NO860710L - Merking av oligonukleotider. - Google Patents
Merking av oligonukleotider.Info
- Publication number
- NO860710L NO860710L NO860710A NO860710A NO860710L NO 860710 L NO860710 L NO 860710L NO 860710 A NO860710 A NO 860710A NO 860710 A NO860710 A NO 860710A NO 860710 L NO860710 L NO 860710L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- probe
- oligonucleotide
- nucleic acid
- fragment
- thalassemia
- Prior art date
Links
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 18
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 15
- 108060003196 globin Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 102000018146 globin Human genes 0.000 claims description 4
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108010085686 Hemoglobin C Proteins 0.000 claims description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 2
- 125000004464 hydroxyphenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 6
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- UFPBWCBCUAYIIW-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-prop-2-enylacetamide Chemical compound FC(F)(F)C(=O)NCC=C UFPBWCBCUAYIIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- DIJUCTBXTPCIMF-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(4-hydroxyphenyl)propanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O DIJUCTBXTPCIMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-DICFDUPASA-N dichloromethane-d2 Chemical compound [2H]C([2H])(Cl)Cl YMWUJEATGCHHMB-DICFDUPASA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 2
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- VOVWQRQDSCYAEA-UHFFFAOYSA-N n-[chloro(methoxy)phosphanyl]-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound COP(Cl)N(C(C)C)C(C)C VOVWQRQDSCYAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910002093 potassium tetrachloropalladate(II) Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[[4-(ethylamino)-3-methylphenyl]-(4-ethylimino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-3-sulfobenzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=C(C)C(=NCC)C=C1 VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N (2S,3R)-N-[(2S)-3-(cyclopenten-1-yl)-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxopropan-2-yl]-3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-2-[[(2S)-2-[(2-morpholin-4-ylacetyl)amino]propanoyl]amino]propanamide Chemical compound C1(=CCCC1)C[C@@H](C(=O)[C@@]1(OC1)C)NC([C@H]([C@@H](C1=CC=C(C=C1)OC)O)NC([C@H](C)NC(CN1CCOCC1)=O)=O)=O GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N 0.000 description 1
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 1
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 1
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- WJBNIBFTNGZFBW-DJLDLDEBSA-N 2'-deoxynebularine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 WJBNIBFTNGZFBW-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- QMQXVNHINOVNSD-UHFFFAOYSA-N 2-[chloro(diphenyl)methyl]-5,5-dimethoxycyclohexa-1,3-diene Chemical compound C1=CC(OC)(OC)CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 QMQXVNHINOVNSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N Carbon-13 Chemical compound [13C] OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150048063 NTP1 gene Proteins 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Natural products P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100492656 Plasmodium berghei (strain Anka) ApiAT8 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- CXHAQBKHAYWQCI-CDNBRZBRSA-M chloro-[1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2,4-dioxopyrimidin-5-yl]mercury Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C([Hg]Cl)=C1 CXHAQBKHAYWQCI-CDNBRZBRSA-M 0.000 description 1
- 229940125797 compound 12 Drugs 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000034737 hemoglobinopathy Diseases 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000018337 inherited hemoglobinopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- LQERIDTXQFOHKA-UHFFFAOYSA-N nonadecane Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCC LQERIDTXQFOHKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N p-methoxybenzaldehyde Chemical class COC1=CC=C(C=O)C=C1 ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av et oligonukleotid. Foreliggende oppfinnelse ved-rører også fremgangsmåter for fremstilling av oligonukleotid-prober.
Det er vist av Studencki og Wallace (DNA, 3, 7 (1984)) at et oligonukleotid kan merkes med radioaktivt<32>P ved å anvende et enzym og en kombinasjon av primer og template. Fremgangsmåten er effektiv og kan gi sterkt merkede prøver. Fremgangsmåten har en alvorlig ulempe idet templatet og produktet har identisk elektroforetisk mobilitet med mindre en av dem er fosforylert ved 5'-enden, eller templatet eller primeren er tritylert ved en ende. Dette krever av en av kjedene må være merket med<32>P ved å anvende terminalt merkeenzym, eller tritylert og 100% av disse molekylene bør bære modifikasjonen.
Modifikasjonen ved fosforylering er ikke effektiv nok til å gi 100% 5'-enden fosforylerte nukleinsyrer. Videre kan - avhengig av frekvensen - mobilitetsforskjellen mellom fosforylert template-utvidet primer og den andre kjeden ikke være tilstrekkelig til å separere dem. 5<1->endetritylerte rester har den ulempen at de er ustabile i vandige-oppløsninger. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for separering av primer-utvidede oligonukleotid-prober fra templatene ved modifikasjon av ett av de deltage,nde oligonukleotidene. Modifikasjonen er slik at den er stabil, hydrofob/hydrofil og endrer den elektroforetiske mobiliteten og utvaskingsegenskapen på en reversert fase-kolonne og kan om ønsket benyttes på nytt. Det er ønskelig at templatet modifiseres slik at det bærer separer-barhetsegenskapen. De syntetiserte merkede molekylene bør for-bli umodifiserte bortsett fra modifikasjonene innført ved en enzymreaksjon som benyttes i syntesen.
Dersom templatet f.eks. er modifisert ved 3'-enden med hexylamino ATP, vil mobiliteten av templatet under gelelektroforese være langsommere enn for det syntetiserte merkede produktet. Tilsvarende modifikasjoner vil også gi opphav til separerbar-het under kromatografi og høyt trykk i et reversert fase-system.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et oligonukleotid som innbefatter hybridisering av
a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med
b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært med det ønskede oligonukleotidet, hvor en av a) og b)
bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosidtrifosfater, hvorved det kortere fragmentet vokser i en retning inntil det er i.det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragmentet, denaturering av det hybridiserte materialet og separering av forlenget a) fra b).• Slik separering av det merkede materialet kan utføres ved høyytelse-væskekromatografi (HPLC) eller ved gelelektroforese.
I den ovenfor omtalte fremgangsmåten kan den organiske resten være et reaktivt sete og separasjonen kan bevirkes ved kontakt med et medium som reagerer med det reaktive sete.
I den ovenfor omtalte fremgangsmåten kan nukleosid-trifosfåtene innbefatte et merke. Merket kan være et radioaktivt element, f.eks. radioaktivt fosfor.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også et hybridisert materiale som innbefatter b) et nukleinsyrefragment og a) et kortere oligonukleotid som er hybridisert dertil, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest (f.eks. en hydroksyfenylrest eller en polyacrylsyrerest) som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b). Den organiske resten kan være et reaktivt sete.
I det ovenfor omtalte materiale kan a) og b) være koterminale ved en ende.
Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av en oligonukleotid-probe som innbefatter hybridisering av to korte fragmenter av nukleinsyre som er komplementære med hverandre over bare en del av deres lengder ved motstående ender, det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosidtrifosfater, nukleosidtrifosfat-sammensetningen er slik at den tillater vekst av bare det ene av fragmentene, hvorav ett av fragmentene gror selektivt i en retning inntil det er koterminalt med det andre fragmentet.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også et hybridisert materiale som innbefatter to korte fragmenter av nukleinsyre og en av de følgende strukturene:
hvori X:Y er T:A for sigdcelle-proben og A:T for den tilsvarende normale glibingen-proben
b) hemoglobin C
hvori X:Y er A:T for Hb C-proben og G:C for den
tilsvarende normale globingen-proben,
c) beta 0 (B 39) thalassemia)
hvori X er A for beta^-proben og G for den tilsvarende normale globingen-proben,
d) (i) beta+ thalassemias
hvori X, Y og Z er G, G og T for den normale
glibingen-proben, A, G og T for IVS-1 thalassemia-proben, G, C og T for IVS-5 thalassemia-
proben, og G, G og C for IVS-6 thalassemia-proben; N er det aktuelle komplementære nukleotid,
d) (i) beta<+>thalassemias
hvori X:Y er A:T for IVS-110 thalassemia-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben, e) homozygotisk alfa-thalassemia N.J. Proundfoot og T Maniatis, "The Structure of A Human Beta-Globin Pseudogene And Its Relationship To Alpha-Globin Gene Duplication", Cell,21, 537-544 (1980), f) alfa^protease-inhibitor (antitrypsin) -mangel
hvori X:Y er A:T for mangel (Z)-proben og
G:C for den tilsvarende normale globingen-(M)-proben.
I strukturene ovenfor står de forskjellige symbolene for føl-gende nukleotidrester:
A = adenin nukleotid-rest
C = cytosin nukleotid-rest
G = guanosin nukleotid-rest
T - thymidin nukleotid-rest
U = uracil nukleotid-rest
Oppfinnelsen kan ytterligere beskrives som følger:
Fremgangsmåte 1
I stedet for å modifisere templatet, kan - dersom et modifisert nukleosidtrifosfat anvendes - merket kjede også separeres.
For å opprettholde påliteligheten av prosessen, er det ønskelig at modifikasjonen av templatet utføres ved 3'- eller 5'-enden. Dersom en primer er modifisert, er 5'-enden det ønskede sete for endringen. Modifikasjonen utføres via ved å anvende kjente reaksjoner og modifiserte nukleinsyre-rester ved det spesifikke setet. Modifikatoren kan være ionisk, ikke-ionisk, hydrofob eller hydrofil. Modifikasjonen kan fore-gå før eller etter merkereaksjonene. Dersom modifikasjonen ut-føres etter - bør merkereagensen være reaktiv nok til effektivt å modifisere alle de ønskede restene.
F.eks. kan oligonukleosid med en aminrest (som i 8-hexylamino A eller 5-allylamino U inneholdende oligonukleotid) omsettes med: eller lignende reagenser slik at det dannes:
Noen få andre typiske reaksjoner er beskrevet nedenfor.
En hvilken som helst type merke kan innføres ved å anvende tilsvarende nukleosidsubstrater, f.eks. kan med biotinylert UTP,et biotinmerke og<32>P merket NTP innføres.
En spesiell type forlengelsesreaksjon kan benyttes for å merke eller syntetisere en spesifikk nukleinsyresekvens. I fremgangsmåte 1 inneholder templatet den fullstendige sekvensen av nukleinsyren som skal kopieres (beskrevet i diagrammet ovenfor for fremgangsmåte 1) på templatet. Et templatprimer-par kan velges slik at en kan utvides slik at den fullfører en ønsket sekvens uten å utvide det andre paret. F.eks. vil følgende fire par produsere nonadecannukleotid uten anvendelse av en av den samme lengden som templatet:
Bare den øvre kjeden vil bli utvidet dersom deoksyadenosin- trifosfat (dATP) og deoksyguanosin-trifosfat (dGTP) benyttes som nukleosid-trifosfat (NTP)-substrater for DNA-polymerase eller reversert transcriptase-reaksjon. Dette vil produsere 19A<1>/S'-sekvenser og uutvidet lavere kjede.
Tilsvarende komplementære kjeder kan syntetiseres eller merkes ved å anvende pyrimidin nukleosid-trifosfater i stedet for dATP og dGTP for å fremstille komplementære sekvenser. Parene som benyttes er:
Et annet nyttig sett av oligonukleotid-prober som kan merkes ved å forlenge bare en del av et par av delvis komplementære oligonukleotider er et som vil diskriminere det normale alf a-^-antitrypsin-gen fra det muterte gen som er ansvarlig for den vanlige formen for antitrypsinmangel. En mangel på denne proteaseinhibitor resulterer i emfysem og beslektede tilstander. Det normale allelet av genet er M, og viktigste mangel allelet er Z; nukleotidsekvensen for genet rundt posi-sjonen av Z-punktmutasjonen (Kidd, V.J., Wallace R.B., Itakura, K og Woo, S.C.C., "a-Antitrypsin Deficiency Detention By Direct Analysis Of The Mutation In the Gene", Natur, 309, 230-234 (1983)) er slik at den asymmetriske primerutvidelsesmerkingen anvendes som følger:
Begge disse kan merkes asymmetrisk ved å tilveiebringe en revers transcriptase- eller Klenow-polymerasereaksjon med bare purin-deoksyribonukleosid-trifosfat-forløpere. Templatet forblir et tetrakaidekanukleotid, mens primeren kan utvides fra en lengde på 17 til enten 20 ved innføring av bare dATP, eller 23 ved innføring av både dATP og dGTP i reaksjonsblan-dingene.
Merking ved å anvende disse typene av par er begrenset til sekvenser som kan identifiseres som inneholdende den påkrevede nærhet av en mutasjon og en sammenklumpning av nukleotider som kan virke som et templat i en kjede, men ikke i den andre. Disse er ikke vanlige. I situasjoner hvor konfigurasjonen av nukleotider i en gensekvens ikke tillater et valg av primer og templat for denne merkingsutførelsen, er det mulig å syntetisere et templat som er blokkert ved 3'-enden, slik at det ikke kan utvides uavhengig av dets sekvens. Slik blokkering kan oppnås ved å inkorporere et 2', 3<1->dideoksyribonukleotid som det ytterste 3'-nukleotidet under kjemisk syntese av templat-oligonukleotidet.
Et hovedtrekk ved det asymmetriske primer-utvidelsesmerke-systemet beskrevet i foreliggende søknad, er at forskjellen i lengde mellom merkede og umerkede oligonukleotider i stor grad letter separasjonen og rensingen av førstnevnte fra sistnevnte og fra uinkorporerte forløpere ved elektroforese eller kromatografi. Uventet har det også vist seg at ingen frak-sjonering av merkingsreaksjonsblandingen er nødvendig for prepareringen av en hybridiseringsanalyse.
Merket oligonukleotid renses normalt bort fra umerket oligonukleotid, fordi sistnevnte ville være innbefattet i hybridisering og ville redusere styrken av det resulterende signalet fra merket probe som bindes til prøve DNA. Imidlertid er
forskjellen i lengde mellom det umerkede templatet og den merkede utvidede primeren tilstrekkelig til at under betingelser som kan anvendes for hybridisering av merket probe, er templatet for kort til å danne stabile hybrider slik at det ikke
påvirker bindingen av proben til prøve DNA. Dette trekket ved oppfinnelsen er beskrevet detaljert i Eksempel 8 nedenfor,
Andre genetiske sykdommer for hvilke det finnes tilstrekkelig DNA-sekvensinformasjon til å utvikle syntetiske oligonukleotid-prober, er familien av hemoglobinopatier. Primer-utvidelses-merking av alfa- og beta-thalassemia prober kan oppnås ved å anvende oligonukleotidpar som i de følgende eksemplene, uten dideoksyribonukleotid-blokkering av 3'-enden av templatet:
1. homozygotisk a-thalassemia
2. P+ (IVS-1)-thalassemia 3. (3 (3-39)- thalassemia
Ved å anvende nukleosid-trifosfater (NTP) som skal tilsettes den ønskede kjeden, er det mulig å separere utgangsmaterialene (ureagert) ved gelelektroforese eller ved kolonnekromatografi. En hvilken som helst type merkede oligonukleotider kan fremstilles ved riktig valg av de merkede NTP1 er. For eksempel kan med et 19A'-par, dersom en biotinylert dUTP og dCTP benyttes som substrater, et biotinylert oligonukleotid som er spesifikt for det normale globingenet syntetiseres; med et fluorescein merket NTP kan et fluorescent oligonukleotid fremstilles.
Oppfinnelsen skal nedenfor beskrives med referanse til de følgende ikke-begrensende eksemplene:
Eksempel 1
Syntese av et modifisert oligonukleotidtemplat og modifikasjon med en hydrofob rest.
Reaksjonsskjerna for syntese av 1 som adderes til 19A' ved 5<1->enden.
5-klormercuri-2<1->deoksyuridin (forbindelse 5), fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Bergstrøm og Ruth (D.E. Berstrøm og J.L. Ruth, J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides 4(5), 257 (1977)) ble behandlet med 3-trifluoracetamido-l-propen (forbindelse 7) (. Pailer og W.J. Hubsch, "Monatshefte flir Chemie" 97 (6), 99 (1966)) og K2PdCl4i metanol slik at man fikk 5-trifluoracetamidoallyl-2<1->deoksyuridin (forbindelse 8) i 22% utbytte etter 2 kromatografiprosedyrer og en krystalli-sasjon fra metanol. Omsetning av forbindelse 8 med 4,4-di-metoksytritylklorid i pyridin ga forbindelse 3 i 85% utbytte etter flammekromatografi (W.C. Still, M. Kahn og A. Mitra,
"J.Org.Chem" 43, 2923 (1978)), som deretter ble behandlet med N,N-diisopropylaminometoksy-klorofosfin (L.J. McBride og M.H. Caruthers, "Tet. Letters" 24 (3), 245 (1983)) (forbindelse 10) slik at man fikk forbindelse 1 som et hvitt,fast stoff etter utfelling fra pentan.
Et 19-enhets oligonukleotid (I) ble fremstilt ved å benytte
en DNA:
syntetiserer; tre separate 1 pmol porsjoner av hvert oligo-nikleotid ble fremstilt og hvert ble knyttet til en fast bærer og beskyttet fullstendig. Dimetoksytrityl-beskyttelses-gruppen ble fjernet fra 5<1->terminalen og forbindelse 1 ble knyttet til 19-enhetskjeden uten DNA-syntetisereren, men ved å anvende de samme reagensene og betingelsene som maskinen typisk anvender. Resultatet av denne prosessen er en oligonukleotid med en 5<1->aminoallyl-5'-(4,4'-dimetoksytrityl)-2'-deoksyuridin-enhet
Når porsjoner av hvert av de modifiserte oligonukleotidene ble behandlet med 3% trikloreddiksyre i metylenklorid, ble den distinkte rød-orange farven for frigjort dimetoksytritylkation observert, hvilket indikerer at 5-allylamino-2<1->deoksyuridin-enheten var tilknyttet. Polynukleotidet ble til sist de-tri-tytilert med kort eksponering mot 3% trikloreddiksyre, deretter renset ved polyacrylamidgel-elektroforese. Dette demon-strerer anvendeligheten av forbindelse 1 som et synton for innføring av en 5-aminoallyl-2<1->deoksyuridin-enhet ved C-5<1->terminalen av et oligonukleotid; inkorporering av denne en-heten på et hvilket som helst punkt i oligonukleotidet bør være mulig ved å benytte den samme metodologien.
Prosessen for tilknytning av en analog av en Bolton og Hunter (A.E. Bolton og W.M. Hunter, "Biochem.J." 133, 529 (1973)) reagens er beskrevet i reaksjonsskjema 2. Omsetning av den amino-funksjonaliserte polynukleotidforbindelsen 11 med N-hydrok.sysuccinimidesteren av 3-(4'-hydroksyfenyl)propion-syre (forbindelse 12) vil gi probe polynukleotidforbindelsen 13.
Polynukleotidet H(319A' er 19-enhets polynukleotider svarende til en del av humant DNA som koder for polypeptidhemoglobin, nærmere bestemt det området av DNA, hvori mutasjonen som manifesterer seg i dannelsen av sigd-celle-hemoglobin og den genetiske tilstanden som er kjent som sigdcelle-anemi ligger.
Skjema_2_
Infrarøde (IR) spektra ble oppnådd med et "Perkin-Elmer Model 710 B" eller "237" infrarødt spektrofotometer som oppløs-ninger i CHCl^medmindre annet er angitt; 1602 cm "'"-båndet av polystyrenfilm ble benyttet som en ytre kalibreringsstan-dard. Signaler er angitt som cm
Protonmagnetiske resonans ("'"H NMR)-spektra ble oppnådd ved 89,55 MHz ved å benytte et "Varian T-60"-spektrometer; spektrene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning medmindre annet er angitt. Kjemiske forskyvninger er angitt i deler pr. million nedover fra den indre standarden tetrametylsilan, medmindre annet er angitt.
Karbon-13-magnetiske resonans ( 13C NMR)-spektra ble oppnådd ved 22,5 MHz ved å benytte et "JEOL FX90Q"-spektrometer med Fourier transformasjon og med fullstendig proton bred-bånd støy frakobling; spektrene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning, medmindre annet er angitt. Karbonforskyvninger er angitt i deler pr. million med den for den indre standarden tetrametylsilan, medmindre annet er angitt.
Fosfor-31 magnetiske resonans ( 31PNMR)-spektra ble oppnådd ved 36,21 MHz ved å anvende et "JEOL FX 90Q"-spektrometer; spek trene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning medmindre annet er angitt. Fosforforskyvninger er angitt i deler pr. million nedenfor
den ytre standarden av vandig 15% H^PO^.
Optiske rotasjoner ble målt ved hjelp av et "Perkin-Elmer Model 141 Polarimeter".
Organiske reagenser ble tilveiebragt fra Aldrich Chemical Company og ble benyttet uten rensing medmindre annet er angitt. Uorganiske reagenser var ACS-reagensrenhet fra Fisher Scientific Company eller andre hovedforhandlere. Reaksjons-oppløsningsmidler var av ACS-reagensrenhet. Reagenser benyttet i oligonukleotidsyntesen ble tilveiebragt fra Applied Biosystems, Inc. Saltvannsoppløsning refererer til en mettet vandig natriumkloridoppløsning.
Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført ved å benytte silicagel "60F-254"-plater fra E. Merck. Kolonnekromatografi ble utført ved å anvende "Silica Gel 60" (70-230 mesh) fra E.Merck. Alle de angitte smeltepunktene er ukorrigerte.
5- trifluoracetamidoally1- 2'- deoksyuridin (forbindelse 8)
En suspensjon av 5-klormercuri-2'-deoksyuridin (forbindelse 5)
(D.E. Berstrøm og J.L. Ruth, "J.Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides" 4(5), 257 (1977)) (5,56 g; 12 mmol) i metanol av HPLC-renhet (120 ml) ble holdt under en atmosfære av inert gass ved romtemperatur og behandlet med 3-trifluoracetamido-1-propen (forbindelse 7) (M. Pailer og W.J. Hubsch, "Monatshefte flir Chemie", 97 (6), 99 (1966)) (7, 33 g; 48 mmol; 4 eq) og K2PdCl4(4,28 g; 1,1 eq). Reaksjonen ble gradvis sort og ble omrørt i 22 timer. Blandingen ble behandlet med H2S-gass i flere minutter, deretter filtrert gjennom "Celite", renset med MeOH og inndampet til tørrhet under redusert trykk fra et bad på 80°C, slik at man fikk en rå, halv-fast rest(7,0 g). Resten ble kromatografert på en silicagel-kolonne utviklet med CH2C12/ MeOH (5:1). Båndet som antok en blå farve med modifisert p-anisaldehyd-reagens ("Thin Layer Chromatography" av
Egon Stahl, 2.utgave, Springer Verlag, New York 19 69, side 8 57) og hadde en Rf = 0,51 (CH3CN/MeOH 3:1) ble samlet og inndampet til tørrhet i vakuum slik at man fikk et farveløst skum. Produktet ble krystallisert fra en minimal mengde metanol, filtrert, vasket med kald CHCl3/MeOH (3:1) og vakuumtørket. Moderluten ble bearbeidet slik at man fikk en andre porsjon-totaltutbytte 1,01 g (22%). En rekrystallisasjon fra MeOH
ga forbindelsen i overskriften (8) som analytisk rene, små, hvite nåler med smp. = 18 3-4°C etter tørking i vakuum
(«1,0 torr) ved 64°C over natten. IR (KBr) cm"<1>3420, 3260, 1718, 1683 (br), 1560, 1478, 1283, 1190, 1102, 1061, 980, 788, 763, 737; 'HNMR (DMSO-d<6>) (Ref.-DMSO-d<6>) 62,13 (d av d,
J= 6Hz, 2H), 3,59 (br s, 2H), 3,70-3,97 (m, 3H), 4,25 (br s, 1H), 5,06 (br m, 1H), 5,20 (br m, 1H), 6,05-6,65 (m, 4H),
8,01 (s, 1H), 9,60 (br s 1H);<13>C NMR (DMSO-d<6>) (Ref. DMSO-D<6>) ppm 162,05, 155,29, 149,50, 138,05, 124,33, 124,14, 109,96, 87,53, 84,47, 70,23, 61,12, 39,93; [<x]D= +8,01°
c = 0,87, MeOH).
Analyse for ci4Hi6<N>3°6<F>3
Beregnet: C 44,33 H 4,25 N 11,08
Funnet: C 44,19 H 4,10 N 10,93"
5- trifluoracetamidoallyl- 5'- 0-( 4, 4'- dimetoksytrityl)- 2'- deoksyuridin (forbindelse 9)
En oppløsning av forbindelse 8 (0,60 g; 1,58 mmol) i vannfritt pyridin (8 ml) ble holdt under en atmosfære av inert gass og behandlet ved romtemperatur med 4,4<1->dimetoksytrityl-klorid (0,67 g; 1,25 ekv.) Etter omrøring i 18 timer ble reaksjonen heldt i isvann (70 ml) med kraftig risting. Ved henstand i
1/3 time ved 0°C separertes et gummiaktig faststoff ut og etterlot en tilnærmet klar oppløsning som ble dekantert. Det faste stoffet ble vasket en gang med H20 (5 ml), deretter opptatt i CH2C12(10 ml), vasket en gang med saltvannsoppløsning (5 ml), deretter ble CH2Cl2-oppløsningen tørket over K2C03, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum slik at det oppsto
et brunaktig skum. Råproduktet ble renset ved flammekromatografi (W.C. Still, M. Kahn og A. Mitra, J. Org.Chem. 43, 2923
(1978)) på en kolonne av silicagel (Merck,"Grade 60", 230-
400 mesh, 60A) (75 g) utviklet med 4,0% MeOH i CHCl3-oppløs-ningsmiddel (1,0 liter). Fraksjoner på ca. 20 ml hver ble samlet i rør inneholdende pyridin (10 yl) for å inhibere av-beskyttelse av 5<1->hydroksylet. Fraksjoner inneholdende hoved-produktbåndet (Rf=0,29; MeOH/CHCl37:93) ble samlet, filtrert og inndampet i vakuum til tørrhet, slik at man fikk forbindelse 9 (0,91 g; 85%) som et svakt gulaktig skum. En fraksjon fra sentret av elueringsbåndet ble frigjort for oppløsningsmiddel, opptatt i EtOAc, behandlet med "Norit 211", filtrert gjennom "Celite" og inndampet til tørrhet under høyvakuum (<1,0 torr) ved 63°C over natten, slik at man fikk den analytiske prøven som et farveløst skum med smeltepunkt 105-110°C (dekomponering). IR (CHC13) cm"<1>3370, 2920, 1715, 1695, 1618, 1515, 1470, 1260, 1182, 1045, 842; 1H NMR (CDC13) 62,38 (br m, 2H), 3,25-3,75
(m, 5H), 3,75 (s, 6H), 4,10 (br m 1H), 4,60 (br s, 1H),
5,39 (d, J=16 Hz, 1H), 6,10-6,55 (m, 2H), 6,70-6,95 (m, 5H), 7,15-7,45 (m, 10H), 7,84 (s,lH); 13C NMR (CDC13)(Ref.CDC13) ppm 162,31, 158,74, 157,70, 156,01, 149,70, 144,04,
137,88, 135,65, 135,52, 130,12, 128,11, 127,26, 125,05, 113,48, 111,33, 86,94, 86,68, 85,25,
72,18, 63,60, 55,34, 42,66, 41,42.
Analyse av C35H34N3°sF3:
Beregnet: C 61,67 H 5,03 N 6,16
Funnet: C 61,47 H 5,19 N 5,95
5- trifluoracetamidoaminoallyl- 5'- 0-( 4, 4'- dimetoksytrity1)- 2'-deoksyuridin- 3'- 0-( N, N- diisopropylamiriometoksy- fosfin)(forb. 1)
En oppløsning av forbindelse 9 (0,34 g; 0,5 mmol) i vannfritt CH2C12(1,5 ml) holdt under en Argon-atmosfære ved romtemperatur ble behandlet først med vannfritt diisopropyletylamin (0,35 ml; 0,259 g; 2 mmol; 4 ekv) deretter dråpevis, iløpet
av ett minutt med N,N-diisopropylaminometoksyklorfosfin (L.J.
McBride og M.H. Caruthers, "Tet.Letters" 24 (3), 245 (1983))
(forbindelse 10) (0,19 ml; ca. 0,2 g; 2,2 ekv.) Den resulterende farveløse oppløsningen ble omrørt i 20 minutter, deretter overført med EtOAc (20 ml) (EtOAc var på forhånd vasket med mettet vandig NaHCO^, deretter saltvannsoppløsning) til en skilletrakt, vasket fire ganger med saltvannsoppløsning (35 ml hver gang), tørket over IS^SO^, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at man fikk et farveløst glass (0,51 g). Dette råproduktet ble opptatt i vannfri benzen (2 ml) og utfelt i raskt omrørt vannfri pentan (60 ml) ved
-78°C under en Argon-atmosfære. Den resulterende suspensjon ble filtrert, vasket med pentan ved -78°C og vakuumtørket ved mindre enn 1 torr over KOH natten over, slik at man fikk forbindelsen 1 i overskriften (0,38 g; 93%) som et hvitt amorft pulver. IR (CHC13) cm"<1>2965, 1722, 1698, 1618, 1518, 1470, 1262, 1185, 1045, 988, 842; •H NMR (CD2C12) 6 0,95-1,30 (m, 12H), 2,20-2,60 (m, 2H),
3,24 og 3,37 (d av d, J=13 hz, 3H) (P-0-CH3), 3,20-3, 80 (m, 6H) , 3,75 (s,6H), 4,17 (br m 1H) , 4,68 (v br m, 1H), 5,42 (d, J=16Hz, 1H)
6,15-6,55 (m, 3H), 6,75-6,95 (m, 4H),
7, 20-7,50 (m, 10H) , 7,79 (s, 1H) ;
<13>C NMR (CD2C12) (Ref. CD2C12) ppm 162,40, 159,21, 157,78, 149,78, 144,71, 138,34, 136,00, 130,53, 128,71, 128,45, 127,54, 125,66, 125,27, 113,82, 111,48, 87,23, 86,31,
85,60, 55,75, 43,78, 43,20, 42,94, 24,99, 24,60;<31>PNMR(CD2C12) ppm 149,30,148,87, 14,11 (ca. 12% forurensning, 8,18 (ca. 4% forurensning).
Tilknytning av forbindelse 1 til oligonukleotider
19-enhets oligonukleotidene ble syntetisert ved å anvende en "Model 380A DNA Synthesizer" fra Applied Biosystems på en fast bærer av poreglass. Straks før tilknytning av forbindelse 1 til 5'-enden på oligomeren ble 5<1->0-(4,4'-dimetoksytrityl)-beskyttelsesgruppen avspaltet på maskinen med 3% CC13C02H i CH2C12i 90 sekunder. Den bærer-bundne 5'-avbe-
skyttede oligomeren ble vasket med CH^CN og tørket i en Argon-strøm. Etterfølgende trinn ble utført uten maskinen, men ved å anvende den samme kjemien; 1) Den bærer-bundne oligomeren ble fjernet fra be-holderen (kolonnen) som ble benyttet for auto-matisert syntese og overført til en tørr flaske med septum-hette under en Argon-atmosfære. 2) Den bundne oligomeren ble behandlet med et 20-30 gangers overskudd av 0,5 M lH-tetrazole i vannfri CH^CN straks etterfulgt av et tilsvarende overskudd av forbindelse 1 i CH^CN. Det ble deretter inkubert i 30 minutter med svak risting. 3) Reagenser rble avpipettert og bundet oligomer ble vasket med 3 porsjoner CH^CN. 4) Det ble behandlet med et overskudd av n^-I^O— lutidin-THF (0,1 M : 1:10:40) og ristet i 15 min. 5) Reagensen ble avpipettert og bundet oligomer ble vasket med 4 porsjoner CH^CN. 6) Det ble behandlet med et overskudd av thiofenol-trietylamin-dioksan i 60 minutter. 7) Reagens ble avpipettert og den bundne oligomeren ble vasket med 4 porsjoner MeOH.
8) Det ble behandlet med konsentrert vandig NH^OH
i to timer ved romtemperatur ( dette fjerner beskyttet oligonukleotid fra bæreren). 9) Det tilsettes mer konsentrert vandig NH^OH og opp-varmes til 50°C over natten (dette fjerner alle beskyttende grupper bortsett fra dimetoksytrityl). 10) Bæreren f raf Utreres og filtratet inndampes til tørrhet slik at man får rå oligonukleotid.
Dette ble gjentatt med alle porsjonene av bærer-bundet oligonukleotid. Behandling av en del av hver på en tynnsjikts-kromatografi (TLC)-plate av silicagel med 3% CC13C02H i CH2C12ga den orange-røde farven av dimetoksytrityl-kation som indikerer vellykket inkorporering av forbindelse 1 i oligo-nikleotidene.
En porsjon av det modifiserte H 19A<1->oligonukleotidet ble detritylert med 3% CC13C02H i CH2C12, deretter renset ved elektroforese på en 20% polyacrylamid-gel under denaturerende betingelser.
Eksempel 2
Reaksjonen av et spesifikt oligonukleotid med sulfosuccinimi-dy1- hydrok sy f e ny1- prop iona t 2 mikrogram av 19A<1->aminproduktet fra Eks. 1 oppløses i 20 mikroliter av 10 mM-boratbuffer, pH 8,16. Til dette tilsettes 5 mikroliter av en nyfremstilt oppløsning av sulfosuccinimidyl 3-(4-hydroksyfenyl)-propionat (SHPP) (tilveiebragt fra Pierce Chemical Co., Illionois). Konsentrasjonen av SHPP er 5 mg/ml i vann. Reaksjonen får forløpe ved romtemperatur i 30 min., deretter holdes den i en dypfryser før HPLC-separasjonen fore-tas .
Etter reaksjonen bedømmes omfanget av reaksjonen ved å anvende en 20% polyacrylamid-gel på konvensjonell måte.
Eksempel 3
Separasjon av det SHPP-omsatte T9A' fra reaksjonsblandingen inneholdende hydrolysert SHPP og bligoriukléotider.
Et HPLC-forsøk ble utført på en "Brownlee RP300 guard"-kolonne koblet til en "Synchrome RP-P"4,1 x 10 cm kolonne ved romtemperatur. En gradient av a) 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7 med b) 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0, 50% aceto-nitril ved en strømningshastighet på 1 ml/min. UV-detektoren ved 254 mm benyttes til å overvåke utvaskingen av oligonukleotidet. For å finne plasseringen av produktet er et blindfor-søk utført med alle reaktantene i utgangsblandingen uten oligonukleotidet. Den nye toppen som kom til syne etter tilsats av oligonukleotidet antas å være toppen som svarer til reaksjons-produktet. Etter at produktet er separert og samlet i en fraksjonssamler, analyseres produktet ved gelelektroforese, og fra det neste forsøket er en analytisk bestemmelse av den riktige toppen ikke påkrevet. Utbyttet og utvinningen av produktet fra kolonnen er mellom 80 og 90%.
Eksempel 4
Primer utvidelsesreaksjon for merking av et oligonukleotid
Produktet fra Eks. 1 eller 3 kan benyttes som templat og begge er separerbare ved HPLC (høytrykksvæskekromatografi) eller gel-elektroforese. Et eksempel er tilveiebragt med produktet fra Eks. 1. En identisk fremgangsmåte kan følges med produktet fra Eks. 3.
Reaksjonsbetingelsene er diskutert av Studencki og Wallace, DNA, 3, 7(1984). Primer utvidelsesreaksjonsblandingen inneholdt et totalt volum på 25 yl og fremstilles ved å blande, for å fremstille en sluttkonsentrasjon på 1,6 yM template
og 5 yM av hver av dATP, dTTP, a-[<32>P] dCTP og a-[<32>P] dGTP,
og 10 enheter av E. coli DNA polymerase I (Klenow-fragment) innkjøpt fra New England Nuclear, Boston, Mass., USA. Reaksjonen får forløpe i 18 timer ved romtemperatur.
Eksempel 5
Rensing av produktet ved gelelektroforese
Når produktet fra Eks. 1 eller 3 benyttes som templater,
er den elektroforetiske mobiliteten (på en 20% polyacrylamid-gel) av produktet forskjellig fra mobiliteten for template og den korte primeren. Reaksjonsblandingen (eks. 4) for-tynnes til 4 0 yl med buffer inneholdende 8 ^ urea, 0,0 5% xylen-cyanol FF og 0,0 5 bromfenol-blått i 20 mM tris-EDTA-buffer (ph 7,5). Blandingen 40 yl plasseres på et stykke av 20% polyacrylamidgel (0,2 x 15,5 x 29,5 cm) som på forhånd er elektroforest i 1 time ved 1000 V. - Denne gelen kjøres i 8 timer ved 100 0 V i 50 mM trisborat-buffer, pH 8,3. Etter forsøket gjennomføres autoradiografisk deteksjon for å loka-lisere det radioaktive produktbåndet; dette skjæres ut og utvaskes fra gelen ved å anvende 1 mM EDTA-oppløsning som beskrevet av Studencki og Wallace (DNA, 3, 7 (1984)).
Eksempel 6
Rensing av produktet ved høytrykks væskekromatografi
Begge produktene fra Eks. 1 og 3 er mer hydrofobe enn utgangs-oligonukleotidet. De kan separeres fra den merkede komplementære kjeden på et reversert fasesystem ved å anvende aceto-nitrilgradient. En identisk innretning og reaksjonsbetingelser som beskrevet i Eks. 3 benyttes for å separere det merkede produktet fra templatet. Ved denne fremgangsmåten utvaskes en del av primeren (ureagert) med produktet. Denne kan renses på et gelfiltreringssystem.
Eksempel 7
Hybridisering av produktet fra Eks. 5 eller 6 med DNA fra ft- glimin- génet
Det spesifikke oligonukleotid-fragmentet som velges for eksemplene (5,6) kan anvendes for deteksjonen av sigdcelle-anemi. Denne spesielle sekvensen av oligonukleotid vil hybridisere med DNA ekstrahert fra normalt blod og under visse betingelser vil det ikke hybridisere med DNA som er ekstrahert fra blod hos en person som har sykdommen sigdcelle-anemi. Ekstrahe-ringen av DNA fra blodprøver og nedbrytningen med et restrik-sjonsenzym og annen egnet behandling ved hybridiseringspro-sessen er beskrevet av Studencki og Wallace (DNA, 3 (1984) 7). Det nymerkede materiale viser tilsvarende hybridiserings-
32
egenskaper som en P merket probe som er beskrevet av Studencki og Wallace (DNA, 3 (1984) 7) .
Eksempel 8
Merking av et oTigonukleotid ved primer- utvidelse og dets hybridisering i en urenset form til DNA av | 3- globin- genet
Det har vært nødvendig å rense merkede oligonukleotider for umerket materiale og uinkorporerte trifosfater ved enten acrylamidgel-elektroforese (Studencki, A.B. og R.B. Wallace "Allele-specific Hybridization Using Oligonucleotide Probes
Of Very High Specific Activity: Discrimination of The Human
PA and |3S<->globin Genes", DNA 3, 7-15 U984)) eller homo-kromatografi (Conner, B.J., Reyes, A.A., Morin, C., Itakura,I., Teplitz, R.L. og Wallace, R.B. : "Detection Of Sickle Cell (3S<->globin Allele By Hybridization With Synthetic Oligonucleo-tides", Proe. Nati.Acad.Sei, USA, 80, 278-282.(198 3)).
Fordi merkingsreaksjonene ikke er meget effektive, har den tidkrevende og arbeidskrevende rensingen av merket fra umerket oligonukleotid vært spesielt viktig, slik at sistnevnte ikke interfererer med førstnevnte ved hybridisering med prøve-DNA.
Med den primer-utvidelsesmerkefremgangsmåte som er beskrevet i dette eksemplet er imidlertid rensing av merket fra umerket oligonukleotid ikke påkrevet. Dette er fordi den umerkede templat-oligonukleotidkomponenten av merkeblandingen beholder en molekyllengde som er utilstrekkelig for å opprettholde et stabilt dupleks under hybridiseringsbetingelsene, mens oligonukleotidet merket ved primer-utvidelsesreaksjonen er for-lengd t med fra 14 til 19 eller flere nukleotider. Denne forskjellen tillater de forlengede oligonukleotidene å smelte sammen med prøve-DNA under hybridiseringsreaksjonene:
Merking ved forlengelse av et forskjøvet par:
Sekvensene som ble benyttet var som følger:
For å fremstille en merket nonadecanukleotid-probe spesifikk for normalt 3-globingen anvendes sekvenspar 1 og 2 og for sigd 3-globinprobe anvendes sekvens 3 og 4 i et par.
En typisk reaksjonsblanding ble fremstilt som beskrevet nedenfor: For å fremstille en merket probe spesifikt for normalt gen, inneholdt reaksjonsblandingen:
1 yl - 400 ng/yl - oligonukleotid nr. 2
1 yl - 200 ng/yl - oligonukleotid nr. 1
85,8 pico mol - lyofilisert - a-<32>P-dATP
fra 26 yl (NEN)
3,3 picomol/yl
1 yl - 0,13 mM - dGTP
2 yl - 5 X tilfeldig primerbuffer (sammenset-ningen av den 5 X tilfeldige primerbuf-feren er som følger:
0,25 M tris-HCl (pH 8,1)
10 mM dithiothreitol
25 mM MgCl2
0,2 M KC1 )
1,0 yl - 20 y/yl revers transcriptase (Molecular Genetics Resources, Tampa, Florida, USA)
3,5 yl - deionisert vann.
Det totale reaksjonsvolumet var 10 yl. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 15°C i 90 minutter.
For det merkede sigd 3-globingenet ble i stedet for 2), sekvens 4), og i stedet for 1), sekvens 3), benyttet i reaksjonsblandingen. Forøvrig var betingelsene identiske.
Etter merkingsreaksjonen ble blandingen oppvarmet til 90°C for å stoppe reaksjonen. Dette trinnet ble funnet å være unødvendig.
Overskytende trifosfater kan også ødelegges ved inkubering med 50 enheter bakteriell alkalisk fosfatase eller kan fjernes ved passasje gjennom en siktekolonne, f.eks. "Sephadex G25".
Hybridisering:
Reaksjonsproduktene som viste ekvivalente egenskaper med hensyn på spesifikk hybridisering ble ført gjennom fremgangsmåten beskrevet nedenfor.
Restriksjbhsehz<y>mnedbr<y>tniri<g>av humant DNA
Humane genome DNA-prøver ble nedbrudt med Bam HI under
følgende betingelser: DNA ved 0,2 - 0,5 mg/ml, 100 mM NaCl,
10 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetanol,
Bam HI ved 1600 enheter/ml, 37°C, i 4-20 timer. Reaksjonene ble stoppet ved tilsats av 1/10 volumdeler av geloppløsning:
20% ficoll, 0,2% bromfenol-blått, 0,2% xylencyanol FF,
100 mM Na2EDTA.
Agarosgelelektroforese
Nedbrudte DNA-prøver ble plassert i vertikale 0,8% agarose-geler med målene 0,15 x 7,3 x 8,3 cm. Gelene ble anvendt i 40 mM tris-borat, pH 8, 4mM Na2EDTA, 0,25 ym/ml etidiumbromid vanligvis ved 80 V i ca. 1,5 timer eller inntil bromfenol-blått befant seg nær bunnen av gelen. Etter elektroforese,
ble gelene fotografert ved å benytte en UV-transilluminator, orange eller gule barrierefiltere og "Polaroid"-film.
Hybridisering til DNA i geler
Elektroforert DNA ble denaturert ved å neddykke geler i 10 min. i 0,5 M NaOH, 0,15 M NaCl. Etter korte rensinger i vann ble gelene nøytralisert ved neddykking i 0,5 M tris-HCl, pH 8,
0,15 M NaCl i 10 minutter. Gelene ble tørket på "Whatman 3MM"-papir i en "BioRad"-geltørker, oppvarmet til 60°C og deretter lagret i forseglede plastposer. Før hybridering ble gelene fjernet fra papiret ved å fukte dette med vann eller saltvannsoppløsning, deretter ble de plassert i forseglbare plastposer.
32
Hybridiseringsoppløsninger inneholdt typisk P-merket oligonukleotid i en konsentrasjon på ca. 20 ng/ml, 6 x NET (1 x NET er 150 mM NaCl, 30 mM tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Na2EDTA),
5 x Denhardfs oppløsning (1 x Denhardfs er 0,02% ficoll, 0,02% bovint serum albumin, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% Na-dodecylsulfat), 0,5% NP-40, 2 mM Na-pyrofosfat, 10% dekstran- sulfat, og ble benyttet ved 5 ml/gel. Hybridiseringen ble utført i plastposer ved 50°C i 2-20 timer.
Vask etter hybridisering
Etter at dét meste av hybridiseringen var pipettert fra en pose, ble gelen fjernet på en plate inneholdende ca. 500 ml av 6 x SSC (1 x SSC er 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3~citrat) på et isbad. Oppløsningen ble utvekslet etter minst 15 min. forsiktig risting, deretter ble det gjennomført en tredje kald 6 x SSC-vasking, gelen ble anbragt på et "Whatman No.l"-papir. En "stringensvasking" som tillot diskriminering av perfekte oligonukleotid-genome DNA-hybrider fra de som inneholdt et par eller flere mistilpassede baser, ble utført på en av to måter: 1) lgelen ble neddykket i 1-2 min. i ca.
1 liter av 6 x SSC ved 56 - 1°C; 2) gelen ble neddykket i
20 minutter ved 37°C i ca. 0,1 liter 3 M tetrametylammonium-klorid, 0,05 M tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM Na2EDTA, 0,1% Na-dodecylsulfat, deretter i 2 x 10 min. i den samme oppløs-ningen ved 56 - 1°C.
Autoradiografi
Etter en hvilken som helst av stringent-vaskene ble gelen anbragt på et papir nr. 1, deretter innpakket i plastfilm. Autoradiografi ble utført på "Kodak" XAR-5-film og mellom to intensiverende skjermer i et par timer til et par dager ved -70°C.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et oligonukleotid, karakterisert ved at den innbefatter hybridisering av a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært til det ønskede oligonukleotidet, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper relativt til den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosid-trifosfater, hvorved det kortere fragmentet vokser i en retning inntil det er i det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragmentet, denaturering av det hybridiserte materiale og separering av forlenget a) fra b).
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den organiske resten er et reaktivt sete og separasjonen bevirkes ved kontakt med et medium som reagerer med det reaktive setet.
3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2, karakterisert ved atb) bærer den organiske resten.
4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at den organiske resten er en hydroksyfenyl-rest, eller en polyacrylsyrerest.
5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at nukleosid-trif osf åtene innbefatter et merke.
6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at merket er et radioaktivt element.
7. Hybridisert materiale, karakterisert ved at det innbefatter b) et nukleinsyrefragment og a) et kortere oligonukleotid hybridisert dertil, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller dens fysikalske eller kjemiske egenskaper fra den andre av a) og b).
8. Hybridisert materiale, karakterisert ved at det innbefatter to korte fragmenter av nukleinsyre og en av de følgende strukturene:
hvori X:Y er T:A for sigdcelle-proben og A:T for den tilsvarende normale globingen-proben,b) hemoglobin C
hvori X:Y er A:T for Hb C-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben,c) 3° (B <39> ) thalassemia
hvori X er A for 3^-proben og G for den tilsvarende normale globingen-proben,d) (i) 3 <+> thalassemias
hvori X,Y og Z er G, G og T for den normale globingen-proben, A, G og T for IVS-l-thalassemia- proben, G, C og T for IVS-5-thalassemia-proben, og G, G og C for IVS-6-thalassemia-proben; N er det egnede komplementære nukleotidet,d) (ii) |3+ thalassemias
hvori X:Y er A:T for IVS-llO-thalassemia-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben,e) homozygotisk a-thalassemia
f) protease inhibitor (antitrypsin)-mangel
hvori X:Y er A:T for mangel (Z)-proben og G:C for den tilsvarende normale globingen-proben(M).
9. Analysesystem for deteksjon av en nukleinsyre i en biologisk prøve som inneholder et oligonukleotid, karakterisert ved at det fremstilles ved en fremgangsmåte som innbefatter hybridisering av a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært til det ønskede oligonukleotid, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosid-trifosfater, hvorved det kortere fragmentet vokser i en retning inntil det er i det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragmentet, denaturering av det hybr idiserte materialet og separering av forlenget a) fra b).
10. Anvendelse av et oligonukleotid i en nukleinsyre-hybridiseringsanalyse som fremstilles ved en fremgangsmåte som innbefatter hybridisering av a) et kortere fragment av det ønskede oligonukleotidet med b) et nukleinsyrefragment som er lengere enn a) og komplementært det ønskede oligonukleotidet, hvor en av a) og b) bærer en organisk rest som adskiller seg når det gjelder fysikalske egenskaper fra den andre av a) og b), det hybridiserte materialet bringes i kontakt med et enzym og nukleosidtrifosfater, hvorved det korte fragmentet gror i en retning inntil det er i det vesentlige koterminalt med det komplementære nukleinsyrefragment, denaturering av det hybridiserte materialet og separering av forlenget a) fra b) .
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/712,481 US4808520A (en) | 1985-03-15 | 1985-03-15 | Labelling of oligonucleotides |
US80887185A | 1985-12-18 | 1985-12-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO860710L true NO860710L (no) | 1986-09-16 |
Family
ID=27108843
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO860710A NO860710L (no) | 1985-03-15 | 1986-02-26 | Merking av oligonukleotider. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0194545B1 (no) |
AU (1) | AU592777B2 (no) |
CA (1) | CA1278755C (no) |
DE (1) | DE3667292D1 (no) |
DK (1) | DK119086A (no) |
ES (1) | ES8705920A1 (no) |
FI (1) | FI861039A (no) |
IL (1) | IL78123A (no) |
NO (1) | NO860710L (no) |
NZ (1) | NZ215453A (no) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5604099A (en) * | 1986-03-13 | 1997-02-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
US5273879A (en) * | 1987-07-23 | 1993-12-28 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
US4994368A (en) * | 1987-07-23 | 1991-02-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
CA1325761C (en) * | 1987-12-25 | 1994-01-04 | Takanori Oka | Method of detecting an intended nucleic acid in a sample |
US5047523A (en) * | 1988-08-02 | 1991-09-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea |
US4879214A (en) * | 1988-11-15 | 1989-11-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Differentiation of nucleic acid segments on the basis of nucleotide differences |
US5324829A (en) * | 1988-12-16 | 1994-06-28 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties |
GR1000347B (el) * | 1988-12-21 | 1992-06-25 | Ortho Diagnostic Systems Inc | Μεθοδος παραγωγης νουκλεοτιδικων ανιχνευτων χρησιμοποιωντας ενα συμπληρωμα γεφυρωσεως. |
JPH03123500A (ja) * | 1989-10-06 | 1991-05-27 | Canon Inc | 核酸の分別方法 |
US5612199A (en) * | 1991-10-11 | 1997-03-18 | Behringwerke Ag | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification |
ATE161586T1 (de) | 1991-10-11 | 1998-01-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung eines polynukleotids zum gebrauch in ''single-primer'' amplifizierung und phosphorothioat-enthaltende oligonukleotide als primer in nukleinsäureamplifizierung |
GB9201073D0 (en) * | 1992-01-18 | 1992-03-11 | Cytocell Ltd | Chromosome hybridisation methods |
CA2141450A1 (en) * | 1992-07-31 | 1994-02-17 | Maureen Laney | Method for introducing defined sequences at the 3' end of polynucleotides |
US6294323B1 (en) | 1993-04-14 | 2001-09-25 | Behringwerke Ag | Self initiating single primer amplification of nucleic acids |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1254525A (en) * | 1983-04-13 | 1989-05-23 | Christine L. Brakel | Kit for terminally chemically labeling dna |
DE3441369A1 (de) * | 1984-11-13 | 1986-05-22 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur herstellung von hydroxymethylen-alkoxyessigsaeureestern |
US4734363A (en) * | 1984-11-27 | 1988-03-29 | Molecular Diagnostics, Inc. | Large scale production of DNA probes |
CA1272443A (en) * | 1985-02-22 | 1990-08-07 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
DK171161B1 (da) * | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
-
1986
- 1986-02-03 CA CA000500968A patent/CA1278755C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-26 NO NO860710A patent/NO860710L/no unknown
- 1986-03-03 EP EP86102766A patent/EP0194545B1/en not_active Expired
- 1986-03-03 DE DE8686102766T patent/DE3667292D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-07 AU AU54431/86A patent/AU592777B2/en not_active Ceased
- 1986-03-12 NZ NZ215453A patent/NZ215453A/xx unknown
- 1986-03-12 IL IL78123A patent/IL78123A/xx unknown
- 1986-03-13 FI FI861039A patent/FI861039A/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-03-14 DK DK119086A patent/DK119086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-03-14 ES ES553034A patent/ES8705920A1/es not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU5443186A (en) | 1986-09-18 |
FI861039A0 (fi) | 1986-03-13 |
DK119086A (da) | 1986-09-16 |
EP0194545A3 (en) | 1988-01-13 |
AU592777B2 (en) | 1990-01-25 |
ES8705920A1 (es) | 1987-05-16 |
CA1278755C (en) | 1991-01-08 |
IL78123A (en) | 1990-02-09 |
DK119086D0 (da) | 1986-03-14 |
EP0194545B1 (en) | 1989-12-06 |
IL78123A0 (en) | 1986-07-31 |
FI861039A (fi) | 1986-09-16 |
EP0194545A2 (en) | 1986-09-17 |
ES553034A0 (es) | 1987-05-16 |
NZ215453A (en) | 1989-06-28 |
DE3667292D1 (de) | 1990-01-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5446137A (en) | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides | |
Gebeyehu et al. | Novel biotinylated nucleotide-analogs for labeling and colorimetric detection of DNA | |
NO860710L (no) | Merking av oligonukleotider. | |
US8003769B2 (en) | Dye-labeled ribonucleotide triphosphates | |
US5525494A (en) | Amplification processes | |
US5948648A (en) | Nucleotide compounds including a rigid linker | |
US6309836B1 (en) | Compounds for protecting hydroxyls and methods for their use | |
CA1338597C (en) | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides | |
US5430138A (en) | Hydroxyl-protecting groups attached to cytidine nucleotide compounds which are orthogonally removable | |
CA2774344C (en) | Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use | |
JP2511005B2 (ja) | インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬 | |
US4808520A (en) | Labelling of oligonucleotides | |
US5547860A (en) | Sulphocoumarin-containing nucleotides and their use in processes for detecting nucleic acids | |
EP1879906A2 (en) | Reversible nucleotide terminators and uses thereof | |
US20070292879A1 (en) | Terminal phosphate blocked nucleoside polyphosphates | |
US6107039A (en) | Assays using base protected table 1 | |
JPH0730108B2 (ja) | 修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法 | |
US6063571A (en) | Process for amplifying nucleic acids using DNA/PNA primers | |
CN116284185A (zh) | 核苷酸类似物及其在测序中的应用 | |
US5218102A (en) | Nucleic acid probe containing a terminal carbamyl linking non-radioactive labeling and preparating processes | |
EP0471338B1 (en) | Phenytoin derivatives | |
JPH01500353A (ja) | 2′‐デオキシアデノシン誘導体を含む核酸検出用プローブ | |
EP1546399B1 (en) | Terminal phosphate blocked nucleoside polyphosphates | |
IZUTA et al. | Synthetic Nucleosides and Nucleotides. XXVII. Selective Inhibition of Deoxyribonucleic Acid Polymerase α by 1-β-D-Arabinofuranosyl-5-styryluracil 5'-Triphosphates and Related Nucleotides: Influence of Hydrophobic and Steric Factors on the Inhibitory Action | |
Geiger et al. | A new approach for the efficient synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing the mutagenic DNA modification 7, 8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine at predefined positions |