NO840576L - Sensitive tester for ondartede sykdommer basert paa dna-paavisning - Google Patents
Sensitive tester for ondartede sykdommer basert paa dna-paavisningInfo
- Publication number
- NO840576L NO840576L NO840576A NO840576A NO840576L NO 840576 L NO840576 L NO 840576L NO 840576 A NO840576 A NO 840576A NO 840576 A NO840576 A NO 840576A NO 840576 L NO840576 L NO 840576L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- enzyme
- matrix
- labeled
- test
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 133
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 121
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 111
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 111
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 53
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 38
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 38
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 27
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N Phosphorus-32 Chemical compound [32P] OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N 0.000 claims description 3
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 3
- 229940097886 phosphorus 32 Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 29
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 222
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 95
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 56
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 50
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 35
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 10
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 9
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 7
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GDTWSDAEFQZUPS-UHFFFAOYSA-N 4-[[(3-aminonaphthalen-2-yl)amino]methyl]benzoic acid Chemical compound NC1=CC2=CC=CC=C2C=C1NCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 GDTWSDAEFQZUPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 Cyanogen Halides Chemical class 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- KHWTYGFHPHRQMP-UHFFFAOYSA-N (4-propan-2-ylcyclohexyl)methanol Chemical compound CC(C)C1CCC(CO)CC1 KHWTYGFHPHRQMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 HNLXNOZHXNSSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- AZUVBPVDRHGGEP-UHFFFAOYSA-N 6a,9a-dimethyl-4,5,7,8,9,9a-hexahydro-6aH-dipyrrolo(2,3-b;3',2',1'-hi)indole Natural products CC(=C)C1CCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CC1O AZUVBPVDRHGGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000499445 Maize chlorotic dwarf virus Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WSTYNZDAOAEEKG-UHFFFAOYSA-N Mayol Natural products CC1=C(O)C(=O)C=C2C(CCC3(C4CC(C(CC4(CCC33C)C)=O)C)C)(C)C3=CC=C21 WSTYNZDAOAEEKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000724220 Phage M13mp8 Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004800 psychological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- QZRSVBDWRWTHMT-UHFFFAOYSA-M silver;3-carboxy-3,5-dihydroxy-5-oxopentanoate Chemical compound [Ag+].OC(=O)CC(O)(C([O-])=O)CC(O)=O QZRSVBDWRWTHMT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medical Treatment And Welfare Office Work (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår forbedrede midler
for testing av humane og animale pasitenter med hensyn til nærvær av visse ondartede svulster. Nærmere bestemt er en utførelsesform beskrevet som muliggjør diagnose av flere typer av lymfoide ondartede sykdommer (leukemi).
Det er funnet at blodsera og andre kroppsvæsker oppsamlet fra mus eller menneskelige pasienter med visse ondartede sykdommer inneholder visse særpregede dobbelt-strengede DNA-molekyler som har evne til selektivt å inhibere visse medlemmer av gruppen av enzymer kjent som DNA-polymerisaser. Disse DNA-molekyler er fraværende i sera erholdt fra mus eller menneskelige pasienter som ikke har disse sykdommer. Denne oppdagelse på disse DNA-molekyler og tilknyttet informasjon er beskrevet i en serie av publika-sjoner. Se: Perisco and Gottlieb, DNA Polymerases of Myeloma, Nature New Biology 239:173-76 (1972); Gottlieb, Smith, Plescia, Perisco, and Nicholson, Inhibitor of DNA Polymerase, Nature 246:480-82 (1973); Gottlieb, Smith, Plescia, Nicholson, Bowers, Pankuch, and Berkoben, An Inhibitor of
DNA Polymerase, in Fundamental Aspects of Neoplasia, ch. 20, pp. 269-77 (1975); Gottlieb, Gottlieb, and Nicholson, Inhibition of DNA Polymerase by/ Sera, In Bibliotheca haematologica, No. 43 (Basel 1976); Brennessel, Buhrer, and Gottlieb, Use of Insoluble Heparin for Isolation of DNA Polymerase, Analytical Biochemistry 87: 411-17 (1978); Gottlieb, Chang, Buhrer, and Brennessel, Isolation from Murine Myeloma and Leukemia Cells of a Selective Inhibitor of DNA Polymerase, Cancer Research 40: 758-70 (1980). Disse DNA-molekyler er kollektivt referert til som "DNA-L".
DNA-L er en blanding av DNA-molekyler i 150 til 300 base par området. Enhver av disse DNA-molekyler kan selektivt inhibere R-l DAN polymerase. Oppfinneren har oppdelt disse DNA-molekyler i to grupper, DNA-1 og DNA-2, som kan separeres ved kromatografi. Lignende DNA-molekyler kan ekstraheres fra normal lever, men ikke fra normalt blodserum. Normalt blodserum mangler disse DNA-molekyler, og serum av pasienter med leukemi har disse DNA-molekyler. Alle av de foregående DNA-L-molekyler kan clones og anvendes i de her beskrevne testprosedyrer.
Det er to grupper av DNA-L-molekyler av prinsippiell interesse, som hver inneholder et begrenset men ubestemt antall av forskjellige molekyler. DNA-molekylene av prinsippiell interresse kan angis som "DNA-1" og "DNA-2". Det er antatt at disse DNA-molekyler kan spille en viktig rolle i replikasjonen av leukemiceller. DNA-1 og DNA-2 har viktige felles egenskaper.
Det er blitt demonstrert at både DNA-1 og DNA-2 utviser selektiv inhibering av R-l DNA polymeraseenzymet,
som finnes i muse myeloma og kan eksistere i andre tumorer og normalt vev. (Inhiberingen er "selektiv" idet at andre DNA-molekyler kan foreligge som vil vilkårlig inhibere dette og andre polymerase enzymer. DNA-molekylene av interesse inhiberer R-l DNA polymerase og inhiberer ikke andre kjente polymeraseenzymer). R-l DNA polymerase enzym kan gjenvinnes fra MOPC-21 muse myeloma tumor ved prosedyrer beskrevet i Analytic Biochemistry 87:411-17 (1978), supra. Det faktum at enzymet er av muse-opprinnelse er her uten betydning fordi det reagerer med de DNA-molekyler av interesse både fra humane og musekilder.
Foreliggende tester på leukemi slik som benmarg-tester, kan være uhensiktsmessige og traumatiske for pasienten. Deres sensitivitet er også begrenset til påvisning av nærvær av betydelig antall cancerceller, slik at et tidlig trinn av leukemi kan unngå påvisning. Prosedyrene ifølge oppfinnelsen innbefatter ikke produksjon av antistoff slik som arbeidet av Bogoch, Detection of Malignant Tumor Cells, U.S. Pat. No. 4 298 590 (Nov. 3, 1981). Slike besværlige og indirekte metoder for måling anvendes ikke her.
Testprosedyren ifølge oppfinnelsen bestemmer nærvær av DNA (heretter "cancer DNA") hvis nærvær i kroppsvæsker i rimelige mengder er forbundet med veksten av ondartede celler og hvis nærvær således indikerer nærvær i kroppen av ondartede celler. Ifølge testprosedyren bestemmes denne ved at et medium som muligens inneholder cancer DNA underkastes potensiell "konkurrerende binding", hvor konkurrenten (enkelte ganger angitt som "DNA sonde") er en kjent mengde av en slik cancer DNA. Det nedenfor beskrevne medium er blodserum, som oppfinnelsen foretrekker å anvende på grunn av at dette er hensiktsmessig og tilgjengelig, men andre media slik som ascites væske og lymfe inneholder også de her diskuterte cancer DNA og kan inneholde andre cancer DNA av lignende interesse. Cerebrospinalvæske, duodenalvæske, magevæske, pleuralvæske, urin, salvia, andre slimhinnesekreter og andre kroppsvæsker kan også inneholde lignende DNA.
I den her beskrevne test blandes det serum som skal testes med hensyn til et cancer DNA med en kjent mengde av "merket" cancer DNA (DNA sonde). Blandingen "introduseres" for hva som senere beskrives som en "enzym-konjugert matrise" som vil bindes til cancer DNA men som ikke vil bindes til andre typer av DNA som kan være tilstede, eller med andre tilstedeværende substanser. Deretter anvendes en testprosedyre for å bestemme hvor meget merket DNA (DNA sonde) som er tatt opp og bundet til den enzym-konjugerte matrise eller som er tilbake i residuet av testblandingen.
Når relativt lite merket DNA taes opp av den enzym-kon jugerte matrise, er årsaken at umerket lignende DNA fra testserumet konkurrerte med og utelukket det merkede DNA fra enzymsetene på den enzym-konjugerte matrise. Når relativt mer merket DNA taes opp av den enzym-konjugerte matrise er årsaken at umerket DNA lik det merkede DNA ikke var tilstede i testserumet til å konkurrere med og således utelukke det merkede DNA fra setene på den enzym-konjugerte matrise.
Et hovedbidrag med oppfinnelsen ligger i oppdagelsen av en sensitiv testprosedyresom muliggjør tidlig påvisning av leukemia eller tilbakefall, og som muliggjør påvisning av hvorvidt en remisjon har funnet sted. Det er antatt at disse teknikker er så følsomme at man kan påvise nærvær av så få som 250 ondartede celler i en mus, eller ved ekstrapolering på en blod- og kroppsvektbasis, ca. 750 000 ondartede celler i et menneske. Det sistnevnte tall må sees på bakgrunn av e 4,5 x lO<1>^ celler som ertilstede i en typisk human blod-strøm, slik at testen påviser ca. 15 deler pr. million. For tiden anvendte leukemitester er i motsetning til dette i stand til å påvise leukemi bare når så mange som ca. 10 000 000 ondartede celler, eller ca. 220 deler pr. million allerede er etablert i legemet.
Det er flere grunner til hvorfor en mere følsom test ønskes, som vil tillate tidligere påvisning av ondartede sykdommer slik som leukemi. For det første er det antatt at tidlig anvendelse av behandling ville forårsake mindre skade på pasientens kropp og muligens øke pasientens overlevelses-grad. En tidlig diagnose er imidlertid nødvendig før en slik terapi, som kan være svekkende, er indikert. For det andre er leukemia meget alarmerende sykdommer. Mononucleosis forveksles ofte med leukemi på grunn av lignende symptomer. Det er viktig raskt å fastslå en negativ diagnose for leukemi i tilfeller med mononucleosis, på grunn av de alvorlige psy-kologiske effekter på unge pasienter og deres foreldre ved en diagnose av mulig leukemi.
Metoden ifølge oppfinnelsen er også billig, mer hensiktsmessig, mindre traumatisk for pasienten, mer lett tilpasselig ved undersøkelser i stor skala, og mere praktisk i bruk ved hyppig testing av samme pasient, i forhold til eksisterende prosedyrer.
I denne beskrivelse innbefatter uttrykket "leukemi" ikke bare slike muse leukemier som MCDV 12 og L 1211, men også multiple myeloma og andre ondartede sykdommer på det humane eller animale lymfesystem. Følgelig må den etterfølgende beskrivelse og patentkrav leses i lys av detfi vanlige bruk av uttrykket "leukemi".
Testprosedyren ifølge oppfinnelsen er en ny og forbedret metode for testing av nærvær av ondartede sykdommer slik som leukemi, forbundet med bestemte DNA-molekyler. Når det gjelder leukemi er DNA-molekyler DNA-L. Oppfinneren antar at andre DNA-molekyler kan foreligge, på lignende måte tilknyttet andre ondartede sykdommer, og som er egnet for lignende testprosedyrer.
I. Fremstilling av testprøve
Det første trinn i den foreliggende leukemitest er
å ekstrahere en mengde av blod (eller annen kroppsvæske) fra testpersonen. fjerne celler ved sentrifugering for å fremstille serum (når det gjelder blod) og fremstille en testprøve fra dette. For å gjøre dette behandles kroppsvæskeprøven med 70 % ammoniumsulfat for å utfelle alt protein i prøven.
Bunnfallet kastes og supernatantvæsken beholdes. Den sistnevnte renses hovedsakelig ved sentrifugering og dialyse.
Den resulterende klare væske er "testprøven".
Eksempel 1 - Testprøve
0,5 ml blodserum ble erholdt fra en laboratoriemus. En mettet vandig løsning av (Nr^^SG^ ACS reagenskvalitet ble dråpevis tilsatt til prøven til en sluttkonsentrasjon på 70 %
(NI^^SO^ble oppnådd. Det resulterende proteinbunnfall ble fjernet ved sentrifugering ved 1700 g i 10 minutter og ble kastet. Ca. 1 ml klar supernatantvæske ble således fremstilt. Denne' ble dialysert i en 12 000 M.W. dialysesekk mot 0,01 M Tris.HCl buffer (pH 7,8) over natten ved 4° C. Dét materiale som var tilbake i dialysesekken (ca. 1 ml) er testprøven.
Tester kan utføres direkte på testprøven ifølge eksempel 1, men det betraktes som fordelaktig først å rense den ytterligere med en "rensematrise" som beskrevet i eksempel 8B.
II. Fremstilling av DNA- L
Oppfinneren har generelt beskrevet ekstraksjon av DNA-L i Cancer Research 40:758 (1980), supra. DNA-L er en blanding av DNA-molekyler. Det er mulig å anvende en DNA-L-blanding av DNA-1 og DNA-2 for å utfelle de her .beskrevne tester. Denne prosedyre krever anvendelse av et forbrukt utgjort av DNA-1 og DNA-2 i ukjente og variable proporsjoner. Oppfinneren har derfor utviklet en valgfri prosedyre for separering av DAN-1 og DNA-2 fra hverandre. Oppfinnelsen har også utviklet en prosedyre for å oppnå cloner av indivi-duelle DNA-molekyler innen DNA-L-gruppen.
Prosedyren for separering av DAN-1 og DAN-2 innbefatter at en human eller musetestprøve, fremstilt som tidligere beskrevet i eksempel 1 og tatt fra en person som er kjent for å ha leukemi eller myeloma, underkastes sekvenskromatogra-fi. Kromatograferingen utføres på en enzym-konjugert matrise. Dette er en matrise til hvilken et enzym kan bindes. Et eksempel er en agarose-basert, gellignende substans til hvilken et enzym kovalent kan bindes på en stabil måte, slik at dette er tilgjengelig for ytterligere bruk. Et annet eksempel er mikrokuler. Begge eksempler er beskrevet i det ettergølg-ende.
En generell prosedyre er foreslått for fremstilling av enzym-konjugerte matriser i Affinity Chromatography, Principles and Methods (Pharmacia). Den valgte harpiks må være én til hvilken enzymet av interesse vil bindes. Farma-siaproduktet CNBr-Sepharose, er blitt funnet å være egnet for R-l DNA polymerase, og oppfinneren har utviklet en prosedyre for fremstilling av en slik matrise. Man er ikke kjent med noen publisert eller på annen måte tidligere kjent prosedyre for fremstilling av en enzymkonjugert matrise hvori R-l DNA polymerase er bundet til matrisen.
Den etterfølgende prosedyre avviker fra den ovenfor angitte generelle prosedyre på flere viktige punkter. Oppfinneren har funnet at for å fremstille en Sepharose-gel enzym-konjugert matrise som er effektiv for anvendelse i de etter-følgende beskrevne prosedyrer og tester, dvs. for å oppnå reproduserbare og ensartede resultater, er det viktig eller kanskje til og med nødvendig å forbehandle den enzym-konjugerte matrise med bufferløsning inneholdende DNA, slik som alkali-denaturert laksesperm DNA (Millipore Corp.). Matrisen behandlet på denne måte vaskes med bufferløsning. Hvis denne forbehandlings prosess med DNA ikke utføres i den Sepharose-gel enzym-konjugerte matrise tilsynelatende ikke reagerer spesifikt med DNA-L slik at de ensartede testresultater oppnås. Det er antatt at DNA forbehandlingen binder og således eliminerer fra den prosedyre som følger, de bindingsseter på den enzym-konjugerte matrise som har en generell eller ikke-selektiv affinitet for DNA, i motstning til seter som har en selektiv affinitet for DNA-L. Det er antatt at anvendelse av en slik forbehandlingsprosedyre i forbindelse med slike matriser er ukjent innen teknikkens stand. Selv om nødvendigheten av dette trinn bare er blitt vist for enzymet konjugert til Sepharose, er det antatt at et slikt trinn vil være nødvendig eller vise seg å være ønskelig også for de enzym-konjugerte perler beskrevet i Eksempel 3A, og for andre enzym-konjugerte matriser.
Eksempel 2 - Fremstilling av renset blanding av DNA- 1 og DNA- 2
Et hensiktsmessig volum (2 ml) av testprøven ifølge Eksempel 1 ble fremstilt fra oppsamlet serum tatt fra inavls- mus som bærer myeloma MOPC-21. Dialysetrinnet angitt i slutten av Eksempel 1 ble etterfulgt av konsentrering mot 30 % polyethylenglycol i 0,01 M tris.HCl buffer (pH 7,8). Den resulterende løsning ble ytterligere renset ved kromatografi på DEAE-cellulose (Whatman) under anvendelse av en lineær KC1 gradient på 0 til 1,0 M i 0,01 M tris.HCl buffer (pH 7.8).
DNA elueres ved 0,45 M KCL, og de eluerte fraksjoner ble konsentrert ved dialyse mot polyethylenglycol.
Det resulterende DNA-preparat ble justert til 0,4 M
i natrium PO 4 buffer (pH 7,0) og ble varme-denaturert ved inkubering 16 minutter ved 68° C. Destillert vann ble tilsatt for å bringe fosfatkonsentrasjonen til 0,14 M, og blandingen ble anbragt på en 1 ml<1>s kolonne av hydroxylapatitt (DNA-kvalitet, Bio-Rad Labs) som var blitt ekvilibrert i 0,01 M natrium PO4buffer (pH 7,0), kokt i 5 minutter og opprett-holdt ved 68° C. Etter anbringelse av DNA-blandingen på kolonnen fikk kolonnen drenere ved hjelp av tyngdekraften,
og overskudd av væske ble kastet vekk. Deretter ble 6,0 ml 0,14 M natrium P04buffer (pH 7,0, 68° C) forsiktig lagt på kolonnen og drenert.
Den dobbel-strengede DNA av interesse ble deretter frigitt fra kolonnen ved forsiktig påføring av 8,0 ml 0,4 M natrium PO^buffer (pH 7,0). Det resulterende preparat av en renset blanding av dobbel-strenget DNA angis som "blandet DNA-L" eller "DNA-L blanding".
Eksempel 2A - lignende preparering ( MCDV- 12)
Prosedyren ifølge Eksempel 2 ble gjentatt med mus med leukemia MCDV-12.
Eksempel 2B - lignende prepararing ( L- 1211)
Prosedyren ifølge Eksempel 2 ble gjentatt med mus med leukemia L-1211.
Eksempel 2C - lignende preparering ( oppsamlet MOPC 21, MCDV- 12,
L- 1211
Prosedyren ifølge Eksempel 2 ble gjentatt med oppsamlet serum tatt fra mus med myeloma MOPC-21, leukemia MCDV-12 og leukemia L-1211, slik at hver leukemia er representert i DNA-L-blandingen.
Separeringen og den ytterligere rensing av DNA-1
og DNA-2 ble oppnådd ved fraksjonering av blandet DNA-L og en enzym-konjugert matrise. Dette er en uløselig Sepharose-matrise (Pharmacia) til hvilken R-l DNA polymerase er kovalent bundet. Den fremstilles på generell basis - noe variert for å oppfylle de bestemte behov for denne situasjon - ved den metode som er beskrevet i Affinity Chromatography — Principles and Methodes (Pharmacia), som er basert på den originale metode ifølge Axen, Porath og Ernback, Chemical Coupling of Peptides and Proteins to Polysaccharides by Means of Cyanogen Halides, Nature 214:1302-04 (1967). Andre uløse-lige matriser kan anvendes i stedet for affinitetsmatriser slik som Sepharose som beskrevet i det etterfølgende. Eksempelvis er det kjent å anvende glassperler, keramikk og silica for å tilveiebringe en bærer for enzymer i enzymatiske pro-sesser. Den enzym-konjugerte matrise må også være forbehandlet for å bindes spesifikt med DNA-L som beskrevet i det etterfølgende.
Eksempel 3 - Fremstilling av enzym- konjugert matrise
1 g CNBr-aktivert Sepharose 4 B (Pharmacia) ble svellet i 0,001 M HCl på et glassfilter og ble vasket i 15 minutter med 20 0 ml 0,0 01 M HCl. Den resulterende gel ble vasket med 0,1 M NaHC03(pH 8,3) og deretter med 0,1 M NaHC03(pH 8,3) inneholdende 0,5 M NaCl. Gelen ble deretter suspendert i 3,5 ml av den sistnevnte buffer. Deretter ble renset R-l DNA polymerase (inneholdende ca. 0,040 mg protein i 1,0 ml 0,28 M kalium P04buffer (pH 6,3) med 0,001 M DTT (dithiothreitol) og 20 % glycerol) tilsatt til geloppslemmingen, og blandingen ble ristet på en rister over natten ved 4° C.-Gelen ble deretter vasket to ganger med 0,1 M NaHC03inneholdende 0,5 M NaCl (pH 8,3) før blokkering av de gjenværende aktive grupper med 1 M Tris.HCl buffer (pH 8,0) i 2 timer ved romtemperatur. Tre yaskesykluser av gelen fulgte: Hver syklus besto av en vasking med 0,1 M acetatbuffer inneholdende 1 M NaCl (pH 4,0) og ble etterfulgt av vasking med 0,1 M boratbuffer inneholdende 1 M NaCl (pH 8,0).
Sepharose-gelen inneholdende R-l DNA polymerase, fremstilt på denne måte, ble deretter suspendert i 5 ml "buffer-A" (0,054 M Tris.HCl (pH 7,8), inneholdende 0,001 M 2-mercaptoethanol, 0,0001 M MnCl2, 0,04 M KCL). En 1 ml's minikolonne ble deretter støpt. Den enzym-konjugerte matrise er nå klar.for bruk. Den kan også lagres og forbli i god tilstand når den lagres ved 4° C i opp til 3 måneder. Dette produkt inneholder ca. 10 mikrogram enzym pr. ml. Resultatene kan imidlertid variere med hver sats, og en bestemmelse er nødvendig for å fastslå nøyaktig enzyminnhold.
Eksempel 4 - Fremstilling av poly- Bead enzym- konjugert matrise
En alternativ enzym-konjugert matrise er blitt utviklet av oppfinneren som kan være enklere å anvende og mer pålitelig når det gjelder resultater enn Sepharose-gelen.
Den er basert på Polybead mikropartikler (Polysciences Inc., Warrington, Pa.), med-carboxylgrupper på deres overflater. Disse perler er også angitt som "carboxylerte monodisperse mikrokuler".
Ca. 0,1 g Polybead mikropartikler ("perler") ble grundig vasket i kalium PO4buffer (pH 7,2 7,6). Ca 25 mikroliter av en konsentrert suspensjon av perler ble tilsatt til 75 mikroliter av den samme kalium PO^buffer sammen med 10 mikroliter av en 50 %-ig løsning (i vann) av l-ethyl-3-3-di-methylaminopropylcarbodiimid (ECDI). Blandingen ble incubert ved romtemperatur (2 4° C) i 30 minutter. Perlene ble deretter vasket to ganger med den samme kalium P04buffer og resuspendert i alikotter på 75 mikroliter av denne buffer inneholdende 4 % glycerol. Perlene ble satt til side og ble lagret i denne tilstand.
Ca. 75 mikroliter av det foregående lagrede perle-produkt ble anbragt i et testrør. Deretter ble 25 mikroliter renset R-l DNA polymerase, 0,5 til 1,0 mikrogram/mikroliter,
i PC>4/DTT/glycerol som beskrevet i Eksempel 3, tilsatt inntil blandingen nådde 100 mikroliter. Blandingen ble deretter incubert i 60 minutter ved 4° C.
10 mikroliter 0,2 M glycin (pH 7,6 - 8,0) eller 10 mikroliter av en løsning av okseserum albumin (20 mg/ml) ble deretter langsomt tilsatt til blandingen og incuberingen'ble utført i 30 minutter ved romtemperatur (2 4° C) med periodevis risting. Perlene ble deretter vasket to ganger med "lager- buffer" (0,05 M Tris pH 7,8; 0,004 M meta-mercaptoethanol; 0,04 M KC1 0,2 mg/ml okseserum albumin; 0,001 M MnCl220 % glycerol) og ble resuspendert i 50 mikroliter lagringsbuffer. De ble deretter satt til side til videre bruk. Før bruk av perlene i testprosedyren ble disse vasket med en 0,1 %-ig løsning av denaturert laksesperm DNA i lagringsbuffer, etterfulgt av skylling i lagringsbuffer. Produktet inneholder ca. 5,0 mikrogram enzym pr. ml, men en bestemmelse er nødvendig for å fastslå nøyaktig enzyminnhold.
Eksempel 5 - Forbehandling av kolonnen og separering av DNA- 1 og DNA- 2
Minikolonnen ifølge Eksempel 3 ble forbehandlet med 5 ml av et hensiktsmessig tilgjengelig ikke-humant, ikke-murint DNA, slik som alkali-denaturert laksesperm DAN (50 mikrogram/ml) som ble ført gjennom kolonnen ved 4° C. Kolonnen ble deretter vasket i rekkefølge med 10 ml Buffer-A, 10 ml Buffer-A pluss 0,5 M KC1, og 10 ml Buffer-A. Preparatet av blandet DNA-L ifølge Eksempel 2 (en renset blanding av DNA-1 og DNA-2) ble ført gjennom kolonnen og eluatet ble resirkulert gjennom kolonnen i løpet av en 20-minutters periode.
Kolonnen ble deretter drenert og vasket igjen med
5 ml Buffer-A (Eksempel 3) som ble etterfulgt av eluering av DNA-L blandingen méd 5 ml av en lineær gradient av KCl (0-1 M i Buffer-A). DNA-1 ble eluert ved 0,1 M KC1; DNA-2 ble eluert ved 0,22 M KCl. Etter fullførelse av gradienten ble kolonnen vasket med 5 ml Buffer-A inneholdende 1 M KCl.
(Kolonnen kan regenereres for ytterligere bruk ved vasking med 15 ml Buffer-A).
Av det opprinnelige innførte DNA gjenvinnes ca.
4,5 % som DNA-1 og 4,6 % som DNA-2.
Det er mulig å anvende en renset blanding av naturlig DNA-L ekstrahert fra en levende kilde for disse tester, men oppfinneren foretrekker å anvende et rent, clonet produkt. Dette er billigere og mer hensiktsmessig såsnart prosedyren er fastslått. Det er også antatt å være vitenskapelig mer forsvarlig da det eliminerer en mulig variabel faktor, dvs. nærværet av forurensende DNA-molekyler i DNA-L-preparatet, og det clonede DNA er nøyaktig det samme DNA i hver test som utføres.
Oppfinneren har derfor anvendt en cloningsprosedyre under anvendelse av pBR322 plasmid, som cloningsvektoren.
Det etterfølgende eksempel henviser til DNA-1, men prosedyren for cloning av DNA-2 eller en DNA-L-blanding er hovedsakelig identisk. Den generelle prosedyre anvendt her er basert på den metode som er beskrevet i Bahl, Marians, Wu, Stawinsky and Narang, A General Method For Inserting Specific DNA Sequences Into Cloning Vehicles, Gene 1: 81-92 (1976). Metoden anvender "kjeder" som er følsomme overfor begrensningsenzymet Barn I som beskrevet i Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs, and Itakura, Chemical Synthesis of Restriction Enzyme Recognition Sites Useful for Cloning, Science 196:177-80 (1977). Alternativt kan den cloningsmetode som anvender den enkel-strengede M13 faget som beskrevet av Sanger, Coulson, Barrell, Smith and Roe, J. Molecular Biology (1980) 143:161-178, anvendes.
Eksempel 6 - Cloning DNA- 1
Fosforyleringsbuffer (10X) ble fremstilt, bestående av 0,7 M Tris.HCl (pH 7,6) og 0,1 M MgCl2. 1 mikroliter av bufferen ble blandet med 0,5 mikroliter 0,01 M ATP, 5 mikroliter 0,01 M DTT, 1 mikroliter 4,5 mg/ml T4 Polynucleotide Kinase (New England Biolabs). Deretter ble 500 nmg Bam-kjeder, oppløst i 1 mikroliter vann, tilsatt. Ytterligere vann ble tilsatt for å bringe volumet opp til 10 mikroliter. Blandingen ble incubert i 1 time ved 37° C og ble deretter fryst ved -20° C for lagring. Denne blanding angis som "fosforylert Bam-kjeder" eller "PBM".
En blanding ble fremstilt inneholdende 10 enheter
T4 DNA Ligase (New England Biolabs) i 82 mikroliter 0,07 M Tris.HCl (pH 7,5), inneholdende 0,007 M MgCl2og 70 mikro M ATP. Til dette ble tilsatt 10 mikrogram av det merkede DNA-1 ifølge Eksempel 6 og 1,8 mikrogram PBM i 18 mikroliter vann. Den resulterende 10 0 mikroliters blanding ble incubert ved 15° C over natten og reaksjonen ble stoppet ved å bringe tem-peraturen på blandingen til 65° C i 10 minutter. Dette gir en blanding inneholdende DNA-kjeder molekyl.
Til blandingen ble deretter tilsatt 100 enheter Barn HI i 10 mikroliter vann og 12 mikroliter Bam 10X buffer (0,2
M Tris.HCl (pH 8,0), 0,0 7 M MgCl2, 0,02 M BME, 1 M NaCl)."
Blandingen ble incubert ved 37° C i 3 timer, og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 12 mikroliter 9,2 M Na2EDTA. Dette avskjærer PBM fra DNA-kjeder molekylet.
DNA-k j ede r-blan din gen ble i rekkefølge behandlet med fenol og ether for å ekstrahere DNA-kjederen fra denne. Volumet av ekstraktet ble redusert til 20 mikroliter ved å føre nitrogengass over dette.
Det konsentrerte ekstrakt ble ført over en 1 ml's kolonne av Sephadex G-50 (Pharmacia) ekvilibrert i 0,01 M Tris.HCl (pH 7,8) inneholdende 0,05 M NaCl. Én dråpes fraksjoner ble oppsamlet i mikrofugerør. Lokaliseringen av DNA-kjederen bestemmes ved påvisning av 32 Jrmerket, og volumet av løsningen inneholdende DNA-kjederen måles (ca. 0,1 ml). DNA-kjederen ble gjenvunnet ved tilsetning av 10 mikroliter
3 M Na acetat og 0,2 ml ethanol. Blandingen fikk stå ved
-2 0° C over natten.
Den utfelte DNA-kjeder ble deretter pelletisert ved sentrifugering og tørket i vakuum. Pelletsene ble oppløst i 30 mikroliter vann og ble lagret ved -20° C. 1 mikrogram (pBR322 (BRL Labs) ble behandlet med BAM I og bakteriell alkalisk fosfatase og anbragt i et voum på 5 mikroliter vann. Til dette ble tilsatt 2 mikroliter IOX Ligase-buffer (20 enheter T4 DNA Ligase i 2 mikroliter)'og 1 mikrogram DNA-kjederpellets i 2 mikroliter vann. Volumet ble justert il 20 mikroliter ved tilsetning av vann. Blandingen ble incubert ved 15° C over natten. DNA-kjederen var nå ombundet i pBR322 plasmid vektor og blandingen inneholder DNA-kjeder-pBR322 vektor.
HB101 E. coli ble deretter infisert med DNA-kjeder-pBR322 vektor. HB101 vertceller ble forbehandlet med avkjølt 0,1 M CaCl2og ble incubert ved 4° C i 15 minutter og ble gjenvunnet ved sentrifugering. Til 0,3 ml cellepellet ble tilsatt 10 0 mg av vektoren. E. coli/vektorblandingen ble deretter incubert på is i 10 minutter og ble deretter gitt et 30 sekunders varmesjokk ved 37° C. E. coli/vektoren ble deretter incubert på is i 90 minutter.
En "ML medium" blanding ble fremstilt fra 1 % Bactopeptone, 0,5 % gjærekstrakt og 0,5 % NaCl. Deretter ble 2 ml ML medium tilsatt til E. coli/vektor-blandingen og blandingen ble incubert ved 37° C i 60 minutter. Ampicillin ble tilsatt til blandingen til en konsentrasjon på 40 mikrogram/ml og incuberingen ble fortsatt ved 37° C i 30 minutter.
0,5 ml av blandingen ble plettert på ML medium inneholdende 50 mikrogram/ml Ampicillin.
En separat plate ble fremstilt under anvendelse av en 1:10 fortynning av blandingen. Platene ble inkubert over natten ved 37° C. Antallet kolonier ble tellet.
Replikasjonsplater ble deretter fremstilt på ampicillin og tetracyclin. E. coli koloniene av interesse er de som har mistet resistens overfor tetracyclin og bibe-holdt restistens overfor ampicillin. Ca. 5 til 10 kolonier overlever ut av de 300 som finnes på de opprinnelige ampicillin-holdige plater.
Hver E. coli koloni ble separat dyrket i 10 ml ML medium i 7 timer ved 37° C. Kloramfenicol ble deretter tilsatt til en konsentrasjon på 100 mikrogram/ml og inkuberingen ble fortsatt ved 37° C over natten. Løsningene ble oppsamlet og sentrifugert for å gjenvinne cellepelleten. Pelleten ble tatt opp i 9,7 ml STET-buffer (0,05 M Tris.HCl (pH 8,0) inneholdende 8 % sucrose, 5 % Triton-X-100, 0,5 M EDTA) til hvilken 50 mikroliter lysozym (10 mg/ml) ble tilsatt.
Blandingen ble umiddelbart sentrifugert ved 12 000 g i 10 minutter ved romtemperatur. Den resulterende super-natånt ble anbragt i mikrofugerør. Et likt volum (ca. 0,4 ml) isopropanol ble tilsatt, og blandingen fikk stå ved -20° C i 1 time og ble deretter sentrifugert.
Den resulterende DNA-pellet ble vasket med ethanol, ble resuspendert i 0,5 ml buffer (0,02 M Tris.HCl (pH 8,1) inneholdende 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl/ og ble behandlet med RNAse-A (millipore), RNAse Tl (Sigma) og Proteinase K (EM Biochemicals, Darmstadt) til sluttkonsentrasjoner på 100 mikrogram/ml, 25 U/ml og 0,025 mg/ml i 5 timer ved 37° C.
Blandingen ble deretter ekstrahert med 0,5 ml buffer-mettet fenol og ble ristet i 5 minutter og ekstrahert med 0,166 ml kloroform i 5 minutter. Den resulterende vandige fase ble ekstrahert med ether for å fjerne fenol og kloroform.
0,05 ml 3 M Na acetat ble tilsatt til den vandige fase, etterfulgt av 2 volumer kold ethanol. Blandingen fikk stå over natten ved -20° C.
Det utfelte DNA ble vasket med ethanol, ble vakuum-tørket og resuspendert i et egnet volum (ca. 100 ml) av 0,005 M Tris.HCl (pH 7,4) inneholdende 0,0001 M EDTA.
En prøve av dette DNA må deretter testes. Dets evne til å inhibere R-l DNA polymerase bekrefter dens identi-tet. DNA ble testet ved at den ble fjernet fra pBR 322 vektoren. Dette ble utført ved fremstilling og anvendelse av en "oppslutningsblanding". Oppslutningsblandingen var 100 mg/ml okseserum albumin; 0,02 M Tris.HCl (pH 7,0),
0,1 M NaCl, 0,007 M MgCl2og 0,002 M 2-mercaptoethanol. Til 0,1 ml oppslutningsblanding ble tilsatt 50 mikrogram pBR 322 DNA med innsetning og 50 enheter BAM HI. Blandingen ble incubert i 1 time ved 3 7° C.
Plasmid DNA insetningsformen ble deretter separert ved gel elektroforese. En 2 % agarosegel ble anvendt med en buffer av 0,08 M trizma base, 0,033 M Na acetat, 0,036 M NaCl og 0,0 04 M EDTA.
En alternativ cloningsmetode kan anvendes. En blanding av det dobbelt-strengede DNA eller "DNA-L-blanding" erholdt i eksempel 2 ble rekromatografert på DEAE-cellulose (Whatman) under anvendelse av en lineær KCL-gradient på 0 til 1,0 M i 0,01 M Tris HCl buffer (pH 7,8). DNA elueres ved 0,4 4 til 0,5 M og angis heretter som DEAE-II DNA. De eluerte fraksjoner inneholdende DEAE-II DNA ble konsentrert ved dialyse mot polyethylenglycol. Denne ytterligere rensing fjerner nedbrutt DNA og gir en mer ren, dobbelt-strenget, heterogen blanding av DNA-molekyler. Blandingen inneholder DNA-1 og DNA-2. Alternativt kan DNA-1 og DNA-2 fremstilles som beskrevet i eksempel 5. Cloning under anvendelse av bakteriofagen M13 mp8 kan utføres med en hvilken som helst av de tidligere angitte DNA-fraksjoner etter følgende prosedyre:
Eksempel 6A - Andre cloningsprosedyre .'
DEAE II DNA ble suspendert i 25 mikroliter av en løs-ning inneholdende 0,06 7 M Tris pH 8,0, 0,00 78 M MgCl2, 0,01 M 2-mercaptoethanol og 25 M dGTP, dCTP, dATP og dTTP.
Deretter ble 0,014 enhet/mg DNA av T4 DNA polymerase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) tilsatt og incuberingen ble utført ved 15° C i 2 timer. Dette er en modifikasjon av metodene ifølge Challberg og Englund beskrevet i Enzymology 65:39-43 (1980). Denne prosedyre tjener til å skape "stumpe ender" på DNA-molekylet.
2 mikrogram av den replikative DNA-form av fagen
M13 mp8 (New England Nuclear, Boston, Mass.) ble splittet med Smal begrensnings endonuclease (New England Biolabs, Beverly, Mass.) og utfelt med ethanol. Dette omdanner den sirkulære replikative form til et lineært DNA. Det således behandlede lineære DNA ble resuspendert i 25 mikroliter 0,01 M Tris pH 7,8, og 280 enheter bakterielt alkalisk fosfatase (Bethesda Research Laboratories) ble tilsatt. Blandingen ble incubert ved 6 5° C i 1 time, hvoretter løsningen i rekkefølge ble ekstrahert med fenol og ether.
En ombindingsblanding ble fremstilt inneholdende 0,3 til 10 nagogram av stumpavsluttet DNA, 10 nanogram M13 fage DNA, og 80 enheter T4 DNA ligase (New England Biolabs) i 0,05 M Tris, pH 7,8, 9,01 M MgCl2/0,02 M dithiothreitol, 0,001 M ATP: og 50 mikrogram/ml okseserum albumin (nuclease-fritt, Bethesda Research Laboratories)
i et 20 mikroliters volum. DNA ble ombundet i M13 fagen ved incubering av denne blanding over natten ved 15° C, og det lineære DNA ble resirkularisert.
Det er deretter nødvendig å anbringe det resirkulari-serte DNA nå inneholdende DNA som skal clones i en egnet vert hvori DNA kan replikere. Dette kalles transfeksjon og utføres ved en modifikasjon av teknikken ifølge Mandel and Higa (J. Molecular Biology 53:154 (1970). E. coli stamme JM103 dyrkes til log fase (A6 00, ca. 0,4) i 2x YT medium (16 mg/ml Baeto-Tryptone, 10 mg/ml gjærekstrakt, 10 mg/ml NaCl). 25 ml av kultur anbringes på is i 15 ' minutter, og cellene pelletiseres deretter ved sentrifugering og resuspenderes i 10 ml iskald 0,01 M NaCl. Etter dette pelletiseres cellene én gang til ved sentrifugering, Biolabs, Beverly, Mass.), 1 mikroliter buffer (0,07 M Tris HCl, pH 7,5, 0,0 7 M MgCl2/0,5 M NaCl) og 3 mikroliter H20. Denne blanding ble trukket inn i et kapillær-rør hvis begge ender ble varmeforseglet og ble deretter anbragt i et rør med vann (13 x 100 mm) ved 100° C i 5 minutter. Blandingen fikk forbli i røret med vann i 30 minutter mens det ble avkjølt til romtemperatur etter metoden ifølge Anderson, Gait, Mayol and Young beskrevet i Nucleic Acids Research 8:1731 (1980).
Innholdet i hvert av de foregående kapillarrør ble anbragt i et Eppendorf rør og kombinert med 1 mikroliter 0,1 M dithiothreitol, 2 mikroliter av en løsning av 0,0022 M av hver av de fire dNTP, og 1 enhet av Klenow fragmentet av DNA polymerase I (New England Biolabs) .
De DNA-holdige blandinger ble incubert i 20 minutter ved romtemperatur, ved hvilket tidspunkt følgende ble tilsatt: 0,5 mikroliter 1 mg/ml nuclease-fritt okseserum albumin (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, '.{ Md.) og 5 enheter hver av Eco RI (Miles Laboratories, Elkhart, 111.) og Bam HI (New EnglandBiolabs, Beverly, Mass.). Incuberingen ble fortsatt i 1 time ved 37° C.
Elektroforese av de således erholdte prøver ble ut-ført i 2 %-ig agarosegeler med en løpende buffer av 0,08 M Tris HCl pH 7,8, 0,03 M natriumacetat, 0,036 M natriumklorid, 0,004 M EDTA og 0,5 mikrogram/ml ethidiumbromid. Geler ble kjørt submerst i en minigel apparatur (C.B.S. Scientific, Del Mar, Cal.) ved en konstant strøm på 20 m.a. Vandringen av de respektive DNA kan måles ved observering av gelene under ultrafiolett lys ved et tidspunkt hvor den bromfenolblå sporfargen har vandret 3 eller 4 cm fra opprinnelig start.
Fage fra plater funnet å ha innsetninger og anvendelse for å fremstille 1 ml<1>s kulturer som ovenfor beskrevet for bedømmelse av 10 ml's alikotter fra 1 ml<1>s kulturer fryst ved -70° C kan anvendes i stedet for fage tatt direkte opp med tannpirker fra platene. Fage-kulturen ble tilsatt til 200 - 500 ml av en log fase kultur av E. coli JM 101 (A600, ca. 0,3) i 2x YT medium.
resuspenderes i 10 ml iskald 0,1 M CaCl2, og får stå på
is i 20 minutter. Cellene pelletiseres deretter og resuspenderes i 2 ml iskald 0,1 M CaC^ og incuberes på is i ytterligere 15 minutter. 0,3 ml celler tilsettes deretter til alikotter av det ombundne DNA og anbringes i et 37° C vannbad i 30 sekunder. Blandingen anbringes deretter på is i 90 minutter med leilighetsvis risting, og cellene pletteres deretter på et medium inneholdende isopropylthiogalactoside (IPTG) og dibrom-diklor-indoly^-glactoside (xgal) ved metoden ifølge Messing (methods in Enzymology, 1983). Etter incubering over natten ved 37° C utvelges klare plater for ytterligere bedømmelse.
Enkelstrenget fage DNA ble deretter erholdt under anvendelse av metodene beskrevet av Sanger, Coulson,Barrell, Smith and Rose i J. Molecular Biology 143:161
(1980) med enkelte modifikasjoner. Fageplater ble gjenvunnet med en tannpirker og anbragt i 1 ml<1>s kulturer av log fase JM103 céller (A650, ca. 0,3) i 2x YT medium i 17 x 100 mm's kulturrør. Rørene ble sentrifugert ved 300 omdreininger pr. minutt i 4 til 8 timer ved 37° C, med ventilerte propper for å tillate gjennomluftning. Innholdet i hvert rør ble overført til et 1,5 ml's Eppendorf-sentrifugerør og sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge. Supernatanten ble helt over i et andre Eppendorf-rør og 200 mikroliter 20 %-ig polyethylenglycol 6000 i 2,5 M NaCl ble tilsatt. Rørene ble deretter sentrifugert og incubert ved romtemperatur i minst 15 minutter i en Eppendorf-sentrifuge. Supernatantene ble fjernet så grundig;som mulig under anvendelse av pasteur-pipetter med uttrukne kapillære ender. Pelletene ble suspendert i 100 mikroliter 0,01 M tris (pH 7,8) inneholdende 0,0001 M EDTA, og ble ekstrahert med 50 mikroliter nøytralisert fenol. DNA ble ethanol-utfelt og brakt til et sluttvolum på 25 mikroliter. Ca. 5 mikrogram DNA ble gjenvunnet ved denne prosedyre. 5 mikroliter DNA-løsning (inneholdende ca. 1 mikrogram DNA) ble kombinert med 1 mikroliter av en 15 basepar dobbels trenget M13 primer (2,5 mikrogram/ml, New England Denne kultur ble ristet ved 37° C i 4 timer, koramfeni-col ble deretter tilsatt til 100 mikrogram/ml og incuberingen fortsatt i ytterligere 2-3 timer. Rensing av den replikative form ble utført ved metoden ifølge Holmes and Quiglye beskrevet i Analytical Biochemistry 114:193 (1981). Celler ble pelletisert ved sentrifugering og vasket med 0,01 M Tris, 0,002 M EDTA, ble deretter sentrifugert og resuspendert i 20 - 35 ml 8 % sucrose, 5 % Triton x 100, 0,05 M EDTA og 0,05 M Tris, pH 8,0 (STET buffer). 20 - 50 mikroliter av en 50 mg/ml lagerløsning av lysozyme (Worthington Biochemicals, Freehold, N.J.) ble tilsatt. Cellesuspensjonen ble bragt til kokning over en flamme, ble anbragt i et kokende vannbad i 4 0 sekunder og ble umiddelbart sentrifugert ved 12000 x G i 10 minutter. Supernatanten inneholdende den replikative DNA-form ble dekantert og DNA ble utfelt med isopropanol. Den replikative form ble ytterligere renset ved CsCl densitetsgradient sentrifugering ved anvendelse av ethidium bromid. Ethidium bromid ble fjernet fra DNA-løsningen ved to ekstraksjoner med CsCl mettet isopropanol. Prøvene ble deretter dialysert mot 0,01 M Tris, pH 7,8, 0,00 01 M EDTA og konsentrert mot 30 % polyethylenglycol i den samme buffer. Begrensningsenzymene, Barn'HI og Eco RI ble anvendt for å fjerne innsetninger, som ble separert fra vektor DNA på 2 % agarosegeler kjørt som beskrevet for den ovenfor angitte bedømmelsesprosedyre. Innsetningsbånd ble elektroeluert i trau kuttet i agarosen, under anvendelse av metoden ifølge Yang, Lis og Wu, Methods in Enzymology 68:176 (1979), ble ethanolutfelt og rekonstituert med en egnet buffer. Analytiske tester er blitt,utført på clonet DNA-L for å fastslå identiteten av DNA med større nøyaktighet. Del-sekvenser av tre DEAE-II DNA-molekyler, cihonet fra MOPC-21 tumorvev er angitt i det etterfølgende:
III. Merking av DNA
Etter cloning av DNA-1 kan det være ønskelig å "merke" dette for å lette verifisering av deler av clonings-prosedyren. Ennvidere krever den senere beskrevne testprosedyre anvendelse av "merket" DNA, dvs. DNA som er fysialsk eller kjemisk behandlet slik at det kan følges og måles gjennom de etterfølgende prosedyrer. Typisk anvendes et radioaktivt materiale for å merke molekyler for slike formål. Opp-32 3
finneren har funnet at fosfor 32 ( P) og tritium ( H) er
særlig anvendbare og effektive isotoper for merking av DNA-L. Det er også kjent i faget å anvende optisk aktive merker slik som farvestoffer eller fluorescente komplekser og å anvende radioopake midler for å medhjelpe til synliggjøringen av den således merkede substans. Det taes således i betraktning å innbefatte innen begrepet merking (som senere krevet) alle slike ekvivalente midler.
Ennvidere kan det merkede DNA anvendt for kokur-rende binding være et modifisert cancer DNA valgt på grunn av dets affinitet med enzymet til hvilket det naturlige cancer DNA i testen bindes; og i et slikt tilfelle kan det modifi-serte DNA anvendes isteden for naturlig avledet DNA som det DNA som i testen.
Et radioaktivt merke innføres i DNA-molekylet ved en enzymatisk prosess som beskrevet i det etterfølgende.
Det etterfølgende eksempel refererer til DNA-1, men prosedyren for DNA-2 eller clonet DNA fra DNA-1, DNA-2 eller DNA-L er hovedsakelig identisk. Uttrykket "DNAse I" anvendt i det etterfølgende, refererer til et materielt enzym som er i stand til å innføre enkel strengbrudd eller spalter i dobbelt-strengede DNA-molekyler. Det her anvendte DNAse I enzyn erholdes fra Millipore Corp., men det er også andre fabrikan-ter.
32
Eksempel 7 - Merking av DNA- 1 med P
En blanding inneholdende 5000 mikroCuries av et bærer-fritt radio-merket (32^) deoxynucleoside trifosfat (dCTP) merket i a-stilling ble fremstilt i 1,0 ml 0,01 MM Tris.HCl buffer (pH 7,4). Separate løsninger av hver av fire umerkede deoxynucleosid trifosfater (kjent innen faget som dCTP, dATP, dGTP og TTP) ble fremstilt, inneholdende 0,2 nano-mol/mikroliter og under anvendelse av samme buffer. En blanding ble deretter fremstilt inneholdende 20 mikroliter av det radio-merkede<32>P deoxynucleoside trifosfat, 10 mikroliter av hver av de umerkede deoxynucleocidtrifosfater dGTP, dATP, og TTP og 2 mikroliter umerket dCTP. Dette ble fulgt av 10 mikroliter 10x reaksjonsbuffer og 2 mikrogram av DNA-molekylet ifølge eksempel 6 i 2 mikroliter. Etter blanding ble destillert vann tilsatt for å bringe det totale volum til 97 mikroliter. Denne blanding angis som "merkeblanding".
"Aktiveringsbuffer" ble fremstilt ved å blande
10 ml Tris.HCl (pH 7,6), 0, 005 11 MgCl2og 1 mg/ml nuclease-fritt BSA. 9 mikroliter aktiveringsbuffer ble blandet med 1 mikroliter av en løsning inneholdende 100 mikrogram/ml DNAse I (ekvivalent med 0,1 mikrogram DNAse I), og blandingen fikk stå ved 4° C i 2 timer. Denne blanding angis som "aktivert DNAse I". 1 mikroliter aktivert DNAse I ble tilsatt til 97 mikroliter merkeblanding, og den resulterende blanding ble incubert i 10 minutter ved 15° C. Til blandingen ble deretter tilsatt to enheter E. Coli DNA polymerase I (1 enhet/ mikroliter) i 2 mikroliter kalium PO^(pH 7,0) buffer. Bufferen er 0,001 M i 2-mercaptoethanol og inneholder 50 % glycerol. Reaksjonen fikk fortsette i 1 time og ble stoppet ved tilsetning av 0,2 ml 0,3 M Na2EDTA (pH 8,0). DNA ble deretter fraskilt fra rest-nucleotidene ved kromatografi på en kolonne av Sephadex G-50 (fin kvalitet) (Pharmacia) på forhånd ekvilibrert i et egnet volum av 0,01 M Tris.HCl inneholdende 0,0001 M Na2EDTA (pH 8,0).
Eksempel 7A - Merking av DNA med fluorescent farvestoff
( Ethidiumbromid)
Til 1,0 nu 0,1 %-ig løsning ethidiumbromid ble tilsatt 1,0 ml løsning inneholdende 10 mikrogram DNA-L/ml. Blandingen ble underkastet gelfiltrering på en kolonne av Sephadex G-10 for å fjerne uomsatt ethidiumbromid. Det merkede DNA-L ble gjenvunnet i 0,01 M Tris.HCl inneholdende 0,0001 M Na2EDTA (pH 8,0) som angitt i slutten av eksempel 6.
Ethidiumbromidet føyes inn mellom strengene av den doble DNA-spiral. Det fjernes ved 518 nm og emiteres ved 610 nm.
Eksempel 7B - Merking av DNA ved fluorescent antistoffteknikk
En "pakk translasjons" teknikk lik den i eksempel 7 kan anvendes med biotinylert deoxyuridin trifosfat (dUTP).
En prosedyre er beskrevet i Garner, Non-radioactive DNA Laberling: Detection of Specific DNA og RNA Sequences on Nitrocellulose and in situ Hybridizations, Biotechniques 1:38-41 (1983) .
32
Det biotinylerte dUTP anvendes i stedet for P merket deoxynucleosid trifosfat ifølge eksempel 7, avsnitt 1. Således ble 100 n mol biotinylert deoxynucleosid trifosfat (dUTP) fremstilt i 2 mikroliter 0,01 M Tris (pH 7,4). Separate løsninger av ikke-biotinylert deoxynucleosid trifosfater (dAYP, dCTP, dAMP, TTP) ble fremstilt i samme bufferkonsen-trasjon slik at 2 mikroliter vil inneholde 50 n mol av hver av de ikke-biotinylerte deoxynucleosid trifosfater. En blanding ble deretter fremstilt inneholdende 2 mikroliter av biotinylert dUTP og 2 mikroliter av hver av de ikke-biotinylerte deoxynucleosid trifosfater. Dette ble fulgt av 10 mikroliter av 10x reaksjonsbuffer og 2 mikrogram av DNA ifølge eksempel 6 i 2 mikroliter. Etter blanding ble destillert vann tilsatt for å bringe det totale volum til 97 mikroliter. Denne blanding er angitt som "merkeblanding".
Prosedyren beskrevet i avsnitt 2 og 3 i eksempel 7 følges deretter.
Biotin■ påvises deretter på biotinylert DNA med et antistoff, spesifikt en IgG fraksjon av geite anti-biotin og et fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugert kanin anti-geite antistoff (Enzo Biochem Inc.). Geite anti-biotin bindes til biotin i DNA-molekylet, som deretter følges av binding av FITC kanin anti-geite antistoff til geit-anti-biotin. DNA
er tilnærmet lik i molekylvekt med immunoglobulin. Derfor reageres 1 mikrogram av biotinylert DNA med 1 mikrogram av IgG-fraksjonen av geite anti-biotin, etterfulgt av omsetning med 1 mikrogram FITC konjugert kanin anti-geite antistoff. Det hele kompleks av DNA og antistoffer anvendes i testen på samme måte som radio-merket DNA.
IV. Fremstilling av enzym- konjugert matrise og rensematrise for testene
Det kan være et utall enzymer i andre vev fra andre arter som er i stand til selektivt å inhiberes av DNA-L.
Selv om oppfinneren hittil bare har funnet ett som er effek-tivt i disse tester, er det antatt at "prøv og se" prosedyrer vil utvikle andre som er anvendbare i disse tester på basis av de her beskrevne teknikker, og disse betraktes som å falle inn under oppfinnelsens ramme. Det her anvendte enzym er
R-l DNA polymerase, ekstrahert fra muse myeloma tumor ved prosedyren beskrevet i Analytic Biochemistry 87:411 (1978), supra. Oppfinneren har testet R-l DNA polymerase med prøver av andre DNA som kan være tilstede i blod og andre kroppsvæsker, og funnet at ingen av disse DNA syntes spesifikt å inhibere (selektivt binde til) R-l DNA polymerase.
Eksempel 8 - Fremstilling av enzym- konjugert matrise for testene
Prosedyren beskrevet i eksempel 3 eller 4 ble utført, under anvendelse av samme CNBr-aktivert Sepharose eller Poly-Beads. Forbehandlingsprosedyren ifølge eksempel 5 utføres. Enzyminnholdet bestemmes ved prosedyren beskrevet i Gottlieb et al., Cancer Research 40:758-770 (1980), supra, og nedtegnes.
Det resulterende produkt er en R-l DNA polymerase enzym-konjugert matrise egnet for bruk i de her beskrevne tester. Den forblir stabil ved 4° C i minst 3 måneder. Den kan regenereres for gjentatt bruk med vasking med 1 M KCl, etterfulgt av prøvebuffer.
Serumprøver kan inneholde små mengder av "fremmed DNA", dvs. DNA som ikke er beslektet med DNA-L. Slikt fremmed DNA kan interferere med nøyaktigheten på testen ved å bindes til noe av R-l DNA polymerasen på den enzym-konjugerte matrise. Imidlertid vil slike fremmed DNA ikke være spesifikt for R-l DNA polymerase. Derfor kan de "renset opp" ved anvendelse av et fremmedenzym på en egnet matrise. Enzymet Reverse Transcriptase, som er avledet fra Rauscher Leukemia Virus, inhiberes ikke av DNA-1, DNA-2 eller DNA-L, men inhiberes av et vidt antall andre fremmed DNA. En metode for fremstilling av enzymet beskrevet i Ross, Scolnik, Todaro og Aaronson, Nature New Biology 23i: 163 - 170 (1071). Dette enzym kan anvendes for å fremstille en rensematrise for test-prøven, som beskrevet i det etterfølgende.
Eksempel 8A - Fremstilling av rensematrise for testene
Ca. 0,1 g Polybead mikrokuler ble vasket i kalium P04buffer (pH 7,2 - 7,6). Ca. 25 mikroliter av en konsentrert suspensjon av perler ble tilsatt til 75 mikroliter av den samme kalium P04buffer sammen med 10 mikroliter av en 1 gram/ml løsning av l-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodi- imid i f^O (ECDI) . Blandingen ble incubert ved romtemperatur (24° C) i 30 minutter. Perlene ble deretter vasket med det samme kalium P04buffer og resuspendert i alikotter på 75 mikroliter av denne buffer inneholdende 4 % glycerol. Perlene ble satt til side og lagret i denne tilstand.
Ca. 75 mikroliter av det foregående lagrede perle-produkt ble anbragt i et testrør. Renset Reverse Transcriptase (0,5 til 1,0 mikrogram/mikroliter) ble tilsatt inntil blandingen nådde 10 0 mikroliter. Blandingen ble deretter incubert i 30 minutter ved romtemperatur (2 4° C). 10 mikroliter 0,2 M glycin (pH 7,6 - 8,0) eller 10 mikroliter av en løsning av okseserum albumin (2 0 mg/ml) ble deretter langsomt tilsatt til blandingen og incuberingen ble fortsatt i 30 minutter ved romtemperatur (24° C), med periodevis risting. Perlene ble deretter vasket to ganger med "lagringsbuffer" (0,05 M Tris pH 7,8, 0,004 M Beta-mercaptoethanol, 0,04 M KCl 0,2 mg/ml okseserum Albumin, 0,0 001 M MnCl220 % glycerol) og ble resuspendert i 50 mikroliter lagringsbuffer. Det ble deretter satt til side inntil bruk. Før bruk ble perlene vasket i en 0,1 %-ig løsning av denaturert laksesperm DNA i lagringsbuffer, etterfulgt av skylling i lagringsbuffer. Dette produkt er "rensematrise".
Eksempel 8B - Anvendelse av rensematrise for å rense testprøven
Ca. 1 cm^ av testprøven ifølge eksempel 1 ble blandet med 10 mikroliter av rensematrise ifølge eksempel 8A. Blandingen ble grundig ristet og ble satt til side i 30 minutter ved romtemperatur (24° C). Den ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 1000 g.
Supernatanten er "renset testprøve". Perlene kan gjenvinnes og resirkuleres.
V. Testprosedyre
Som allerede angitt, påviser oppfinnelsen nærvær av cancer DNA (DNA hvis produksjon i rimelig mengde er forbundet med ondartet sykdom) ved hjelp av "komkurrerende binding". Merkede cancer DNA "konkurrerer" med (dvs. virker som en DNA sonde for) enhver cancer DNA som fremkommer i testpersonens blod (eller annen kroppsvæske) for bindingsseter på enzymet i den enzym-konjugerte matrise. Da den enzym-konjugerte matrise er blitt forbehandlet med annet DNA (slik som laksesperma DNA) er de bindingsseter på den enzym-konjugerte matrise som generelt har en affinitet for DNA (istedet for en selektiv affinitet for det cancer DNA av interesse, slik som DNA-L) allerede er bundet og innvirker således ikke med testprosedyren. Muligheten for at fremmed DNA er tilstede, som vil kunne interferere med testen fordi disse vil bindes til et hvilket som helst av et utall enzymseter, muligens innbefattende R-l DNA polymerase, unngås ved forbehandling av testprøven med en rensematrise. Mengden av merket cancer DNA som taes opp og bindes til den enzym-konjugerte matrise, er relatert til nærværet eller fravær av konkurrerende cancer DNA i pasientens blod (eller væske). Hvis ikke noe konkurrerende cancer DNA er tilstede, bindes en maksimal mengde av merket cancer DNA til den enzym-konjugerte matrise. Hvis imidlertid konkurrerende DNA er tilstede, bindes en mindre mengde av merket DNA til den enzym-konjugerte matrise. Mengden av merket DNA (DNA sonde) bundet til den enzym-konjugerte matrise under disse betingelser er således en indikator for nærvær av cancer DNA
i pasientens blod eller væske.
Testprosedyren innbefatter fremstilling av en test-prøve fra pasientens blod eller væske (eksempel 1); rensing av denne med rensematrise (eksempler 8A og 8B); blanding av merket DNA (eksempel 7), fortrinnsvis clonet (eksempel 6) heller enn naturlig, med den rensede testprøve; "introdusering" av testprøven inneholdende merket DNA ("DNA/prøveblan-ding") for en enzym-konjugert matrise (eksempel 8); og endelig bestemmelse av hvor meget merket DNA som er blitt bundet til den enzym-konjugert matrise.
For å "introdusere" DNA/prøveblåndingen for den enzym-konjugerte matrise, blandes en kjent mengde av DNA/ prøveblåndingen med buffer og en kjent mengde av forbehandlet enzym-konjugert matrise ifølge eksempel 8. Den sistnevnte inneholder en kjent mengde av enzym. Den resulterende blanding incuberes deretter i 15 minutter ved 25° C. Matrisen separeres deretter fra væskeresiduet av DNA/prøveblandingen og buffer ved sentrifugering. For å oppnå best mulige resultater skal de relative konsentrasjoner av merket DNA og enzym-konjugert matrise ha et forhold slik at ved forventede konsentrasjoner av de cancer DNA av interesse (som når det gjelder leucemica er DNA-L) i testprøven, det er en betydelig forskjell (f.eks. 10 % mot 90 %) mellom resultatene av en test på en normal blodprøve og en på en "ondartet" blodprøve. Dette resultat kan med fordel oppnås når: (1) mengden av DNA-L tilsatt til testprøven svakt overskrider mengden av enzym i den enzym-konjugerte matrise (uttrykt i molekyler), slik at det tilsatte DNA-L kan bindes til alle setene på enzymet og fremdeles etterlate et svakt overskudd av DNA-L; og (2) mengden av naturlig DNA-L tilstedeværende i testprøven, hvir pasienten har en ondartet sykdom, er minst flere ganger mengden av enzym (uttrykt i molekyler).
Oppfinneren antar at 1 molekyl DNA bindes til 1 molekyl enzym; at molekylvekten av DNA-L er tilnærmet lik 0,65 av molekylvekten av R-l DNA polymeraseenzym, slik at 0,65 nanogram av rent DNA-L og 1,0 nanogram av rent enzym hver representerer det samme antall molekyler (dvs. av DNA-L eller enzym); og at 0,65 nanogram av DNA-L bindes til 1,0 nanogram R-l DNA polymerase osv. Ennvidere er det antatt at molekylvekten av enzymet er ca. 200 000 og at molekylvekten av DNA-L er ca. 130 000. Eksemplene som følger er beskrevet med hensyn til renset DNA-L og preparater av R-l DNA polymeraseenzym renses hovedsakelig til homogenitet.
Det er minst to måter å teste opptav av merket DNA på. En metode er å teste den restvæske som er tilbake etter fjerning av den enzym-konjugerte matrise. Hvis x prosent av merket DNA-(DNA sonde) er tilbake i restvæsken, er 100-x prosent bundet til den enzym-konjugerte matrise. Den andre metode er å teste den enzym-konjugerte matrise ved å ekstrahere fra denne hovedsakelig alt av det bundne, merkede DNA og måle det sistnevnte. Ideelt sett er de to metoder komplemen-terende og summen av de to mengder av merket DNA (i restvæsken og i den enzym-konjugerte matrise) skal være lik mengden av merket DNA som tilsettes til testserumet.
Beklageligvis finner ikke dette sted på grunn av forsøksfeil. Den første metode, restvæske-bestemmelsesmetoden, er antatt å være mest nøyaktig. Den andre metode, matrisebestemmelsesmetoden, innbefatter tap i vaskinger, utilstrekkelig ekstraksjon etc. som er antatt å utgjøre 25 %. Dette overslag er basert på oppfinnerens tester under anvendelse av et testserum med 100 % merket DNA-L, hvor DNA-L var tilstede i overskudd i forhold til tilgjengelige seter, slik at ca. 50 % ville være i hver del, og hvor begge prøvemetoder ble utført og alt tap ble tilskrevet matrisebestemmslesmetoden.
Den foretrukne utførelsesform, i det minste for DNA-L og leukemia-testen er derfor restvæskebestemmelsesmeto-den heller enn matrisebestemmelsesmetoden, selv om den sistnevnte er en sjekk på den førstnevnte. Det kan også bemerkes at prosedyrene ved matrisebestemmelsesmetoden er mer besvær, lige og tidskrevende enn de ved restvæske-bestemmelsesmetoden.
De etterfølgende eksempler refererer alle til DNA-1. I alle henseender oppfinneren kjenner til gir DNA-2 identiske resultater med DNA-1, og det spiller ingen rolle hvem som anvendes, eller hvorvidt en blanding anvendes som inneholder DNA-1 og DNA-2. Heller ingen forskjell finnes mellom resultatene av tester lunder anvendelse av clonet DNA-L opprinnelig erholdt henholdsvis fra mennesker eller mus, selv om human og muse DNA-L ikke antas å være identiske. Det kan imidlertid være forskjeller i resultater som oppstår fra anvendelse av forskjellige clonede DNA-molekyler og sera fra forskjellige pasienter med forskjellig lymfoid cancer.
Eksempel 9 - Test av normal mus ( restvæske- bestemmelsesmetode)
1,0 cm 3 serum ble erholdt fra en laboratoriemus som ble antatt å være normal. Testprøve ble fremstilt i henhold til eksempel 1, og renset i henhold til eksempel 8A - 8B.
Til 0,5 cm 3av den rensede testprøve ble det tilsatt 0,5 cm^ av en vandig buffret blanding inneholdende den merkede DNA-1 løsning ifølge eksempel 7. DNA-løsningen inneholder 1,0 mikrogram/cm 3 av det rene, merkede, clonede DNA-1 ifølge eksempel 6, eller totalt 500 nanogram. Løsningene ble grundig blandet og den resulterendeDNA/prøveblanding var deretter klar for "introduksjon" for den enzym-konjugerte matrise.
0,5 ml av en suspensjon av prøvet og på forhånd behandlet enzym-konjugert matrise innbeholdende 650 nanogram R-l DNA polymeraseenzym ble tilsatt til DNA/prøveblandingen. Etter incubering ved 25° C i 15 minutter ble matrisen gjenvunnet ved sentrifugering og satt til side.
Restvæsken ble oppsamlet. Den ble testet med hensyn til merket DNA-1 ved væskescintillasjonsspektrometri. Det ble funnet at restvæsken inneholder 78 nanogram merket DNA-1. Dette er 16 % av den opprinnelige mengde i DNA/- bl åndingen.
Musen ble holdt i live i 30 dager og ble deretter avlivet, ved hvilket tidspunkt den ikke viste noe tegn på ondartet sykdom.
Eksempel 10 - Test av normale mus ( matrisebestemmelsesmetode)
Testen ifølge eksempel 9 ble gjentatt, men bestemmelsen ble utført på matrisen ved væskescintillasjonsspektro-me tri .
Det ble funnet at matrisen hadde bundet til seg 28 nanogram merket DNA-1. Dette er 56 % av den opprinnelige mengde i DNA/serum-blandingen.
Eksempel 1:1 - Test på mus med kjent leukemia
Prosedyren beskrevet i avsnitt 1 til og med 3 i eksempel 9 ble gjentatt med en laboratoriemus kjent for å ha multiple myeloma. Restvæske-bestemmelsesmetoden ble anvendt.
Det ble funnet at restvæsken inneholdt 410 nanogram merket DNA-1. Dette er 82 % av den opprinnelige mengde DNA/ prøveblåndingen. Forholdet mellom denneprosent og den ifølge eksempel 9 (normal mus) er ca. 5,1 til 1.
Musen ble avlivet. Undersøkelse ved autopsi fastslo typiske tegn på myeloma.
For å demonstrere følsomheten av testmetoden, for-bruk i tidlig påvisning av små kolonier av leukemiaceller, kan en fortynnet leukemiaprøve fremstilles. En renset test-prøve fra musen ifølge eksempel 11 ble derfor fortynnet med en renset testprøve fra d^n normale mus ifølge eksempel 9,
i forholdet 1:1000. Den tidligere testprosedyre ble variert for å kompensere for den mindre mengde av DNA-L som ble forventet å være tilstedeværende.
Eksempel 12 - Fortynningstest av mus med kjent leukemia
Testprosedyrene beskrevet i eksempel 9 ble fulgt
på den fortynnede rensede restprøve. Til 0,5 cm 3 av den fortynnede rensede testprøve ble tilsatt 0,5 cm 3 av en vandig buf f ret blanding inneholdende 1,0 nanogram/cm"^ av det rene, merkede, clonede DNA-1 ifølge eksempel 7, dvs. totalt 0,5 nanogram. På lignende måte ble 0,65 nanogram enzym anvendt. Anvendelse av restvæske-bestemmelsesmetoden indikerte at restvæsken inneholdt 0,4 nanogram merket DNA, hvilket er 80 % av den opprinnelige mengde.
Den samme test ble gjentatt med det ublandede "normale" testserum ifølge eksempel 9. Anvendelse av restvæske-bestemmelsesmetoden indikerte at restvæsken inneholdt 0,08 nanogram merket DAN-1, som er 16 % av den opprinnelige mengde. Forholdet mellom de to prosenter er 5 til 1. Eksempel 13 - Test av normal human person
1,0 cm 3 serum ble erholdt fra en human person som ble antatt å være normal. Testprøven ble fremstilt i henhold til eksempel 1 og renset i henhold til eksempel 8A - 8B.
Til 0,5 cm^ av den rensede testprøve ble det tilsatt 0,5 cm 3 av en vandig buffret blanding inneholdende clonet DEAE-II-løsning, merket i henhold til eksempel 7. DNA-løs-ningen inneholdt 1,0 mikrogram/cm 3 av det rene, merkede, clonede muse DNA-L ifølge eksempel 6A, eller totalt 500 nanogram. Løsningene ble grundig blandet og den resulterende DNA/ prøveblanding var deretter klar for "introdusering" for den enzym-konjugerte matrise.
0,5 ml av en suspensjon av forbehandlet og bestemt enzym-konjugert matrise inneholdende ca. 650 nanogram rent R-l DNA polymeraseenzym ble tilsatt til DNA/prøveblandingen. Etter incubering ved 25° C i 15 minutter ble matrisen gjenvunnet ved sentrifugering og satt til side for resirkulasjon.
Restvæsken ble oppsamlet. Den ble testet med hensyn til merket DNA-1 ved væskescintillasjonsspektrometri. Det ble funnet at restvæsken inneholdt 70 nanogram merket DNA. Dette er 14 % av den opprinnelige mengde i DNA/prøveblandingen.
Personen ble undersøkt seks måneder senere og viste ingen tegn på leukemia.
Eksempel 14 - Test av menneske med kjent leukemia
Prosedyren beskrevet i avsnitt 1 til og med 3 i eksempel 13 ble gjentatt med en human pasient som var kjent for å ha leukemia. Restvæske-bestemmelsesmetoden ble anvendt.
Det ble funnet at restvæsken inneholdt 4 30 nanogram merket DNA. Dette er 86 % av opprinnelige mengde i DNA/prøve-blandingen. Forholdet mellom denne prosent og prosenten fra eksempel 13 (normal human person) var ca. 6,1 til 1.
Undersøkelse ved en autopsi av pasienten fastslo typiske tegn på leukemia.
For å demonstrere følsomheten av testmetoden for anvendelse ved tidlig påvisning av små kolonier av leukemiaceller, kan en fortynnet leukemiaprøve fremstilles. En prøve av renset testserum fra den humane testperson beskrevet i eksempel 14 ble derfor forrynnet med en renset testprøve fra den normale humane testperson ifølge eksempel 13, i forholdet 1:1000. Den tidligere testprosedyre ble variert for å kompensere for den mindre mengde av DNA-L som ble forventet å være tilstedeværende.
Eksempel 15 - Fortynningstest på human testperson med kjent leukemia
Testprosedyrene ifølge eksempel 13 ble fulgt på denne resnede fortynnede testprøve. Til 0,5 <~m 3 av den rensede fortynnede testprøve ble tilsatt 0,5 cm<3>av en vandig buffret blanding inneholdende 1,0 nanogram/cm av det rensede, merkede, clonede DEAE-II DNA ifølge eksempel 6A, dvs. totalt 0,5 nanogram. På lignende måte ble 0,65 nanogram enzym anvendt. Anvendelse av restvæske-bestemmelsesmetoden indikerte at restvæsken inneholdt 0,42 nanogram merket DNA, som er 84 % av den opprinnelige mengde.
Den samme test ble gjentatt med ublandet "normalt" testserum ifølge eksempel 13. Anvendelse av restvæske-bestemmelsesmetoden indikerte at restvæsken inneholdt 0,0 9 nanogram merket DNA, som er 18 % av den opprinnelige mengde. Mengden av de to prosenter er 4,7 til 1.
VI. Utstyr og apparatur
For å lette bedømmelse og testing i stor skala som antas å være nødvendig for å tilfredsstille FDA-kravene (dvs. demonstrering av fravær av falske positive og negative effekter under "doble blind"-betingelser), og for å muliggjøre utførelse av testen av relativt utrenet laboratoriepersonell, er en modifisert prosedyre blitt utviklet som gjør bruk av testutstyr og en tilegnet testapparatur.
For det første anvendes en standardisert testprosedyre innbefattende forblandede reagenser, slik at testen lett kan utføres. Utstyrét består av på forhånd fremstilt, merket DNA-materiale, hvor merket er et fluorescent farvestoff (innbefattende fluorescente kompleksdannende midler); på forhånd fremstilt enzym-konjugert matrise, og på forhånd fremstilt "renset matrise". For det andre anvendes en tilegnet fluorescens målingsanordning som er spesielt tilpasset og kalibrert for leukemia testprosedyren. Denne prosedyre kan muligens ikke så være så nøyaktig som den ovenfor beskrevne radio-bestemmelsesprosedyre, men er meget enklere og meget billigere. (Radioaktiv merking kan anvendes i stedet, men radiobestemmelsesapparaturen er meget mer kostbar enn den senere beskrevne fluorescens bestemmelsesapparatur).
A. Fremstilling og anventdelse av utstyr
r Eksempel 16 - DNA for utstyr
Rent, clonet DEAE-II DNA ble fremstilt fra DNA-L eholdt fra serumet fra en pasient som hadde dødd av leukemia. Metoden ifølge eksempel 6A ble anvendt.
Følgende ble blandet i 1,0 cm<3>0,005 M Tris.HCl buffer (pH 7,4): 0,5 mg av DNA fra det foregående avsnitt, merket med en fluorescent merke i henhold til eksempel 7A.
(Radioaktiv merking, f.eks. med 32 P eller<3>H er alternativt hensiktsmessig som ovenfor angitt. Prosedyren ifølge eksempel 7.B kan også anvendes.) Etter blanding ble saltvannsløsning, USP (slik som fra Baxter Laboratories) tilsatt for å bringe det totale volum til 5 00 cm<3>.
I hver av ca. 1000 1,0 cm 3 ampuller ble pipettert 0,5 cm<3>(5 00 nanogram av merket DNA) av blandingen fra det foregående avsnitt. Ampullene ("DNA-ampuller") ble forseglet og anbragt i et kjøleskap for lagring ved ca. 5° C.
Innholdet i en DNA-ampulle ble helt over i en 100 ml's målekolbe. Saltvannsløsning ble tilsatt for å bringe volumet til 50 ml. I hver av ca. 100 1 cm<3>'s ampuller ble pipettert 0,5 ml (5 nanogram DNA) av den fortynnede DNA løsning. Ampullene ("1:100 DNA ampuller") ble forseglet og bragt i et kjøleskap for lagring ved rundt 5° C.
Eksempe'. 17A - Enzym- kon jugert matrise for utstyr
Ca. 10 g av Polygead microparticlene ("perler") ifølge eksempel 4 ble vasket i kalium P04buffer (pH 7,4).
Ca. 250 ml av en konsentrert suspensjon av perler ble tilsatt til 750 ml av den samme P04buffer sammen med 10 0 ml ECDI
(1 g/ml vann). Blandingen ble incubert ved romtemperatur i
1 time. Perlene ble deretter vasket med den samme buffer og suspendert i buffer inneholdende 4 % glycerol.
Ca. 75 0 ml av perleproduktet ble anbragt i et beger-glass. Renset R-l DNA pcbymerase, som beskrevet i eksempel 3, kjent ved bestemmelse å inneholde ca. 8 mikrogram/ml enzym, ble tilsatt inntil blandingen nådde ca. 1,0 liter. Blandingen ble incubert i ca. 1 time ved 4° C. Perlene inneholdt nå totalt ca. 2 mg R-l DNA polymeraseenzym.
100 ml 0,2 M glycin (pH 7,6 - 8,0) eller 100 ml av en løsning av okseserum albumin (2 0 mg/ml) ble deretter langsomt tilsatt til blandingen og incuberingen ble utført i 30 minutter ved romtemperatur (24° C), med periodevis risting. Perlene ble deretter vasket to ganger med "lagringsouffer"
(0,05 M Tris pH 7,8; 0,0004 M beta-mercaptoethanol;
0,04 M KCl 0,2 mg/ml okseserum albumin; 0,0001 M MnCl220 % glycerol), og ble resuspendert i 50 ml lagringsbuffer. Blandingen ble bestemt med hensyn til enzym innhold ifølge metoden beskrevet i Cancer Research 40:758-70, supra. Enzyminnholdet i 0,5 ml av blandingen overskred ubetydelig 650 nanogram. Tilstrekkelig av perleproduktet fra avsnitt 1 i dette eksempel ble tilsatt til den prøvede blanding for å redusere enzyminnholdet av 0,5 ml av blandingen til 650 nanogram.
Til den foregående blanding ble tilsatt 5 cm 3 av
1 mg/ml alkali-denaturert laskesperma DNA (Millipore Corp.) under omrøring ved 4° C. Blandingen ble omrørt langsomt ved 4° C i 30 minutter. Materialet ble deretter vasket i lagringsbuffer og ble lagret i et egnet volum av lagringsbuffer for å bringe volumet til 1,5 liter.
I hver av ca. 3000 1, 0 cm-3' s ampuller ble anbragt
5 50,5 cm<J>av det foregående (650 nanogram enzym). Ampullene ("matriseampuller") ble forseglet og anbragt i et kjøleskap
for lagring ved ca. 5° C.
Innholdet av en matriseampulle ble helt over i en
100 ml's målekolbe. Saltløsning ble tilsatt for å bringe volumet til 50 ml. I hver av ca. 100 1 cm<3>' ampuller ble pipettert 0,5 ml av den fortynnede løsning. Ampullene
("1:100 matriseampuller") ble forseglet og anbragt i et kjøle-skap for lagring ved ca. 5° C.
Eksempel I. 17B - Rensematrise for utstyr
Ca. 10 g av Polybead mikropartiklene ("perler") ifølge eksempel 3A ble vasket i kalium PO4buffer (pH 7,4).
Ca. 250 ml av en konsentrert suspensjon av perler ble tilsatt til 750 ml av den samme P04buffer sammen med 100 ml ECDI
(1 g/ml vann). Blandingen ble incubert ved romtemperatur i 1 time. Perlene ble deretter vasket med den samme buffer og resuspendert i buffer inneholdende 4 % glycerol.
Ca. 75 0 ml av perleproduktet ble anbragt i et beger-glass. Ca. 25 mg av renset Reverse Transcriptase i 25 0 ml vann, som beskrevet i eksempel 8A, ble tilsatt inntil blandingen nådde ca. 1,0 liter. Blandingen ble incubert i ca. 1 time ved 4° C.
100 ml av 0,2 M glycin (pH 7,6 - 8,0) eller 100 ml
av en løsning av okseserum albumin (2 0 mg/ml) ble deretter langsomt tilsatt til blandingen og incuberingen ble utført i 30 minutter ved romtemperatur (24° C), med periodevis risting. Perlene ble deretter vasket to gangerumed "lagringsbuffer"
(0,05 M Tris pH 7,8, 0,0004 M beta-mercaptoethanol, 0,04 M
KCl 0,2 mg/ml okse serum albumin, 0,0001 M MnCl220 % glycerol), og ble resuspendert i 50 ml lagringsbuffer.
Til den foregående blanding ble tilsatt 5 cm 1 mg/ ml alkali-denaturert laksesperma DNA (Millipore Corp.) under omrøring ved 4° C. Blandingen ble omrørt langsomtved 4° C i 30 minutter. Materialet ble deretter vasket i lagringsbuffer og ble lagret i et egnet volum av lagringsbuffer for å bringe volumet til ca. 1,5 liter.
I hver av ca. 30 00 1,0 cm<3>ampuller ble anbragt 0,5 cm av det foregående. Ampullene ("matriseampuller") ble forseglet og anbragt i et kjøleskap for lagring ved ca. 5° C.
Eksempel 18 - Bruk av utstyr
En testprøve ble fremstilt i henhold til eksempel 1.
I en 2 cm 3 ampulle ("testampulle") ble anbragt 0,5 cm<3>av testprøven. Deretter ble en rensematriseampulle ifølge eksempel 17B åpnet og helt over i den samme 2 cm 3 testampulle. Blandingen ble grundig ristet i 15 minutter ved 25°C (romtemperatur). Testampullen ble sentrifugert (1000 g) for å separere perlene og en supernantantvaeske. (Perlene ble gjenvunnet og resirkulert). Supernantanten ble gjenvunnet og bragt i den samme eller en annen 2 cm 3 testampulle. En
DNA-ampulle ifølge eksempel 16 ble åpnet og tilsatt til supernantanten i den 2 cm 3 testampulle. De to løsninger ble grundig blandet ved kraftig risting.
En matriseampulle ifølge eksempel 17A ble åpnet og helt over i den 2 cm 3 testampulle. Løsningene ble grundig blandet ved kraftig risting. Testampullen ble satt til side i 15 minutter ved romtemperatur (25°C).
Testampullen ble underkastet sentrifugering (1000 g) for å separere perlene og en supernantantvæske. (Perlene ble gjenvunnet og satt til side for resirkulering). 1 cm<3>av supernantanten ble anbragt i en 1 cm 3 ampulle ("bestemmelsesampulle") for bestemmelse som beskrives i det etterfølgende.
B. Apparatur
Bestemmelsen ble utført på en tilegnet apparatur som måler fluorescensen av supernantantvæsken ifølge eksempel 18. Apparaturen er vist i Fig. 1, i en perspektivtegning hvor enkelte deler er tatt bort, sett fra et punkt ubetydelig over testampullen og et stykke bort fra denne lateralt. Rammen av apparaturen er en treboks B, hvor bare den øvre overflate av gulv 2 og den indre overflate av vegger 4 og 6 av boks B er vist i Fig. 1. Veggene 4 og 6 er de lengst bort fra observatøren, idet de nærmere vegger or tatt bort og ikke vist i Fig. 1. Et fjernbart lokk 8 dekker boksen når testen utføres. De indre overflater av boksen og lokket er malt mørkt sort.
Et vertikalt hull 10 er lokalisert i lokk 8 hvor diameteren av hull 10 er ubetydelig større enn diameteren av bestemmelsesampulle 12 ifølge eksempel 18. Bestemmelsesampulle 12 inneholder testprøve-supernantantvæsken 14 ifølge eksempel 18, som er en væske inneholdende DNA-L merket med et fluorescentfarvestoff. Et grunt hull eller fordypning 16 er lokalisert i gulv 2 direkte under hull 10, slik at bunnen av bestemmelsesampullene 12 anbragt i hull 10 vil hvile sikkert på et på forhånd bestemt sted på gulv 2.
Et hull 18 er lokalisert i vegg 4 i tilnærmet samme avstand fra vegg 6 som hullene 10 og 12. En ultrafiolett lyskilde (ikke vist) skinner gjennom hull 18. Den ultrafiolette kilde kan med fordel være en 4 v/atts ultrafiolett lampe, med maksimal emisjon ved 360 nm (General Electric NF4T4/BL). Den kan ha et filter mellom den ultrafiolette kilde og bestemmelsesampullen 12 for å eliminere fremmed frekvens.
Et hull 20 er lokalisert i vegg 6, tilnærmet ved samme avstand fra vegg 4 som hull 10 og 16. En fotopåvisningsanordning 20A (ikke vist i Fig. 1) er lokalisert bak hull 20. Fotopåvisningsanordningen 20A kan være en hvilken som helst egnet optisk føleanordning. For eksempel kan den med fordel være et fotomultiplikatorrør (f.eks. et Hamamatsu 1P4 Photomultiplier Tube). Den kan også ha et filter (ikke vist) mellom anordningen 20A og bestemmelsesampulle 12.
For å anvende apparaturen anbringes en bestemmelsesampulle 12 ifølge eksempel 18 gjennom hull 10, og som hviler i hull 16. Den ultrafiolette kilde aktiveres (kraftkilde og bryter ikke vist) og ultrafiolett lysstråle U passerer gjennom væske 14 i bestemmelsesampulle 12. Det ultrafiolette lys bevirker at farvestoffet fluorescerer og sender ut synlig lys i alle retninger. En slik retning er den av den fluorescente lysbane F, som står i rett vinkel til den ultrafiolette stråle U og som er hovedsakelig fri for stråling fra den ultrafiolette kilde. Intensiteten av fluorescent lys F måles av fotopåvisningsanordning 20A, og utgangssignalet fra anordning 20A er hovedsakelig upåvirket av ultrafiolett stråle U.
Utgangssignalet fra anordning 20A bearbeides og indikeres av anordningene vist i Fig. 2. Kretsen forsterker og kalibrerer utgangssignalet slik at det fordelaktig kan vises på en kommersielt tilgjengelig tre-siffers digital-voltmeterindikator ("DVM") som avleser fra 000 til 999 .. Hvis således utgangssignalet fra anordning 20A betegnes x, kan utgangssignalet av kretsen betegnes som y=ax+b, hvor y er avlesningen på DVM-indikatoren og a og b er konstanter valgt til å gjøre y = ca. 200 når ca. 20% av DNA-L merket med fluorescentfarvestoff er tilstede i restvæsken ifølge eksempel 13, og for å gjøre y = ca. 700 når ca. 70% av DNA-L merket med fluorescentfarvestoff er tilstede i restvæsken ifølge eksempler 14 og 15. (Disse avlesninger tilsvarer henholdsvis "ingen ondartethet" og "tilsynelatende ondartethet").
Som vist i Fig. 2 føres utgangssignalet fra fotopåvisningsanordning 20A til en forforsterker 22. Forfor-sterkeren kan med fordel være en hvilken som helst av et stort antall kommersielt tilgjengelige operasjonsforsterker-brikker, fortrinnsvis en "dual op-amp-brikke" slik som ICL 7611 eller ICL 7621. Justering av R&, potensiometer 24, regulerer forsterkning og således konstant a i ligningen y=ax+b. (Utgangssignalet fra forforsterker 22 er R /R ganger inngangssignalet). Utgangssignalet fra forforsterker 22 føres til adderer 26. Utgangssignalet fra R^, potensiometer 28, føres også til adderer 26 som summerer de to inngangs-signaler. Justering av R^regulerer konstant b i ligningen y=ax+b. Addereren kan være en operasjonsforsterker eller differensialforsterkerbrikke, fortrinnsvis en andre op-amp på en dualbrikke slik som ICL 7621 (f.eks. Radio Shack nr. RS 276-2331).
Utgangssignalet fra adderer 26 representerer faktoren y i ligningen y=ax+b. Dette føres til en DVM-anordning 30, bestående av en analog-til-digitalomdanner, forsterker, og en digitalindikator. En slik anordning kan være dannet fra halvlederanordninger slik som Teledyne Semiconductor chip 7107 og tre LED eller LCD indikatorbrikker (slik som Radio Shack nr. RS 272-053 eller Radio Shack nr. RS 276-075).
En kommersiell DVM inneholdende forsterker, analog-til-digitalomdanner, indikator, batteri etc. kan ellers med fordel anvendes. En typisk slik anordning er Fluke DVM modell 8022B,' en annen er Radio Shack nr. RS 22-191.
Det foregående system vil automatisk gi en numerisk avlesning som indikerer den tilnærmede prosent av merket DNA-L i restvæsken, når systemet anvendes i forbindelse med utstyr ifølge eksempel 16-18. Systemet angis her som "DNA-L apparatur".
Det er nødvendig å kalibrere DNA-L apparaturen fra
tid til annen, blant annet på grunn av at forskjellige preparater av satser av reaktanter har forskjellige enzymatisk- eller farveaktivitet.
Eksempel 19 - Kalibrering av DNA- L apparatur
3 3
En 1,0 cm DNA ampulle (50 0 ng DNA i 0,5 cm ) ifølge eksempel 16 ble merket "ampulle A" og ble åpnet. En femte-del av innholdet (100 ng av DNA i 0,1 cm 3) av ampulle A ble pipettert inn i en annen 1,0 cm<3>ampulle, som ble merket "ampulle D". Saltløsning ble tilsatt til hver ampulle for å bringe volumet opp til 1,0 cm 3. Fra ampulle A ble 0,125 cm 3 pipettert opp og kastet. Saltløsning ble tilsatt til ampulle A for å bringe volumet opp til 1,0 cm 3. Ampulle A inneholder nå 350 ng DNA i 1,0 cm 3; ampulle B inneholder
3
nå 100 ng DNA i 1,0 cm .
Ampulle A ble anbragt gjennom hull 10 og 16 i DNA-L a<p>paraturen. Potensiometrene R&og ble innstilt på deres midtpunkter. Effekt ble tilkoblet apparatet, innbefattende den ultrafiolette kilde.
Hvis indikatoren avleser mer eller mindre enn 700 justeres R clinntil avlesningen er tilnærmet halvparten mellom den tidligere avlesning og 700. Effekten fjernes, ampulle A fjernes og ampulle B innsettes isteden.
Effekt tilkobles apparaturen. Hvis indikatoren avleser mer eller mindre enn 200, justeres R^inntil avlesningen er tilnærmet halvparten mellom den tidligere avlesning og 200. Effekten fjernes, ampulle B fjernes og ampulle A innsettes. Prosedyrene beskrevet i de foregående to avsnitt gjentas
inntil de respektive avlesninger er 700 og 200.
Eksempel 20 - Anvendelse av DNA- L apparaturen
1,0 cm<3>bestemmelsesampulle ifølge eksempel 18 ble anbragt i den kalibrerte DNA-L apparatur. Effekt ble tilkoblet og DVM-avlesningen ble nedtegnet.
Måleren avleser ca. 200 for en normal testperson*
700 eller mer for en person med aktiv leukemia. Avlesninger mellom 200 og 700 er ufyllestgjørende og indikerer nødvendig-heten av en andre test på grunn av testfeil eller nærvær av tidlig leukemia.
Hvis en andre test fører til en avlesning mellom 200
og 700 er prosedyrene ifølge eksempel 21 indikert.
Eksempel 21 - Anvendelse av DNA-L apparatur med tidlig leukemiatest
Prosedyren ifølge eksempel 18 ble fulgt med en test-prøve fra en pasient som ble mistenkt for tidlig leukemia, eksempelvis på grunn av en 200-700 avlesning i prosedyren beskrevet i det foregående avsnitt i eksempel 20. Imidlertid ble det anvendt 1:100 DNA og matriseampuller ifølge eksempel 16og 17A istedenfor ' de vanlige DNA og matriseampuller.
DNA-L apparaturen ble rekalibrert i henhold til
eksempel 19, under anvendelse av A<*>og B<1>ampuller hvori en 1:100 DNA ampulle ifølge eksempel 16 ble anvendt istedenfor en DNA ampulle ifølge eksempel 16. (Ellers tilsvarer A<*>
til A og B' til B. Ampulle A' vil inneholde 3,5 ng DNA i 1,0 cm 3 , ampulle B<1>vil inneholde 1 ng DNA i 1,0 cm 3).
Etter kalibrering ble prosedyren ifølge eksempel 20 fulgt. En avlesning på ca. 200 indikerer fravær av DNA-L i pasientens test<p>røve. En avlesning på 500 eller mer indikerer nærvær av DNA-L i pasientens testprøve og antyder muligheten for leukemia, og som derved indikerer behov for mer utførlig testing for å bekrefte den antydede diagnose.
Generelle konkluderende bemerkninger
De foregående prosedyrer tilveiebringer en full-stendig ny diagnosemetode som hittil har vært ukjent for den medisinske vitenskap. Det er antatt å være av betydning at disse prosedyrer anvender rene, laboratoriefremstilte reaktanter (slik som clonet DNA) istedenfor (med unntak av enzymet) substanser som må erholdes fra givere og deretter renses. De ovenfor beskrevne prosedyrer gjør bruk av DNA-L (de DNA molekyler som er angitt som DNA-1 og DNA-2) men oppfinneren antar at andre DNA molekyler forbundet med andre ondartede sykdommer (dvs. andre enn i lymfesystemet) vil bli isolert og funnet å være anvendbare i en tester som bare er ubetydelige variasjoner av de ovenfor beskrevne tester, og gi samme type av resultat på samme måte.
Ennvidere kan andre matriser anvendes for å fremstille en egnet enzym-konjugert matrise. Andre harpikser kan også anvendes såvel som polystyren og latexperler til hvilke enzymet kan kjemisk bindes. Eksempler på de sistnevnte er hydrofile latexkuler ("Covaspheres MX" eller FX", Covalent Technology Corp., Ann Arbor, Michigan). Oppfinnelsen kan utøves med et hvilket som helst hovedsakelig uløselig materiale til hvilket enzymet kan bindes, da ethvert slikt materiale kan anvendes for å fremstille en enzymkonjugert matrise. Andre enzymer som har en selektiv affinitet med (dvs. som er istand til selektivt å bindes med) det aktuelle DNA kan anvendes. Uttrykket "enzymkonjugert matrise" som anvendt her er således beregnet å innbefatte enhver slik matrisesubstans til hvilken ethvert enzym kan bindes som vil selektivt bindes med (eller selektivt inhiberes av eller "ha en selektiv affinitet for") de her beskrevne DNA molekyler.
Selv om oppfinnelsen er blitt beskrevet primært i forbindelse med en spesifikk og foretrukken utførelsesform, skal det forståes at ytterligere modifikasjoner er mulig uten å avvike fra oppfinnelsens ramme. Enkelte slike modifikasjoner er beskrevet ovenfor. Foreliggende søknad er beregnet på å dekke alle variasjoner, bruk eller tilpasninger av oppfinnelsen som generelt følger oppfinnelsens prin-sipper, og som innbefatter slike avvik fra foreliggende beskrivelse som er kjent eller vanlig praksis innen det fag som oppfinnelsen henhører til, eller som er selvsagt for fag-mannen innen faget.
Claims (27)
1. Testprosedyre for påvisning av nærvær av ondartet sykdom i legemet av humane eller animale testpersoner, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:
(1) en testprøve fremstilles fra en kroppsvæskeprøve oppsamlet fra testpersonen;
(2) angitte testprøve blandes med et preparat inneholdende minst ett DNA-, hvis nærvær i kroppsvæsken er forbundet med nærvær av den ondartede sykdom for påvisning av hvilken testen utføres, og som er merket;
(3) angitte blanding introduseres for en enzym-konjugert matrise, hvilken matrise har bundet dertil et enzym med hvilket angitte DNA har en selektiv affinitet; og
(4) en bestemmelse utføres for å bestemme mengden av angitte merkede DNA som bindes til angitte enzym-
.konjugerte matrise eller som ikke bindes dertil.
2. Metode ifølge krav 1,
karakterisert ved at det merkede DNA er DNA-L og at den ondartede sykdom er en leukemia.
3. Metode ifølge krav 1,
karakterisert ved at enzymet R-l DNA polymerase er bundet til den enzym-konjugerte matrise.
4. Metode ifølge krav 1,
karakterisert ved at den enzym-konjugerte matrise er forbehandlet, før trinn (3), med minst ett DNA forskjellig fra et DNA hvis nærvær i kroppsvæsken er forbundet med den ondartede sykdom for påvisning av hvilken testen utføras.
5. Metode ifølge krav 1,
karakterisert ved at angitte DNA er merket med et fluorescent farvestoff.
6. Metode ifølge krav 1,
karakterisert ved at angitte DNA er merket med et medlem av gruppen bestående av fosfor 32 og tritium.
7. Metode ifølge krav 1,
karakterisert ved at det utføres et ytterligere trinn mellom det første og annet trinn, hvilket ytterligere trinn er ett hvori testprøven renses for fremmed-DNA ved anvendelse av en rensematrise.
8. Testprosedyre for påvisning av nærvær av leukemia i humane pasienter, karakterisert ved følgende trinn:
(1) en testprøve fremstilles fra blod oppsamlet fra pasienten;
(2) angitte testprøve blandes med et preparat inneholdende merket DNA-L;
(3) angitte blanding introduseres for en enzym-konjugert matrise til hvilken R-l DNA polymerase er bundet;
(4) en bestemmelse utføres for å bestemme mengden av merket DNA-L som er bundet til den enzym-konjugerte matrise eller som ikke er bundet dertil.
9. Metode ifølge krav 8,
karakterisert ved at den enzym-konjugerte matrise før trinn (3), forbehandles med et DNA forskjellig fra DNA-L.
10. Metode for fremstilling av en enzym-konjugert matrise egnet for anvendelse ved testing av nærvær av ondartede sykdommer, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:
et første DNA hvis nærvær i kroppsvæsken er forbundet med nærvær av den ondartede sykdom for påvisning av hvilken testen utføres, utvelges;
et enzym med hvilket angitte første DNA har en selektiv affinitet, utvelges;
et hovedsakelig uløselig matrisemateriale med hvilket angitte enzym kan bindes, utvelges;
en enzym-konjugert matrise fremstilles fra angitte materiale og med hvilket angitte enzym er bundet;
angitte matrise forbehandles med minst et andre DNA som er forskjellig fra angitte første DNA.
11. Metode ifølge krav 10,
karakterisert ved at den ondartede sykdom er en leukemia og at angitte første DNA er DNA-L.
12. Metode ifølge krav 10,
karakterisert ved at enzymet er R-l DNA polymerase.
13. Metode for fremstilling av en enzym-konjugert matrise egnet for anvendelse ved testing av nærvær av leukemia, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:
(1) et hovedsakelig uløselig matrisemateriale med hvilket R-l DNA polymeraseenzym kan bindes, utvelges ;
(2) angitte matrisemateriale blandes grundig med en løsning av angitte enzym;
(3) angitte matrisemateriale dreneres og vaskes; og
(4) angitte matrise behandles med DNA forskjellig fra DNA-L.
14. Enzym-konjugert matrise egnet for anvendelse ved testing av nærvær av ondartede sykdommer, karakterisert ved at den omfatter en matrise til hvilken det er bundet et enzym med en selektiv affinitet med et DNA hvis nærvær i kroppsvæsken er forbundet med angitte ondartede sykdom.
15. Enzym-konjugert matrise ifølge krav 14, karakterisert ved at den ondartede sykdom er en leukemia og at DNA er DNA-L.
16. Enzym-konjugert matrise ifølge krav 15, karakterisert ved at enzymet er R-l DNA polymerase.
17. Hovedsakelig rent DNA-L, hovedsakelig fritt for andre DNA.
18. DNA-L ifølge krav 17,
karakterisert ved at angitte DNA-L er DNA-1.
19. DNA-L ifølge krav 17,
karakterisert ved at angitte DNA-L er DNA-2.
20. DNA-L ifølge krav 17,
karakterisert ved at angitte DNA-L er merket DNA-L.
21. DNA-L ifølge krav 20,
karakterisert ved at det merkede DNA-L er merket med et medlem av gruppen bestående av fosfor 32 og tritium.
22. Hovedsakelig ren, merket blanding av DNA-1 og DNA-2, hovedsakelig fri for andre DNA.
23. Gjenstand omfattende:
en første beholder inneholdende en på forhånd målt mengde av merket DNA-L, hvilket DNA-L er hovedsakelig rent og hovedsakelig fritt for andre DNA; og en andre beholder inneholdende enzym-konjugert matrise, hvilken enzym-konjugerte matrise har bundet dertil en på forhånd målt mengde av R-l DNA polymerase.
24. Gjenstand ifølge krav 23,
karakterisert ved at DNA-L er merket med et fluorescent farvestoff.
25. Gjenstand ifølge krav 23,
karakterisert ved at antall molekyler av DNA-L i første beholder er ubetydelig større enn antallet av aktive enzymseter på enzymet i den andre beholder.
26. Gjenstand ifølge krav 23,
karakterisert ved at det foreligger en tredje beholder inneholdende rensematrise.
27. System for bestemmelse av kroppsvæskeprøver for nærvær av DNA forbundet med leukemia eller lymfoide, ondartede sykdommer, karakterisert ved at det omfatter:
en understøttelsesanordning tilpasset til å understøtte en beholder og holde denne på et på forhånd bestemt sted og stilling i forhold til angitte understøttelses-anordning;
understøttet av angitte anordning, en hovedsakelig transparent beholder inneholdende en løsning av DNA-L merket med et fluorescent farvestoff;
tilstøtende til angitte understøttelsesanordning, en lyskilde tilpasset til og anordnet til å bestråle angitte løsning i angitte beholder med lys;
tilstøtende til angitte understøttelsesanordning og adskilt fra angitte lyskilde, en fotodetektor, hvilken fotodetektor er anordnet til å motta lys, hvis slikt finnes, som stråler ut fra løsningen av merket DNA-L i beholderen, og hvor angitte fotodetektor er tilpasset til å frembringe, når angitte løsning i angitte beholder belyses av angitte lyskilde, et elektrisk ut- gangssignal som svarer til intensiteten av fluorescens av angitte løsning av DNA-L merket med et fluorescent farvestoff og inneholdt i angitte beholder; og anordninger for registrering av angitte elektriske ut-gangssignal.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/389,381 US4490472A (en) | 1982-06-17 | 1982-06-17 | Sensitive tests for malignancies based on DNA detection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO840576L true NO840576L (no) | 1984-02-16 |
Family
ID=23538027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO840576A NO840576L (no) | 1982-06-17 | 1984-02-16 | Sensitive tester for ondartede sykdommer basert paa dna-paavisning |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4490472A (no) |
| EP (1) | EP0097341B1 (no) |
| AT (1) | ATE37395T1 (no) |
| AU (1) | AU577260B2 (no) |
| CA (1) | CA1211062A (no) |
| DE (1) | DE3378062D1 (no) |
| DK (1) | DK68384D0 (no) |
| FI (1) | FI77689C (no) |
| IL (1) | IL69023A0 (no) |
| NO (1) | NO840576L (no) |
| WO (1) | WO1984000037A1 (no) |
| ZA (1) | ZA834474B (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4774176A (en) * | 1982-06-17 | 1988-09-27 | Gottlieb Arthur A | Sensitive tests for malignancies based on DNA detection |
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| GB2155176B (en) * | 1984-01-16 | 1988-05-11 | California Inst Of Techn | Sequencing dna |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US4681840A (en) * | 1984-01-18 | 1987-07-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce | Deoxyribonucleic acid molecules useful as probes for detecting oncogenes incorporated into chromosomal DNA |
| DE3431536A1 (de) * | 1984-08-28 | 1986-03-13 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Derivatisierte nucleinsaeure-sequenz, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum nachweis von nucleinsaeuren |
| JPH02500323A (ja) * | 1986-08-13 | 1990-02-08 | ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション | 結腸病変用検出マーカー |
| US4968603A (en) * | 1986-12-31 | 1990-11-06 | The Regents Of The University Of California | Determination of status in neoplastic disease |
| US4994368A (en) * | 1987-07-23 | 1991-02-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| US5273879A (en) * | 1987-07-23 | 1993-12-28 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| US4921788A (en) * | 1988-04-12 | 1990-05-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Competitive nucleic acid immunoassay for the detection of analytes |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| US5612199A (en) * | 1991-10-11 | 1997-03-18 | Behringwerke Ag | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification |
| CA2080305A1 (en) | 1991-10-11 | 1993-04-12 | Linda M. Western | Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification |
| DK0652973T3 (da) * | 1992-07-31 | 1997-09-15 | Behringwerke Ag | Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider |
| US6294323B1 (en) | 1993-04-14 | 2001-09-25 | Behringwerke Ag | Self initiating single primer amplification of nucleic acids |
| ATE427495T1 (de) * | 2001-12-11 | 2009-04-15 | Univ New Jersey Med | Diagnoseverfahren fur proteinprofilierung |
| US20100279279A1 (en) * | 2003-09-17 | 2010-11-04 | Robert Danielzadeh | Compositions and methods for analysis of target analytes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4298590A (en) * | 1975-02-25 | 1981-11-03 | Samuel Bogoch | Detection of malignant tumor cells |
| US4101276A (en) * | 1976-06-02 | 1978-07-18 | Beckman Instruments, Inc. | Method and apparatus for signalling the introduction of chemical reaction components into a chemical analyzing system |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
-
1982
- 1982-06-17 US US06/389,381 patent/US4490472A/en not_active Expired - Fee Related
-
1983
- 1983-06-16 CA CA000430514A patent/CA1211062A/en not_active Expired
- 1983-06-16 EP EP83105940A patent/EP0097341B1/en not_active Expired
- 1983-06-16 AT AT83105940T patent/ATE37395T1/de active
- 1983-06-16 DE DE8383105940T patent/DE3378062D1/de not_active Expired
- 1983-06-17 WO PCT/US1983/000946 patent/WO1984000037A1/en active IP Right Grant
- 1983-06-17 IL IL69023A patent/IL69023A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-06-17 ZA ZA834474A patent/ZA834474B/xx unknown
- 1983-06-17 AU AU18208/83A patent/AU577260B2/en not_active Ceased
-
1984
- 1984-02-15 DK DK0683/84A patent/DK68384D0/da not_active Application Discontinuation
- 1984-02-16 FI FI840640A patent/FI77689C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-02-16 NO NO840576A patent/NO840576L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3378062D1 (en) | 1988-10-27 |
| ZA834474B (en) | 1984-07-25 |
| EP0097341B1 (en) | 1988-09-21 |
| FI840640A0 (fi) | 1984-02-16 |
| EP0097341A1 (en) | 1984-01-04 |
| CA1211062A (en) | 1986-09-09 |
| AU1820883A (en) | 1984-01-16 |
| DK68384A (da) | 1984-02-15 |
| WO1984000037A1 (en) | 1984-01-05 |
| FI840640A (fi) | 1984-02-16 |
| FI77689B (fi) | 1988-12-30 |
| US4490472A (en) | 1984-12-25 |
| AU577260B2 (en) | 1988-09-22 |
| IL69023A0 (en) | 1983-10-31 |
| DK68384D0 (da) | 1984-02-15 |
| FI77689C (fi) | 1989-04-10 |
| ATE37395T1 (de) | 1988-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO840576L (no) | Sensitive tester for ondartede sykdommer basert paa dna-paavisning | |
| FI60720B (fi) | Foerfarande och medel foer bestaemning av aktiviteten av kreatinkinas-mb | |
| 牧村進 et al. | Quantitative determination of bovine serum Haptoglobin and its elevation in some inflammatory diseases. | |
| JP2577881B2 (ja) | ポリヌクレオチド連鎖を利用する検定方法 | |
| JP6694403B2 (ja) | 非結合ビリルビンの蛍光プローブの開発および使用 | |
| Ebadi et al. | MICROASSAY OF ADENOSINE‐3′, 5′‐MONOPHOSPHATE (CYCLIC AMP) IN BRAIN AND OTHER TISSUES BY THE LUCIFERIN‐LUCIFERASE SYSTEM 1 | |
| CA1052245A (en) | Detection of breast cancer | |
| US4366242A (en) | Method and agent for the immunological determination of enzymes | |
| US6949351B1 (en) | Cell assay, method and reagents | |
| IE42031B1 (en) | Detection of hepatitis b surface antigen by latex agglutination | |
| ES2322931T3 (es) | Preparacion de esferas para pruebas de diagnostico. | |
| JPH01501339A (ja) | 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット | |
| EA012438B1 (ru) | Способ и набор для определения тимидинкиназной активности и их применение | |
| US4424278A (en) | Cancer detection procedure using an acyl carrier protein | |
| Ma et al. | Detection of nucleophosmin gene mutations in plasma from patients with acute myeloid leukemia: clinical significance and implications | |
| JPH02298866A (ja) | 酵素検定キット及び完全細胞に適用可能な方法 | |
| EA005275B1 (ru) | Способ прогнозирования преэклампсии и других заболеваний | |
| JPH0275958A (ja) | Ｄｎａ検出法 | |
| US4774176A (en) | Sensitive tests for malignancies based on DNA detection | |
| US3616254A (en) | Screening procedure for enzyme deficiencies | |
| Shetlar et al. | Objective evaluation of patients with rheumatic diseases: IV. Comparison of the diphenylamine reaction (DPA) with serum glycoprotein and seromucoid levels | |
| Judd et al. | Serological studies on an α-D-galactosyl-binding lectin isolated from Bandeiraea simplicifolia seeds | |
| CN109694912A (zh) | 甲基化位点的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 | |
| CA2404502A1 (en) | Diagnosis of autoimmune disease by detecting thyroid stimulating autoantibodies | |
| Sawazaki et al. | Transferrin (TF) typing from semen stains using isoelectric focusing and immunoblotting: correlation of TF types among blood, semen, urine, and vaginal secretion |