JPH02500323A - 結腸病変用検出マーカー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は米国政府基金を用いて行われた。米国政府は本発明に関する権利を有し ている。

発明の分野 本発明は、特に核酸ハイブリッド形成操作による前悪性及び悪性結腸組織の診断 のため、の分子生物学的アプローチに関する。

背景技術の説明 前悪性及び悪性結腸組織の診断のための免疫学的アプローチは、米国国立衛生研 究所のシュロム（Ｓｃｈｌｏｍ）うにより報告された。ツアーら、ネーチャー、 第３１１巻。

第５６２頁、１９８４年（Ｔｈｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１１：５ Ｂ２（１９８４））及びシュロム（Ｓｃｈｌｏｍ）ら、ジャーナル・オブ・セル ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＣｅｌｌＢｌｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）　、補巻第９Ａ号、第３６頁、１９８５年は、ヒト結腸組織における特異 的腫瘍遺伝子産物の検出法について開示している。これらのレポートは、良性及 び悪性結腸疾患において９２１タンパク質の異なるｒａｓ遺伝子発現性を調べる ためのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の使用について示している。組織セクショ ン内における個々の細胞の免疫組織化学的分析によれば、正常結腸上皮、良性結 腸腫瘍及び炎症もしくは形成異常結腸病変部と比較した場合に、結腸癌ではｒａ ｓ９２１発現に関して差異を生じていた。著者は、ｒａｓｐ２１がおそらく結腸 発癌に際して比較的遅い時期の現象であろうと結論付けていた。

ツアーら、ラボラトリ−・インベスティゲーション。

第５２巻、第６８Ａ頁、１９８５年［Ｔｈｏｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、５２：６８Ａ　（１９８ ５））　；　ハンドら。

プロシーディング・オブ・ナショナル−アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、 第８１巻、第５２２７頁。

１９８４年［Ｈａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ　Ｎａｔｉｏ ｎａｌＡｃａｄｅｌＩｙ　ｏｌ’　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ、８１：５２２７　 （１９ｇ４））　；及びハンドら、ハイブリドーマ、第６８Ａ頁、１９８５年（ Ｈａｎｄａｔ　ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、６８Ａ　（１９１１５）　）にお いて、研究グループはｐ２１に対するＭａｂを用いてｒａｓ　ｐ２１発現に関し 様々な癌組織を試験した。ｒａｓ遺伝子発現は、結腸腺癌の４９％、骨癌の６３ ％、良性孔腫瘍の１０％、並びに良性結腸病変部及び正常結腸の０％で見られた 。

大多数のヒト結腸及び乳腺症はｒａｓ遺伝子発現を示したが、一方線維腺腫及び 嚢様変性線維腫症患者の異常管及び小兵の大部分は陰性であった。著者は、これ らの発見がｒａｓ翻訳産物に関する定量的ＲＩＡの基礎を形成しており、しかも 正常細胞内並びに良性、前悪性及び悪性病変部内におけるｒａｓ　ｐ２１発現を 評価するための手段を提供するものであると主張していた。

Ｃ型関連ヒト内在性レトロウィルス配列が最近発見されかつ特徴付けられた。そ れらは、特に細胞形質転換中に連鎖遺伝子の転写をコントロールする役割を果た しているようである。

いくつかの文献では、ヒト内在性レトロウィルス配列について説明していた。例 えば、キャラノ＼ンら、サイエンス、第２２８巻、第１２０８頁、１９８５年［ Ｃａ１ｌａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８：１２０Ｂ（１９８ ５）］では、公知の内在性レトロウィルスゲノムの構造及び鎖長に類似したレト ロウィルス配列のモザイクを含んだヒト組換えＤＮＡクローン（ＨＬＭ−２）に ついて開示している。

特定のＨＬＭ−２長鎖末端繰返しくり、ＴＲ）配列はＤ型レトロウィルスのＬＴ Ｒとハイブリッド形成した。

ＨＬＭ−２のｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は、Ａ型関連レトロウィルス、Ｂ型関連レ トロウィルス及びＣ型レトロウィルスと広範囲の相同性を共有している。）ＩＬ Ｍ−２のｐｏｌ遺伝子中には、乳癌ウィルスｐｏｌ遺伝子と７０％以内で一致す る領域が存在していた。推定的ＨＬ　Ｍ　−２のｅｎｖ遺伝子の一部は、Ａ型レ トロウィルスゲノムの対応領域とハイブリッド形成した。マーチン（Ｍａｒｔｉ ｎ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス 、第７５巻、第４８９２頁。

１９８２年は、ヒト脳、ヒヒ皮膚繊維芽細胞及びアカゲザル肝臓中におけるＣ型 レトロウィルス配列の検出及びクローニングについて開示していた。

ラブソン（Ｒａｂｓｏｎ）ら、ネーチャー、第３０６巻、第６０４頁、１９８３ 年は、８．４ｋｂ離れた２つのＬＴＲ要素並びにｇａｇＳｐｏｌ及び推定ｅｎｖ 領域を含んだ完全鎖長ヒトレトロウィルスクローンの特徴について開示していた 。ハイブリッド形成実験では、ＬＴＲを欠く鎖長７２〜７６塩基対の不完全繰返 しタンデム配列（ｔａｎｄｅｍ　ａｒｒａｙ）によって結合された４、１ｋｂの ｇａｇ−ｐｏｌ配列のみを含んだ完全鎖長レトロウィルスクローンのセグメント とアニーリングしたポリ（Ａ）　ＲＮＡ種をヒト細胞（胎盤）が含有しているこ とを明らかにした。

４巻、第７６４頁、１９８５年（Ｒｅｐａｓｋｅ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｒＶｉｒｏｌｏｇｙ、５４ニア６４　（１９８５）　）は、ヒトゲノムＤ ＮＡライブラリーからクローニングされた完全鎖長（８，８ｋｂ）内在性Ｃ型ヒ トレトロウィルスＤＮＡ　（クローン４−１）の完全ヌクレオチド配列について 開示していた。コリニアリティー（ｃｏｌｉｎｅａｒｉｔｙ）及び４０％アミノ 酸相同性がモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウィルスＤＮＡと比較した 場合に見られた。

ラブソンら、ジャーナル・オブ・パイロロジー、第５６巻、第１７６頁、１９８ ５年は、ノザンプロット／Ｘイブリッド形成及びｃＤＮＡクローニングによりヒ ト内在性レトロウィルスｅｎｖＲＮＡ転写体の構造について開示していた。ポリ （Ａ）３．０及び１．７ｋｂｅｎｖＲＮＡは、胎盤、結腸癌及び乳癌細胞中で確 認された。

しかしながら、結腸癌病変に有用である正確な核酸−基本マーカーはまだ開示さ れていない。

ンベローブ配列（Ｈ−ＬＴＲ及びＨ−ｅｎｖと称される）を用いた、いくつかの ヒト主要結腸癌、隣接結腸粘膜及び２種の結腸癌細胞系（ＨＣＴ及びＣａｃｏ２ ）から抽出されたポリ（Ａ）”ＲＮＡ中におけるＣ型関連レトロウィルス配列の 発現バタ、−ンの分析に基づいている。試験された腫瘍サンプルの大半において 、本発明者らは正゛常結腸粘膜（ＮＣＭ）中で非常に顕著かつ豊富な３．６ｋｂ ＬＴＲ関運転写体の量の著しい減少を観察したが、逆に２種の３．０及び１．７ ｋｂｅｎｖ関運転写体の一方もしくは双方、特に１．７ｋｂ転写体はＮＣＭより も結腸腫瘍中で増加していた。

このようなことから、本発明はＲＮＡ含有結腸サンプル中における結腸腫瘍疾患 の検出方法を提供するが、この方法は： （１）サンプルのＲＮＡを検出可能に標識化されたＨ−ＬＴＲ又はＨ−ｅｎｖヌ クレオチドプローブと接触させ；及び （２）既知の非癌性結腸サンプル中の量と比較してプローブ及びＲＮＡ間のハイ ブリッド形成量を検出することを特徴とする。

具体的な好ましい態様において、本発明はＣ型関連ヒト内在性レトロウィルス配 列の転写パターンに関する結腸組織の分析方法に関するが、この方法では組織か ら全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーでポリ（Ａ）” ＲＮＡを回収し、変性ゲル電気泳動によりこのＲＮＡをサイズ分離し、標識化さ れたＨ−ＬＴＲ又はＨ−ｅｎｖヒトプロウィルスプローブとハイブリッド形成さ せ、ハイブリッド形成した種を検出し、かつＬＴＲ特異性又はｅｎｖ関運関与転 写体化を定量する。

図面の説明 第１図はｅｎｖプローブの完全配列について示している。

第２図はＨ−ＬＴＲプローブの完全配列について示し２種の核酸プローブが本発 明の方法で用いられる。第一のプローブは、内在性Ｃ型ヒトレトロウィルス核酸 の配列と同一であるか又はそれと相同的である配列であって、以後“エンベロー プ″又は“ｅｎｖ”プローブと称される。問題のエンベロープＣ型レトロウィル ス遺伝子の完全配列は、レバスフら、ジャーナル・オブ・パイロロジー、第５４ 巻、第７６４頁（１９８５年６月）に記載されている。好ましいセグメントは、 第１図に示されたそのＢａｍ　Ｈｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグメント又は標的核酸 とハイブリッド形成しうるそのサブフラグメントである。

第二のプローブは“Ｈ−ＬＴＲ”と命名され、その完全配列は第２図に示されて いる。Ｈ−ＬＴＲプローブも、レバスフらの文献（前掲）に示されたエンベロー プＣ型レトロウィルス遺伝子の完全配列から得られる。Ｈ−ＬＴＲプローブは、 第２図に示された配列と同一か、その一部であるか又はそれと相同的である配列 である。

望ましいヌクレオチドプローブ配列は側鎖（ｆ’　Ｉａｎｋｉｎｇ）天然ヌクレ オチドを更に含んでいてもよいが、但しこれらの側鎖ヌクレオチドはＤＮＡ又は ＲＮＡ配列のハイブリッド形成特異性を変化させるような数で存在していてはな らない。典型的には、プローブ配列は少なくとも１８個のヌクレオチドを含んで いる。したがって、ｅｎｖ又はＨ−ＬＴＲプローブの一部又はそれらと相同的な 少なくとも１８個の構成物を含むものであればあらゆる及びすべてのポリヌクレ オチドが更に本発明の範囲内に包含される。

これらのプローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれの形であってもよい。それらは 、公知かつ公表された単離及び消化操作法（前掲）により得られるか又は常法に よって合成される。プローブは、メツセンジャーＲＮＡから得られる、即ち、逆 転写酵素によるメツセンジャーＲＮ　Ａの逆転写１こよって又はゲノムの開裂に よって、好都合にはエンドヌクレアーゼ消化によって、しかる後常法による遺伝 子もしくは遺伝子フラグメントのクローニングによって得られるｃＤＮＡから得 られる。例えば、コーンバーグ、ＤＮＡレブリケーション、Ｗ、Ｈ，フリーマン 社、サンフランシスコ、１９８０年、第６７０−６７９頁［Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、 ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｊｏｎ、Ｗ、Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　＆Ｃｏ、、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｊｓｃｏ、１９８０．ｐｐ、６ ７０−６７９　）参照。

一方、プローブはメリフィールド、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミカル ・ソサエティー、第８５巻、第２１４９頁、１９６２年［Ｍｅｒｒｉｌ’１ｅｌ ｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｊ ｅｔｙ、８５：２１４９（１９８５））に記載された技術に従い合成することも できる。ＤＮＡフラグメントの単離後、フラグメントはプローブ作成のために用 いられる。

プローブはそれ自体であってもよいし又はプラスミドの一部であってもよい。例 えば、Ｈ−ＬＴＲプローブはＴａｑＩ部位で側鎖形成される。例えばプラスミド ｐＢＲ３２２のＴａｑ１部位に組込まれてサブクローニングされかつ大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）中でクローニングされる。

益な標識は放射性原子、酵素、発色団、ビオチン／アビジン等である。核酸ハイ ブリッド形成技術の更に詳細な説明については、゛ワン、Ｅ、Ｓ、（Ｈｕａｎｇ 、Ｅ、Ｓ、）ら、第６巻、第４５７−４９７頁、１９７７年で見られるが、これ は参考のため本明細書に組込まれる。オリゴヌクレオチドプローブ技術は、スジ スタフ、Ｊ、Ｗ、ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第、６８巻、第４１ ９−４２８頁、１９７９年（Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｊ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ ｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：４１９−４２８　（１９７９）　） でも開示されているが、これも参考のため本明細書に組込まれる。

ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドプローブは、最も一般的には放射性核 種を用い、更にはおそらく重金属であっても、このような原子又は無機基で標識 化される。一部の状況下では、標的ＤＮＡとハイブリッド形成したプローブと特 異的に結合する抗体を用いることも可能であろう。

最も一般的には放射性標識が用いられるが、適切な放射性標識としては３２Ｐ、 ３Ｈ１１４Ｃ１１２５１等がある。

適切なシグナルを与えかつ十分な半減期を有するものであれば、いずれの放射性 標識も使用可能である。他の標識としては、リガンド、螢光剤、化学発光剤、酵 素、抗体等がある。

１つの標識化技術において、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌは二本鎖ＤＮＡ分子の うち１本の鎖にニック（ｎｉｃｋ）が生じた場合に形成される３′　−ヒドロキ シ末端にヌク　ルオチド残基を加えるために用いられる。しかも、その酵素は、 その５′−３′工キソヌクレオチド分解活性のに基づき、ニックの５′側からヌ クレオチドを除去する。

５′側からのヌクレオチド除去及び３′側へのヌクレオチドの連続的付加の結果 として、ＤＮＡに沿いニックにツク・トランスレーション）が形成される〔ケリ ーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー。

第２４５巻、第３９頁、１９７０年（Ｋｅｌｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４５： ３９（１９７０））　）。

先に存在するヌクレオチドを高度の放射性ヌクレオチドで置換えることにより、 １０８ｃｐＩＩｌｌμｇを超える十分な比活性をもつ標識化プローブを製造する ことが可能である〔リグビー、　Ｐ、　Ｗ、Ｊ、ら、ジャーナル・オブ・モレキ ュラー・バイオロジー、第１１３巻、第２３７頁。

１９７７年（Ｒｌｇｂｙ、Ｐ、Ｗ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ）’、１１３：２３７（１９７７）））。

プローブは、３Ｈ−チミジン三リン酸又はα−３２Ｐ−デオキシヌクレオチド三 リン酸のいずれかを用いかかるニック・トランスレージジンによって高比活性に 標識化することもできる（リグビーら、前掲）。

マーカーに関して結腸サンプルを試験する場合、ＲＮＡは低温槽上で断片化しか っＳＤＳ等の界面活性剤及びＥＤＴＡ等のキレート化剤で場合によりプロテイナ ーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）での−夜消化で断片を溶解することにより組織から単 離することができる。タンパク質はフェノール及びクロロホルム抽出により除去 され、核酸はエタノールで沈降せしめられる。ＲＮＡはオリゴｄＴカラムクロマ トグラフィーにより分離され、その際そこから溶離される。更に分別化してもよ い。

分子ハイブリッド形成用のいくつかの技術は結腸組織中におけるレトロウィルス ＲＮＡ配列の検出に用いられるが、各々ある利点及び欠点を有している。多量の 組織が入手される場合、ハイブリッド形成動態分析によれば、存在するレトロウ ィルスＲＮＡ０量を正確に定量し、プローブと非常に類似するが同一ではない配 列を識別してかつ相同率を調べるための機会を提供することができる。

反応は、プローブの解離速度が最適となるようなハイブリッド形成条件下（Ｔｍ 　−２５℃）で行われる〔ウェットマー＊　Ｊ、　Ｇ、　（Ｗｅｔａ＋ｕｒ、Ｊ 、Ｇ、）　、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第３１巻、第３ ４９−３７０頁、１９６８年〕。反応動態は組織中での配列がプローブのものと 同一である場合に秒オーダーであるが、しかしながらプローブ配列が組織中のも のと部分的相同性を有する場合には反応は複雑な動態を示す〔シャープ。

ｐ、　Ａ、　（Ｓｈａｒｐ、Ｐ、Ａ、）、　ジャーナル・オブ・モレキュラー・ バイオロジー、第８６巻、第７０９−７２６頁。

１９７４年〕。

プローブ対細胞ＲＮＡの濃度は、どの程度の感度を望むかによって決定される。

１細胞当たり１つのレトロウィルス転写体を検出するためには、全細胞ＲＮＡ１ μｇ当たりプローブ約ｘｏｏｐｇを必要とする。核酸は混合され、変性され、適 切な塩濃度及び温度に調節され、様々な時間にわたりハイブリッド形成に付され る。解離速度は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー〔ブリラテン、Ｒ， Ｊ、（Ｂｒｉｔｉｅｎ、Ｒ，Ｊ、）ら、サイエンス、第１６１巻、第５２９−５ ４０頁、１９６８年〕又はＳ１ヌクレアーゼ消化〔サラトンら、　Ｗ、　Ｄ、　 、バイオロジー・エツト・バイオロジー・アクタ、第２４０巻、第５２２−５３ １頁、１９７１年（Ｓｕｔｔｏｎ、Ｖ、Ｄ、　。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｅｔａ、２４０：５２ ２−５３１（１９７１）））のいずれかでハイブリッド形成したプローブの量を 定量することにより調べられる。

更に順応的なハイブリッド形成方法はノザンプロット技術である。この技術によ れば、ハイブリッド形成反応の緊縮性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の可変性及び分 析試料中のレトロウィルス配列状態の決定を可能にする。細胞ＲＮＡはその場で アルカリにより変性され、中性化されて、ニトロセルロース膜に移される。

洗浄後、膜は真空下でベーキングされ、超音波処理変性サケ精子ＤＮＡ５０μｇ ／ｍｌ含有４ｘＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５Ｍクエン酸ナ トリウム）中１０×デンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）溶液（各々０．２％のフ ィコール（Ｆｉｃｏｌ　ｌ）、牛血清アルブミン、ボリビニド形成される。緊縮 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリッド形成又は非緊縮ハイブリッド形成が行われ る。膜は５２℃で多量の４ＸＳＳＣにより洗浄され、風乾され、検出される。

レトロウィルスＲＮＡ配列のハイブリッド形成分析に際して主な考慮事項は、試 験試料中に存在する配列とプローブとの関連度である。これはプロット技術の場 合に重要であるが、その理由はハイブリッド形成の非緊縮条件下において適度の 配列相同性があればたとえプローブ及びサンプル中の配列が異なるレトロウィル ス型を表す場合であっても強いシグナルを生じうるからである。

具体的なハイブリッド形成技術は本発明にとって重要でなく、当業界で通常用い られる技術であればいかなるものであっても本発明の範囲内に属する。典型的な プローブ技術は、参考のため本明細書に組込まれるファルコウ（Ｆａｌｋｏｖ） らの米国特許第４．３５８，５３５号明細書に記載されている。

上記のような標識化プローブによれば、結腸病変検出用の一般的診断方法を提供 することができる。本方法は妥当な速さであって、簡単なプロトコールを有し、 市販キットとして標準化されかつ提供されうる試薬類を有し、多数のサンプルの 迅速なスクリーニングを可能にするこ操作を実施するための一方法において、Ｒ ＮＡ転写体含有臨床的分離物は支持体に固定される。固定された核酸は、レトロ ウィルス遺伝子のコード鎖と相補的又は相同的な塩基配列を有する標識化ポリヌ クレオチドと接触せしめられる。

本発明のハイブリッド形成アッセイは特にキットの形で製造及び市販するために 十分適しており、このキットは１以上の容器手段（バイアル、試験管等）を隙間 なく収納しうるように仕切られたキャリア手段を含んでおり、上記容器手段は各 々ハイブリッド形成アッセイに用いられる別個の要素のうち１つを含んでいる。

例えば、１本のバイアルは可溶性の検出可能に標識化されたＨＬＲ又はｅｎｖプ ローブを含有しており、一方１本以上の異なるバイアルは異なる既知量のｅｎｖ 又はＨＬＲＲＮＡ転写体を含有している。後者の容器は、未知サンプルから得ら れたデータを当てはめるための標準曲線を作成するために用いられる。

結腸病変の存在は、試験組織中のプローブ関連ＲＮＡ転写体の出現及び／又は量 の差異によって調べられる。

２種のＬＴＲ特異性転写体及び３種のｅｎｖ関運社運転写体察される。

下記第１表は、正常結腸粘膜（ＮＣＭ）対癌性結腸組式中における転写体分布パ ターンについて示している。

第１表 ＮＣＭ　癌性組織 ３．６ｋｂ　↑↑　↓↓ １．７ｋｂｅｎｖ関運転写体は明らかに増加し、３．６ｋｂＬＴＲ関運転写体は 癌性結腸組織中で明らかに減少している。

通常、これらの転写体の有意の増加又は減少が各々正確な診断のために観察され るべきである。好ましくは、１．７ｋｂ転写体の場合には３倍以上の増加、３． ６ｋｂ転写体の場合には６０％以上の減少が各々観察されるべきである。

ある例はここでは説明目的のみで示されている。

ＨＣＴ及びＣａｃｏ２結腸癌細胞系を２０％牛脂児血清〔ギブコ（Ｇ　Ｉ　ＢＣ Ｏ）　）補充ダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞培養 物を空気中５％ＣＯ２湿式インキュベーター中３７℃で増殖させ、１週間に３回 栄養物補充した。ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出のために結腸組織外科的試料を用いたが 、これはルーチンの病理学にとってかつ人体研究上ＮＩＨガイドラインに従えば 不要であった。

プローブ及び核酸ハイブリッド形成 初期研究では、ｐＢＲ３２２でクローニングされたＨ−ＬＴＲ又はＨ−ｅｎｖを ニック・トランスレーションにより（３２Ｐ）標識化した。後の実験では、Ｈ− ＬＴＲセグメントをｐＳＰ６４ベクター系〔メルトン、Ｄ、Ａ。

ら、ヌクレイツク・アシッズ挙リサーチ、第１２巻、第７０３５頁、１９８４年 （Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、１２ニア０３５（１９８４））　）でサブクローニングして（３２ｐ ）標識化リボプローブを得た。染色体ＤＮＡを既に開示された操作法〔ガットニ 、Ｓ０１モル・セル・バイオロジー、第２巻、第４２−５１頁、１９８２年（Ｇ ａｔｔｏｎｉ、Ｓ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｊｏｌ、、２：４２−５１　（１９ ８２）））に従い細胞培養物又は組織試料から抽出し、制限エンドヌクレアーゼ 〔ニューイングランド・バイオラプス（ＮｅνＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｊｏｌａｂｓ ））消化及びサザンプロットハイブリッド形成に付した。全ＲＮＡをカサラ（Ｃ ａｔｈａｌａ）ら（ＤＮＡ、第２巻、第３２９−３３５頁、１９８３年）に記載 された方法により抽出した。ポリ（Ａ）”ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースクロマ トグラフィーにより選択し〔アビブ、　Ｈ，（Ａｖｉｖ、Ｈ，）ら、プロシーデ ィング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第６９巻、第１４ ０８−１４１２頁、１９７２年〕、変性ゲル電気泳動によりサイズ分離し〔トー マス、Ｐ、　Ａ。

（ＴｈｏＩｌａｓ　、　Ｐ、Ａ、）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ アカデミ−・オブ・サイエンス、第７７巻、第５２０１−５２０８頁、１９８０ 年〕、プロットハイブリッド形成させた〔メルトン、前掲；ウオール、　Ｇ、　 Ｍ。

（Ｗａｈｌ　、Ｇ、Ｍ、）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ −拳オブ・サイエンス、第７６巻。

第３６８３−３６８７頁、１９７９年）。次いで、ＤＮＡ及びＲＮＡプロットを リンスし、７０℃でＸ線フィルム（コダック）を用いてオートラジオグラフィー のために露出させた。

Ｈ−ＬＴＲ又は：Ｈ−ｅｎｖプローブが一連のヒト組織及び細胞系中の特異的転 写体を検出するというラブソン、マーチン及び協同者（ネーチャー、第３０５巻 。

第６０４−６０７頁、１９８３年）の発見が確認された。

次いで、注意は正常結腸粘膜（ＮＣＭ）、いくつかの主な結腸腫瘍（Ｔ）及び２ 種の結腸癌細胞系ＨＣＴ。

Ｃａｃｏ２に向けられたが、そこからＲＮＡを抽出し、ポリ（Ａ）”ＲＮＡを選 択し、ノザンプロット分析のために変性アガロースゲル上でサイズ分離した。す べてのサンプルにおいて、Ｈ−ｅｎｖプローブは３，０．１．７及び０．６ｋｂ の３種の転写体を確認したが、−万Ｈ−ＬＴＲプローブで４よハイブリッド形成 の質及び強度双方について著しい差異を生じた。Ｈ−ＬＴＲはＮ　ＣＭ及びＴ１ において非常に顕著な主要３．６ｋｂ種を確認したが、逆にＴ３及びＴ４はほと んどいかなるハイブリッド形成も示さず（同量のＲＮＡを各列にのせた）、ＨＣ Ｔでは正常結腸粘膜よりも著しく低いハイブリッド形成強度を示した。更に、３ ．　６ｋｂ種はＨ−ｅｎｖだけ形成しなかったようである。

次いで、これまでに分析されたいずれの結腸ＲＮＡサンプルも（正常粘膜からか 又は腫瘍からのものかにかかわらず）３種のｅｎｖ特異性転写体を示したが、ハ イブリッド形成強度にやや差異があった（腫瘍は一貫して更に多くの１．７ｋｂ と時々更に多くの３．０及び０．６ｋｂ種とを含有しているようであった）。し かも、試験された４種の結腸癌細胞系（ＨＣＴ、Ｃａｃｏ２．５Ｗ４８０及びＣ ｏ１ｏ３２０）のうち、ＨＣＴ及びＣａｃｏ２のみが上記パターンを示したこと から、更に研究された。この点について、ＨＣＴ及びＣａｃｏ２は５Ｗ４８０及 びＣｏ　ｌ　ｏ３２０のストックで観察されなかった明瞭な上皮形態を示すこと に留意すべきである。

したがって、）ｉ−ｅｎｖプローブはいくつかのヒト繊維芽細胞及び癌細胞系中 で検出されなかった比較的特異的なハイブリッド形成パターンを確認しうるらし く、しかもそれはＲＮＡ保有性（ｔｒ＋ｔｅｇｒ＋ｔｙ）をチェックするために 有用なマーカーを提供する。このようなコントロールは、これまでに試験された 大多数の結腸腫瘍及びすべての結腸癌細胞系において３．６ｋｂＬＴＲ転写体の 劇的な減少を確認するために重要である。

ＲＮＡ転写体の実質上改善された解析性及びＨ−ＬＴＲプローブの高感度化も達 成された。ＬＴＲインサートをｐＳＰ６ベクター゛（メルトン、前掲）中でサブ クローニングし、ニックトランスレーションされたＨ−ｅｎｖプローブと既にハ イブリッド形成されたフィルターを再プローブ探査するために対応リボプローブ を用いた。このような実験の例としては、５種の異なるポリ（Ａ）”ＲＮＡ、即 ち２種のＮＣＭコントロール、２種の悪性腫瘍（Ｔ５、Ｔ６）及び１種の絨毛線 （ｖｉｌｌｏｇｌａｎｄｕｌａｒ）ポリープ（Ｐｌ）がＨ−ｅｎｖ及びＨ−ＬＴ Ｒリボプローブでプローブ探査された例がある。

Ｈ−ｅｎＶは有用なパターン（３，０，１，７及び０．６ｋｂの転写体）を与え たが、１．７及び０．　６ｋｂ種のシグナル強度は腫瘍の方が更に強かった。Ｐ ｌの場合には、３種すべてのＨ−ｅｎＶ転写体が明らかに増加していた。

同様のフィルターをＨ−ＬＴＲで再プローブ探査することにより前記発見を確認 し、更に内在性レトロウィルス配列の転写に際する変化が発癌過程の初期的現象 であることを示唆する証拠も提供した。特に、これまでに研究された正常結腸粘 膜（ＮＣＭ）のすべてのサンプルと比較して、前悪性及び悪性腫瘍双方において 一定の差異が出現した。ＬＴＲ特異性３．６ｋｂＲＮＡの量に関するしばしば非 常に顕著な減少、及び時々３．０及び０．６ｋｂ種の同様の増加を伴う１．　７ ｋｂ転写体についての増加があった。

この点において、これまでに試験された慢性潰瘍性結腸炎時の形成異常（Ｄｌ） の−例の場合に、１．７ｋｂ転写体が明らかに増加していた（下記第２表参照） 。（全結腸除去がこの患者で後に行われ、“その場”で癌が結腸試料から確認さ れた。） ３．０及び１．７ｋｂＲＮＡは、ｅｎｖ及びＬＴＲ双方のプローブと交差ハイブ リッド形成するようであった。

それらがＬＴＲプローブを用いた場合にＮＣＭで実質上検出不能である理由は、 ３．６ｋｂＲＮＡのＬＴＲ部分及びプローブ間の相同性が３．０及び１．７ｋｂ ＲＮＡの場合と比較して異なることに起因するらしい。したがって、後者２種の 転写体が所定の閾値以上に増加した場合にのみ、それらは検出可能になった。一 方、各プローブは、異なるにもかかわらず同時移動する転写体を確認することが できた。

分析結果の要旨は第２表に示されている。

第２表 ノザンプロット分析の要旨 外科的　ＬＴＲＬＴＲ−ｅｎｖ　ｅｎｖ試料　、転写体　転写体　転写体 ３、［ｉｋｂ　２．１ｋｂ　３．Ｏｋｂ　１．７ｋｂ　Ｏ，［１ｋｂＴｌ　２　 ＋　＋　＋　＋＋　ＮＤ Ｔ１３　＋　＋　ＮＤ Ｔ　１４　＋＋　十　±　＋　ＮＤ 細胞系 ＣａＣｏ２　ＣＡ−ＩＩ　−十　±　＋＋　＋８正常結腸粘膜：各腫瘍試料に隣 接する正常粘膜（ＮＣＭ）のサンプルが分析されたが、各コントロールの転写パ ターン中に検出可能な差異はみられなかった。

”Ｔｌ−１４は結腸癌であった；Ｔ１５は直腸癌であった。

＊＊＊　Ｐ１絨毛腺ポリープ ５慢性潰瘍性結腸炎時のＤ１形成異常 ＳＳ記号士−はとんど検出されず、ＮＤ−実施せず３．６ｋｂＨ−ＬＴＲ特異性 転写体の著しい豊富性及び試験された大半の原発（ｐｒ４ｍａｒｙ）ヒト結腸癌 におけるその著しい減少は、対応配列の調節が正常結腸粘膜の場合とは逆に腫瘍 では変化していることを示唆している。他方、結腸腫瘍はこれまで試験された形 成異常の１例を含めて高レベルのｅｎｖ関運関与転写体に１．７ｋｂ種を発現し ているようである。この観察及び非転移性非悪性腫瘍（Ｐｌ）における“癌様” パターンの発見は、Ｃ型関連内在性レトロウィルス配列が腫瘍形成に発展する結 腸病変の早期検出マーカーを提供することを示している。

特に、１．７ｋｂＲＮＡの増加及び３．６ｋｂ種のしばしば劇的な減少は、変化 した表現型に対応して変化する転写パターンの最良の指標を表す。

比較例１ ゲノムＤＮＡ中におけるレトロウィルス配列の試験Ｃ型関連ヒト内在性レトロウ ィルス配列のゲノムパターンのサザンプロットハイブリッド形成を、ヒト結腸癌 細胞系又はヒト結腸外科的試料のいずれかから得られたいくつかのＤＮＡサンプ ルについて分析した。

Ｈ−ＬＴＲは、ヒト繊維芽細胞系（ＨＦ）　、４種の結腸癌細胞系（Ｃａｃｏ２ ．５Ｗ４８０、Ｃｏ１ｏ３２０及びＨＣＴ）、正常結腸粘膜（ＮＣＭ）試料及び 結腸腫瘍（Ｔ１）から抽出された７種の異なる染色体ＤＮＡサンプル中における 相同的ゲノム配列の組込みパターンを比較するためにプローブとして用いられた 。

これらのＰｓｔｌ消化染色体Ｄ　Ｎ　Ａのサザンプロットハイブリッド形成では 、ｇ　ａ　ｇ　−ｅ　ｎ　Ｖプローブについて既に示されたように［スティール 、Ｐ、Ｅ、（ＳｔｅｅｌｅＰ、Ｅ、）　、サイエンス、第２２５巻、第９４３− ８４７頁。

１９８４年］、Ｈ−ＬＴＲプローブがヒトゲノム中の多数の相同的配列を確認し うろことを示した。

ハイブリッド形成パターンの複雑性の故にわずかなバリエーションの検出につい ては可能にならなかったけれども、試験されたＤＮＡ間で明らかな差異は存在し なかったようであった。

例２ 同様に、ＨＣＴ及びＣａｃｏ２細胞系はそれらが腸上皮と同様のいくつかのマー カー及び形態学的特徴を共有していることから特徴付けられた。しかも、集密的 Ｃａｃｏ２細胞は腸アルカリホスファターゼ及び腸細胞分化マーカーのレベルに 関して非常に増加することを示した。この点から、Ｃａｃｏ２細胞はインビトロ 操作し易い誘導可能な系を提供しうる。

したがって、Ｃａｃｏ２細胞を培養し、播種後桟々な時点で、即ち指数的増殖時 （ＣＡ−Ｉ）　、準集密時（ＣＡ−ＩＩ）及び集密時（ＣＡ−ＩＩＩ）にＲＮＡ について抽出した。対応ポリ（Ａ）、ＲＮＡをＨ−ＬＴＲリボプローブとのノザ ンプロットハイブリッド形成に洪し、正常粘膜コントロール（ＮＣＭ）　、ＨＣ Ｔ細胞系及び２種の原発腫瘍（Ｔ７及びＴ８）と比較した。

３、６ｋｂ転写体はＮ　ＣＭにおいて再度非常に顕著になり、原発腫瘍及びＨＣ Ｔ細胞双方で減少した。しかしながら、Ｃａｃｏ２細胞は指数的に増殖する場合 にのみ３．６ｋｂ転写体を産生ずるようであった。

ＨＣＴ及びＣａｃｏ２細胞中におけるこれらの配列の転写パターンは、一部の原 発腫瘍に関して観察されたパターンと著しく類似している（第２表参照）。Ｔ７ は双方のｅｎｖ関運関与転写体、０及び１．７ｋｂ）を発現し、その結果ＨＣＴ 細胞に匹敵するが、後者の方がむしろこれらのＲＮＡについて顕著である；代わ って、Ｔ８はＣａｃｏ２細胞の場合のように更に小さな転写体のみを示すが、準 集密及び集密培養物の場合には極めて少量の３、Ｏｋｂ転写体でも検出可能であ る。

例の説明 最初に一致した発見は、試験されたすべての原発腫瘍及び２例の非悪性病変（即 ち、ポリープ及び形成異常）の場合におけるＬＴＲ−ｅｎｖｌ、７ｋｂ転写体の 増加であった。

第二の関連発見は、３．６ｋｂＬＴＲ関運転写体のしばしば非常に顕著な減少で ある。Ｃａｃｏ２細胞系に関する“インビトロ″研究ではかかる転写体の発現が 調節可能であることを示しており、このことは対応遺伝子産物が結腸粘膜細胞の 分化過程で必要あることを示唆している。

１５例の正常結腸粘膜試料における極めて一致したパターンと比較して、腫瘍及 び腫瘍細胞系における転写パターンの多様性は、癌、特に原発癌の形態学的及び 生化学的特徴を含めた腫瘍異種性概念とも適合する。

本結果は、レトロウィルス転写体の発現パターン変更が初期段階における腫瘍疾 患検出用のマーカーを提供しうることを示している。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　１　年　２　月　１３日 ２、発明の名称 結腸病変用検出マーカー 名　称　ザ、ゼネラル、ホスピタル、コーポレーション５、　補正書の提出年月 日 １９８８年９月３０日 ６、　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１　通 和文明細書第１７頁下から４行に「第３０５巻」とあるを「第３０６巻」に補正 する。

国際調査報告 １剛・・−−電・・ｈ・−＾・−ｍ＋＋＋ｓ轡＊−〇？Ｃ’：／’：５Ｂ７ＩＯ ＩＢＢ９２国際調査報告 ＵＳ　８７０１８８９ ＳＡ　１８２１９

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ＲＮＡ含有結腸サンプル中における結腸腫瘍疾患の検出方法であって： （１）上記サンプルのＲＮＡを検出可能に標識化されたＨ・ＬＴＲ又はＨ−ｅｎ ｖヌクレオチドプローブと接触させ；及び
2. （２）既知の非癌性結腸サンプル中の量と比較してプローブ及びＲＮＡ間のハイ ブリッド形成量を検出する；ことを特徴とする方法。 ２．プローブがＨ−ｅｎｖである、請求項１に記載の方法。
3. ３．プローブがＨ−ＬＴＲである、請求項１に記載の方法。
4. ４．Ｈ−ｅｎｖプローブが第１図の配列の少なくとも一部を有するか又はその一 部と相同的である、請求項２に記載の方法。
5. ５．Ｈ・ＬＴＲプローブが第２図の配列の少なくとも一部を有するか又はその一 部と相同的である、請求項３に記載の方法。
6. ６．一部が少なくとも１８個のヌクレオチド鎖長である、請求項４又は５に記載 の方法。
7. ７．非癌性サンプルと比較してサンプル中に存在する１．７ｋｂレトロウイルス ＲＮＡ転写体の有意の増加を検出する、請求項２に記載の方法。
8. ８．非癌性サンプルと比較してサンプル中に存在する３．６ｋｂレトロウイルス ＲＮＡ転写体の有意の減少を検出する、請求項３に記載の方法。
9. ９．工程（１）の前に、サンプルからＲＮＡを精製しておく、請求項１に記載の 方法。
10. １０．ＲＮＡがオリゴｄＴクロマトグラフィーにより精製される、請求項９に記 載の方法。
11. １１．プローブが放射性原子、酵素又はビオチンもしくはアビジン標識で標識化 されている、請求項１に記載の方法。