FI77689C - Sensitiva tester baserade pao konstaterandet av dna foer paovisande av malignitet. - Google Patents

Description

, 77689 DNA:n toteamiseen perustuvia herkkiä testejä malignisuuksien toteamiseksi

Keksinnön taustaa 5 1. Keksinnön ala Tämä keksintö koskee parannettuja keinoja ihmis- ja eläinpotilaiden testaamiseksi tiettyjen malignisuuksien läsnäolon suhteen. Erityisemmin julkaistaan suoritusmuoto, joka sallii lymfoidisten malignisuuksien (leukemioiden) useiden 10 tyyppien diagnoosin.

2. Taustan ja tekniikan tason yksityiskohtainen tarkastelu

Keksijä on keksinyt, että hiiristä tai ihmispotilais-ta, joilla on tiettyjä malignisuuksia, kerätyt veriseerumit 15 ja muut kehon nesteet sisältävät tiettyjä ainutlaatuisia kaksijuosteisia DNA-molekyylejä, joilla on kyky selektiivisesti inhiboida DNA-polymeraaseinä tunnetun entsyymiryhmän tiettyjä jäseniä. Näitä DNA-molekyylejä ei ole läsnä seerumeissa, jotka on saatu hiiristä tai ihmispotilaista, joil-20 ia ei ole näitä malignisuuksia. Keksijä on, muiden kanssa, kuvannut tätä havaintoa ja näitä DNA:itä, asiaan liittyvän informaation kerällä, sarjassa artikkeleita. Katso: Perisco ja Gottlieb, DNA Polymerases of Myeloma, Nature New Biology 239:173-76 (1972); Gottlieb, Smith, Plescia, Perisco ja 25 Nicholson, Inhibitor of DNA polymerase, Nature 246:480-82 (1973); Gottlieb, Smith, Plescia, Nicholson, Bowers, Pankuch ja Berkoben, An Inhibitor of DNA Polymerase, teoksessa Fundamental Aspects of Neoplasia, luku 20, s. 269-77 (1975); Gottlieb, Gottlieb ja Nicholson, Inhibition of DNA polymerase 30 by Sera, teoksessa Bibliotheca Haematologica, No. 43 (Basel 1976); Brennessel, Buhner ja Gottlieb, Use of Insoluble Heparin for Isolation of DNA Polymerase, Analytical Biochemistry 87: 411-17 (1978); Gottlieb, Chang, Buhrer ja Brennessel, Isolation from Murine Myeloma and Leukemia Cells 35 of a Selective Inhibitor of DNA polymerase, Cancer Research 2 77689 40: 758-70 (1980). Näihin DNA:ihin viitataan tässä tekstissä kollektiivisesti termillä "DNA-L".

DNA-L on seos DNA-molekyylejä, jotka ovat 150-300 emäsparin alueella. Mikä hyvänsä näistä DNA-molekyyleistä 5 voi selektiivisesti inhiboida R-1 DNA-polymeraasia. Keksijä on erotellut nämä DNA-molekyylit kahteen ryhmään, DNA-1 ja DNA-2, jotka voidaan erotella kromatografiän avulla. Samankaltaisia DNA-molekyylejä voidaan uuttaa normaalista maksasta, mutta ei normaaleista veriseerumeista. Normaaleista 10 veriseerumeista puuttuvat nämä DNA:t ja leukemiapotilaiden seerumeissa on näitä DNA:itä. Kaikki edellä olevat DNA-L-molekyylit voidaan kloonata ja niitä voidaan käyttää testi-menettelyissä, joita kuvataan tässä tekstissä.

DNA-L-molekyylejä on kaksi tässä pääasiallisen mie-15 lenkiinnon omaavaa ryhmää, joista kumpikin sisältää rajoitetun, mutta määrittelemättömän lukumäärän erilaisia molekyylejä. Tässä pääasiallisen mielenkiinnon omaavia DNA:itä voidaan nimittää "DNA-1" ja "DNA-2". Uskotaan, että näillä DNA:illa voi olla tärkeä osa leukeemisten solujen replikaa-20 tiossa. DNA-1:llä ja DNA-2:lla on tärkeitä yhteisiä ominaisuuksia .

Sekä DNA-1:n että DNA-2:n on osoitettu aiheuttavan selektiivistä inhibitiota R-1 DNA-polymeraasientsyymin ;‘ suhteen, jota tavataan hiiren myeloomassa, ja jota voi 25 esiintyä muissa tuumoreissa ja normaaleissa kudoksissa.

(Inhibitio on "selektiivinen" siinä suhteessa, että muita DNA:itä voi hyvin olla olemassa, jotka erottelemattomasti inhiboivat tätä ja muita polymeraasientsyymejä. Mielenkiintoa omaavat DNA:t inhiboivat R-1 DNA-polymeraasia eivät-30 kä inhiboi muita tunnettuja polymeraasientsyymejä.) R-1 DNA-polymeraasientsyymi voidaan saada talteen MOPC-21-myeloomatuumorista menettelyin, joita kuvataan julkaisussa

Analytical Biochemistry 87:411-17 (1978), supra. On epäolennaista, että entsyymi on hiiri-alkuperää, koska se 35 reagoi sekä humaani- että hiirilähteistä peräisin olevien mielenkiintoa omaavien DNA:iden kanssa.

3 77689

Nykyiset leukemiatestit, kuten luuydintestit, voivat olla epämukavia ja traumaattisia potilaalle. Sitä paitsi niiden herkkyys rajoittuu syöpäsolujen melkoisten lukumäärien läsnäolon toteamiseen, joten varhaiset leukemiatapaukset 5 saattavat jäädä havaitsematta. Tämän keksinnön menettelyihin ei kuulu vasta-aineiden tuottaminen, kuten Bogoch'in työssä Detection of Malignant Tumor Cells, US-patentti nro 4 298 590 (3. marraskuuta 1981). Sellaisia työläitä ja epäsuoria mittausmenetelmiä ei käytetä tässä.

10 Tämän keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön testimenettely määrittää DNA:iden (tämän jälkeen "syöpä-DNA:t") läsnäolon, joiden läsnäolo kehon nesteissä merkittävissä määrissä liittyy malignien solujen kasvuun ja joiden läsnäolo täten ilmaisee malignien 15 solujen läsnäolon kehossa. Tämä saavutetaan altistamalla väliaine, joka mahdollisesti sisältää syöpä-DNA:itä, mahdölliselle "kilpailevalle sitoutumiselle", missä kilpailija (jota joskus nimitetään "DNA-koettimeksi") on tunnettu määrä jotakin sellaista syöpä-DNA:ta. Alempana ku-20 vattava väliaine on veriseerumia, jota keksijä pitää parempana käyttää johtuen sen kätevyydestä ja saatavuudesta, mutta muut väliaineet, kuten ascites-neste ja lymfa, sisältävät myös tässä tarkasteltuja syöpä-DNA:itä ja saattavat sisäl-tää muita syöpä-DNA:itä, joilla on samankaltaista mielen-25 kiintoa. Selkäydinneste, duodenaalineste, mahaneste, pleu-raalineste, virtsa, sylki, muut limaiset eritteet ja muut kehon nesteet voivat myös sisältää samankaltaisia DNA:itä.

Tässä kuvattavassa testissä sekoitetaan syöpä-DNA:n suhteen testattavaa seerumia tunnettuun määrään leimattua 30 syöpä-DNA:ta (DNA-koetinta). Seos "viedään" jäljempänä kuvattuun "entsyymi-konjugoituun matriisiin", joka sitoutuu syöpä-DNA:hän, mutta ei muunlaisiin DNA:ihin, joita voi olla läsnä, eikä muihin läsnä oleviin aineisiin. Sitten käytetään testimenettelyä sen määrittämiseksi, kuinka 35 paljon leimattua DNA:ta (DNA-koetinta) entsyymikonjugoitu 4 77689 matriisi sitoi tai jäi jäljelle testiseoksen jäännökseen.

Kun entsyymi-konjugoitu matriisi sitoo suhteellisesti vähemmän leimattua DNA:ta, syynä on se, että leimaamaton samankaltainen DNA testiseerumista kilpaili entsyymi-konju-5 goidulla matriisilla olevista entsyymipaikoista ja sulki leimatun DNA:n pois niistä. Kun entsyymi-konjugoitu matriisi sitoo suhteellisesti enemmän leimattua DNA:ta, syynä on, ettei leimatun DNA:n kanssa samankaltaista leimaamatonta DNA:ta ollut läsnä testiseerumissa kilpaillakseen entsyymi-10 konjugoidulla matriisilla olevista paikoista ja täten sul-keakseen niistä pois leimattua DNA:ta.

Tämän keksinnön yksi pääasiallinen edistysaskel on se, että on keksitty herkkiä testimenettelyjä, jotka sallivat leukemian tai uudelleenpuhkeamisten varhaisen toteamisen ja 15 jotka sallivat remission voimassaolon määrittämisen. Näiden menettelytapojen uskotaan olevan niin herkkiä, että ne toteavat niin harvojen kuin 250:n malignin solun läsnäolon hiiressä tai, veren ja kehon painon pohjalta ekstrapoloiden, likimain 750 000:n malignin solun läsnäolon ihmisessä. Viimek-20 si mainittua lukua voidaan verrata niihin likimain 4,5 x 10^ soluun, jotka ovat läsnä tyypillisessä ihmisen verenkierrossa, niin että testi toteaa likimain 15 miljoonasosaa. Nykyisten leukemiatestien taas sitä vastoin uskotaan kykenevän toteamaan leukemian vain kun likimain 10 000 000 malignin solua ; 25 tai likimain 220 miljoonasosaa on jo vakiintunut kehoon.

On useita syitä, miksi halutaan herkempää testiä, joka sallii malignisuuksien, kuten leukemian varhaisemman toteamisen. Ensinnäkin uskotaan, että varhaisemmin aloitettu hoito aiheuttaa vähemmän vahinkoa potilaan keholle ja mahdolli-30 sesti lisää potilaiden henkiinjäämismahdollisuuksia. Mutta varhainen diagnoosi on välttämätön ennen kuin määrätään sel-laista terapiaa, joka voi olla heikentävää. Toiseksi, leukemiat ovat hyvin hälyttäviä tauteja. Mononukleoosi sekoitetaan usein leukemiaan, johtuen molempien oireiden

II

5 77689 samankaltaisuudesta. On tärkeää saada negatiivinen leukemia-diagnoosi välittömästi mononukleoositapauksissa, johtuen mahdollisen leukemian diagnoosin vakavista haitallisista psykologisista vaikutuksista nuoriin potilaisiin ja heidän 5 vanhempiinsa.

Keksinnön menetelmä on myös halvempi, kätevämpi, vähemmän traumaattinen potilaalle, helpommin sovellettavissa suuren mittakaavan seulontaan ja käytännöllisempi käyttää saman potilaan usein toistuvaan testaukseen - verrattuna 10 olemassa oleviin menettelyihin.

Keksijän suosimassa kielenkäytössä, tässä yhteydessä, termi "leukemia" sulkee sisäänsä ei vain sellaiset hiiri-leukemiat kuin MCDV 12 ja L1211, vaan myös multippelin mye-looman ja muut ihmisen tai eläimen lymfoidisysteemin malig-15 nisuudet. Niinpä seuraava tarkastelu ja patenttivaatimukset tulisi lukea termin "leukemia" sellaisen käytön valossa.

Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön testimenettely on uusi ja parannettu testauskeino malignisuuksien, sellaisten kuin leukemia, jot-20 ka liittyvät erityisiin DNA:ihin, läsnäolon toteamiseksi. Leukemian tapauksessa DNA on DNA-L. Keksijä uskoo, että voi olla olemassa toisia DNA:ita, jotka samaan tapaan liittyvät toisiin malignisuuksiin ja jotka ovat käytettävissä samankaltaisiin testimenettelyihin.

25 I. Testinäytteen valmistus

Alkuaskel keksijän leukemiatestissä on ottaa tietty määrä verta (tai muuta kehon nestettä) tutkittavasta potilaasta, poistaa solut sentrifugoinnilla seerumin valmistamiseksi (veren tapauksessa) ja valmistaa testinäyte siitä. Tä-30 män tekemiseksi kehon nesteen näytettä käsitellään 70 %:lla ammoniumsulfaatilla kaiken näytteessä olevan proteiinin saostamiseksi. Saostuma heitetään pois ja pintaneste otetaan • talteen. Viimeksi mainittu puhdistetaan olennaisesti sentri fugoinnilla ja dialyysillä. Tuloksena saatava kirkas neste 35 on "testinäyte".

6 77689

Esimerkki 1

Testinäyte 0,5 ml veriseerumia saadaan laboratoriohiirestä. Kyllästettyä ACS Reagent Grade -laatuisen (NH^^SO^in vesiliuos-5 ta lisätään tipoittain näytteeseen, kunnes saavutetaan lopullinen konsentraatio 70 % (NH^^SO^. Tuloksena saatava pro-teiinisaostuma poistetaan sentrifugoimalla käyttäen 1 700 g 10 minuutin ajan ja heitetään pois. Likimain 1 ml kirkasta pintanestettä saadaan täten aikaan. Se dialysoidaan 12 000:n 10 molekyylipainon dialyysipussissa 0,01 M Tris.HCl -puskuria (pH 7,8) vastaan yli yön 4°C:ssa. Dialyysipussiin jäljelle jäävä materiaali (likimain 1 ml) on testinäyte.

Testit voidaan suorittaa suoraan esimerkin 1 testi-näytteestä, mutta keksijä katsoo olevan edullista ensin puh-15 distaa se edelleen "puhdistusmatriisilla", kuten kuvataan alempana esimerkissä 8B.

II. DNA-L:n valmistus

Keksijä on kuvannut yleisesti DNA-L:n uuttamista julkaisussa Cancer Research 40:758 (1980), supra. DNA-L 20 on DNAtiden seos. On mahdollista käyttää DNA-1:n ja DNA-2:n DNA-L-seosta tässä kuvattujen testien suorittamiseen.

; Menettely vaatii DNA:1:stä ja DNA-2:sta tuntemattomissa ja vaihtelevissa osuuksissa koostuvan tuotteen käyttöä. Keksijä on tästä syystä kehittänyt valinnanvaraisen menettelyn 25 DNA-1:n ja DNA-2:n erottelemiseksi toisistaan. Keksijä on myös kehittänyt menettelyn kloonien saamiseksi yksittäisistä : : DNArista, jotka kuuluvat DNA-L-ryhmään.

DNA-1:n ja DNA-2:n erotteluun tarkoitettuun menettelyyn kuuluu se, että ihmis- tai hiiritestinäytteelle, 30 joka on valmistettu, kuten edellä on kuvattu esimerkissä 1 ja otettu potilaalta, jolla tiedetään olevan leukemia tai I myelooma, tehdään sarjakromatografia. Kromatografia suori tetaan jollakin entsyymikonjugoidulla matriisilla. Tämä on matriisi, johon voidaan sitoa entsyymi. Toinen esimerkki on **: 35 agaroosipohjäinen, geelimäinen aine, johon entsyymi voidaan kovalenttisesti sitoa stabiililla tavalla, niin että se on 7 77689 käytettävissä tulevaa käyttöä varten. Toisessa esimerkissä käytetään mikropalloja. Molempia esimerkkejä kuvataan alla.

Yleistä menettelyä entsyymi-konjugoitujen matriisien valmistamiseksi ehdotetaan julkaisussa Affinity Chromato-5 graphy, Principles and Methods (Pharmacia). Valitun hartsin täytyy olla sellainen, johon kiinnostuksen kohteena oleva 6ö entsyymi sitoutuu. Pharmacia'n tuote CNBr-Sepharose on havaittu soveliaaksi R-1 DNA -polymeraasille ja keksijä on kehittänyt menettelyn sellaisen matriisin valmistamiseksi.

10 Keksijä ei ole tietoinen mistään julkaistusta tai muutoin ennestään tunnetusta menettelystä entsyymi-konjugoidun matriisin valmistamiseksi, jossa R-1 DNA -polymeraasi on sidottu matriisiin.

Seuraava menettely eroaa yllä siteeratusta yleisestä 15 menettelystä useissa tärkeissä suhteissa. Keksijä on keksinyt, että alempana kuvattavissa menettelyissä ja testeissä © käytettäväksi tehokkaan Sepharose-geeli-entsyymi-kon^ugoidun matriisin valmistamiseksi, so. toistettavien ja yhdenmukaisten tulosten saamiseksi, on tärkeää tai ehkä jopa välttämä-20 töntä esikäsitellä entsyymikonjugoitu matriisi puskuriliuoksella, joka sisältää DNArta, kuten aikaiidenaturoitua lohen siemennesteen DNA:ta (Millipore Corp.). Tällä tavalla käsi- telty matriisi pestään puskuriliuoksella. Jollei tätä esi- (S) käsittelyprosessia DNA:11a tehdä, Sepharose-geeli-entsyymi-25 konjugoitu matriisi ei ilmeisesti reagoi spesifisesti DNA-L:n kanssa, niin että saadaan vaihtelevia testituloksia. Uskotaan, että DNA-esikäsittely sitoo ja siten eliminoi menettelystä, joka seuraa, ne entsyymi-konjugoidulla matriisilla olevat sitomiskohdat, joilla on yleinen tai ei-selek-30 tiivinen affiniteetti DNA:han, vastakohtana paikoille, .. joilla on selektiivinen affiniteetti DNA-L:ään. Uskotaan, että sellaisen esikäsittelymenettelyn käyttö sellaisten V. matriisien yhteydessä on alalla aiemmin tuntematon. Vaikka tämän vaiheen välttämättömyys on osoitettu vain entsyymille, 35 joka on konjugoitu Sepharose^en, oletetaan, että sellainen vaihe tarvitaan tai osoittautuu toivottavaksi myös 8 77689 entsyymikonjugoiduille helmille, joita kuvataan esimerkissä 3A ja muille entsyymi-konjugoiduille matriiseille.

Esimerkki 2 DNA-1:n ja DNA-2:n puhdistetun seoksen valmistus 5 Kätevä tilavuus (2 ml) esimerkin 1 testinäytettä val mistetaan poolatusta seerumista, joka on otettu sisäsiittoisista hiiristä, joilla on myelooma MOPC-21. Esimerkin 1 lopussa olevaa dialyysivaihetta seuraa konsentrointi 30-%:ista polyetyleeniglykolia 0,01 M Tris.HCl-puskurissa (pH 7,8) 10 vastaan. Tuloksena saatavaa liuosta puhdistetaan edelleen kromatografiällä DEAE-selluloosalla (Whatman) käyttäen lineaarista 0 - 1,0 M KCl-gradienttia 0,01 M Tris.HCl-puskurissa (pH 7,8). DNA eluoituu 0,45 M KCl:n kohdalla ja eluoidut fraktiot konsentroidaan dialyysillä polyetyleeniglykolia 15 vastaan.

Tuloksena saatava DNA-valmiste säädetään 0,4 Miksi natrium-PO^-puskurissa (pH 7,0) ja lämpödenaturoidaan inku-boimalla 16 minuutin ajan 68°C:ssa. Tislattua vettä lisätään fosfaattikonsentraation saattamiseksi 0,14 Miksi ja seos 20 pannaan 1 mlin pylvääseen, joka on hydroksyyliapatiitista (DNA grade, Bio-Rad Labs) ja joka on tasapainotettu 0,01 M natrium-P04~puskurissa (pH 7,0), keitetty viiden minuutin ajan ja pidetty 68°C:ssa. Sen jälkeen kun DNA-seos on pantu pylvääseeen, pylvään sallitaan valua painovoiman vaiku- 25 tuksesta ja ylimääräinen neste heitetään pois. Sitten 6,0 ml 0,14 M natrium-PO^-puskuria (pH 7,0, 68°C) kerrostetaan varovasti pylvääseen ja valutetaan.

Mielenkiinnon omaava kaksijuosteinen DNA vapautetaan sitten pylväästä panemalla siihen varovasti 8,0 ml 0,4 M 3° natrium-PO^-puskuria (pH 7,0). Tuloksena saatavaan kaksi-juosteisen DNAin puhdistetun seoksen valmisteeseen viitataan termillä "seka-DNA-L" tai "DNA-L-seos".

Esimerkki 2A

-·: Samankaltainen valmiste (MCDV-12) 35 Esimerkin 2 menettely toistetaan hiirillä, joilla on • * leukemia MCDV-12.

Il 9 77689

Esimerkki 2B

Samankaltainen, valmiste (L-1211)

Esimerkin 2 menettely toistetaan hiirillä, joilla on leukemia L-1211.

5 Esimerkki 2C

Samankaltainen valmiste (Poolattu MOPC 21, MCDV-12, L-1211)

Esimerkin 2 menettely toistetaan poolatulla seerumilla, joka on otettu hiiristä, joilla on myelooma MOPC-21, 10 leukemia MCDV-12 ja leukemia L-1211, vastaavasti, niin että kukin leukemia on edustettuna DNA-L-seoksessa.

DNA-1:n ja DNA-2:n erottelu ja edelleenpuhdistus saadaan aikaan seka-DNA-L:n fraktioinnilla entsyymi-^onjugoi-dulla matriisilla. Tämä on liukenematon Sepharose (Pharmacia)-15 matriisi, johon R-1 DNA -polymeraasi on kovalenttisesti kiinnitetty. Se valmistetaan sen menetelmän yleisellä pohjalla, jonkin verran muutettuna vastatakseen tämän tilanteen erityisiä tarpeita, jota menetelmää kuvataan julkaisussa Affinity Chromatography - Principles and Methods (Pharmacia) 20 ja joka perustuu Axen'in, Porath'in ja Ernback'in alkuperäiseen menetelmään, Chemical Coupling of Peptides and Proteins to Polysaccharides by Means of Cyanogen Halider, Nature 214:1302-04 (1967). Muita liukenemattomia matriiseja voidaan käyttää affiniteettimatriisien sijasta, kuten • * · (¢) 25 Sepharose ,kuvattu alempana. Esimerkiksi tiedetään käyttää lasihelmiä, keramiikkaa ja piihappoa tuen antamiseksi ent-syymeille entsymaattisissa prosesseissa. Entsyymi-konjugoi-tu matriisi täytyy myös esikäsitellä, jotta se sitoutuisi spesifisesti DNA-L:ään, kuten kuvataan alempana.

30 Esimerkki 3

Entsyymi-konjugoidun matriisin valmistus 1 g CNBr-aktivoitua Sepharose 4B:tä (Pharmacia) tur-votetaan 0,001 M HCl:ssä lasisuodattimella ja pestään 15 minuutin ajan 200 ml:11a 0,001 M HC1. Tuloksena saatavaa 35 geeliä pestään 0,1 M NaHCO^lla (pH 8,3) ja sitten 0,1 M NaHCO^illa (pH 8,3), joka sisältää 0,5 M NaCl. Geeli 10 77689 suspendoidaan sitten 3,5 ml:aan viimeksi mainittua puskuria. Sitten lisätään puhdistettua R-1 DNA -polymeraasia (joka sisältää likimain 0,040 mg proteiinia 1,0 ml:ssa 0,28 M kalium-P04-puskuria (pH 6,3) 0,001 M DTT:tä (ditiotreito-5 lia; ja 20 % glyserolia kerralla) geelilietteeseen ja seosta ravistellaan ranneliikeravistelijalla yön yli 4°C:ssa.

Geeli pestään sitten kahdesti 0,1 M NaHCO^illa, joka sisältää 0,5 M NaCl (pH 8,3), ennen kuin jäljellä olevat aktiiviset ryhmät suljetaan 1 M Tris.HCl-puskurilla (pH 10 8,0) kahden tunnin ajan huoneen lämmössä. Seuraa kolme gee

lin pesukierrosta: kukin kierros koostuu pesusta 0,1 M ase-taattipuskurilla, joka sisältää 1 M NaCl (pH 4,0) ja sitä seuraa pesu 0,1 M boraattipuskurilla, joka sisältää 1 M

NaCl (pH 8,0). ^

Qjp 15 Tällä tavalla valmistettu Sepharose-geeli, joka sisäl tää R-1 DNA-polymeraasin, suspendoidaan sitten 5 ml:aan "puskuri-A:ta" (0,054 M Tris.HCl (pH 7,8), joka sisältää 0,005 M 2-merkaptoetanolia, 0,0001 M MnC^, 0,04 M KC1) . Sitten valetaan 1 ml:n minipylväs. Entsyymi-konjugoitu mat-20 riisi on nyt käyttövalmis. Se voidaan myös varastoida ja säilyy hyvässä kunnossa, kun sitä säilytetään 4°C:ssa, ainakin kolmen kuukauden ajan. Tämä tuote sisältää likimain 10 mikrogrammaa entsyymiä millilitraa kohti. Mutta tulokset vaihtelevat kunkin erän mukaan, ja tarvitaan määritys 25 tarkan entsyymipitoisuuden määrittämiseksi.

Esimerkki 4

Polybeäd-entsyymi-konjugoidun matriisin valmistus Keksijä on kehittänyt vaihtoehtoisen entsyymi-konju-goidun matriisin, joka saattaa olla yksinkertaisempi käyt-30 tää ja tuloksiltaan luotettavampi kuin Sepharose-geeli. Se perustuu Polybead-mikropartikkeleihin (Polysciences Inc., Warrington, Pa.), joilla on pinnoillaan karboksyyliryhmiä.

:.· Näitä helmiä kutsutaan myös "karboksyloiduiksi monodispers- seiksi mikropalloiksi".

35 Likimain 0,1 g Polybead-mikropartikkeleja ("helmiä") pestään perusteellisesti kalium-PO^-puskurissa (pH 7,2 -

II

11 77689 7,6). Likimain 25 mikrolitraa helmien konsentroitua suspensiota lisätään 75 mikrolitraan samaa kaiium-PO^-puskuria yhdessä 10 mikrolitran kanssa 1-etyyli-3 ,3-dimetyyliamino-propyylikarbodi-imidin (ECDI) 50-%:ista liuosta (vedessä).

5 Seosta inkuboidaan huoneen lämmössä (24°C) 30 minuutin ajan. Helmet pestään sitten kahdesti samalla kalium-PO^-puskuril-la ja suspendoidaan uudelleen 75 mikrolitran eriin tätä puskuria, joka sisältää 4 % glyserolia. Helmet siirretään syrjään ja varastoidaan tässä tilassa.

10 Likimain 75 mikrolitraa edellä olevaa varastoitua helmituotetta pannaan koeputkeen. Sitten 25 mikrolitraa puhdistettua R-1 DNA-polymeraasia, 0,5 - 1,0 mikrogrammaa/ mikrolitra, PO^/DTT/glyserolissa siten kuin on kuvattu esimerkissä 3, lisätään, kunnes seos saavuttaa 100 mikrolitraa. 15 Seosta inkuboidaan sitten 60 minuutin ajan 4°C:ssa.

10 mikrolitraa 0,2 M glysiiniä (pH 7,6 - 8,0) tai 10 mikrolitraa naudan seerumialbumiinin liuosta (20 mg/ml) lisätään sitten hitaasti seokseen ja inkubointia suoritetaan 30 minuutin ajan huoneen lämmössä (24°C) ajoittain sekoit-20 taen. Helmet pestään sitten kahdesti "varastointipus- kurilla" (0,05 M Tris pH 7,8; 0,004 M beeta-merkaptoetanoli; 0,04 M KC1 0,2 mg/ml seerumialbumiini; 0,0001 M MnC^ 20 % glyseroli) ja suspendoidaan uudelleen 50 mikrolitraan varas-: tointipuskuria. Se siirretään sitten sivuun siihen asti, 25 kun sitä käytetään. Ennen helmien käyttöä testimenettelyssä helmet pestään denaturoidun lohen siemennesteen DNA:n 0,1-%:isessa liuoksessa varastointipuskurissa, mitä seuraa huuhtelu varastointipuskurissa. Tuote sisältää likimain 5,0 mikrogrammaa entsyymiä millilitraa kohti, mutta määri-30 tys tarvitaan tarkan entsyymipitoisuuden varmistamiseksi.

Esimerkki 5 ·' Pylvään esikäsittely ja DNA-1:n ja DNA-2:n erottele- minen

Esimerkin 3 minipylvästä esikäsitellään 5 ml:11a jol-35 lakin mukavasti saatavissa olevalla ei-ihmisen, ei-hii-ren DNA:ta, kuten alkalidenaturoitua lohen siemennesteen 12 77689 DNA:ta (50 mikrogrammaa/ml), joka johdetaan pylvään läpi 4°C:ssa. Pylväs pestään sitten perättäisesti 10 ml :11a puskuria A, 10 ml:11a puskuria A plus 0,5 M KC1 ja 10 ml:11a puskuria A taas. Esimerkin 2 seka-DNA-L-valmiste (DNA-1:n 5 ja DNA-2:n puhdistettu seos) johdetaan pylvään läpi ja elu-aattia uudelleenkierrätetään pylvään läpi 20 minuutin ajanjakson ajan.

Pylväs valutetaan ja pestään uudelleen 5 ml:11a puskuria A (esimerkki 3), mitä seuraa DNA-L-seoksen eluutio 10 5 mlrlla KCl:n lineaarista gradienttia (0,1 M puskurissa A).

DNA-1 eluoituu 0,1 M KCl:n kohdalla, DNA-2 eluoituu 0,22 M KCl:n kohdalla. Sen jälkeen, kun gradientti on suoritettu loppuun, pylväs pestään 5 ml:11a puskuria A, joka sisältää 1 M KC1. (Pylväs voidaan regeneroida tulevaa käyttöä varten 15 pesemällä 15 ml:lla puskuria A).

Alunalkaen sisäänpannusta DNA:sta saadaan talteen likimain 4,5 % DNA-1:nä ja 4,6 % DNA-2:nä.

On mahdollista käyttää jostakin elävästä lähteestä uutetun luonnollisen DNA-L:n puhdistettua seosta näihin 20 testeihin, mutta keksijä pitää parempana käyttää puhdasta, . kloonattua tuotetta. Se on halvempaa ja kätevämpää, kun menettely on kerran vakiinnutettu. Sen uskotaan olevan myös tieteellisesti paremmin perusteltua, koska se eliminoi mahdollisen vaihtelevan tekijän, so. kontaminoivien 25 DNA:iden läsnäolon DNA-L-valmisteessa ja kloonattu DNA on tarkalleen samaa DNA:ta jokaisessa suoritettavassa testissä.

Keksijä on siitä syystä käyttänyt kloonausmenettelyä, jossa käytetään pBR322-plasmidia kloonausvektorina. Seuraa-va esimerkki viittaa DNA-1:een, mutta menettely DNA-2:n tai 30 DNA-L-seoksen kloonaamiseksi on olennaisesti identtinen.

Tässä käytetty yleinen lähestymistapa perustuu menetelmään, jota kuvataan julkaisussa Bahl, Marians, Wu, Stawinsky ja Narang, A General Method For Inserting Specific DNA Sequences Into Cloning Vehicles, Gene 1: 81-92 (1976). Mene-35 telmässä käytetään "linkkereitä", jotka ovat sensitiivisiä restriktioentsyymille Bam I, kuten on kuvattu julkaisussa

II

13 77689

Scheller, Dickerson, Boyer, Riggs ja Itakura, Chemical Synthesis of Restriction Enzyme Recognition Sites Useful for Cloning, Science 196:177-80 (1977). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kloonausmenetelmää, jossa käytetään yksijuos-5 teista M13-fagia, kuten ovat kuvanneet Sanger, Coulson, Barreli, Smith ja Roe, J. Molecular Biology (1980) 143: 161-178.

Esimerkki 6 DNA-1:n kloonaus 10 Valmistetaan fosforylaatiopuskuri (10X), joka koos tuu 0,7 M Tris.HCl:stä (pH 7,6) ja 0,1 M MgC^tsta. 1 mikro-litra puskuria sekoitetaan 0,5 mikrolitraan 0,01 M ATP:tä, 5 mikrolitraan0,01 M DTT:tä, 1 mikrolitraan 4,5 mg/ml T4-polynukleotidikinaasia (New England Biolabs). Sitten lisä-Ί5 tään 500 ng Bam-linkkeriä liuotettuna 1 mikrolitraan vettä. Lisää vettä lisätään tilavuuden saamiseksi 10 mikrolitrak-si. Seosta inkuboidaan yhden tunnin ajan 37°C:ssa ja se pakastetaan sitten -20°C:ssa varastointia varten. Tähän seokseen viitataan termein "fosforyloitu Bam-linkkeri" tai 20 "PBM".

Valmistetaan seos, joka sisältää 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia (New England Biolabs) 82 mikrolitrassa 0,07 M Tris.HCl:ää (pH 7,5), joka sisältää 0,007 M MgC^ ja 70 mik-... ro-M ATP. Tähän lisätään 10 mikrogrammaa esimerkin 7 lei- 25 mattua DNA-1 :tä ja 1,8 mikrogrammaa PBM:ää 18 mikrolitrassa vettä. Tuloksena saatavia 100 mikrolitraa seosta inkuboidaan 15°C:ssa yön yli ja reaktio pysäytetään saattamalla seoksen lämpötila 65°:een 10 minuutin ajaksi. Tämä tuottaa seoksen, joka sisältää DNA-linkkerimolekyylin.

30 Seokseen lisätään sitten 100 yksikköä Bam Hirtä

10 mikrolitrassa vettä ja 12 mikrolitraa Bam 10X puskuria (0,2 M Tris.HCl (pH 8,0) 0,07 M MgCl2, 0,02 M BME, 1 M NaCl). Seosta inkuboidaan 37°C:ssa kolmen tunnin ajan ja ·:·: reaktio pysäytetään lisäämällä 12 mikrolitraa 0,2 M

35 Na2EDTA:ta. Tämä leikkaa PBM:n DNA-1inkkerimolekyylistä.

,4 77689 DNA-linkkeriseosta käsitellään perättäin fenolilla ja eetterillä DNA-linkkerin uuttamiseksi siitä. Uutteen tilavuus pienennetään 20 mikrolitraan johtamalla typpikaasua sen yli.

5 Konsentroitu uute johdetaan 1 ml:n pylvään läpi, jossa on Sephadex G-50 (Pharmacia) tasapainotettuna 0,01 M Tris.HClrssä (pH 7,8), joka sisältää 0,05 M NaCl. Yhden tipan fraktioita kerätään mikrofugiputkiin. DNA-linkkerin si- 32 jainti määritetään P-leiman toteamisen avulla, ja DNA-10 linkkeriä sisältävän liuoksen tilavuus mitataan (likimain 0,1 ml). DNA-linkkeri otetaan talteen lisäämällä 10 mikro-litraa 3 M Na-asetaattia ja 0,2 ml etanolia. Seoksen annetaan olla -20°C:ssa yön yli.

Saostettu DNA-linkkeri pelletoidaan sentrifugoimalla 15 ja kuivataan vakuumissa. Pelletit liuotetaan 30 mikrolitraan vettä ja varastoidaan -20°C:ssa.

1 mikrogramma pBR322 (BRL Labs) käsitellään BAM I:llä ja bakteeriperäisellä alkalisella fosfataasilla ja laitetaan 5 mikrolitran tilavuuteen vettä. Tähän lisätään 2 mikrolit-20 raa IOX-ligaasipuskuria (20 yksikköä T4 DNA-ligaasia 2 mik-rolitrassa) ja 1 mikrogramma DNA-linkkeripellettejä 2 mik-rolitrassa vettä. Tilavuus säädetään 20 mikrolitraksi lisää-: mällä vettä. Seosta inkuboidaan 15°C:ssa yön yli. Tuloksena DNA-linkkeri ligatoituu nyt pBR322-plasmidivektoriin ja 25 seos sisältää DNA-linkkeri-pBR322-vektorin.

HB101 E. coli infektoidaan sitten DNA-linkkeri-pBR322-vektorilla. Isäntä-HB-101-soluja esikäsitellään jäähdytetyllä 0,1 M CaC^tlla ja inkuboidaan 4°C:ssa 15 minuutin ajan ja otetaan talteen sentrifugoimalla. 0,3 ml:aan solupellet-30 tiä lisätään 100 mg vektoria. E. coli/vektori-seosta inkuboidaan sitten jäiden päällä 10 minuutin ajan ja sille anne-taan sitten 30 sekunnin lämpöshokki 37°C:ssa. E. coli/vek-toria inkuboidaan sitten jäiden päällä 90 minuutin ajan.

"ML-väliaine"-seos valmistetaan 1 %:sta Bactopep-35 tone'a, 0,5 %:sta hiivauutetta ja 0,5 %:sta NaClta. Sitten lisätään 2 ml ML-alustaa E. coli/vektori--seokseen ja is 77689 seosta inkuboidaan 37°:ssa 60 minuutin ajan. Ampisilliiniä lisätään seokseen niin, että saadaan aikaan konsentraatio 40 mikrogrammaa/ml ja inkubointia jatketaan 37°C:ssa 30 minuutin ajan.

5 0,5 ml seosta maljataan ML-alustalle, joka si sältää 50 mikrogrammaa/ml ampisilliiniä. Tehdään erillinen maljaus käyttäen seoksen laimennusta 1:10. Maljoja inkuboi-daan yön yli 37°C:ssa. Pesäkkeiden lukumäärä lasketaan.

Replikamaljoja tehdään sitten ampisilliinille ja tet-10 rasykliinille. Mielenkiintoa omaavat E. coli-pesäkkeet ovat ne, jotka ovat menettäneet resistenssin tetrasyklii-nille ja säilyttäneet resistenssin ampisilliinille. Likimain 5-10 pesäkettä säilyy hengissä noin 300:sta sellaisesta, jotka havaitaan alkuperäisillä ampisilliiniä sisältä-15 villä maljoilla.

Kutakin E. coli-pesäkettä kasvatetaan erillisesti 10 ml:ssa ML-alustaa seitsemän tunnin ajan 37°C:ssa. Kloramfenikolia lisätään sitten niin, että se saavuttaa konsentraation 100 mikrogrammaa/ml, ja inkubointia jatketaan 20 37°C:ssa yön yli. Liuokset poolataan ja sentrifugoidaan so-lupelletin taiteenottamiseksi. Pelletti otetaan 0,7 ml:aan STET-puskuria (0,05 M Tris.HCl (pH 8,0), joka sisältää 8 % sakkaroosia, 5 % Triton-X-100, 0,5 M EDTA), johon lisätään 50 mikrolitraa lysotsyymiä (10 mg/ml).

25 Seos sentrifugoidaan välittömästi 12 000 g:ssä 10 minuutin ajan huoneen lämmössä..Tuloksena saatava pintanes-te pannaan mikrofugiputkiin. Yhtä suuri tilavuus (likimain 0,4 ml) isopropanolia lisätään ja seos pannaan -20°:seen yhden tunnin ajaksi ja sentrifugoidaan sitten.

30 Tuloksena saatava pelletti pestään etanolilla, sus- pendoidaan uudelleen 0,5 ml saan puskuria (0,02 M Tris.HCl (pH 8,1), joka sisältää 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl) ja käsitel-' lään RNAasi-A: 11a (Millipore) , RNAasilla T1 (Sigma) ja pro- teinaasilla K (EM Biochemicals, Darmstadt) vastaavissa lo-35 pullisissa konsentraatioissa 100 mikrogrammaa/ml, 25 U/ml ja 0,025 mg/ml viiden tunnin ajan 37°C:ssa.

ie 77689

Seosta uutetaan sitten 0,5 ml :11a puskurilla kyllästettyä fenolia ja ravistellaan viiden minuutin ajan ja uutetaan kloroformilla (0,166 ml) viiden minuutin ajan. Tuloksena saatavaa vesifaasia uutetaan eetterillä fenolin 5 ja kloroformin poistamiseksi. 0,05 ml 3 M Na-asetaattia lisätään vesifaasiin ja sitten seuraa 2 tilavuutta kylmää etanolia. Seosta pidetään yön yli -20°C:ssa.

Saostettu DNA pestään etanolilla, vakuumikuivataan ja suspendoidaan uudelleen sopivaan tilavuuteen (likimain 10 100 ml) 0,005 M Tris.HCl (pH 7,4), joka sisältää 0,0001 M

EDTA.

Sitten täytyy testata näyte DNA:sta. Sen kyky inhiboida R-1 DNA-polymeraasia osoittaa sen identtisyyden. DNA testataan leikkaamalla se pBR322-vektorista. Tämä suorite-15 taan valmistamalla ja käyttämällä "digestiseosta". Digesti-seos on 100 mg/ml naudan seerumialbumiinia, 0,02 M Tris.HCl (pH 7,0), 0,1 M NaCl, 0,007 M MgCl2 ja 0,002 M 2-merkapto-etanolia. 0,1 ml:aan digestiseosta lisätään 50 mikrogrammaa pBR322-DNA:ta, jossa on insertti ja 50 yksikköä BAM HI:tä.

20 Seosta inkuboidaan yhden tunnin ajan 37°C:ssa.

Inserttimuotoinen plasmidi-DNA erotellaan sitten gee-lielektroforeesilla. Käytetään 2-%:ista agaroosigeeliä puskurin kanssa, jossa on 0,08 M trizma-emästä, 0,033 M Na-asetaattia, 0,036 M NaCl ja 0,004 M EDTA.

25 Vaihtoehtoista kloonausmenetelmää voidaan käyttää.

Esimerkissä 2 saatu kaksijuosteisen DNA:n seos eli "DNA-L-seos" kromatografoidaan uudelleen DEAE-selluloosalla (Whatman) käyttäen lineaarista 0 - 1,0 M KCl-gradienttiä 0,01 M Tris HC1 -puskurissa (pH 7,8). DNA eluoituu 0,44 - 0,5 M kohdal-30 la ja siihen viitataan tämän jälkeen termillä DEAE-II-DNA. Eluoidut fraktiot, jotka sisältävät DEAE-II-DNA:ta, konsentroidaan dialyysillä polyetyleeniglykolia vastaan. Tämä lisäpuhdistus poistaa hajonneen DNA:n ja tuottaa puhtaamman, kaksijuosteisen, heterogeenisen DNA:iden seoksen. Seos si-* 35 sältää DNA-1:tä ja DNA-2:ta. Vaihtoehtoisesti DNA-1 ja DNA-2 voidaan valmistaa, kuten on kuvattu esimerkissä 5.

17 77689

Kloonaus käyttäen bakteriofagia M13 mp8 voidaan suorittaa millä hyvänsä edellä mainituista DNA-fraktioista seuraaval-la menettelyllä:

Esimerkki 6A

5 Toinen kloonausmenettely

DEAE-II-DNA suspendoidaan 25 mikrolitraan liuosta, joka sisältää 0,067 M Tris pH 8,0, 0,0067 M MgClj/ 0,01 M

2-merkaptoetanolia ja 25 M dGTP, dCTP, dATP ja dTTP. Sitten lisätään T4 DNA-polymeraasia (Bethesda Research Labora-10 tories, Gaithersburg, Md.) 0,014 yksikköä/mg DNA ja inku-bointi suoritetaan 15°C:ssa kahden tunnin ajan. Tämä on muunnos Challberg'in ja Englund'in menetelmistä, joita on kuvattu julkaisussa Enzymology 65:39-43 (1980). Tätä menettelyä käytetään luomaan "tylppiä päitä" DNA-molekyyliin.

15 2 mikrogrammaa fagin M13 mp8 replikatiivimuotoista DNA:ta (New England Nuclear, Boston, Mass.) leikataan Smal-restriktioendonukleaasilla (New England Biolabs, Beverly,

Mass.) ja saostetaan etanolilla. Tämä muuttaa ympyrän muotoisen replikatiivisen muodon lineaariseksi DNA:ksi. Näin kä-20 sitelty lineaarinen DNA suspendoidaan uudelleen 25 mikro- litraan 0,01 M Tris pH 7,8 ja lisätään 280 yksikköä bakteeriperäistä alkalista fosfataasia (Bethesda Research Laboratories).

.. Seosta inkuboidaan 65°C:ssa yhden tunnin ajan, minkä jälkeen liuosta uutetaan perättäin fenolilla ja eetterillä.

25 Valmistetaan ligaatioseos, joka sisältää 0,3 - 10 nanogrammaa tylppäpäistä DNA:ta, 10 nanogrammaa M13-fagin DNA:ta ja 80 yksikköä T4 DNA -ligaasia (New England Biolabs) 0,05 M Tris'issä, pH 7,8; 0,01 M MgCl2; 0,02 M ditiotrei-tolia; 0,001 M ATP; ja 50 mikrogrammaa/ml naudan seerumi-30 albumiinia (nukleaasivapaata, Bethesda Research Laboratories) 20 mikrolitran tilavuudessa. DNA ligatoidaan M13-fagiin in-kuboimalla tätä seosta yön yli 15°C:ssa ja lineaarinen DNA tulee uudelleen ympyrän muotoiseksi.

Sitten on välttämätöntä saattaa uudelleen ympyrän 35 muotoiseksi tullut DNA, joka nyt sisältää kloonattavan DNA:n, johonkin sopivaan isäntään, jossa DNA voi replikoitua. Tätä ie 77689 kutsutaan transfektioksi ja suoritetaan Mandel'in ja Higa'n menettelyn (J. Molecular Biology 53:154 (1970) muunnoksella. E. coli-kantaa JM103 kasvatetaan logaritmiseen vaiheeseen (A600, likimain 0,4) 2 x.YT-alustassa (16 mg/ml Bacto- 5 Tryptone, 10 mg/ml hiivauutetta, 10 mg/ml NaCl). 25 ml viljelmää pannaan jäiden päälle 15 minuutin ajaksi ja solut pelletoidaan sitten sentrifugoimalla ja suspendoidaan 10 ml:aan jääkylmää 0,01 M NaCl. Tämän jälkeen solut pelletoidaan taas sentrifugoimalla, suspendoidaan uudelleen 10 10 ml:aan jääkylmää 0,1 M CaC^ ja jätetään jäiden päälle 20 minuutiksi. Solut pelletoidaan sitten ja suspendoidaan uudelleen 2 ml:aan jääkylmää 0,1 M CaC^ ja inkuboidaan jäiden päällä taas 15 minuuttia. 0,3 ml soluja lisätään sitten ligatoidun DNA:n eriin ja pannaan 37°:n vesihauteeseen 30 15 sekunniksi. Seos pannaan sitten jäiden päälle 90 minuutiksi ravistellen silloin tällöin ja sitten solut maljataan alustalle, joka sisältää isopropyylitiogalaktosidia (IPTG) ja dibromi-dikloori-indoligalaktosidia (xgal) Messing'in menetelmän mukaisesti (Methods in Enzymology, 1983). Sen 20 jälkeen, kun on inkuboitu yön yli 37°C:ssa, kirkkaat plakit valikoidaan edelleen seulottaviksi.

;; Yksijuosteista fagi-DNA:ta saadaan sitten käyttäen menetelmiä, joita ovat kuvanneet Sanger, Coulson, Barreli, Smith ja Rose julkaisussa J. Molecular Biology 143:161 25 (1980), muutamin muunnoksin. Fagiplakit otetaan talteen ham mastikulla ja pannaan 1 ml:n viljelmiin, joissa on logarit-mivaiheisia JM103-soluja (A650, likimain 0,3) 2 x YT-alustassa 17 x 100 mm:n viljelyputkissa. Putkia pyörretetään 300 kierrosta minuutissa 4-8 tunnin ajan 37°C:ssa korkit 30 ilmanvaihtoaukollisinä ilmastuksen sallimiseksi. Kunkin putken sisältö siirretään 1,5 ml:n Eppendorf-sentrifugiput-kiin ja sentrifugoidaan viisi minuuttia Eppendorf-sentrifu-gissa. Pintaneste kaadetaan toiseen Eppendorf-putkeen ja 200 mikrolitraa 20-%:ista polyetyleeniglykoli 6000:ta 2,5 M 35 NaCl:ssä lisätään. Putkia pyörteytetään sitten ja inkuboidaan huoneen lämmössä ainakin 15 minuutin ajan Eppendorf-

II

19 77689 sentrifugissa. Pintanesteet poistetaan niin perusteellisesti kuin mahdollista käyttäen pasteurpipettejä, joissa on ulosvedetyt kapillaarikärjet. Pelletit suspendoidaan uudelleen 100 mikrolitraan 0,01 M tris. (pH 7,8), joka sisältää 5 0,0001 M EDTA ja uutetaan 50 mikrolitralla neutraloitua feno lia. DNA etanolisaostetaan ja saatetaan lopulliseen tilavuuteen 25 mikrolitraa. Likimain 5 mikrogrammaa DNA:ta saadaan talteen tällä menettelyllä.

5 mikrolitraa DNA-liuosta (sisältäen likimain 1 mik-10 rogramman DNA:ta) yhdistetään 1 mikrolitraan 15-emäsparista kaksijuosteista M13-primeria (2,5 mikrogrammaa/ml, New England Biolabs, Beverly, Mass.) 1 mikrolitraan puskuria (0,07 M Tris HC1, pH 7,5; 0,07 M MgCl2; 0,5 M NaCl) ja 3 mikrolitraan H20. Tämä seos vedetään kapillaariputkeen, 15 jonka molemmat päät suljetaan liekillä ja pannaan sitten vesiputkeen (13 x 100 mm) 100°C:seen viideksi minuutiksi. Seoksen annetaan jäädä vesiputkeen 30 minuutiksi tämän jäähtyessä huoneen lämpötilaan, Anderson'in, Gait'in, Mayol'in ja Young'in menetelmän mukaisesti, jota on kuvattu julkai-20 sussa Nucleic Acids Research 8:1731 (1980).

Kunkin edellä olevan kapillaariputken sisältö pannaan Eppendorf-putkeen ja yhdistetään 1 mikrolitraan 0,1 M ditiotreitolia, 2 mikrolitraan liuosta, joka on 0,0022 M kunkin 4:n dNTP:n suhteen ja 1 yksikköön DNA-polymeraasin I 25 Klenow-fragmenttia (New England Biolabs). DNA:ta sisältäviä seoksia inkuboidaan 20 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, jona aikana seuraavat lisättiin: 0,5 mikrolitraa 1 mg/ml nukleaasivapaata naudan seerumialbumiinia (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) ja 5 yksikköä Eco RI:tä 30 (Miles Laboratories, Elkhart, 111.) ja Bam HI:tä (New

England Biolabs, Beverly, Mass.) kumpaistakin. Inkubointia jatketaan yhden tunnin ajan 37°:ssa.

Näin saatujen näytteiden elektroforeesi suoritetaan 2-%:isissä agaroosigeeleissä käyttäen juoksevaa puskuria, 35 jossa on 0,08 M Tris HC1 pH 7,8, 0,03 M natriumasetaattia, 0,036 M natriumkloridia, 0,004 M EDTA ja 0,5 mikrogrammaa/ml 20 77689 etidiumbromidia. Geelit ajetaan upotettuina minigeelilait-teessa. (C.B.S. Scientific, Del Mar, Cal.) 20 m.a. vakio-virralla. Asianomaisten DNA:iden vaellus voidaan mitata havainnoimalla geelejä ultraviolettivalossa hetkellä, jolloin 5 jäljitysväri bromifenolisininen on vaeltanut 3 tai 4 cm alkukohdasta.

Fageja plakeista, joilla on havaittu olevan inserti-oita, käytetään yhden ml:n viljelmien tekemiseen, kuten edellä on kuvattu seulontaa varten 10 ml:n eriä 1 ml:n vil-10 jelmistä, jotka on jäädytetty -70°:ssa, voidaan käyttää suoraan plakeista hammastikuilla otettujen fagien sijasta. Fagiviljelmä lisätään 200-500 ml:aan E. coli JM 101:n loga-ritmivaiheista viljelmää (A600, likimain 0,3) 2x YT-alus-tassa. Tätä viljelmää ravistellaan 37°:ssa neljän tunnin 15 äjan, kloramfenikolia lisätään sitten 100 mikrogrammaan/ml ja inkubointia jatketaan vielä 2-3 tuntia.

Replikatiivisen muodon puhdistus suoritettiin Holmes'in ja Quiglye'n menetelmällä, jota on kuvattu julkaisussa Analytical Biochemistry 114:193 (1981). Solut pel-20 letoidaan sentrifugoimalla ja pestään käyttäen 0,01 M Tris, 0,002 M EDTA, sitten sentrifugoidaan ja suspendoidaan uudelleen 20-35 ml:aan 8-%:ista sakkaroosia, 5-%:ista Triton X 100, 0,05 M EDTA ja 0,05 M Tris, pH 8,0 (STET-puskuri). Lisätään 25-50 mikrolitraa lysotsyymin perusliuosta, jossa on 25 50 mg/ml (Worthington Biochemicals, Freehold, N.J.). Solu- suspensio saatetaan kiehumaan liekin yläpuolella, pannaan kiehuvaan vesihauteeseen 40 sekunniksi ja välittömästi pyöritetään 12 000 x G:ssä 10 minuutin ajan. Pintaneste, joka sisältää replikatiivista muotoa olevan DNA:n, dekantoidaan 30 ja DNA saostetaan isopropanolilla. Replikatiivinen muoto puhdistetaan edelleen CsCl-tiheysgradienttisentrifugoinnilla käyttäen etidiumbromidia. Etidiumbromidi poistetaan DNA-liuoksesta kahdella uutolla CsCl-kyllästetyllä isopropanolilla. Näytteitä dialysoidaan sitten 0,01 M Tris, pH 7,8, 35 0,0001 M EDTA vastaan ja konsentroidaan 30-%:ista polyety- leeniglykolia samassa puskurissa vastaan.

Il 21 77689

Restriktioentsyymejä Bam HI ja Eco Rl käytetään in-sertioiden poisleikkaamiseen, jotka erotellaan vektori-DNA:sta 2-%:isillä agaroosigeeleillä, jotka ajetaan kuten on kuvattu seulontamenettelylle yllä. Insertiovyöt elektro-5 eluoidaan kouruihin, joita on leikattu agaroosiin, käyttäen Yang'in, Lis'in ja Wu'n menetelmää, Methods in Enzymology 68:176 (1979), etanolisaostetaan ja rekonstituoidaan sopivalla puskurilla.

Analyyttisiä testejä on suoritettu kloonatulle 10 DNA-L:lie DNA:n identtisyyden varmistamiseksi suuremmalla spesifisyydellä. Kolmen DEAE-II-DNA:n, jotka on kloonattu MOPC-21-tuumorikudoksesta, osittaiset sekvenssit luetteloidaan alempana:

Kloonin "A" sekvenssi (210 emäsparia pitkä) 15 1 11 21 31

AACCACGCTT TTGCCAACCG AACACCATTG GGTGATGCCA

41 51 61 71

TCGATTCAAC ATATTTGCTG TCGGTGCAGA GCCGCATCTG

20 81 91 101 111

ACACGGTTGG TTCAACGCGC AGATCACGGC GGTCATTTCC

121 131 141 151 25

ATGCGGTTGT TGGTGGTCTG CGGCTCGGAG CCGACCAGTT

161 CCTTCTCCT ....

30

Kloonin "B" sekvenssi 1 11 21 31

TTATCAGTGA TTACATATCA TTTGAGTTCT TTTGTGATTG

35 41 51 61 ... TGTTACTCAC TCAGGCTCAT TGTGTGA ....

22 77689

Kloonin "C". sekvenssi 1 11 21 31 TGATTTTCAG ATTTCTTGCC ATATTCCACG TCCTACAGTG 5 41 GCATTTCTA ....

Ill. DNA:n leimaus 10 DNA-1:n kloonauksen jälkeen saattaa olla toivottavaa "leimata" se kloonausmenettelyn osien varmennuksen mahdollistamiseksi. Sitä paitsi alempana kuvattavat malignisuus-testimenettelyt vaativat "leimatun" DNA:n käyttöä, so.

DNA:n, joka on fysikaalisesti tai kemiallisesti käsitelty 15 niin, että sitä voidaan seurata ja mitata seuraavien menettelyjen läpi. Tyypillisesti käytetään radioaktiivista materiaalia molekyylien leimaamiseksi sellaisia tarkoituspe- 32 riä varten. Keksijä on havainnut, että fosfori 32 ( P) 3 ja tritium ( H) ovat erityisen käyttökelpoisia ja tehokkai-20 ta isotooppeja DNA-L:n leimaamiseen. On myös alalla tunnettua käyttää optisesti aktiivisia leimoja, kuten värejä tai fluoresoivia komplekseja ja käyttää säteilyä läpäisemättömiä agensseja täten leimattujen aineiden visualisoinnin avuksi. Tästä syystä tarkoitetaan sisällyttää leimaamisen 25 käsitteeseen (siten kuin jäljempänä esitetään patentti-•;· vaatimuksissa) kaikki sellaiset toisiaan vastaavat keinot.

Edelleen saattaa kilpailevaan sitoutumiseen käytettävä leimattu DNA olla modifioitu syöpä-DNA, joka on valittu affiniteettinsa entsyymiin, johon testin luonnollinen 30 syöpä-DNA sitoutuu, perusteella; tällaisissa tapauksissa modifioitua DNA:ta voidaan käyttää luonnollista perää olevan ; DNA:n sijasta testin DNA-koettimena.

Radioaktiivinen leima pannaan sisään DNA-molekyyliin -·· entsymaattisella prosessilla, kuten kuvataan alempana. Seu- -*! 35 raava esimerkki viittaa DNA-1 :een, mutta menettely DNA-2:lle tai DNA-1:stä, DNA-2:sta tai DNA-L:stä kloonatulle DNA:lie 23 7 7 6 8 9 on olennaisesti identtinen. Alempana käytettävä termi "DNAasi I" viittaa bakteriaaliseen entsyymiin, joka kykenee aikaansaamaan yksijuosteisia katkoksia tai aukkoja kaksi-juosteisiin DNA-molekyyleihin. Tässä käytetty DNAasi I 5 -entsyymi on se, jota saadaan Millipore Corprsta, mutta on olemassa muitakin toimittajia.

Esimerkki 7 DNA-1:n leimaus 22P:llä

Seos, joka sisältää 5 000 mikroCurieta kantajavapaa-32 10 ta radioleimattua ( P) deoksinukleosiditrifosfaattia (dCTP), joka on leimattu alfa-asemassa, valmistetaan 1,0 ml:aan 0,01 M M Tris.HCl-puskuria (pH 7,4). Kunkin neljän leimaamattoman deoksinukleosiditrifosfaatin (jotka tunnetaan alalla nimillä dCTP, dATP, dGTP ja TTP) erilliset 15 liuokset valmistetaan, jotka sisältävät 0,2 nanomoolia/ mikrolitra ja käyttäen samaa puskuria. Sitten valmistetaan 32 seos, joka sisältää 20 mikrolitraa radioleimattua P-de-oksinuleosiditrifosfaattia, 10 mikrolitraa kutakin leimaa-mattomista deoksinukleosiditrifosfaateista dGTP, dATP ja 20 TTP ja 2 mikrolitraa leimaamatonta dCTP. Tätä seuraa 10 mikrolitraa 10x^reaktiopuskuria ja 2 mikrogrammaa esimerkin 6 DNA:ta 2 mikrolitrassa. Sekoittamisen jälkeen lisätään tislattua vettä, niin että kokonaistilavuudeksi saadaan 97 mik-;;; rolitraa. Tähän viitataan "leimausseoksena".

*"* 25 "Aktivointipuskuri" valmistetaan sekoittamalla 10 ml

Tris.HCl (pH 7,6), 0,005 M MgC^ ja 1 mg/ml nukleaasivapaa-ta BSA:ta. 9 mikrolitraa aktivointipuskuria sekoitetaan 1 mikrolitraan liuosta, joka sisältää 100 mikrogrammaa/ml DNAasia I (vastaa 0,1 mikrogrammaa DNAasia I), ja seos jä-30 tetään 4°C:seen kahden tunnin ajaksi. Tähän seokseen viitataan termillä "aktivoitu DNAasi I".

Yksi mikrolitra aktivoitua DNAasia I lisätään 97 mikrolitraan leimausseosta ja tuloksena saatavaa seosta inku-boidaan 10 minuutin ajan 15°C:ssa. Tähän seokseen lisätään 35 sitten kaksi yksikköä E. colin DNA-polymeraasia I (1 yksik-• kö/mikrolitra) 2 mikrolitrassa kalium-PO^ (pH 7,0) -puskuria.

24 7 7 6 8 9

Puskuri on 0,001 M 2-merkaptoetanolin suhteen ja sisältää 50 % glyserolia. Reaktiota jatketaan yhden tunnin ajan ja se pysäytetään lisäämällä 0,2 ml 0,3 M Na2EDTA (pH 8,0).

DNA erotellaan sitten jäännösnukleotideista kromatografial-5 la Sephadej^G-50 -pylväässä (hieno laatu) (Pharmacia), joka on etukäteen tasapainotettu sopivassa tilavuudessa 0,01 M Tris.HCl:ää, joka sisältää 0,001 M Na2EDTA (pH 8,0).

Esimerkki 7A

DNA:n leimaus fluoresoivalla värillä (etidiumbromidi) 10 1,0 mitään 0,1-%:ista etidiumbromidiliuosta lisätään 1,0 ml liuosta, joka sisältää 10 mikrogrammaa DNA-L/ml. Seokselle tehdään geelisuodatus SephadesT^G-10 -pylväässä reagoimattoman etidiumbromidin poistamiseksi. Leimattu DNA-L otetaan talteen 0,01 M Tris.HCltään, joka sisältää 15 0,0001 M Na2EDTA:ta, (pH 8,0), kuten esimerkin 6 lopussa.

Etidiumbromidi interkalatoituu DNA-kaksoisheliksin juosteiden väliin. Se on viritettävissä 518 nmtn aallonpituudella ja emittoi 610 nm:n aallonpituudella.

Esimerkki 7B

20 DNA:n leimaus fluoresoivan vasta-aineen menetelmällä " Nick-translaatio"-menettelyä, joka on samankaltainen kuin esimerkissä 7 oleva, voidaan käyttää biotinyloidun deoksiuridiinitrifosfaatin (dUTP) kanssa. Yhtä menettelyä kuvataan julkaisussa Gardner, Non-radioactive DNA Labeling: 25 Detection of Specific DNA and RNA Sequences on Nitrocellulose and in situ Hybridizations, Biotechniques 1:38-41 (1983).

Biotinyloitua dUTP:tä käytetään esimerkin 7, kappale 1, 32 O-leimatun deoksinukleosiditrifosfaatin sijasta. Niinpä 30 100 nanomoolia biotinyloitua deoksinukleosiditrifosfaattia (dUTP) pannaan 2 mikrolitraan 0,01 M Tris:iä (pH 7,4). Ei-biotinyloitujen deoksinukleosiditrifosfaattien (dATP, dCTP, cAMP, TTP) erilliset liuokset tehdään samoihin puskuri-konsentraatioihin siten, että 2 mikrolitraa tulee sisältä-35 mään 50 nanomoolia kutakin ei-biotinyloiduista deoksinukleo-sidifosfaateista. Sitten valmistetaan seos, joka sisältää

II

25 77689 2 mikrolitraa biotinyloitua dUTP:ta ja 2 mikrolitraa kutakin ei-biotinyloiduista deoksinukleosiditrifosfaateista. Tätä seuraa 10 mikrolitraa 10x reaktiopuskuria ja 2 mikro-grammaa esimerkin 6 DNA:ta 2 mikrolitrassa. Sekoittamisen 5 jälkeen lisätään tislattua vettä kokonaistilavuuden saamiseksi 97 mikrolitraksi. Tähän viitataan "leimausseoksena".

Sitten seurataan menettelyä/ jota kuvataan esimerkin 7 kappaleissa 2 ja 3.

Biotiini todetaan sitten biotinyloituneelta DNA:lta 10 vasta-aineella, erityisesti vuohen anti-biotiinin IgG-frak-tiolla ja fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC)-konjugoidun kaniinin anti-vuohi-vasta-aineella (Enzo Biochem Inc.)· Vuohen anti-biotiini sitoutuu DNA:ssa olevaan biotiiniin, mitä sitten seuraa FITC-kaniini-anti-vuohi-vasta-aineen si-15 toutuminen vuohi-anti-biotiiniin. DNA:n molekyylipaino on likimain yhtä suuri kuin immunoglobuliinin. Tästä syystä 1 mikrogramman biotinyloitunutta DNA:ta annetaan reagoida 1 mikrogramman kanssa vuohen anti-biotiinin IgG-fraktiota, mitä seuraa reaktio 1 mikrogramman kanssa FITC-konjugoitua 20 kaniinin anti-vuohi-vasta-ainetta. Koko DNA:n ja vasta-aineiden muodostamaa kompleksia käytetään testissä samalla tavalla kuin radioleimattua DNA:ta.

IV. Entsyymi-koniugoidun matriisin ia puhdistusmat-riisin valmistus testejä varten 25 Saattaa olla joukko entsyymejä muissa kudoksissa ·; muista lajeista, jotka DNA-L kykenee selektiivisesti inhi boimaan. Vaikka keksijä on toistaiseksi löytänyt vain yhden, joka on tehokas näissä testeissä, uskotaan, että yrityksen ja erehdyksen menettelyt kehittäisivät muita, jotka 30 ovat käyttökelpoisia näissä testeissä tässä kuvattujen menettelyjen pohjalta. Tässä käytetty entsyymi on R-l DNA-polymeraasi, joka on uutettu hiiren myeloomatuumorista menettelyllä, jota kuvataan julkaisussa Analytic Biochemistry 87:411 (1978), supra. Keksijä on testannut R-l DNA-polyme-raasia näytteillä, jotka sisältävät muita DNA:itä, joita saattaa olla läsnä 26 77689 veressä ja muissa kehon nesteissä ja havainnut, että mikään noista DNA:ista ei näyttänyt spesifisesti inhiboivan R-1 DNA-polymeraasia (selektiivisesti sitoutuvan siihen).

Esimerkki 8 5 Entsyymi-konjugoidun matriisin valmistus testejä varten

Suoritetaan esimerkin 3 tai 4 menettely käyttäen samaa CNBr-aktivoitua-SepharosJ^:a tai Polybeads'eja. Esimerkin 5 esikäsittelymenettely suoritetaan. Entsyymisisältö 10 määritetään menettelyllä, jota on kuvattu julkaisussa

Gottlieb et ai., Cancer Research 40:758-770 (1980), supra, ja merkitään muistiin.

Tuloksena saatava tuote on R-1 DNA-polymeraasi-ent-syymi-konjugoitu matriisi, joka on sopiva käytettäväksi täs-15 sä kuvattavissa testeissä. Se säilyy stabiilina 4°C:ssa ainakin kolmen kuukauden ajan. Se voidaan regeneroida toistettua käyttöä varten pesemällä 1 M KCl:llä määrityspusku-rin seuraamana.

Seeruminäytteet voivat sisältää pieniä määriä "ulko-20 puolisia DNA:itä", so. DNA:itä, jotka eivät ole yhteydessä DNA-L:ään. Sellaiset ulkopuoliset DNA:t voisivat häiritä testin tarkkuutta sitoutumalla osaan R-1 DNA-polymeraasis-ta entsyymi-konjugoidulla matriisilla. Kuitenkaan sellaiset ulkopuoliset DNA:t eivät ole spesifisiä R-1 DNA-polymeraa-25 sille. Tästä syystä ne voidaan "puhdistaa pois" käyttäen ulkopuolista entsyymiä jollakin sopivalla matriisilla. Käänteinen transkriptaasi-entsyymi, joka on johdettu Rauscher'in leukemiaviruksesta, ei inhiboidu DNA-1:n, DNA-2:n tai DNA-L:n vaikutuksesta, mutta sitä inhiboi laaja joukko erilaisia mui-30 ta, ulkopuolisia DNA:itä. Yhtä menetelmää entsyymin valmistamiseksi kuvataan julkaisussa Ross, Scolnik, Todaro ja Aaronson, Nature New Biology 23i: 163-70 (1971). Tätä entsyymiä voidaan käyttää puhdistusmatriisin valmistamiseen testi-näytettä varten, kuten kuvataan alempana.

27 77689

Esimerkki 8A

Puhdistusmatriisin valmistus testejä varten

Likimain 0,1 grammaa Polybead Microspheres'ejä pestään kalium-PO^-puskurissa (pH 7,2 - 7,6). Likimain 25 mik-5 rolitraa helmien konsentroitua suspensiota lisätään 75 mik-rolitraan samaa kalium-PO^-puskuria yhdessä 10 mikrolitran kanssa 1-etyyli-3-3-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidin 1 gramma/ml -liuosta ^Orssa (ECDI) . Seosta inkuboidaan huoneen lämpötilassa (24°C) 30 minuutin ajan. Helmet pestään 10 sitten samalla kalium-P04-puskurilla ja suspendoidaan uudelleen 75 mikrolitran eriin tätä puskuria, joka sisältää 4 % glyserolia. Helmet siirretään syrjään ja varastoidaan tässä tilassa.

Likimain 75 mikrolitraa edellä olevaa varastoitua 15 helmituotetta pannaan koeputkeen. Puhdistettua käänteistä transkriptaasia (0,5 -1,0 mikrogrammaa/mikrolitra) lisätään, kunnes seos saavuttaa 100 mikrolitran tilavuuden.

Seosta inkuboidaan sitten 30 minuuttia huoneen lämmössä (24°C).

20 10 mikrolitraa 0,2 M glysiiniä (pH 7,6 - 8,0) tai 10 mikrolitraa naudan seerumialbumiinin liuosta (20 mg/ml) lisätään sitten hitaasti seokseen ja inkubointia suoritetaan 30 minuutin ajan huoneen lämmössä (24°C), ravistellen ajoittain. Helmet pestään sitten kahdesti "varastointipus-25 kurilla" (0,05 M Tris pH 7,8; 0,004 M beeta-merkaptoetano-lia; 0,04 M KC1 0,2 mg/ml naudanseerumialbumiinia; 0,0001 M MnCl2 20-%:ista glyserolia) ja suspendoidaan uudelleen 50 mikrolitraan varastointipuskuria. Se pannaan sitten syrjään, kunnes käytetään. Ennen käyttöä helmet työstetään pestyinä 30 0,1-%:isessa denaturoidun lohen siemennesteen DNA:n liuoksessa varastointipuskurissa, mitä seuraa huuhtelu varastoin-tipuskurissa. Tämä tuote on "puhdistusmatriisi".

Esimerkki 8B

Puhdistusmatriisin käyttö testinäytteen puhdistamiseen — 3 35 Likimain 1 cm esimerkin 1 testinäytettä sekoitetaan 10 mikrolitraan esimerkin 8A puhdistusmatriisia. Seosta 28 77689 ravistellaan perusteellisesti ja se siirretään syrjään 30 minuutiksi huoneen lämmössä (24°C). Sitä sentrifugoidaan sitten 10 minuuttia 1 000 g:ssä. Pintaneste on "puhdistettu testinäyte". Helmet voidaan ottaa talteen ja käyttää uudel-5 leen.

V. Testimenettely

Kuten jo on osoitettu, keksintö toteaa syöpä-DNA:n (DNA:n, jonka tuotto huomattavassa määrässä liittyy maligni-suuksiin) läsnäolon "kilpailevan sitoutumisen" avulla. Lei-10 mattu syöpä-DNA "kilpailee" minkä hyvänsä syöpä-DNA:n kanssa (so. toimii DNA-koettimena sille), jota esiintyy testi-potilaan veressä (tai muussa kehon nesteessä), entsyymi-konjugoidussa matriisissa olevalla entsyymillä olevista sitoutumiskohdista. Koska entsyymi-konjugoitu matriisi on 15 esikäsitelty muulla DNA:11a (kuten lohen siemennesteen DNA:lla), ne entsyymi-konjugoidulla matriisilla olevat sitoutumiskohdat, joilla on yleinen affiniteetti DNA:ta kohtaan (pikemminkin kuin selektiivinen affiniteetti mielenkiinnon kohteena olevaa syöpä-DNA:ta, kuten esimerkiksi 20 DNA-L:ää, kohtaan), ovat jo sidotut eivätkä häiritse testi-menettelyä. Myös se mahdollisuus, että läsnä olisi ulkopuolisia DNA:ita, jotka voisivat häiritä testiä, koska ne sitoutuvat mihin hyvänsä joukosta entsyymipaikkoja, mahdollisesti mukaan lukien R-1 DNA -polymeraasi, saadaan ehkäis-25 tyksi esikäsittelemällä testinäytettä puhdistusmatriisilla. Entsyymi-konjugoidun matriisin ottaman ja siihen sitoutuneen leimatun syöpä-DNA:n osuus on suhteessa kilpailevan syöpä-DNA^ läsnäoloon tai poissaoloon testipotilaan veressä (tai nesteessä). Jos läsnä ei ole yhtään kilpailevaa syöpä-30 DNA:ta, maksimimäärä leimattua syöpä-DNA:ta sitoutuu entsyymikon jugoituun matriisiin. Mutta jos kilpailevaa DNA:ta on : läsnä, vähäisempi määrä leimattua DNA:ta sitoutuu entsyymi kon jugoituun matriisiin. Entsyymi-konjugoituun matriisiin näissä olosuhteissa sitoutuneen leimatun DNA:n (DNA-koetti-35 men) osuus on täten indikaattori syöpä-DNA:n läsnäololle testipotilaan veressä tai nesteessä.

29 77689

Testimenettelyyn kuuluvat vaiheet testinäytteen valmistaminen testipotilaan verestä tai nesteestä (esimerkki 1), sen puhdistaminen puhdistusmatriisilla (esimerkit 8A ja 8B), leimatun DNA:n sekoittaminen (esimerkki 7) - edulli-5 semmin kloonatun (esimerkki 6) kuin luonnollisen - puhdistettuun testinäytteeseen, leimattua DNA:ta sisältävän testi-näytteen ("DNA/näyte-seos") "vieminen" entsyymi-konjugoi-tuun matriisiin (esimerkki 8) ja lopuksi sen määrittäminen, kuinka paljon leimattua DNAzta on tullut sidotuksi entsyymi-10 konjugoituun matriisiin.

DNA/näyte-seoksen "viemiseksi" entsyymi-konjugoituun matriisiin jokin tunnettu määrä DNA/näyte-seosta sekoitetaan puskuriin ja johonkin tunnettuun määrään esimerkin 8 esikäsiteltyä entsyymi-konjugoitua matriisia. Viimeksi mai-15 nittu sisältää jonkin tunnetun määrän entsyymiä. Tuloksena saatavaa seosta inkuboidaan sitten 15 minuutin ajan 25°C:ssa. Matriisi erotetaan sitten DNA/näyte-seoksen ja puskurin neste jäännöksestä sentrifugoimalla. Parhaiden tulosten saamiseksi leimatun DNA:n ja entsyymi-konjugoidun matriisin suh-20 teellisillä konsentraatioillatulisi olla sellainen suhde, että - mielenkiintoa omaavien syöpä-DNA:iden (jotka, leukemian tapauksessa ovat DNA-L) ennakoiduilla konsentraatioilla testinäytteessä - normaalilla verinäytteellä ja "malig-nilla" verinäytteellä tehdyn testin tulosten välillä on mel-25 koinen ero (esimerkiksi 10 % vastaan 90 %). Tämä saavutetaan edullisesti silloin, kun: (1) testinäytteeseen lisätyn DNA-L:n määrä lievästi ylittää entsyymi-konjugoidussa matriisissa olevan entsyymin määrän (molekyylien määrän mukaan), niin että lisätty DNA-L voi sitoutua kaikkiin paikkoihin 30 entsyymille ja että vielä jää lievä ylimäärä DNA-L:ää ja (2) testinäytteessä läsnäoleva luonnollisen DNA-L:n määrä, jos potilaalla on malignisuus, on ainakin useita kertoja .... entsyymin määrä (molekyylien määrän mukaan).

Keksijä uskoo, että 1 molekyyli DNA:ta sitoutuu 35 1 molekyyliin entsyymiä, että DNA-L:n molekyylipaino on li kimain yhtä suuri kuin 0,65 R-1 DNA-polymeraasientsyymin 30 7 7 6 8 9 molekyylipainosta, niin että 0,65 nanogrammaa puhdasta DNA-L:ää ja 1,0 nanogrammaa puhdasta entsyymiä kumpikin edustavat samaa molekyylien (so. DNA-L:n tai entsyymin, tässä järjestyksessä) lukumäärää ja että 0,65 nanogrammaa 5 DNA-L:ää sitoutuu 1,0 nanogrammaan R-1 DNA -polymeraasia ja niin edelleen. Edelleen uskotaan, että entsyymin mole-kyylipaino on likimain 200 000 ja että DNA-L:n molekyylipai-no on likimain 130 000. Seuraavana tulevia esimerkkejä kuvataan puhdistetun DNA-L:n ja olennaisesti homogeenisuuteen 10 puhdistettujen R-1 DNA -polymeraasientsyymin valmisteiden valossa.

On ainakin kaksi tapaa testata leimatun DNA:n ottoa.

Toinen ontestata jäännösnestettä, joka jää jäljelle entsyymikon jugoidun matriisin poistamisen jälkeen. Jos x prosenttia 15 leimatusta DNA:sta (DNA-koettimesta) jää jäljelle jäännös-nesteeseen, 100-x prosenttia sitoutui entsyymi-konjugoituun matriisiin. Toinen tapa on testata entsyymi-konjugoitua matriisia uuttamalla siitä olennaisesti kaikki sitoutunut, leimattu DNA ja mittaamalla viimeksi mainittu. Ideaalisesti 20 kaksi menetelmää ovat toisiaan täydentäviä ja leimatun DNA:n kahden määrän (jäännösnesteessä ja entsyymi-konjugoidussa matriisissa) summan tulisi olla yhtä suuri kuin testiseeru-miin lisätyn leimatun DNA:n määrä.

Valitettavasti näin ei tapahdu, johtuen koevirheistä. 25 Ensimmäisen menetelmän, jäännösnestemääritysmenetelmän, uskotaan olevan tarkin. Toiseen menetelmään, matriisimääri-tysmenetelmään, tulee mukaan häviöitä pesussa, riittämättömässä uutossa ja niin edelleen, joiden uskotaan kohoavan noin 25 %:iin. Tämä arvio perustuu keksijän testeihin, 30 joissa käytettiin testiseerumia, jossa oli 100 % leimattua DNA-L:ää, siten että DNA-L:ää oli läsnä ylimäärin verrattuna käytettävissä oleviin paikkoihin, niin että noin 50 % olisi ollut kummassakin osuudessa ja joissa suoritettiin molemmat määritysmenetelmät ja katsottiin kaiken häviön liittyvän 35 matriisimääritysmenetelmiin.

Il 31 77689

Edullinen suoritusmuoto ainakin DNA-L:ää ja leuke-miatestiä varten on tästä syystä jäännösnestemääritysmenetel-mä pikemmin kuin matriisimääritysmenetelmä, vaikkakin viimeksi mainittu on tarkistus ensin mainitulle. Voidaan myös 5 todeta, että matriisimääritysmenetelmän menettelyt ovat työläämpiä ja aikaavievempiä kuin jäännösnestemääritysmene-telmän menettelyt.

Kaikki seuraavat esimerkit viittaavat DNA-1:een. Kaikissa keksijän tuntemissa suhteissa DNA-2 tuottaa identtiset 10 tulokset DNA-1:een verraten, eikä siitä, kumpaa käytetään tai käytetäänkö seosta, joka sisältää DNA-1:tä ja DNA-2:ta, aiheudu mitään keksijän tuntemaa eroa. Myöskään ei havaita mitään eroa testien, joissa käytetään kloonattua DNA-L:ää, joka on alkuperäisesti saatu, vastaavasti ihmisistä tai hii-15 ristä, tulosten välillä, vaikkakin uskotaan, että ihmisen ja hiiren DNA-L eivät ole identtiset. Kuitenkin tuloksissa saattaa olla eroja, jotka aiheutuvat useiden erilaisten kloonattujen DNA:iden ja seerumeiden, jotka ovat peräisin useilta eri potilailta, joilla on erilaiset lymfoidiset 20 syövät, käytöstä.

Esimerkki 9

Normaalin hiiren testi (jäännösnestemääritysmenetelmä) 3 1,0 cm seerumia saadaan laboratoriohiirestä, jonka uskotaan olevan normaali. Testinäyte valmistetaan esimerkin 25 1 mukaisesti ja puhdistetaan esimerkkien 8A-8B mukaisesti.

3 0,5 cm :iin puhdistettua testinäytettä lisätään 3 0,5 cm vesipitoista puskuroitua seosta, joka sisältää esimerkin 7 leimatun DNA-1:n liuoksen. DNA-liuos sisältää 1,0 3 mikrogrammaa/cm esimerkin 6 puhdasta, leimattua, kloonat-30 tua DNA-1:tä, eli yhteensä 500 nanogrammaa. Liuokset sekoitetaan perusteellisesti ja tuloksena saatava DNA/näyte-seos on sitten valmis "vietäväksi" entsyymikonjugoituun matriisiin.

0,5 ml määritetyn ja esikäsitellyn entsyymi-konjugoi-35 dun matriisin suspensiota, joka sisältää 650 nanogrammaa R-1 DNA-polymeraasientsyymiä, lisätään DNA/näyte-seokseen.

32 7768 9

Sen jälkeen, kun oli inkuboitu 25°C:ssa 15 minuutin ajan, matriisi otetaan talteen sentrifugoimalla ja pannaan syrjään.

Jäännösneste kerätään. Se testataan leimatun DNA-1:n suhteen nestetuikespektrometrialla. Havaitaan jäännösnesteen 5 sisältävän 78 nanogrammaa leimattua DNA-1:tä. Tämä on 16 % määrästä, joka alunalkaen oli DNA/näyte-seoksessa.

Hiiri pidetään hengissä 30 päivän ajan ja tapetaan sitten, minä aikana se ei osoita mitään malignisuuden merkkejä.

10 Esimerkki 10

Normaalin hiiren testi (matriisimääritysmenetelmä)

Esimerkin 9 testi toistetaan, mutta määritys suoritetaan matriisista nestetuikespektrometrialla.

Havaitaan, että matriisi on sitonut itseensä 28 nano-15 grammaa leimattua DNA-1:tä. Tämä on 56 % määrästä, joka alunalkaen oli DNA/seerumi-seoksessa.

Esimerkki 11

Leukemiaa sairastavalle hiirelle suoritettu testi

Esimerkin 9 kappaleiden 1-3 menettely toistetaan la-20 boratoriohiirellä, jolla tiedetään olevan multippelimyeloo-ma. Jäännösnestemääritysmenetelmää käytetään.

Havaitaan, että jäännösneste sisältää 410 nanogrammaa leimattua DNA-1:tä. Tämä on 82 % määrästä, joka alunalkaen oli DNA/näyte-seoksessa. Tämän prosenttiosuuden suhde esi-25 merkki 9:n vastaavaan (normaali hiiri) on likimain 5,1:n suhde 1:een.

Hiiri tapetaan. Tutkimus autopsiassa paljastaa tyypilliset myelooman tunnusmerkit.

Testimenetelmän herkkyyden osoittamiseksi leukemia-30 solujen pienten pesäkkeiden varhaisessa toteamisessa käytettäväksi voidaan valmistaa laimennettu leukemianäyte. Puhdistettu testinäyte esimerkin 11 hiirestä laimennetaan tästä syystä puhdistetulla testinäytteellä esimerkin 9 normaalista hiirestä suhteessa 1:1 000. Aikaisempaa testime-35 nettelyä muunnetaan DNA-L:n vähäisemmän määrän, jonka ennakoidaan olevan läsnä, ottamiseksi huomioon.

li 33 7 7 6 8 9

Esimerkki 12

Leukemiaa sairastavalle hiirelle suoritettu laimennustesti

Esimerkin 9 testimenettelyjä seurataan laimennetulla 3 puhdistetulla testinäytteellä. 0,5 cm :iin laimennettua puh- 3 ...

5 distettua testinäytettä lisätään 0,5 cm vesipitoista pusku-roitua seosta, joka sisältää 1,0 nanogrammaa/cm esimerkin 7 puhdasta, leimattua, kloonattua DNA-1:tä, so. yhteensä 0,5 nanogrammaa. Samoin käytetään 0,65 nanogrammaa entsyymiä. Jäännösnestemääritysmenetelmän käyttö osoittaa, että jään-10 nösneste sisältää 0,4 nanogrammaa leimattua DNA:ta, mikä on 80 % alkuperäisestä määrästä.

Sama testi toistetaan esimerkin 9 sekoittamattomalla "normaalilla" testiseerumilla. Jäännösnestemääritysmenetelmän käyttö osoittaa, että jäännösneste sisältää 0,08 nano-15 grammaa leimattua DNA-1:tä, mikä on 16 % alkuperäisestä määrästä. Kahden prosenttiosuuden suhde on viiden suhde yhteen.

Esimerkki 13

Normaalille ihmispotilaalle suoritettu testi 20 1,0 cm seerumia saadaan ihmispotilaasta, jonka usko taan olevan normaali. Testinäyte valmistetaan esimerkin 1 mukaisesti ja puhdistetaan esimerkkien 8A-8B mukaisesti.

3 0,5 cm :iin puhdistettua testinäytettä lisätään 0,5 cm vesipitoista puskuroitua seosta joka sisältää kloo- 25 nattua DEAE-II-liuosta, joka on leimattu esimerkin 7 mukai- 3 sesti. DNA-liuos sisältää 1,0 mikrogrammaa/cm esimerkin 6A puhdasta, leimattua, kloonattua hiiri-DNA-L:ää, eli yhteensä 500 nanogrammaa. Liuokset sekoitetaan perusteellisesti ja tuloksena saatava DNA/näyte-seos on sitten valmis "vie-30 täväksi" entsyymi-konjugoituun matriisiin.

0,5 ml esikäsitellyn ja määritetyn entsyymi-konjugoi-dun matriisin suspensiota, joka sisältää likimain 650 nanogrammaa puhdasta R-1 DNA-polymeraasientsyymiä, lisätään DNA/näyte-seokseen. Sen jälkeen, kun on inkuboitu 25°C:ssa 35 15 minuutin ajan, matriisi otetaan talteen sentrifugoimalla ja pannaan syrjään uudelleen kierrätystä varten.

34 77689 Jäännösneste kerätään. Se testataan leimatun DNA-1:n suhteen nestetuikespektrometrialla. Havaitaan, että jäännösneste sisältää 70 nanogrammaa leimattua DNA:ta. Tämä on 14 % määrästä, joka alunalkaen oli DNA/näyte-seoksessa.

5 Potilas tutkitaan kuuden kuukauden kuluttua, eikä hänessä näytä olevan mitään leukemian tunnusmerkkejä.

Esimerkki 14

Leukemiapotilaalle suoritettu testi

Esimerkin 13 lukujen 1-3 menettelyt toistetaan ihmis-10 potilaan osalta, jolla tiedetään olevan leukemia. Jäännös-nestemääritysmenetelmää käytetään.

Havaitaan, että jäännösneste sisältää 430 nanogrammaa leimattua DNA:ta. Tämä on 86 % määrästä, joka alunalkaen oli DNA/näyte-seoksessa. Tämän prosenttiosuuden suhde esi-15 merkin 13 (normaali ihmispotilas) vastaavaan on likimain 6,1:n suhde yhteen.

Potilaan tutkimus autopsiassa paljastaa tyypilliset leukemian tunnusmerkit.

Testimenetelmän herkkyyden osoittamiseksi leukemia-20 solujen pienten pesäkkeiden varhaisessa toteamisessa käytettäväksi voidaan valmistaa laimennettu leukemianäyte. Esimerkin 14 leukemiapotilaalta peräisin oleva puhdistetun testiseerumin näyte laimennetaan siitä syystä esimerkin 13 normaalilta ihmispotilaalta peräisin olevalla puhdistetulla 25 testinäytteellä, suhteessa 1:1 000. Aiempaa testimenettelyä muunnetaan DNA-L:n vähäisemmän määrän, jonka ennakoidaan olevan läsnä, ottamiseksi huomioon.

Esimerkki 15

Leukemiapotilaan näytteellä suoritettu laimennus-30 testi

Esimerkin 13 testimenettelyjä seurataan puhdistetun 3 laimennetun testinäytteen osalta. 0,5 cm :iin puhdistettua - · laimennettua testinäytettä lisätään 0,5 cm^ vedellistä pus- 3 kuroitua seosta, joka sisältää 1,0 nanogrammaa/cm esimer-35 kin 6A puhdasta, leimattua, kloonattua DEAE-II-DNA:ta, so. yhteensä 0,5 nanogrammaa. Samoin käytetään 0,65 nanogrammaa

II

35 77689 entsyymiä. Jäännösnestemääritysmenetelmän käyttö osoittaa, että jäännösneste sisältää 0,42 nanogrammaa leimattua DNA:ta, mikä on 84 % alkuperäisestä määrästä.

Sama testi toistetaan esimerkin 13 sekoittamattomalla 5 "normaalilla" testiseerumilla. Jäännösnestemääritysmenetelmän käyttö osoittaa, että jäännäsneste sisältää 0,09 nanogrammaa leimattua DNA:ta, mikä on 18 % alkuperäisestä määrästä. Kahden prosenttiosuuden suhde on 4,7:n suhde yhteen.

VI. Tarvikesarjät ja laitteet 10 Suuren mittakaavan seulonnan ja testauksen, joiden uskotaan olevan välttämättömät FDA:n vaatimusten tyydyttämiseksi (so. väärien positiivisten ja negatiivisten tulosten poissaolon osoittaminen "kaksoissokko"-olosuhteissa), mahdollistamiseksi ja testin suorittamisen suhteellisen taitamat-15 toman laboratoriohenkilökunnan toimesta mahdollistamiseksi on kehitetty muunnettu menettely, jossa käytetään testitar-vikesarjoja ja asiaan omistettua testilaitteistoa.

Ensinnäkin käytetään standardoitua testimenettelyä, johon kuuluvat etukäteen sekoitetut reagenssit, niin että 20 testi voidaan helposti suorittaa. Tarvikesarja koostuu etukäteen valmistetusta leimatusta DNA-materiaalista, missä leima on jokin fluoresoiva väri (mukaan lukien fluoresoivat kompleksoivat aineet), etukäteen valmistetusta entsyymikon-jugoidusta matriisista ja etukäteen valmistetusta "puhdis-25 tusmatriisista". Toisekseen käytetään sovitettua fluoresenssinmittauskonetta, joka on erityisesti sovitettu ja kalibroitu leukemiatestimenettelyä varten. Tämä menettely ei ehkä ole yhtä tarkka kuin yllä kuvattu radiomääritys-menettely, mutta se on paljon helpompi ja paljon halvempi.

30 (Radioaktiivista leimausta voidaan käyttää sen sijaan, mutta radiomäärityslaitteisto on paljon kalliimpi kuin alempana kuvattava fluoresenssimäärityslaitteisto.) 36 77689 A. Tarvikesarjojen valmistus ja käyttö

Esimerkki 16 DNA tarvikesarjaa varten

Puhdasta, kloonattua DEAE-II-DNA:ta valmistetaan 5 DNA-L:stä, joka on saatu potilaan, jonka tiedetään kuolleen leukemiaan, seerumista. Esimerkin 6A menetelmää käytetään.

3

Seuraavat sekoitetaan 1,0 cm :iin 0,005 M Tris.HCl-puskuria (pH 7,4); 0,5 mg edellisen kappaleen DNA:ta, leimattuna fluoresoivalla leimalla esimerkin 7A mukaisesti (Ra-10 dioaktiivinen leimaus, esimerkiksi P:llä tai Hilla on vaihtoehtoinen keino, kuten yllä on osoitettu. Esimerkin 7B menettelyä voidaan myös käyttää.) Sekoittamisen jälkeen lisätään suolaliuosta, U.S.P. (kuten esimerkiksi Baxter Labo- 3 ratories), kokonaistilavuuden saamiseksi 500 cm :ksi.

3 15 Kuhunkin likimain 1 000:sta 1,0 cm :n astiasta pipe- 3 toidaan 0,5 cm (500 nanogranunaa leimattua DNA:ta) edellisen kappaleen seosta. Astiat ("DNA-astiat") suljetaan umpeen ja pannaan jääkaappiin varastointia varten likimain 5°C:seen.

20 Yhden DNA-astian sisältö kaadetaan 100 ml:n mittala siin. Suolaliuosta lisätään, niin että tilavuus saadaan 3 50 mliksi. Kuhunkin likimain 100:sta 1 cm :n astiasta pi-petoidaan 0,5 ml (5 nanogrammaa DNA:ta) laimennettua DNA-liuosta. Astiat ("1:100-DNA-astiat") suljetaan umpeen ja 25 pannaan jääkaappiin varastointia varten likimain 5°C:seen.

Esimerkki 17A

Entsyymi-konjugoitu matriisi tarvikesarjoja varten

Likimain 10 g esimerkin 4 Polybead Microparticles'eja ("helmiä") pestään kaiium-PO^-puskurissa (pH 7,4). Likimain 30 250 ml helmien konsentroitua suspensiota lisätään 750 ml:aan samaa PO^-puskuria yhdessä 100 ml:n kanssa ECDIitä (1 g/ml vettä). Seosta inkuboidaan huoneen lämmössä yhden tunnin ajan. Helmet pestään sitten samalla puskurilla ja suspen-doidaan uudelleen puskuriin, joka sisältää 4 % glyserolia.

35 Likimain 750 ml helmituotteesta pannaan dekantteriin.

Puhdistettua R-1 DNA-polymeraasia, kuten on kuvattu

II

37 7 7 6 8 9 esimerkissä 3, jonka tiedetään määrityksen perusteella sisältävän likimain 8 mikrogrammaa/ml entsyymiä, lisätään, kunnes seos saavuttaa tilavuuden noin 1,0 1. Seosta in-kuboidaan likimain yhden tunnin ajan 4°C:ssa. Helmet sisäl-5 tävät nyt yhteensä likimain 2 mg R-1 DNA-polymeraasient-syymiä.

100 ml 0,2 M glysiiniä (pH 7,6 - 8,0) tai 100 ml naudan seerumialbumiinin liuosta (20 mg/ml) lisätään sitten hitaasti seokseen ja inkubointia suoritetaan 30 minuu-10 tin ajan huoneen lämmössä (24°C), ravistellen ajoittain. Helmet pestään sitten kahdesti "varastointipuskurilla" (0,05 M Tris pH 7,8; 0,0004 M beeta-merkaptoetanoli; 0,04 M KC1 0,2 mg/ml naudan seerumialbumiini; 0,0001 M MnCl2 20 % glyserolia) ja suspendoidaan uudelleen 50 ml:aan 15 varastointipuskuria. Seoksesta määritetään entsyymipitoisuus sen menetelmän mukaisesti, jota kuvataan julkaisussa Cancer Research 40:758-70, supra. Entsyymipitoisuus 0,5 ml:ssa seosta ylittää lievästi 650 nanogrammaa. Riittävästi helmi-tuotetta, joka on tuloksena tämän esimerkin kappaleesta 1, 20 lisätään määritettyyn seokseen 0,5 ml:n seosta entsyymipitoisuuden pienentämiseksi 650:ksi nanogrammaksi.

3

Edellä olevaan seokseen lisätään 5 cm 1 mg/ml alkali-denaturoitua lohen siemennesteen DNArta (Millipore Corp.) sekoittaen samalla 4°C:ssa. Seosta sekoitetaan hitaasti 25 4°C:ssa 30 minuutin ajan. Materiaali pestään sitten varas-tointipuskurissa ja varastoidaan sopivassa tilavuudessa varastointipuskuria, niin että tilavuudeksi tulee 1,5 1.

3

Kuhunkin likimain 3 000:sta 1,0 cm :n astiasta pan-naan 0,5 cm edellä olevaa (650 ng) entsyymiä. Astiat ("mat-30 riisiastiat") suljetaan umpeen ja pannaan jääkaappiin varastointia varten likimain 5°C:seen.

Yhden matriisiastian sisältö kaadetaan 100 ml:n mittalasiin. Lisätään suolaliuosta, niin että tilavuudeksi 3 tulee 50 ml. Kuhunkin likimain 100:sta 1 cm :n astiasta pi-35 petoidaan 0,5 ml laimennettua liuosta. Astiat ("1:100- 38 77689 matriisiastiat") suljetaan umpeen ja pannaan jääkaappiin varastointia varten likimain 5°C:seen.

Esimerkki 17B

Puhdistusmatriisi tarvikesarjoja varten 5 Likimain 10 g esimerkin 3A Polybead Microparticles'eja ("helmiä”) pestään kaiium-PO^-puskurissa (pH 7,4). Likimain 250 ml helmien konsentroitua suspensiota lisätään 750 ml:aan samaa PO^-puskuria yhdessä 100 ml:n kanssa ECDI:tä (1 g/ml vettä). Seosta inkuboidaan huoneen lämmössä 1 tunnin ajan.

10 Helmet pestään sitten samalla puskurilla ja suspendoidaan uudelleen puskuriin, joka sisältää 4 % glyserolia.

Likimain 750 ml helmituotteesta pannaan dekantteriin. Likimain 25 mg puhdistettua käänteistä transkriptaasia 250 mlrssa vettä, kuten on kuvattu esimerkissä 8A, lisätään, 15 kunnes seos saavuttaa likimain tilavuuden 1,0 1. Seosta inkuboidaan likimain yhden tunnin ajan 4°C:ssa.

100 ml 0,2 M glysiiniä (pH 7,6 - 8,0) tai 100 ml naudan seerumialbumiinin liuosta (20 mg/ml) lisätään sitten hitaasti seokseen ja inkubointia suoritetaan 30 minuutin 20 ajan huoneen lämmössä (24°C) sekoittaen ajoittain. Helmet pestään sitten kahdesti "varastointipuskurilla" (0,05 M Tris pH 7,8; 0,0004M beeta-merkaptoetanoli; 0,04 M KC1 0,2 mg/ml naudan seerumialbumiini; 0,0001 M MnCl2 20 % glyserolia) ja suspendoidaan uudelleen 50 ml:aan varastoin-25 tipuskuria.

3

Edellä olevaan seokseen lisätään 5 cm 1 mg/ml alkali-denaturoitua lohen siemennesteen DNA:ta (Millipore Corp.) sekoittaen samalla 4°C:ssa. Seosta sekoitetaan hitaasti 4°C:ssa 30 minuutin ajan. Materiaali pestään sitten 30 varastointipuskurissa ja varastoidaan sopivassa tilavuudessa varastointipuskuria niin, että tilavuudeksi tulee likimain 1 , 5 1 .

3

Kuhunkin likimain 3 000:sta 1,0 cm :n astiasta pan- ·; 3 naan 0,5 cm edellä olevaa. Astiat ("matriisiastiat") sul-35 jetaan umpeen ja pannaan jääkaappiin varastointia varten likimain 5°C:seen.

Il 3 39 7 7 6 8 9

Esimerkki 18 Tarvikesarjän käyttö

Valmistetaan testinäyte esimerkin 1 mukaisesti. 2 cm :n 3 astiaan ("testiastia") pannaan 0,5 cm testinäytettä. Sitten 5 avataan yksi esimerkin 17B puhdistusmatriisiastia ja kaade- 3 taan samaan 2 cm :n testiastiaan. Seosta ravistellaan perusteellisesti 15 minuutin ajan 25°C:ssa (huoneen lämpö). Testiastia sentrifugoidaan (1 000 g) helmien ja pintanesteen erottelemiseksi. (Helmet otetaan talteen ja kierrätetään 10 uudelleen.) Pintaneste otetaan talteen ja pannaan samaan 3 tai eri 2 cm :n testiastiaan. Yksi esimerkin 16 DNA-astia 3 avataan ja lisätään pintanesteeseen 2 cm :n testiastiassa. Kaksi liuosta sekoitetaan perusteellisesti kiivaalla ravistelulla.

15 Yksi esimerkin 17A matriisiastia avataan ja kaade- taan 2 cm :n testiastiaan. Liuokset sekoitetaan perusteellisesti kiivaalla ravistelulla. Testiastia pannaan syrjään 15 minuutiksi huoneen lämmössä (25°C).

Testiastialle tehdään sentrifugointi (1 000 g) hel-20 mien ja pintanesteen erottelemiseksi. (Helmet otetaan tal- '·... teen ja pannaan syrjään uudelleenkierrätystä varten.) Yksi 3 3 cm pintanestettä pannaan 1 cm :n astiaan ("määritysastia”) määritystä varten, mitä kuvataan alempana.

B. Laitteisto 25 Määritys suoritetaan sovitetulla laitteistolla, joka mittaa esimerkin 18 pintanesteen fluoresenssin. Laitteisto esitetään kuviossa 1 perspektiivi- ja leikkauskuvana edullisesta asemasta, joka on hieman testiastian yläpuolella ja muutamia jalkoja poispäin siitä lateraalisesti. Laitteiston 30 kehikko on puinen laatikko B ja näytetään kuviossa 1 laatikosta B vain lattian 2 yläpinta ja seinien 4 ja 6 sisäpinta. Seinät 4 ja 6 ovat ne, jotka ovat kauempana katsojasta; lähemmät seinät on leikattu pois eikä niitä esitetä kuviossa 1. Poistettavissa oleva kansi 8 peittää laatikkoa, kun testiä 35 suoritetaan. Laatikon sisäpinnat on maalattu himineällä mus-' · talla.

4o 77689

Vertikaalinen aukko 10 on sijoitettu kanteen 8 ja on aukon 10 halkaisija hieman suurempi kuin esimerkin 18 määritysastian 12 halkaisija. Määritysastiassa 12 on sisällä esimerkin 18 testinäytteen pintaneste 14, joka on neste, 5 joka sisältää DNA-L:ää, joka on leimattu fluoresoivalla värillä. Laakea aukko tai syvennys 16 sijaitsee lattiassa 2 suoraan aukon 10 alapuolella, niin että aukkoon 10 pantujen määritysastioiden 12 pohjat lepäävät tukevasti ennaltasäädetyssä paikassa lattialla 2.

10 Aukko 18 sijaitsee seinässä 4, likimain samalla etäi syydellä seinästä 6 kuin ovat aukot 10 ja 12. Ultravioletti-valolähde (ei näkyvissä) valaisee aukon 18 läpi. Ultravio-lettilähde voi edullisesti olla 4 watin ultraviolettilamppu, maksimiemissio 360 nm:n kohdalla (General Electric NF4T4/BL). 15 Siinä voi olla suodatin ultraviolettilähteen ja määritysas-tian 12 välissä asiaankuulumattomien frekvenssien eliminoimiseksi.

Aukko 20 sijaitsee seinässä 6 likimain samalla etäisyydellä seinästä 4 kuin ovat aukot 10 ja 16. Fotodetektio-20 laite 20A (ei näkyvissä kuviossa 1) sijaitsee aukon 20 takana. Fotodetektiolaite 20A voi olla mikä hyvänsä sopiva optinen mittauslaite. Esimerkiksi se voi edullisesti olla va-lomonistinputki (esimerkiksi Hamamatsu 1P4 -valomonistin-putki). Siinä voi olla suodatin (ei näkyvissä) laitteen 20A 25 ja määritysastian 12 välissä.

Laitteiston käyttämiseksi pannaan esimerkin 18 määrity sastia 12 aukon 10 läpi lepäämään aukkoon 16. Ultravio-lettilähde aktivoidaan (voimanlähde ja katkaisija eivät näkyvissä) ja ultraviolettivalo ja ultraviolettivalonsäde U 30 kulkee määritysastian 12 nesteen 14 läpi. Ultraviolettivalo aikaansaa sen, että väri fluoresoi ja säteilee näkyvää valoa kaikkiin suuntiin. Yksi sellainen suunta on fluoresens-sivalon tien F suunta, joka on suorassa kulmassa ultraviolettisäteeseen U nähden ja olennaisesti vapaa ultravioletti-35 lähteestä tulevasta säteilystä. Fluoresenssivalon F intensiteetti mitataan fotodetektiolaitteella 20A, eikä 11 4, 77689 ultraviolettisäde U olennaisesti vaikuta laitteen 20A tulostukseen .

Laitteen 20A tulostusta prosessoivat ja sen näyttävät kuviossa 2 esitettävät laitteet. Johdotus vahvistaa ja 5 kalibroi tulostuksen, niin että se voidaan edullisesti näyttää kaupallisesti saatavissa olevan kolminumeroisen digitaalisen volttimittarin ("DVM") näytöllä, joka ulottuu 000:sta 999:ään. Niinpä, jos laitteen 20A tulostusta merkitään x. johdostuksen tulostusta voidaan merkitä y=ax+b, 10 missä y on DVM-näytön lukema ja a ja b ovat vakioita, jotka on valittu tekemään y = likimain 200, kun noin 20 % fluoresoivalla värillä leimatusta DNA-L:stä on läsnä esimerkin 13 jäännösnesteessä ja tekemään y = likimain 700, kun noin 70 % fluoresoivalla värillä leimatusta DNA-L:stä on läsnä esi-15 merkkien 14 ja 15 jäännösnesteessä. (Nämä lukemat, tässä järjestyksessä, vastaavat "ei malignisuutta" ja "ilmeinen malignisuus".)

Kuten esitetään kuviossa 2, fotodetektiolaitteen 20A tulostus syötetään esivahvistimeen 22. Esivahvistin voi 20 edullisesti olla mikä hyvänsä suuresta joukosta kaupallisesti saatavissa olevia operaatiovahvistinlastuja, edullisesti jokin kaksinkertainen op-amp-lastu, kuten esimerkiksi ICL 7611 tai ICL 7621. R :n, potentiometri 24, säätö kontrolloi vahvistusta ja siten yhtälön y=ax+b vakiota a. (Esivahvis-25 timen 22 ulostulo on R_/R kertaa sisääntulo.) Esivahvistimen a 22 ulostulo syötetään summaimeen 26. Ulostulo Reistä, potentiometri 28, syötetään myös summaimeen 26, joka laskee yhteen nämä kaksi sisääntuloa. R^rn säätö kontrolloi yhtälön y=ax+b vakiota b. Summain voi olla jokin operaatiovah-30 vistin- tai differentiaalivahvistinlastu, edullisesti toinen op-amp jollakin kaksinkertaisella lastulla, kuten esimerkiksi ICL 7621 (esimerkiksi Radio Shack No. RS 276-: 2331).

Summaimen 26 ulostulo edustaa yhtälön y=ax+b tekijää 35 y. Se syötetään DVM-laitteeseen 30, joka edustaa analogi-digitaali-muuntajasta, vahvistimesta ja digitaalinäytöstä.

42 7 7 6 8 9

Sellainen laite voidaan tehdä puolijohdelaitteista, kuten Teledyne Semiconductor -lastusta 7107 ja kolmesta LED- tai LCD-näyttölastusta (kuten Radio Shack No. RS 276-053 tai Radio Shack No. RS 276-075). Tai jotakin kaupallista DVM:ää, 5 joka sisäisesti sisältää vahvistimen, analogi-digitaali-muuttajan, näytön, pariston ja niin edelleen, voidaan edullisesti käyttää. Tyypillinen sellainen laite on Fluke DVM Model No. 8022B; toinen on Radio Shack No. RS 22-191.

Edellä oleva järjestelmä antaa automaattisesti numee-10 risen lukeman, joka osoittaa leimatun DNA-L:n likimääräisen prosenttiosuuden jäännösnesteessä, kun järjestelmää käytetään yhdessä esimerkkien 16-18 tarvikesarjojen kanssa. Järjestelmään viitataan tästälähtien "DNA-L-laitteistona".

On välttämätöntä kalibroida DNA-L-laitteisto aika 15 ajoin, mm. koska reagenssien eri valmistuserillä on erilaiset entsymaattiset tai väriaktiivisuudet.

Esimerkki 19 DNA-L-laitteiston kalibrointi

Yksi esimerkin 16 1,0 cm^:n DNA-astia (500 ng DNA:ta 3 20 0,5 cm :ssä) merkitään "Astia A" ja avataan. Yksi viidesosa 3 astian A sisällöstä (100 ng DNA:ta 0,1 cm :ssä) pipetoidaan 3 toiseen 1,0 cm :n astiaan, joka merkitään "Astia B". Suolaliuosta lisätään kumpaankin astiaan niin, että tilavuus saa- 3 3 daan 1,0 cm :ksi. Astiasta A pipetoidaan 0,125 cm ja 25 heitetään pois. Suolaliuosta lisätään astiaan A, niin että 3 tilavuus saadaan 1,0 cm :ksi. Astia A sisältää nyt 350 ng 3 DNA:ta 1,0 cm :ssä; astia B sisältää nyt 100 ng DNA:ta 3 1,0 cm :ssä.

Astia A pannaan DNA-L-laitteiston aukkojen 10 ja 16 30 läpi. Potentiometrit R= ja R, asetetaan likimääräisiin kes- r a o kikohtiinsa. Virtaa johdetaan laitteistoon, mukaan lukien ultraviolettilähde.

Jos näytön lukema on enemmän tai vähemmän kuin 700, R :ta säädetään, kunnes lukema on likimain aiemman lukeman a 35 ja 700:n puolivälissä. Virta kytketään pois, astia A poistetaan ja astia B pannaan sisälle sen paikalle.

li 43 7 7 6 8 9

Virtaa johdetaan laitteistoon. Jos näytön lukema on enemmän tai vähemmän kuin 200, R, :tä säädetään, kunnes lukema on likimain aiemman ja 200:n puolivälissä. Virta kytketään pois, astia B poistetaan ja astia A pannaan sisälle sen 5 paikalle.

Edellä olevien kahden kappaleen menettelyjä toistetaan, kunnes asianomaiset lukemat ovat 700 ja 200.

Esimerkki 20 DNA-L-laitteiston käyttö 3 10 Esimerkin 18 1,0 cm :n määritysastia pannaan kalib roituun DNA-L-laitteistoon. Virtaa johdetaan laitteistoon ja DVM-lukema merkitään muistiin.

Mittarin lukema on likimain 200 normaalille testi-potilaalle, 700 tai enemmän henkilölle, jolla on aktiivinen 15 leukemia. Lukemat, jotka ovat 200:n ja 700:n välillä, eivät ole vakuuttavia ja osoittavat toisen testin välttämättömyyden, johtuen testivirheestä tai varhaisen leukemian läsnäolosta .

Jos toinen testi johtaa lukemaan, joka on 200:n ja 20 700:n välillä, esimerkin 21 menettelyihin on indikaatio.

Esimerkki 21 DNA-L-laitteiston käyttö varhaisen leukemian testissä

Esimerkin 18 menettelyä seurataan käyttäen testinäy-tettä, joka on peräisin potilaalta, jolla epäillään olevan 25 varhainen leukemia, esimerkiksi johtuen lukemasta 200-700 esimerkin 20 viimeisen kappaleen menettelyssä. Kuitenkin käytetään esimerkkien 16 ja 17A 1:100 -DNA- ja -matriisi-astioita pikemminkin kuin tavallisia DNA- ja matriisiasti-oita.

30 DNA-L-laitteisto kalibroidaan uudelleen esimerkin 19 mukaisesti käyttäen A'- ja B'-astioita, joissa käytetään esimerkin 16 1:100 -DNA-astiaa esimerkin 16 DNA-astian sijasta. (Muutoin A' vastaa A:ta ja B' B:tä. Astia A' sisäl- 3 tää 3,5 nanogrammaa DNA:ta 1,0 cm :ssä; astia B' sisältää * 3 35 1 nanogramman DNA:ta 1,0 cm :ssä.) 44 77689

Kalibroinnin jälkeen seurataan esimerkin 20 menettelyä. Lukema, joka on likimain 200, osoittaa DNA-L:n poissaolon potilaan testinäytteestä. Lukema, joka on 500 tai enemmän, osoittaa DNA-L:n läsnäolon potilaan testinäyttees-5 sä ja viittaa leukemian mahdollisuuteen, täten osoittaen tarpeen huolitellumpaan testaukseen ehdolle tulleen diagnoosin varmistamiseksi.

Yleisiä loppuhuomautuksia

Edellä olevat menettelyt tarjoavat kokonaan uuden 10 diagnostisen menetelmän, joka on tähän asti tuntematon lääketieteelle. Uskotaan olevan tärkeää, että näissä menettelyissä käytetään puhtaita, laboratoriossa tuotettuja reagens-seja (kuten esimerkiksi kloonattua DNA:ta) pikemmin kuin (lukuun ottamatta entsyymiä) aineita, jotka täytyy saada 15 luovuttajista ja sitten puhdistaa. Yllä kuvatuissa menettelyissä käytetään hyväksi DNA-L:ää (DNA:itä, joihin viitataan termein DNA-1 ja DNA-2), mutta keksijä uskoo, että muita DNA:itä, jotka liittyvät muihin malignisuuksiin (so. muihin kuin lymfoidisen järjestelmän malignisuuteen), tul-20 laan eristämään ja havaitsemaan käyttökelpoisiksi testeissä, jotka ovat yllä kuvattujen testien vähäisiä muunnelmia ja jotka tuottavat samantyyppisen tuloksen samalla tavalla.

Sitä paitsi voidaan käyttää hyväksi muita matriiseja sopivan entsyymikonjugoidun matriisin valmistamiseksi.

25 Muita hartseja voidaan käyttää sekä samoin myös polystyree-ni- ja lateksihelmiä, joihin entsyymi voidaan kemiallisesti sitoa. Esimerkkejä viimeksi mainitusta ovat hydrofiiliset lateksipallot ("Covasphere^MX tai FX", Covalent Technology Corp., Ann Arbor, Michigan). Keksintöä voidaan harjoittaa 30 minkä hyvänsä olennaisesti liukenemattoman materiaalin avulla, johon entsyymi voidaan sitoa, sillä mitä hyvänsä sellaista materiaalia voidaan käyttää hyväksi entsyymi-konjugoidun matriisin valmistukseen. Muita entsyymejä, joilla on selektiivinen affiniteetti asiaankuuluvaan DNA:han (so.

35 jotka kykenevät selektiivisesti sitoutumaan siihen), voidaan käyttää hyväksi. Tästä johtuen tässä tekstissä

II

45 7 7 6 8 9 käytetty termi "entsyymi-konjugoitu matriisi" on tarkoitettu sisältämään minkä hyvänsä sellaisen matriisiaineen, johon mikä hyvänsä entsyymi voidaan kiinnittää, joka tulee selektiivisesti sitoutumaan tässä tekstissä kuvattuihin DNAsihin 5 (tai jota nämä selektiivisesti inhiboivat tai jolla "on selektiivinen affiniteetti" näihin).

Vaikkakin keksintöä on kuvattu ensisijaisesti yhteydessä sen yhteen spesifiseen ja edulliseen suoritusmuotoon, ymmärretään, että siitä voidaan tehdä lisämuunnelmia 10 poikkeamatta sen hengestä ja suojapiiristä. Muutamia sellaisia muunnelmia kuvataan yllä. Tämä hakemus on tarkoitettu kattamaan keksinnön kaikki variaatiot, käytöt tai sovellutukset, jotka seuraavat, yleisesti, keksinnön periaatteita ja joihin kuuluvat mukaan sellaiset poikkeamat tästä julkai-15 susta, jotka kuuluvat tunnettuun tai tavanomaiseen käytäntöön alalla, johon keksintö kuuluu tai jotka ovat ilmeisiä alan asiantuntijoille.

Claims (13)

1. 46 7 7 6 8 9
2. 1. Menetelmä malignisuuden läsnäolon määrittämiseksi ihmis- tai eläinkehossa, tunnettu siitä, että 5 (1) testinäyte valmistetaan kehon nesteen näyttees tä, joka on kerätty testipotilaasta, (2) testinäyte sekoitetaan valmisteeseen, joka sisältää R-l DNA-polymeraasia selektiivisesti inhiboivaa leimattua DNA-L, DNA-1 ja/tai DNA-2, 10 (3) seos viedään R-l DNA-polymeraasientsyymi-konju- goituun matriisiin, joka matriisi edullisesti on agaroosi-pohjäinen aine tai mikropartikkeleista koostuva aine, ja (4) suoritetaan määritys leimatun DNA:n osuuden määrittämiseksi, joka on sitoutunut entsyymi-konjugoituun mat-15 riisiin tai joka ei ole sitoutunut siihen.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leimattu DNA on DNA-L ja malignisuus on jokin leukemia.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että entsyymikonjugoitu matriisi esikäsi- tellään, ennen vaihetta (3), ainakin yhdellä DNA:11a, joka on muu kuin DNA-L, DNA-1 tai DNA-2.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA on leimattu jollakin fluoresoi- 25 valla väriaineella.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA on leimattu 32P:llä.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisävaiheen ensimmäisen 30 ja toisen vaiheen välillä, jossa lisävaiheessa testinäyte puhdistetaan ulkopuolisesta DNAssta käyttäen puhdistusmat-riisia.
8. 7. Menetelmä R-l DNA-polymeraasientsyymi-konjugoidun matriisin valmistamiseksi, käytettäväksi patenttivaatimuk- 35 sen 1 mukaisessa menetelmässä, tunnettu siitä, että 47 77689 valikoidaan ensimmäinen DNA, joka on selektiivisesti R-l DNA-polymeraasia inhiboiva DNA-L, DNA-1 tai DNA-2, valikoidaan R-l DNA-polymeraasientsyymi, jonka kanssa ensimmäisellä DNA:11a on selektiivinen affiniteetti, 5 valikoidaan olennaisesti liukenematon matriisimate- riaali, joka on edullisesti agaroosipohjäinen aine tai mik-ropartikkeleista koostuva aine ja johon entsyymi voi si^· toutua, valmistetaan R-l DNA-polymeraasientsyymi-konjugoitu 10 matriisi sekoittamalla matriisi R-l DNA-polymeraasiliuok-seen, ja esikäsitellään matriisi ainakin yhdellä DNA:11a, joka on muu kuin ensimmäinen DNA.
9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että malignisuus on jokin leukemia ja ensimmäinen DNA on DNA-L.
10. 9. Testipakkaus, käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseen, tunnettu siitä, että se' käsittää 20 ensimmäisen säiliön, joka sisältää etukäteen mitatun määrän leimattua DNA-L:ää, ja toisen säiliön, joka sisältää patenttivaatimuksen 12 mukaista entsyymi-konjugoitua matriisia, johon on sitoutuneena etukäteen mitattu määrä R-l DNA-polymeraasia.
11. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että DNA-L on leimattu fluoresoivalla väriaineella. H. Patenttivaatimuksen 9 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että DNA-L-molekyylien lukumäärä 30 ensimmäisessä säiliössä on vähän suurempi kuin toisessa säiliössä olevan entsyymin aktiivisten entsyymikohtien lukumäärä.
12. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siinä on kolmas säiliö, joka 35 sisältää puhdistusmatriisia. 48 7 7 6 8 9
13. 13. Laitteisto, käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseen, ja johon kuuluu fluorometrinen laite, joka käsittää valaistusvälineet, 5 välineet fluoresenssin toteamiseksi, ja välineet havaitun fluoresenssin lukemiseksi ja tulostamiseksi, tunnettu siitä, että laitteeseen on asennettu ainakin osittain läpinäkyvä säiliö, joka sisältää fluoresoivalla väriaineella leimatun DNA-L:n liuosta, ja 10 joka on asennettu niin, että se ainakin osittain valaistaan valaistusvälineillä ja niin, että välineet fluoresenssin toteamiseksi vastaanottavat valon, joka siirtyy valaistusvälineistä säiliön läpi. 49 7768 9