920A1; CA1278755C; IL78123A; DK119086D0; EP0194545B1; IL78123A0; FI861039A; EP0194545A2; ES553034A0; NZ215453A; DE3667292D1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av et oligonukleotid. Foreliggende oppfinnelse ved-rører også fremgangsmåter for fremstilling av oligonukleotid-prober.

Det er vist av Studencki og Wallace (DNA, 3, 7 (1984)) at et oligonukleotid kan merkes med radioaktivt<32>P ved å anvende et enzym og en kombinasjon av primer og template. Fremgangsmåten er effektiv og kan gi sterkt merkede prøver. Fremgangsmåten har en alvorlig ulempe idet templatet og produktet har identisk elektroforetisk mobilitet med mindre en av dem er fosforylert ved 5'-enden, eller templatet eller primeren er tritylert ved en ende. Dette krever av en av kjedene må være merket med<32>P ved å anvende terminalt merkeenzym, eller tritylert og 100% av disse molekylene bør bære modifikasjonen.

Modifikasjonen ved fosforylering er ikke effektiv nok til å gi 100% 5'-enden fosforylerte nukleinsyrer. Videre kan - avhengig av frekvensen - mobilitetsforskjellen mellom fosforylert template-utvidet primer og den andre kjeden ikke være tilstrekkelig til å separere dem. 5<1->endetritylerte rester har den ulempen at de er ustabile i vandige-oppløsninger. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for separering av primer-utvidede oligonukleotid-prober fra templatene ved modifikasjon av ett av de deltage,nde oligonukleotidene. Modifikasjonen er slik at den er stabil, hydrofob/hydrofil og endrer den elektroforetiske mobiliteten og utvaskingsegenskapen på en reversert fase-kolonne og kan om ønsket benyttes på nytt. Det er ønskelig at templatet modifiseres slik at det bærer separer-barhetsegenskapen. De syntetiserte merkede molekylene bør for-bli umodifiserte bortsett fra modifikasjonene innført ved en enzymreaksjon som benyttes i syntesen.

Dersom templatet f.eks. er modifisert ved 3'-enden med hexylamino ATP, vil mobiliteten av templatet under gelelektroforese være langsommere enn for det syntetiserte merkede produktet. Tilsvarende modifikasjoner vil også gi opphav til separerbar-het under kromatografi og høyt trykk i et reversert fase-system.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et oligonukleotid som innbefatter hybridisering av

a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med

b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært med det ønskede oligonukleotidet, hvor en av a) og b)

bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosidtrifosfater, hvorved det kortere fragmentet vokser i en retning inntil det er i.det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragmentet, denaturering av det hybridiserte materialet og separering av forlenget a) fra b).• Slik separering av det merkede materialet kan utføres ved høyytelse-væskekromatografi (HPLC) eller ved gelelektroforese.

I den ovenfor omtalte fremgangsmåten kan den organiske resten være et reaktivt sete og separasjonen kan bevirkes ved kontakt med et medium som reagerer med det reaktive sete.

I den ovenfor omtalte fremgangsmåten kan nukleosid-trifosfåtene innbefatte et merke. Merket kan være et radioaktivt element, f.eks. radioaktivt fosfor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et hybridisert materiale som innbefatter b) et nukleinsyrefragment og a) et kortere oligonukleotid som er hybridisert dertil, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest (f.eks. en hydroksyfenylrest eller en polyacrylsyrerest) som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b). Den organiske resten kan være et reaktivt sete.

I det ovenfor omtalte materiale kan a) og b) være koterminale ved en ende.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av en oligonukleotid-probe som innbefatter hybridisering av to korte fragmenter av nukleinsyre som er komplementære med hverandre over bare en del av deres lengder ved motstående ender, det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosidtrifosfater, nukleosidtrifosfat-sammensetningen er slik at den tillater vekst av bare det ene av fragmentene, hvorav ett av fragmentene gror selektivt i en retning inntil det er koterminalt med det andre fragmentet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et hybridisert materiale som innbefatter to korte fragmenter av nukleinsyre og en av de følgende strukturene:

hvori X:Y er T:A for sigdcelle-proben og A:T for den tilsvarende normale glibingen-proben

b) hemoglobin C

hvori X:Y er A:T for Hb C-proben og G:C for den

tilsvarende normale globingen-proben,

c) beta 0 (B 39) thalassemia)

hvori X er A for beta^-proben og G for den tilsvarende normale globingen-proben,

d) (i) beta+ thalassemias

hvori X, Y og Z er G, G og T for den normale

glibingen-proben, A, G og T for IVS-1 thalassemia-proben, G, C og T for IVS-5 thalassemia-

proben, og G, G og C for IVS-6 thalassemia-proben; N er det aktuelle komplementære nukleotid,

d) (i) beta<+>thalassemias

hvori X:Y er A:T for IVS-110 thalassemia-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben, e) homozygotisk alfa-thalassemia N.J. Proundfoot og T Maniatis, "The Structure of A Human Beta-Globin Pseudogene And Its Relationship To Alpha-Globin Gene Duplication", Cell,21, 537-544 (1980), f) alfa^protease-inhibitor (antitrypsin) -mangel

hvori X:Y er A:T for mangel (Z)-proben og

G:C for den tilsvarende normale globingen-(M)-proben.

I strukturene ovenfor står de forskjellige symbolene for føl-gende nukleotidrester:

A = adenin nukleotid-rest

C = cytosin nukleotid-rest

G = guanosin nukleotid-rest

T - thymidin nukleotid-rest

U = uracil nukleotid-rest

Oppfinnelsen kan ytterligere beskrives som følger:

Fremgangsmåte 1

I stedet for å modifisere templatet, kan - dersom et modifisert nukleosidtrifosfat anvendes - merket kjede også separeres.

For å opprettholde påliteligheten av prosessen, er det ønskelig at modifikasjonen av templatet utføres ved 3'- eller 5'-enden. Dersom en primer er modifisert, er 5'-enden det ønskede sete for endringen. Modifikasjonen utføres via ved å anvende kjente reaksjoner og modifiserte nukleinsyre-rester ved det spesifikke setet. Modifikatoren kan være ionisk, ikke-ionisk, hydrofob eller hydrofil. Modifikasjonen kan fore-gå før eller etter merkereaksjonene. Dersom modifikasjonen ut-føres etter - bør merkereagensen være reaktiv nok til effektivt å modifisere alle de ønskede restene.

F.eks. kan oligonukleosid med en aminrest (som i 8-hexylamino A eller 5-allylamino U inneholdende oligonukleotid) omsettes med: eller lignende reagenser slik at det dannes:

Noen få andre typiske reaksjoner er beskrevet nedenfor.

En hvilken som helst type merke kan innføres ved å anvende tilsvarende nukleosidsubstrater, f.eks. kan med biotinylert UTP,et biotinmerke og<32>P merket NTP innføres.

En spesiell type forlengelsesreaksjon kan benyttes for å merke eller syntetisere en spesifikk nukleinsyresekvens. I fremgangsmåte 1 inneholder templatet den fullstendige sekvensen av nukleinsyren som skal kopieres (beskrevet i diagrammet ovenfor for fremgangsmåte 1) på templatet. Et templatprimer-par kan velges slik at en kan utvides slik at den fullfører en ønsket sekvens uten å utvide det andre paret. F.eks. vil følgende fire par produsere nonadecannukleotid uten anvendelse av en av den samme lengden som templatet:

Bare den øvre kjeden vil bli utvidet dersom deoksyadenosin- trifosfat (dATP) og deoksyguanosin-trifosfat (dGTP) benyttes som nukleosid-trifosfat (NTP)-substrater for DNA-polymerase eller reversert transcriptase-reaksjon. Dette vil produsere 19A<1>/S'-sekvenser og uutvidet lavere kjede.

Tilsvarende komplementære kjeder kan syntetiseres eller merkes ved å anvende pyrimidin nukleosid-trifosfater i stedet for dATP og dGTP for å fremstille komplementære sekvenser. Parene som benyttes er:

Et annet nyttig sett av oligonukleotid-prober som kan merkes ved å forlenge bare en del av et par av delvis komplementære oligonukleotider er et som vil diskriminere det normale alf a-^-antitrypsin-gen fra det muterte gen som er ansvarlig for den vanlige formen for antitrypsinmangel. En mangel på denne proteaseinhibitor resulterer i emfysem og beslektede tilstander. Det normale allelet av genet er M, og viktigste mangel allelet er Z; nukleotidsekvensen for genet rundt posi-sjonen av Z-punktmutasjonen (Kidd, V.J., Wallace R.B., Itakura, K og Woo, S.C.C., "a-Antitrypsin Deficiency Detention By Direct Analysis Of The Mutation In the Gene", Natur, 309, 230-234 (1983)) er slik at den asymmetriske primerutvidelsesmerkingen anvendes som følger:

Begge disse kan merkes asymmetrisk ved å tilveiebringe en revers transcriptase- eller Klenow-polymerasereaksjon med bare purin-deoksyribonukleosid-trifosfat-forløpere. Templatet forblir et tetrakaidekanukleotid, mens primeren kan utvides fra en lengde på 17 til enten 20 ved innføring av bare dATP, eller 23 ved innføring av både dATP og dGTP i reaksjonsblan-dingene.

Merking ved å anvende disse typene av par er begrenset til sekvenser som kan identifiseres som inneholdende den påkrevede nærhet av en mutasjon og en sammenklumpning av nukleotider som kan virke som et templat i en kjede, men ikke i den andre. Disse er ikke vanlige. I situasjoner hvor konfigurasjonen av nukleotider i en gensekvens ikke tillater et valg av primer og templat for denne merkingsutførelsen, er det mulig å syntetisere et templat som er blokkert ved 3'-enden, slik at det ikke kan utvides uavhengig av dets sekvens. Slik blokkering kan oppnås ved å inkorporere et 2', 3<1->dideoksyribonukleotid som det ytterste 3'-nukleotidet under kjemisk syntese av templat-oligonukleotidet.

Et hovedtrekk ved det asymmetriske primer-utvidelsesmerke-systemet beskrevet i foreliggende søknad, er at forskjellen i lengde mellom merkede og umerkede oligonukleotider i stor grad letter separasjonen og rensingen av førstnevnte fra sistnevnte og fra uinkorporerte forløpere ved elektroforese eller kromatografi. Uventet har det også vist seg at ingen frak-sjonering av merkingsreaksjonsblandingen er nødvendig for prepareringen av en hybridiseringsanalyse.

Merket oligonukleotid renses normalt bort fra umerket oligonukleotid, fordi sistnevnte ville være innbefattet i hybridisering og ville redusere styrken av det resulterende signalet fra merket probe som bindes til prøve DNA. Imidlertid er

forskjellen i lengde mellom det umerkede templatet og den merkede utvidede primeren tilstrekkelig til at under betingelser som kan anvendes for hybridisering av merket probe, er templatet for kort til å danne stabile hybrider slik at det ikke

påvirker bindingen av proben til prøve DNA. Dette trekket ved oppfinnelsen er beskrevet detaljert i Eksempel 8 nedenfor,

Andre genetiske sykdommer for hvilke det finnes tilstrekkelig DNA-sekvensinformasjon til å utvikle syntetiske oligonukleotid-prober, er familien av hemoglobinopatier. Primer-utvidelses-merking av alfa- og beta-thalassemia prober kan oppnås ved å anvende oligonukleotidpar som i de følgende eksemplene, uten dideoksyribonukleotid-blokkering av 3'-enden av templatet:

1. homozygotisk a-thalassemia

2. P+ (IVS-1)-thalassemia 3. (3 (3-39)- thalassemia

Ved å anvende nukleosid-trifosfater (NTP) som skal tilsettes den ønskede kjeden, er det mulig å separere utgangsmaterialene (ureagert) ved gelelektroforese eller ved kolonnekromatografi. En hvilken som helst type merkede oligonukleotider kan fremstilles ved riktig valg av de merkede NTP1 er. For eksempel kan med et 19A'-par, dersom en biotinylert dUTP og dCTP benyttes som substrater, et biotinylert oligonukleotid som er spesifikt for det normale globingenet syntetiseres; med et fluorescein merket NTP kan et fluorescent oligonukleotid fremstilles.

Oppfinnelsen skal nedenfor beskrives med referanse til de følgende ikke-begrensende eksemplene:

Eksempel 1

Syntese av et modifisert oligonukleotidtemplat og modifikasjon med en hydrofob rest.

Reaksjonsskjerna for syntese av 1 som adderes til 19A' ved 5<1->enden.

5-klormercuri-2<1->deoksyuridin (forbindelse 5), fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Bergstrøm og Ruth (D.E. Berstrøm og J.L. Ruth, J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides 4(5), 257 (1977)) ble behandlet med 3-trifluoracetamido-l-propen (forbindelse 7) (. Pailer og W.J. Hubsch, "Monatshefte flir Chemie" 97 (6), 99 (1966)) og K2PdCl4i metanol slik at man fikk 5-trifluoracetamidoallyl-2<1->deoksyuridin (forbindelse 8) i 22% utbytte etter 2 kromatografiprosedyrer og en krystalli-sasjon fra metanol. Omsetning av forbindelse 8 med 4,4-di-metoksytritylklorid i pyridin ga forbindelse 3 i 85% utbytte etter flammekromatografi (W.C. Still, M. Kahn og A. Mitra,

"J.Org.Chem" 43, 2923 (1978)), som deretter ble behandlet med N,N-diisopropylaminometoksy-klorofosfin (L.J. McBride og M.H. Caruthers, "Tet. Letters" 24 (3), 245 (1983)) (forbindelse 10) slik at man fikk forbindelse 1 som et hvitt,fast stoff etter utfelling fra pentan.

Et 19-enhets oligonukleotid (I) ble fremstilt ved å benytte

en DNA:

syntetiserer; tre separate 1 pmol porsjoner av hvert oligo-nikleotid ble fremstilt og hvert ble knyttet til en fast bærer og beskyttet fullstendig. Dimetoksytrityl-beskyttelses-gruppen ble fjernet fra 5<1->terminalen og forbindelse 1 ble knyttet til 19-enhetskjeden uten DNA-syntetisereren, men ved å anvende de samme reagensene og betingelsene som maskinen typisk anvender. Resultatet av denne prosessen er en oligonukleotid med en 5<1->aminoallyl-5'-(4,4'-dimetoksytrityl)-2'-deoksyuridin-enhet

Når porsjoner av hvert av de modifiserte oligonukleotidene ble behandlet med 3% trikloreddiksyre i metylenklorid, ble den distinkte rød-orange farven for frigjort dimetoksytritylkation observert, hvilket indikerer at 5-allylamino-2<1->deoksyuridin-enheten var tilknyttet. Polynukleotidet ble til sist de-tri-tytilert med kort eksponering mot 3% trikloreddiksyre, deretter renset ved polyacrylamidgel-elektroforese. Dette demon-strerer anvendeligheten av forbindelse 1 som et synton for innføring av en 5-aminoallyl-2<1->deoksyuridin-enhet ved C-5<1->terminalen av et oligonukleotid; inkorporering av denne en-heten på et hvilket som helst punkt i oligonukleotidet bør være mulig ved å benytte den samme metodologien.

Prosessen for tilknytning av en analog av en Bolton og Hunter (A.E. Bolton og W.M. Hunter, "Biochem.J." 133, 529 (1973)) reagens er beskrevet i reaksjonsskjema 2. Omsetning av den amino-funksjonaliserte polynukleotidforbindelsen 11 med N-hydrok.sysuccinimidesteren av 3-(4'-hydroksyfenyl)propion-syre (forbindelse 12) vil gi probe polynukleotidforbindelsen 13.

Polynukleotidet H(319A' er 19-enhets polynukleotider svarende til en del av humant DNA som koder for polypeptidhemoglobin, nærmere bestemt det området av DNA, hvori mutasjonen som manifesterer seg i dannelsen av sigd-celle-hemoglobin og den genetiske tilstanden som er kjent som sigdcelle-anemi ligger.

Skjema_2_

Infrarøde (IR) spektra ble oppnådd med et "Perkin-Elmer Model 710 B" eller "237" infrarødt spektrofotometer som oppløs-ninger i CHCl^medmindre annet er angitt; 1602 cm "'"-båndet av polystyrenfilm ble benyttet som en ytre kalibreringsstan-dard. Signaler er angitt som cm

Protonmagnetiske resonans ("'"H NMR)-spektra ble oppnådd ved 89,55 MHz ved å benytte et "Varian T-60"-spektrometer; spektrene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning medmindre annet er angitt. Kjemiske forskyvninger er angitt i deler pr. million nedover fra den indre standarden tetrametylsilan, medmindre annet er angitt.

Karbon-13-magnetiske resonans ( 13C NMR)-spektra ble oppnådd ved 22,5 MHz ved å benytte et "JEOL FX90Q"-spektrometer med Fourier transformasjon og med fullstendig proton bred-bånd støy frakobling; spektrene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning, medmindre annet er angitt. Karbonforskyvninger er angitt i deler pr. million med den for den indre standarden tetrametylsilan, medmindre annet er angitt.

Fosfor-31 magnetiske resonans ( 31PNMR)-spektra ble oppnådd ved 36,21 MHz ved å anvende et "JEOL FX 90Q"-spektrometer; spek trene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning medmindre annet er angitt. Fosforforskyvninger er angitt i deler pr. million nedenfor

den ytre standarden av vandig 15% H^PO^.

Optiske rotasjoner ble målt ved hjelp av et "Perkin-Elmer Model 141 Polarimeter".

Organiske reagenser ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Company og ble benyttet uten rensing medmindre annet er angitt. Uorganiske reagenser var ACS-reagensrenhet fra Fisher Scientific Company eller andre hovedforhandlere. Reaksjons-oppløsningsmidler var av ACS-reagensrenhet. Reagenser benyttet i oligonukleotidsyntesen ble tilveiebragt fra Applied Biosystems, Inc. Saltvannsoppløsning refererer til en mettet vandig natriumkloridoppløsning.

Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført ved å benytte silicagel "60F-254"-plater fra E. Merck. Kolonnekromatografi ble utført ved å anvende "Silica Gel 60" (70-230 mesh) fra E.Merck. Alle de angitte smeltepunktene er ukorrigerte.

5- trifluoracetamidoally1- 2'- deoksyuridin (forbindelse 8)

En suspensjon av 5-klormercuri-2'-deoksyuridin (forbindelse 5)

(D.E. Berstrøm og J.L. Ruth, "J.Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides" 4(5), 257 (1977)) (5,56 g; 12 mmol) i metanol av HPLC-renhet (120 ml) ble holdt under en atmosfære av inert gass ved romtemperatur og behandlet med 3-trifluoracetamido-1-propen (forbindelse 7) (M. Pailer og W.J. Hubsch, "Monatshefte flir Chemie", 97 (6), 99 (1966)) (7, 33 g; 48 mmol; 4 eq) og K2PdCl4(4,28 g; 1,1 eq). Reaksjonen ble gradvis sort og ble omrørt i 22 timer. Blandingen ble behandlet med H2S-gass i flere minutter, deretter filtrert gjennom "Celite", renset med MeOH og inndampet til tørrhet under redusert trykk fra et bad på 80°C, slik at man fikk en rå, halv-fast rest(7,0 g). Resten ble kromatografert på en silicagel-kolonne utviklet med CH2C12/ MeOH (5:1). Båndet som antok en blå farve med modifisert p-anisaldehyd-reagens ("Thin Layer Chromatography" av

Egon Stahl, 2.utgave, Springer Verlag, New York 19 69, side 8 57) og hadde en Rf = 0,51 (CH3CN/MeOH 3:1) ble samlet og inndampet til tørrhet i vakuum slik at man fikk et farveløst skum. Produktet ble krystallisert fra en minimal mengde metanol, filtrert, vasket med kald CHCl3/MeOH (3:1) og vakuumtørket. Moderluten ble bearbeidet slik at man fikk en andre porsjon-totaltutbytte 1,01 g (22%). En rekrystallisasjon fra MeOH

ga forbindelsen i overskriften (8) som analytisk rene, små, hvite nåler med smp. = 18 3-4°C etter tørking i vakuum

(«1,0 torr) ved 64°C over natten. IR (KBr) cm"<1>3420, 3260, 1718, 1683 (br), 1560, 1478, 1283, 1190, 1102, 1061, 980, 788, 763, 737; 'HNMR (DMSO-d<6>) (Ref.-DMSO-d<6>) 62,13 (d av d,

J= 6Hz, 2H), 3,59 (br s, 2H), 3,70-3,97 (m, 3H), 4,25 (br s, 1H), 5,06 (br m, 1H), 5,20 (br m, 1H), 6,05-6,65 (m, 4H),

8,01 (s, 1H), 9,60 (br s 1H);<13>C NMR (DMSO-d<6>) (Ref. DMSO-D<6>) ppm 162,05, 155,29, 149,50, 138,05, 124,33, 124,14, 109,96, 87,53, 84,47, 70,23, 61,12, 39,93; [<x]D= +8,01°

c = 0,87, MeOH).

Analyse for ci4Hi6<N>3°6<F>3

Beregnet: C 44,33 H 4,25 N 11,08

Funnet: C 44,19 H 4,10 N 10,93"

5- trifluoracetamidoallyl- 5'- 0-( 4, 4'- dimetoksytrityl)- 2'- deoksyuridin (forbindelse 9)

En oppløsning av forbindelse 8 (0,60 g; 1,58 mmol) i vannfritt pyridin (8 ml) ble holdt under en atmosfære av inert gass og behandlet ved romtemperatur med 4,4<1->dimetoksytrityl-klorid (0,67 g; 1,25 ekv.) Etter omrøring i 18 timer ble reaksjonen heldt i isvann (70 ml) med kraftig risting. Ved henstand i

1/3 time ved 0°C separertes et gummiaktig faststoff ut og etterlot en tilnærmet klar oppløsning som ble dekantert. Det faste stoffet ble vasket en gang med H20 (5 ml), deretter opptatt i CH2C12(10 ml), vasket en gang med saltvannsoppløsning (5 ml), deretter ble CH2Cl2-oppløsningen tørket over K2C03, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum slik at det oppsto

et brunaktig skum. Råproduktet ble renset ved flammekromatografi (W.C. Still, M. Kahn og A. Mitra, J. Org.Chem. 43, 2923

(1978)) på en kolonne av silicagel (Merck,"Grade 60", 230-

400 mesh, 60A) (75 g) utviklet med 4,0% MeOH i CHCl3-oppløs-ningsmiddel (1,0 liter). Fraksjoner på ca. 20 ml hver ble samlet i rør inneholdende pyridin (10 yl) for å inhibere av-beskyttelse av 5<1->hydroksylet. Fraksjoner inneholdende hoved-produktbåndet (Rf=0,29; MeOH/CHCl37:93) ble samlet, filtrert og inndampet i vakuum til tørrhet, slik at man fikk forbindelse 9 (0,91 g; 85%) som et svakt gulaktig skum. En fraksjon fra sentret av elueringsbåndet ble frigjort for oppløsningsmiddel, opptatt i EtOAc, behandlet med "Norit 211", filtrert gjennom "Celite" og inndampet til tørrhet under høyvakuum (<1,0 torr) ved 63°C over natten, slik at man fikk den analytiske prøven som et farveløst skum med smeltepunkt 105-110°C (dekomponering). IR (CHC13) cm"<1>3370, 2920, 1715, 1695, 1618, 1515, 1470, 1260, 1182, 1045, 842; 1H NMR (CDC13) 62,38 (br m, 2H), 3,25-3,75

(m, 5H), 3,75 (s, 6H), 4,10 (br m 1H), 4,60 (br s, 1H),

5,39 (d, J=16 Hz, 1H), 6,10-6,55 (m, 2H), 6,70-6,95 (m, 5H), 7,15-7,45 (m, 10H), 7,84 (s,lH); 13C NMR (CDC13)(Ref.CDC13) ppm 162,31, 158,74, 157,70, 156,01, 149,70, 144,04,

137,88, 135,65, 135,52, 130,12, 128,11, 127,26, 125,05, 113,48, 111,33, 86,94, 86,68, 85,25,

72,18, 63,60, 55,34, 42,66, 41,42.

Analyse av C35H34N3°sF3:

Beregnet: C 61,67 H 5,03 N 6,16

Funnet: C 61,47 H 5,19 N 5,95

5- trifluoracetamidoaminoallyl- 5'- 0-( 4, 4'- dimetoksytrity1)- 2'-deoksyuridin- 3'- 0-( N, N- diisopropylamiriometoksy- fosfin)(forb. 1)

En oppløsning av forbindelse 9 (0,34 g; 0,5 mmol) i vannfritt CH2C12(1,5 ml) holdt under en Argon-atmosfære ved romtemperatur ble behandlet først med vannfritt diisopropyletylamin (0,35 ml; 0,259 g; 2 mmol; 4 ekv) deretter dråpevis, iløpet

av ett minutt med N,N-diisopropylaminometoksyklorfosfin (L.J.

McBride og M.H. Caruthers, "Tet.Letters" 24 (3), 245 (1983))

(forbindelse 10) (0,19 ml; ca. 0,2 g; 2,2 ekv.) Den resulterende farveløse oppløsningen ble omrørt i 20 minutter, deretter overført med EtOAc (20 ml) (EtOAc var på forhånd vasket med mettet vandig NaHCO^, deretter saltvannsoppløsning) til en skilletrakt, vasket fire ganger med saltvannsoppløsning (35 ml hver gang), tørket over IS^SO^, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at man fikk et farveløst glass (0,51 g). Dette råproduktet ble opptatt i vannfri benzen (2 ml) og utfelt i raskt omrørt vannfri pentan (60 ml) ved

-78°C under en Argon-atmosfære. Den resulterende suspensjon ble filtrert, vasket med pentan ved -78°C og vakuumtørket ved mindre enn 1 torr over KOH natten over, slik at man fikk forbindelsen 1 i overskriften (0,38 g; 93%) som et hvitt amorft pulver. IR (CHC13) cm"<1>2965, 1722, 1698, 1618, 1518, 1470, 1262, 1185, 1045, 988, 842; •H NMR (CD2C12) 6 0,95-1,30 (m, 12H), 2,20-2,60 (m, 2H),

3,24 og 3,37 (d av d, J=13 hz, 3H) (P-0-CH3), 3,20-3, 80 (m, 6H) , 3,75 (s,6H), 4,17 (br m 1H) , 4,68 (v br m, 1H), 5,42 (d, J=16Hz, 1H)

6,15-6,55 (m, 3H), 6,75-6,95 (m, 4H),

7, 20-7,50 (m, 10H) , 7,79 (s, 1H) ;

<13>C NMR (CD2C12) (Ref. CD2C12) ppm 162,40, 159,21, 157,78, 149,78, 144,71, 138,34, 136,00, 130,53, 128,71, 128,45, 127,54, 125,66, 125,27, 113,82, 111,48, 87,23, 86,31,

85,60, 55,75, 43,78, 43,20, 42,94, 24,99, 24,60;<31>PNMR(CD2C12) ppm 149,30,148,87, 14,11 (ca. 12% forurensning, 8,18 (ca. 4% forurensning).

Tilknytning av forbindelse 1 til oligonukleotider

19-enhets oligonukleotidene ble syntetisert ved å anvende en "Model 380A DNA Synthesizer" fra Applied Biosystems på en fast bærer av poreglass. Straks før tilknytning av forbindelse 1 til 5'-enden på oligomeren ble 5<1->0-(4,4'-dimetoksytrityl)-beskyttelsesgruppen avspaltet på maskinen med 3% CC13C02H i CH2C12i 90 sekunder. Den bærer-bundne 5'-avbe-

skyttede oligomeren ble vasket med CH^CN og tørket i en Argon-strøm. Etterfølgende trinn ble utført uten maskinen, men ved å anvende den samme kjemien; 1) Den bærer-bundne oligomeren ble fjernet fra be-holderen (kolonnen) som ble benyttet for auto-matisert syntese og overført til en tørr flaske med septum-hette under en Argon-atmosfære. 2) Den bundne oligomeren ble behandlet med et 20-30 gangers overskudd av 0,5 M lH-tetrazole i vannfri CH^CN straks etterfulgt av et tilsvarende overskudd av forbindelse 1 i CH^CN. Det ble deretter inkubert i 30 minutter med svak risting. 3) Reagenser rble avpipettert og bundet oligomer ble vasket med 3 porsjoner CH^CN. 4) Det ble behandlet med et overskudd av n^-I^O— lutidin-THF (0,1 M : 1:10:40) og ristet i 15 min. 5) Reagensen ble avpipettert og bundet oligomer ble vasket med 4 porsjoner CH^CN. 6) Det ble behandlet med et overskudd av thiofenol-trietylamin-dioksan i 60 minutter. 7) Reagens ble avpipettert og den bundne oligomeren ble vasket med 4 porsjoner MeOH.

8) Det ble behandlet med konsentrert vandig NH^OH

i to timer ved romtemperatur ( dette fjerner beskyttet oligonukleotid fra bæreren). 9) Det tilsettes mer konsentrert vandig NH^OH og opp-varmes til 50°C over natten (dette fjerner alle beskyttende grupper bortsett fra dimetoksytrityl). 10) Bæreren f raf Utreres og filtratet inndampes til tørrhet slik at man får rå oligonukleotid.

Dette ble gjentatt med alle porsjonene av bærer-bundet oligonukleotid. Behandling av en del av hver på en tynnsjikts-kromatografi (TLC)-plate av silicagel med 3% CC13C02H i CH2C12ga den orange-røde farven av dimetoksytrityl-kation som indikerer vellykket inkorporering av forbindelse 1 i oligo-nikleotidene.

En porsjon av det modifiserte H 19A<1->oligonukleotidet ble detritylert med 3% CC13C02H i CH2C12, deretter renset ved elektroforese på en 20% polyacrylamid-gel under denaturerende betingelser.

Eksempel 2

Reaksjonen av et spesifikt oligonukleotid med sulfosuccinimi-dy1- hydrok sy f e ny1- prop iona t 2 mikrogram av 19A<1->aminproduktet fra Eks. 1 oppløses i 20 mikroliter av 10 mM-boratbuffer, pH 8,16. Til dette tilsettes 5 mikroliter av en nyfremstilt oppløsning av sulfosuccinimidyl 3-(4-hydroksyfenyl)-propionat (SHPP) (tilveiebragt fra Pierce Chemical Co., Illionois). Konsentrasjonen av SHPP er 5 mg/ml i vann. Reaksjonen får forløpe ved romtemperatur i 30 min., deretter holdes den i en dypfryser før HPLC-separasjonen fore-tas .

Etter reaksjonen bedømmes omfanget av reaksjonen ved å anvende en 20% polyacrylamid-gel på konvensjonell måte.

Eksempel 3

Separasjon av det SHPP-omsatte T9A' fra reaksjonsblandingen inneholdende hydrolysert SHPP og bligoriukléotider.

Et HPLC-forsøk ble utført på en "Brownlee RP300 guard"-kolonne koblet til en "Synchrome RP-P"4,1 x 10 cm kolonne ved romtemperatur. En gradient av a) 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7 med b) 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0, 50% aceto-nitril ved en strømningshastighet på 1 ml/min. UV-detektoren ved 254 mm benyttes til å overvåke utvaskingen av oligonukleotidet. For å finne plasseringen av produktet er et blindfor-søk utført med alle reaktantene i utgangsblandingen uten oligonukleotidet. Den nye toppen som kom til syne etter tilsats av oligonukleotidet antas å være toppen som svarer til reaksjons-produktet. Etter at produktet er separert og samlet i en fraksjonssamler, analyseres produktet ved gelelektroforese, og fra det neste forsøket er en analytisk bestemmelse av den riktige toppen ikke påkrevet. Utbyttet og utvinningen av produktet fra kolonnen er mellom 80 og 90%.

Eksempel 4

Primer utvidelsesreaksjon for merking av et oligonukleotid

Produktet fra Eks. 1 eller 3 kan benyttes som templat og begge er separerbare ved HPLC (høytrykksvæskekromatografi) eller gel-elektroforese. Et eksempel er tilveiebragt med produktet fra Eks. 1. En identisk fremgangsmåte kan følges med produktet fra Eks. 3.

Reaksjonsbetingelsene er diskutert av Studencki og Wallace, DNA, 3, 7(1984). Primer utvidelsesreaksjonsblandingen inneholdt et totalt volum på 25 yl og fremstilles ved å blande, for å fremstille en sluttkonsentrasjon på 1,6 yM template

og 5 yM av hver av dATP, dTTP, a-[<32>P] dCTP og a-[<32>P] dGTP,

og 10 enheter av E. coli DNA polymerase I (Klenow-fragment) innkjøpt fra New England Nuclear, Boston, Mass., USA. Reaksjonen får forløpe i 18 timer ved romtemperatur.

Eksempel 5

Rensing av produktet ved gelelektroforese

Når produktet fra Eks. 1 eller 3 benyttes som templater,

er den elektroforetiske mobiliteten (på en 20% polyacrylamid-gel) av produktet forskjellig fra mobiliteten for template og den korte primeren. Reaksjonsblandingen (eks. 4) for-tynnes til 4 0 yl med buffer inneholdende 8 ^ urea, 0,0 5% xylen-cyanol FF og 0,0 5 bromfenol-blått i 20 mM tris-EDTA-buffer (ph 7,5). Blandingen 40 yl plasseres på et stykke av 20% polyacrylamidgel (0,2 x 15,5 x 29,5 cm) som på forhånd er elektroforest i 1 time ved 1000 V. - Denne gelen kjøres i 8 timer ved 100 0 V i 50 mM trisborat-buffer, pH 8,3. Etter forsøket gjennomføres autoradiografisk deteksjon for å loka-lisere det radioaktive produktbåndet; dette skjæres ut og utvaskes fra gelen ved å anvende 1 mM EDTA-oppløsning som beskrevet av Studencki og Wallace (DNA, 3, 7 (1984)).

Eksempel 6

Rensing av produktet ved høytrykks væskekromatografi

Begge produktene fra Eks. 1 og 3 er mer hydrofobe enn utgangs-oligonukleotidet. De kan separeres fra den merkede komplementære kjeden på et reversert fasesystem ved å anvende aceto-nitrilgradient. En identisk innretning og reaksjonsbetingelser som beskrevet i Eks. 3 benyttes for å separere det merkede produktet fra templatet. Ved denne fremgangsmåten utvaskes en del av primeren (ureagert) med produktet. Denne kan renses på et gelfiltreringssystem.

Eksempel 7

Hybridisering av produktet fra Eks. 5 eller 6 med DNA fra ft- glimin- génet

Det spesifikke oligonukleotid-fragmentet som velges for eksemplene (5,6) kan anvendes for deteksjonen av sigdcelle-anemi. Denne spesielle sekvensen av oligonukleotid vil hybridisere med DNA ekstrahert fra normalt blod og under visse betingelser vil det ikke hybridisere med DNA som er ekstrahert fra blod hos en person som har sykdommen sigdcelle-anemi. Ekstrahe-ringen av DNA fra blodprøver og nedbrytningen med et restrik-sjonsenzym og annen egnet behandling ved hybridiseringspro-sessen er beskrevet av Studencki og Wallace (DNA, 3 (1984) 7). Det nymerkede materiale viser tilsvarende hybridiserings-

32

egenskaper som en P merket probe som er beskrevet av Studencki og Wallace (DNA, 3 (1984) 7) .

Eksempel 8

Merking av et oTigonukleotid ved primer- utvidelse og dets hybridisering i en urenset form til DNA av | 3- globin- genet

Det har vært nødvendig å rense merkede oligonukleotider for umerket materiale og uinkorporerte trifosfater ved enten acrylamidgel-elektroforese (Studencki, A.B. og R.B. Wallace "Allele-specific Hybridization Using Oligonucleotide Probes

Of Very High Specific Activity: Discrimination of The Human

PA and |3S<->globin Genes", DNA 3, 7-15 U984)) eller homo-kromatografi (Conner, B.J., Reyes, A.A., Morin, C., Itakura,I., Teplitz, R.L. og Wallace, R.B. : "Detection Of Sickle Cell (3S<->globin Allele By Hybridization With Synthetic Oligonucleo-tides", Proe. Nati.Acad.Sei, USA, 80, 278-282.(198 3)).

Fordi merkingsreaksjonene ikke er meget effektive, har den tidkrevende og arbeidskrevende rensingen av merket fra umerket oligonukleotid vært spesielt viktig, slik at sistnevnte ikke interfererer med førstnevnte ved hybridisering med prøve-DNA.

Med den primer-utvidelsesmerkefremgangsmåte som er beskrevet i dette eksemplet er imidlertid rensing av merket fra umerket oligonukleotid ikke påkrevet. Dette er fordi den umerkede templat-oligonukleotidkomponenten av merkeblandingen beholder en molekyllengde som er utilstrekkelig for å opprettholde et stabilt dupleks under hybridiseringsbetingelsene, mens oligonukleotidet merket ved primer-utvidelsesreaksjonen er for-lengd t med fra 14 til 19 eller flere nukleotider. Denne forskjellen tillater de forlengede oligonukleotidene å smelte sammen med prøve-DNA under hybridiseringsreaksjonene:

Merking ved forlengelse av et forskjøvet par:

Sekvensene som ble benyttet var som følger:

For å fremstille en merket nonadecanukleotid-probe spesifikk for normalt 3-globingen anvendes sekvenspar 1 og 2 og for sigd 3-globinprobe anvendes sekvens 3 og 4 i et par.

En typisk reaksjonsblanding ble fremstilt som beskrevet nedenfor: For å fremstille en merket probe spesifikt for normalt gen, inneholdt reaksjonsblandingen:

1 yl - 400 ng/yl - oligonukleotid nr. 2

1 yl - 200 ng/yl - oligonukleotid nr. 1

85,8 pico mol - lyofilisert - a-<32>P-dATP

fra 26 yl (NEN)

3,3 picomol/yl

1 yl - 0,13 mM - dGTP

2 yl - 5 X tilfeldig primerbuffer (sammenset-ningen av den 5 X tilfeldige primerbuf-feren er som følger:

0,25 M tris-HCl (pH 8,1)

10 mM dithiothreitol

25 mM MgCl2

0,2 M KC1 )

1,0 yl - 20 y/yl revers transcriptase (Molecular Genetics Resources, Tampa, Florida, USA)

3,5 yl - deionisert vann.

Det totale reaksjonsvolumet var 10 yl. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 15°C i 90 minutter.

For det merkede sigd 3-globingenet ble i stedet for 2), sekvens 4), og i stedet for 1), sekvens 3), benyttet i reaksjonsblandingen. Forøvrig var betingelsene identiske.

Etter merkingsreaksjonen ble blandingen oppvarmet til 90°C for å stoppe reaksjonen. Dette trinnet ble funnet å være unødvendig.

Overskytende trifosfater kan også ødelegges ved inkubering med 50 enheter bakteriell alkalisk fosfatase eller kan fjernes ved passasje gjennom en siktekolonne, f.eks. "Sephadex G25".

Hybridisering:

Reaksjonsproduktene som viste ekvivalente egenskaper med hensyn på spesifikk hybridisering ble ført gjennom fremgangsmåten beskrevet nedenfor.

Restriksjbhsehz<y>mnedbr<y>tniri<g>av humant DNA

Humane genome DNA-prøver ble nedbrudt med Bam HI under

følgende betingelser: DNA ved 0,2 - 0,5 mg/ml, 100 mM NaCl,

10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetanol,

Bam HI ved 1600 enheter/ml, 37°C, i 4-20 timer. Reaksjonene ble stoppet ved tilsats av 1/10 volumdeler av geloppløsning:

20% ficoll, 0,2% bromfenol-blått, 0,2% xylencyanol FF,

100 mM Na2EDTA.

Agarosgelelektroforese

Nedbrudte DNA-prøver ble plassert i vertikale 0,8% agarose-geler med målene 0,15 x 7,3 x 8,3 cm. Gelene ble anvendt i 40 mM tris-borat, pH 8, 4mM Na2EDTA, 0,25 ym/ml etidiumbromid vanligvis ved 80 V i ca. 1,5 timer eller inntil bromfenol-blått befant seg nær bunnen av gelen. Etter elektroforese,

ble gelene fotografert ved å benytte en UV-transilluminator, orange eller gule barrierefiltere og "Polaroid"-film.

Hybridisering til DNA i geler

Elektroforert DNA ble denaturert ved å neddykke geler i 10 min. i 0,5 M NaOH, 0,15 M NaCl. Etter korte rensinger i vann ble gelene nøytralisert ved neddykking i 0,5 M tris-HCl, pH 8,

0,15 M NaCl i 10 minutter. Gelene ble tørket på "Whatman 3MM"-papir i en "BioRad"-geltørker, oppvarmet til 60°C og deretter lagret i forseglede plastposer. Før hybridering ble gelene fjernet fra papiret ved å fukte dette med vann eller saltvannsoppløsning, deretter ble de plassert i forseglbare plastposer.

32

Hybridiseringsoppløsninger inneholdt typisk P-merket oligonukleotid i en konsentrasjon på ca. 20 ng/ml, 6 x NET (1 x NET er 150 mM NaCl, 30 mM tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Na2EDTA),

5 x Denhardfs oppløsning (1 x Denhardfs er 0,02% ficoll, 0,02% bovint serum albumin, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% Na-dodecylsulfat), 0,5% NP-40, 2 mM Na-pyrofosfat, 10% dekstran- sulfat, og ble benyttet ved 5 ml/gel. Hybridiseringen ble utført i plastposer ved 50°C i 2-20 timer.

Vask etter hybridisering

Etter at dét meste av hybridiseringen var pipettert fra en pose, ble gelen fjernet på en plate inneholdende ca. 500 ml av 6 x SSC (1 x SSC er 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3~citrat) på et isbad. Oppløsningen ble utvekslet etter minst 15 min. forsiktig risting, deretter ble det gjennomført en tredje kald 6 x SSC-vasking, gelen ble anbragt på et "Whatman No.l"-papir. En "stringensvasking" som tillot diskriminering av perfekte oligonukleotid-genome DNA-hybrider fra de som inneholdt et par eller flere mistilpassede baser, ble utført på en av to måter: 1) lgelen ble neddykket i 1-2 min. i ca.

1 liter av 6 x SSC ved 56 - 1°C; 2) gelen ble neddykket i

20 minutter ved 37°C i ca. 0,1 liter 3 M tetrametylammonium-klorid, 0,05 M tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM Na2EDTA, 0,1% Na-dodecylsulfat, deretter i 2 x 10 min. i den samme oppløs-ningen ved 56 - 1°C.

Autoradiografi

Etter en hvilken som helst av stringent-vaskene ble gelen anbragt på et papir nr. 1, deretter innpakket i plastfilm. Autoradiografi ble utført på "Kodak" XAR-5-film og mellom to intensiverende skjermer i et par timer til et par dager ved -70°C.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et oligonukleotid, karakterisert ved at den innbefatter hybridisering av a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært til det ønskede oligonukleotidet, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper relativt til den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosid-trifosfater, hvorved det kortere fragmentet vokser i en retning inntil det er i det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragmentet, denaturering av det hybridiserte materiale og separering av forlenget a) fra b).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den organiske resten er et reaktivt sete og separasjonen bevirkes ved kontakt med et medium som reagerer med det reaktive setet.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2, karakterisert ved atb) bærer den organiske resten.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at den organiske resten er en hydroksyfenyl-rest, eller en polyacrylsyrerest.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at nukleosid-trif osf åtene innbefatter et merke.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at merket er et radioaktivt element.

7. Hybridisert materiale, karakterisert ved at det innbefatter b) et nukleinsyrefragment og a) et kortere oligonukleotid hybridisert dertil, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller dens fysikalske eller kjemiske egenskaper fra den andre av a) og b).

8. Hybridisert materiale, karakterisert ved at det innbefatter to korte fragmenter av nukleinsyre og en av de følgende strukturene:

hvori X:Y er T:A for sigdcelle-proben og A:T for den tilsvarende normale globingen-proben,b) hemoglobin C

hvori X:Y er A:T for Hb C-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben,c) 3° (B <39> ) thalassemia

hvori X er A for 3^-proben og G for den tilsvarende normale globingen-proben,d) (i) 3 <+> thalassemias

hvori X,Y og Z er G, G og T for den normale globingen-proben, A, G og T for IVS-l-thalassemia- proben, G, C og T for IVS-5-thalassemia-proben, og G, G og C for IVS-6-thalassemia-proben; N er det egnede komplementære nukleotidet,d) (ii) |3+ thalassemias

hvori X:Y er A:T for IVS-llO-thalassemia-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben,e) homozygotisk a-thalassemia

f) protease inhibitor (antitrypsin)-mangel

hvori X:Y er A:T for mangel (Z)-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben(M).

9. Analysesystem for deteksjon av en nukleinsyre i en biologisk prøve som inneholder et oligonukleotid, karakterisert ved at det fremstilles ved en fremgangsmåte som innbefatter hybridisering av a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært til det ønskede oligonukleotid, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosid-trifosfater, hvorved det kortere fragmentet vokser i en retning inntil det er i det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragmentet, denaturering av det hybr idiserte materialet og separering av forlenget a) fra b).

10. Anvendelse av et oligonukleotid i en nukleinsyre-hybridiseringsanalyse som fremstilles ved en fremgangsmåte som innbefatter hybridisering av a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært det ønskede oligonukleotidet, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosidtrifosfater, hvorved det korte fragmentet gror i en retning inntil det er i det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragment, denaturering av det hybridiserte materialet og separering av forlenget a) fra b) .