NO831113L

NO831113L - Fremgangsmaate for fremstilling av blodtrykkssenkende midler

Info

Publication number: NO831113L
Application number: NO831113A
Authority: NO
Inventors: James Walter Ryan; Alfred Chung
Original assignee: Univ Miami
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1983-03-28
Publication date: 1981-09-11
Also published as: DK105981A; PT72635B; NO156695B; JPH0667902B2; ES8305698A1; FI810725L; ES500254A0; ES519567A0; EP0038117A1; NO831111L; PL230076A1; JPH01250344A; CS174581A2; ES8403104A1; JPH0667901B2; JPH02209865A; JPH01246257A; PT72635A; ES8403448A1; ES519565A0

Description

Det angiotensin-omdannende enzym (peptidyldipeptidhydrolase, heretter betegnet som ACE) inntar en sentral rolle i fysio-logien omkring hypertensjon. Enzymet er i stand til å om-danne dekapeptidet angiotensin I, som har følgende amino-syresekvens:

AspArgValTyrlleHisProPheHisLeu

til et oktapeptid, angiotensin II, ved at det katalyserer hydrolysen av angiotensin I's nest siste peptidbinding, hvorved man frembringer en fjerning av karboksylsluttgruppen HisLeu,

Forskjellige kjemiske forbindelser som inngår i den etter-følgende forklaring, er angitt i den nedenforstående tabell med sine forkortelser: ACE = L-alanin la = L-alanin Arg = L-arginin Asp = L-aspartinsyre Boe = t-butyloksykarbonyl Bpoc = 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl Bz = benzoyl Cbo = benzyloksykarbonyl Ddz = N-a,a-dimetyl-3,5-dimetyloksykarbonyl Gly = glycin His = L-histidin Ile = L-isoleucin Leu = L-leucin Phe = L-fenylalanin Ppoc = 2-fenylisopropyloksykarbonyl Pro = L-prolin APro = L-3,4-dehydroprolin Ser = L-serin Trp = L-tryptofan Tyr = L-tyrosin Val = L-valin

Angiotensin II er et meget sterkt blodtrykkshevende middel. I tillegg til sin direkte blodtrykkshevende virkning, så stimulerer også angiotensin II frigjøring av aldosteron som har en tendens til å heve blodtrykket ved at det holdes til-bake ekstracellulære salter og væsker. Angiotensin II finnes i målbare mengder i blodet hos normale mennesker. Det finnes imidlertid i forhøyede konsentrasjoner i blodet hos pasienter med nyrehypertensjon.

Nivået av ACE-aktivitet er vanligvis i overskudd, både i normale pasienter og i pasienter med hypertensjon, i forhold til den mengde som er nødvendig for å opprettholde det observerte nivå av angiotensin II. Man har imidlertid funnet at det skjermen betydelig blodtrykkssenkning i hypertensive pasienter når disse behandles med ACE-inhibitorer [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med. 291, 817 (1974)].

Den rolle som ACE synes å ha i patogenesen for hypertensjon har gjort at man lenge har forsket for å finne inhibitorer for enzymet som kunne virke som blodtrykkssenkende midler. Se f.eks. US-patentene 3.891.616, 3.947.575, 4.052.511 og 4.053.651. Reaktiviteten på ACE varierer markert avhengig av substratet. Mange peptider som kalles inhibitorer for den enzymatiske omdannelsen av angiotensin I til angiotensin II, er i virkeligheten substrater som har en lavere Michaelis-konstant (Km) enn angiotensin I. Slike peptider bør mer korrekt kalles konkurrerende substrater.

Tallrike syntetiske peptidderivater har vist seg å være ACE-inhibitorer, se Ondetti et al., i US-patent 3.832.337 utstedt 27. august 1974. En meget effektiv inhibitor med høy biologisk aktivitet når den tilføres oralt, er D-3-merkapto-2-metylpropanoyl-L-prolin, betegnet SQ14225, beskrevet i US-patent 4.046.889 til Ondetti et al., utstedt 6. september 1977, og beskrevet i forskjellige vitenskapelige artikler av Cushman, D.W. et al., Biochemistry 16^, 5484 (1977) og av Ondetti, M. et al., Science 196, 441 (1977). Inhibitoren SQ14225 har vært rapportert å ha en I^-verdi på 2,3 x 10 — 8M. Den I,. Q-verdi som er angitt av Cushman, et al, er den kon- . sentrasjon av inhibitor som er nødvendig for å gi en 50% hemming av enzymet under et standardprøvesystem som inne-holder et substrat ved et nivå vesentlig ^ over K m. Det er underforstått at I^^-verdiene lar seg direkte sammenligne, når man holder alle de virksomme faktorer som påvirker reaksjonen konstante. Disse faktorer innbefatter opprinnelse av enzym, dets renhet, det anvendte substrat og dets konsentrasjon, samt sammensetningen på prøvebufferen. Alle de I□ rAu-verdier som her er angitt, er utført i samme prøvesystem og med samme enzym (human urinær ACE), og med et omtrentlig h K -nivå av substrat, og resultatene lar seg derfor sammenligne.

Ved en analogi av det bedre kjente enzym karboksypeptidase A, har man utviklet en modell for den aktive posisjon i ACE og selve virkningsmåten for SQ14225. Det har vært postulert at den aktive posisjonen har en kationisk posisjon for binding av karboksylgruppen i substratet og en "lomme" eller "kløft" som er i stand til å binde sidekjeden på den C-terminale aminosyren, hvorved man får en spesiell sterk binding for den heterocykliske ringen på den terminale prolin-rest. Det har vært postulert en lignende "lomme" for den nest siste aminosyrerest, og publiserte data antyder et rela-tivt strengt sterisk krav, ettersom D-formen av inhibitoren var vesentlig mer virksom enn sin stereoisomer eller 3-metyl eller andre usubstituerte analoger. Sulfhydrylgruppen på inhibitoren som har vært postulert å ha en aktiv posisjon nær det katalytiske sentrum, antas å spille en sentral rolle for inaktivering av enzymet ved en kombinasjon med den sinkgruppen som er vesentlig for den katalytiske aktiviteten. Substi-tuenter på sulfhydrylgruppen slik som en metylgruppe, og S-acetylderivatet, reduserte i vesentlig grad inhibitorens virkning. Se Cushman. D.W., et al., Biochemistry, slik dette er angitt ovenfor.

In vitro-studier av den mekanime ved hjelp av hvilken SQ14225 og dets analoger virker for å hemme ACE, har vært noe hindret ved at disse molekyler under vanlige betingelser har høy grad av ustabilitet. Man har f.eks. kunnet observere at en frisk vandig oppløsning med en konsentrasjon på 1 mg pr.

ml av SQ14225 ved en pH på 8, blir vesentlig mindre aktiv ved henstand i så lite som 30 minutter, og at aktiviteten fortsetter å synke etter hvert som oppløsningen står. Man antar at dette tap av aktivitet i vesentlig grad skyldes en dimerisering av SQ14225, som skjer ved sulfhydrylende-gruppene, hvorved det dannes et disulfid som i vesentlig grad er inaktivt som en inhibitor. Etter som den frie sulfhydrylgruppen er meget reaktiv og lett kan oksyderes til polare syregrupper, slik som sulfon- og sulfoksydgrupper, så kan det også være at det observerte in vitrotap av aktivitet i vandige oppløsninger av SQ14225 ved henstand, til dels skyldes en eller flere slike oksydasjonsreaksjoner med dannelse av et sulfon eller sulfoksyd som ikke virker effektivt som en inhibitor for ACE.

I rapporter som hittil er tilgjengelige for klinisk prøving av SQ14225, og i visse av disse refereres forbindelsen til under dets varemerke "Captopril", antyder at produktet er tilstrekkelig stabilt i normale magesekk og tarmmiljø man finner hos de fleste pasienter til at midlet er en effektiv inhibitor for ACE når det tilføres oralt. Det er imidlertid ikke klart hvorvidt det er større eller mindre grupper av pasienter hvor SQ14225 i alt vesentlig er ineffektivt. På grunn av den høye reaktiviteten på den frie sulfhydrylgruppen, så vil SQ14225 lett kunne danne blandet disulfider med serum, cellulære proteiner, peptider eller andre forbindelser med frie sulfhydrylgrupper i det miljø som hersker i magesekken eller i tarmen, foruten muligheten for en dimerdannelse eller oksydativ nedbrytning. Et blandet disulfid med protein kan være antigenisk, og enkelte allergiske reaksjoner er også blitt observert klinisk. Se Gavras, et al, New England J. Med. 298, 991 (1978) . Hvis det dannes disulfider og oksydative nedbrytningsprodukter av SQ14225, så kan det i beste fall forventes å være i alt vesentlig ineffektive som inhibitorer. Det kan følgelig postuleres at dosereaksjonen for SQ14225 vil være variabel med hensyn til tilførselsmåte og for den enkelte pasient. Videre kan man hos enkelte pasienter forvente uønskede sideeffekter, og det kan være vanskelig å regulere en effektiv konsentrasjon av inhibitoren i kroppen.

Det er vanligvis vært antatt at tioesterforbindelser er høy-reaktive ved at tioesterbindingen lett lar seg hydrolysere til en sulfhydrylgruppe og en karboksylisk gruppe. Tioestere har følgelig ofte vært brukt som aktive estermellomprodukter for acylering under milde betingelser. Slike grupper, f.eks. acetyltio har vært brukt som blokkerende grupper bl.a. i ovennevnte Ondetti et al. patent. Tioestermellomproduktet har også vært antatt å opptre i biosyntesen av cykliske peptider slik som tyrocidin eller gramicidin S. Se Lipmann, F. i Accounts Chem. Res. 6_. 361 (1973) .

Forbindelser som er beslektet med SQ14225 er beskrevet av Ondetti et al., i US-patentene 4.046.889, 4.052.511, 4.053.651, 4.113.715 og 4.154.840. Det er her blant annet beskrevet interessante analoger av SQ14225 ved at den fem-atomære heterocykliske ringen i prolin er erstattet med ringer inneholdende fire eller seks atomer. Den hemmende virkningen for slike analoger i forhold til SQ14225 er imidlertid ikke beskrevet. Hvis man bruker D-prolin istedenfor L-prolin, så reduserer dette drastisk den hemmende virkningen for 3-merkapto-propanoylaminosyrer (Cushman, D.W., et al., se ovenfor).

Til dags dato har man ikke bestemt effekten av aminosyren til venstre for svovelatomet i tioesterforbindelsene. Det har vært antatt at denne aminosyren virker som en ytterligere "gjenkjennelsesposisjon" for enzymet. Hvis dette er til-felle, så skulle man forvente at en forbindelse med en amino-syre her kunne være en bedre inhibitor. Foreliggende søkere har funnet at forskjellige aminosyrer er effektive, og at hydroksyproliner, prolin-L- og D,L-3,4-dehydroprolin, tia-zolidin-4-karboksylsyre og L-5-oksoprolinderivater alle er effektive som blodtrykkssenkende midler og har høy hemmende virkning for ACE.

Foreliggende oppfinnelse angår en rekke fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser med følgende formel: hvor R er hydrogen, tert-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl eller pyro-L-glutamyl, eller R', hvor R' er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentakarbony1; A er fenylalanyl, alanyl, tryto-fyl, tyrosyl, isoleucyl, leucyl, glycyl, histidyl eller valyl, og a-aminogruppen i disse forbindelser er i amrd-binding med R; R^er hydrogen eller metyl; R2er L-prolin, L-3,4-dehydroprolin, D-L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksy-prolin, L-4-hydroksyprolin, L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-okso-prolin, og hvor iminogruppen i disse forbindelser er i imidbinding med den tilstøtende n er 0 eller 1, slik at når n er 0, så er R-^ metyl; og når n=l og R1er metyl, så står -CH2

gruppen i D-konfigurasjonen.

Disse forbindelser er inhibitorer for ACE og kan brukes som oralt effektive blodtrykkssenkende midler.

Av hensiktsmessighetsgrunner er alle de etterfølgende fremgangsmåter beskrevet på bakgrunn av de trinn som er nødvendig for å fremstille den forbindelsen hvor R er benzoyl, A er fenylalanyl, R^^er metyl, R2er L-prolin og n er 1, dvs. NQ-[3-Na-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. For fagfolk vil det imidlertid være underforstått at man lett kan fremstille andre forbindelser ved at man kan innføre andre forønskede grupper når dette måtte være passende istedenfor de som er brukt for å illustrere de foreliggende fremgangsmåter. Således kan man i alle de etterfølgende fremgangsmåter bruke L-3>4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin,

L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-okso-prolin istedenfor L-prolin i alle de fremgangsmåter som er beskrevet i

det etterfølgende. Videre kan alle de aminosyrer som er angitt for A brukes istedenfor fenylalanin i disse fremgangsmåter. Videre kan andre forønskede forbindelser fremstilles ved å utføre passende substitusjoner hvis intet annet er angitt nedenfor.

I en rekke av de fremgangsmåter som er beskrevet i det etter-følgende, blir N cx-R^-tiofenylalanin, hvor er H, Bz, Boe eller Ddz, reagert med metakrylsyre eller ester eller 3-brom-2-metylpropionsyre, for derved å få fremstilt 3-N<Q->R^-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre eller ester.. Denne forbindelse kan så oppløses slik at det dannes 3-Na<->R3-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre eller ester før denne forbindelsen reageres med L-Pro for å fremstille det forønskede produkt. I andre fremgangsmåter blir Na<->R.-fenylalanin eller N -R^-fenylalanin aktive estere hvor R^ er Bz, Bpoc, Ddz, reagert med 3-merkapto-2-metylpropionsyre eller en ester

av denne, for derved å få fremstilt 3-Na<->R4-fenylalanyltio-2- metylpropionsyre eller en ester. Denne forbindelsen kan så oppløses for å danne 3-Na<->R4-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre eller en ester av denne før den reageres med L-Pro for å danne det forønskede produkt. I andre fremgangsmåter blir 3-R5-tio-2-metylpropionsyre eller en ester av denne hvor R er Cbo, acetyl eller amino, oppløst for å danne 3-R,--tio-2-D-metylpropionsyre eller en ester av denne før man utfører en reaksjon med R-A.

3- benzoyltio-2-D-metylpropionsyre, som brukes som utgangs-forbindelse i de foreliggende fremgangsmåter for syntese av forbindelser med formel I, er kommersielt tilgjengelige fra Chemical Dynamics Corp., 3001 Hadley Road, South Plainfield, New Jersey.

I de følgende fremgangsmåter kan man bruke enhver hensikts-messig koplingsmetode for de trinn hvor dette kreves i tillegg til de som er angitt. Eksempler på koplingsmetoder inn befatter: blandet anhydrid (MA), decykloheksylkarbodiimid (DCC), azid, N-etyloksykarbonyl-2-etyloksy1-1,2-dihydrokinolin (EEDQ), N-isobutyloksykarbonyl-2-isobutyloksy-l,2-dihydro-kinolin, symmetrisk anhydrid, Woodwards reagens K (N-etyl-5-fenylisooksazolium-3'-sulfonat) eller karbonyldiimidazol (CDI) metoder. For en oversikt over disse metoder og fremgangsmåter, se Methoden der Organischem Chemie (Houben-Weyl) vol. XV, del II, s. 1 og etterfølgende (1974).

På lignende måte kan man i de etterfølgende fremgangsmåter hvor man bruker en t-butyloksykarbonyl (Boe)-beskyttende gruppe, erstatte denne med enhver syrefølsom aminobeskyttende gruppe, slik som 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl (Bpoc), 2-fenylisopropyloksykarbonyl (Ppoc), benzyloksykarbonyl (Cbo) eller andre syrefølsomme N-aralkyloksykarbonyl-beskyttende grupper. Fjerning av de beskyttende grupper kan utføres på enhver kjent måte, f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre (TFA) i anisol, HC1 i eddiksyre, kald trifluor-metansulfonsyre eller metanolisk ammoniakk. Se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), vol. XV, del I, s. 376 og de etterfølgende (1974).

I.

I en foretrukken fremgangsmåte ble N cx-Bpoc-Phe først koplet med 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre-t-butylester (fremstilt som beskrevet under fremgangsmåte II, trinnene 1-2) ved å bruke DCC-metoden i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol eller ved hjelp av MA-metoden, hvorved man fikk fremstilt 3-N cx-Bpoc-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester.

I annet trinn fjernet man de beskyttende grupper fra den ester som er fremstilt under trinn 1, hvorved man får 3-Na<->fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester.

I tredje trinn blir produktet fra trinn 2 koplet til.et benzoylhalogenid, slik som benzoylklorid eller -bromid, eller benzotriazolyl, p-nitrofenyl, o-nitrofenyl, 5-norbornen-2,3-dikarboksimidyl, pentaklorifenyl eller pentafluorfenyl- estere av benzosyre, hvorved man får fremstilt 3-N cx-benzoyl-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester.

I fjerde trinn ble t-butylestergruppen fjernet fra produktet fra trinn 3 ved bruk av konvensjonelle beskyttelsesfjerningsmetoder for dannelse av 3-N cx-benzoylfenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre.

I femte trinn ble produktet fra trinn 4 koblet med N-hydroksysuccinimid ved å bruke DCC- eller MA-metoden for dannelse av N-succinimidylesteren, som deretter ble omsatt med L-prolin for oppnåelse av N cx -[3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolin. N-hydroksysuccinimid kan erstattes med andre aktive esterforløpere for dannelse av andre nyttige aktive estere. Alternativt kan produktet fra trinn 4 kobles med L-prolin-t-butylester ved anvendelse av DCC- eller MA-metoden for oppnåelse av t-butylesteren av det samme produktet .

Enhver forønsket A-gruppe kan brukes istedenfor Phe i trinn 1, hvorved man får fremstilt forbindelser med den forønskede A-gruppe. Enhver forønsket R-gruppe kan koples til produktet fra trinn 2 ved å bruke R istedenfor benzoylgruppen i de benzoylkoplingsforbindelser som er beskrevet under trinn 3.

II.

I en annen foretrukken fremgangsmåte blir 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre koplet til N cx-Bpoc-Phe ved å bruke aktive estere slik som N-succinimidyl-, p-nitrofenyl- eller pentaklorfenylester eller lignende av Bz-Phe for dannelse av 3-Na<->Bpoc-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre.

I et annet trinn ble L-Pro-t-butylester koblet til produktet fra trinn 1 ved å bruke DCC-metoden i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol eller MA-metoden, hvorved man får fremstilt N<Q->[3-(Na<->Bpoc-fenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

Den Bpoc-beskyttende gruppen blir fjernet i et tredje trinn ved å bruke fortynnet TFA, hvorved man får fremstilt TFA-saltet av N -[3-fenylalanyltio-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et fjerde trinn ble produktet fra trinn 3 omsatt med benzoylklorid i en NaHCO^-oppløsning for dannelse av Na<->[3-(N<0->benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin-t-buty1-ester.

I et femte trinn ble t-butylesteren fjernet ved å bruke vanlig kjente fremgangsmåter, hvorved man får fremstilt N<0->[3-(N<0->benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin.

Enhver ønskelig A-gruppe kan brukes istedenfor Phe i trinn 1, hvorved man får fremstilt forbindelser med den ønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan koples til produktet fra trinn 3 ved å bruke R istedenfor benzoylgruppen i benzoylkloridkoblingsforbindelsen som er beskrevet i trinn 4.

III.

I en annen foretrukken metode ble benzoylgruppen fjernet fra 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre ved bruk av konvensjonelle beskyttelsesfjerningsmetoder.

I det andre trinnet ble produktet fra trinn 1 koblet til N<Q->Boc-Phe ved bruk av koblingsmetodene med aktiv ester som beskrevet i metode II, trinn 3, for dannelse av 3-N<Q->Boc-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre.

Produktet fra trinn 2 ble underkastet beskyttelsesfjerning i det tredje trinnet ved bruk av trifluoreddiksyre (TFA) i anisol for dannelse av TFA-saltet av 3-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre.

I det fjerde trinnet ble produktet fra trinn tre omsatt med benzoylklorid i en natriumbikarbonatoppløsning for dannelse av 3-Na<->benzoylfenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre. N 0( -[3-(N ( X-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin ble fremstilt i det fjerde trinnet ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet i metode II, trinn 5.

En hvilken som helst A-gruppe kan innsettes istedenfor Phe i trinn 2 for oppnåelse av forbindelser med den ønskede A-gruppen. En hvilken som helst R-gruppe kan kobles til produktet fra trinn 3 ved å innføre R istedenfor benzoyl-delen i benzoylklorid-koblingsforbindelsen som beskrevet i trinn 4.

IV.

I en annen foretrukken fremgangsmåte blir Boc-Phe først omsatt med pentaklorfenol ved å bruke MA-metoden, og dette gir N cx-t-butyloksykarbonylfenylalaninpentaklorfenylester (Boc-Phe-OPcp). Pentafluorfenol eller N-hydroksysuccinimid kan brukes istedenfor pentaklorfenol i denne reaksjon.

I annet trinn blir denne esteren reagert med hydrogenklorid eller hydrogenbromid i eddiksyre, noe som gir HC1 eller HBr-saltet av Phe pentaklorfenylesteren.

I et tredje trinn blir saltet reagert med benzoylklorid i en oppløsning av natriumbikarbonat i etylacetat og vann, hvorved man får Bz-Phe-pentaklorfenylester (Bz-Phe-OPcp).

I et fjerde trinn blir Bz-Phe-OPcp koblet med 3-merkapto-2-metylpropionsyre, noe som gir 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre ved hjelp av velkjente koblingsmetoder.

I et femte trinn ble dette produkt resolvert ved omkrystalli-sering, væskekromatografi, motstrømsfordeling eller ione-utveksling, eller ved anvendelse av spaltningsmidler slik som 3-nitro-D-tyrosinmetylester eller -hydrazid, (d)-(+)-cx-metylbenzylamin, eller 1- (-) -cx-metylbenzylamin, kinin, (-)-efedrin eller N,N-dicykloheksylamin.

I et sjette trinn ble det resolverte produkt koblet med L-prolin-t-butylester, fortrinnsvis ved å bruke DCC- eller MA-metodene, noe som ga Na-[3-(N°-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

Tilslutt ble denne esteren oppløst i en blanding av anisol og TFA, noe som ga den forønskede forbindelse.

3-merkaptopropionsyre eller 2-merkaptopropionsyre kan brukes istedenfor nevnte 3-merkapto-2-metylpropionsyre i trinn 4, hvorved man får fremstilt 3-tiopropionsyre eller 2-tiopropionsyrederivatene. Enhver ønskelig R-A-forbindelse, fremstilt ved metodene som beskrevet i US-patentsøknader nr. 064.897 til og med 064.903, inklusive, inngitt 14. august 1979, søknader nr. 116.950 og 116.951, inngitt 30. januar 1980, og søknad nr. 121.188, inngitt 3. mars 1980, kan brukes istedenfor Boc-Phe i trinn 1 i denne fremgangsmåten. For å oppnå en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper, blir trinnene 2 og 3 eliminert.

V.

I en annen fremgangsmåte blir benzoylklorid reagert med fenylalanin i en NaOH-oppløsning, noe som gir Na<->benzoylfenylalanin (Bz-Phe) som beskrevet i J. Biol. Chem. 138, 627-629 (1941) .

I et annet trinn blir tioeddiksyre omsatt med metakrylsyre til 3-acetyltio-2-metylpropionsyre. Denne syren blir så oppløst i en blanding av metanol og ammoniakk, noe som gir 3-merkapto-2-metylpropionsyre.

I et tredje trinn blir Bz-Phe fra trinn 1 omsatt med et overskudd av N-hydroksysuccinimid ved hjelp av MA-metoden. Det resulterende produkt blir så omsatt med 3-merkapto-2-metylpropionsyre fra trinn 2, hvorved man får 3-(Na<->benzoyl-fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre.

I et fjerde trinn oppløser man produktet fra trinn 3 ved hjelp av velkjente fremgangsmåter nevnt i metode IV ovenfor.

I et femte trinn blir det oppløste produkt fra trinn 4 omsatt med N-hydroksysuccinimid ved hjelp av MA-metoden. Det resulterende produkt blir så omsatt med L-prolin, noe som gir den forønskede forbindelse.

Alternativt kan t-butylesteren av L-prolin brukes istedenfor L-prolin i trinn 5 ovenfor. Hvis dette gjøres, må de beskyttende grupper fjernes fra produktet, f.eks. med TFA i nærvær av anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

Akrylsyre kan brukes istedenfor metakrylsyre i trinn 2 i denne fremgangsmåten, noe som gir 3-tiopropionsyrederivatet. 2-merkaptopropionsyre kan også brukes istedenfor 3-merkapto-2-metylpropionsyre i trinn 3, hvorved man får fremstilt 2-tiopropionsyrederivatet. Enhver ønskelig R-A-forbindelse som beskrevet ovenfor, kan brukes istedenfor Bz-Phe i trinn 3 i denne fremgangsmåten, noe som vil gi en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

VI.

I det første trinn i denne fremgangsmåten blir fenylalanin koblet med et benzoylhalogenid, slik som benzoylklorid eller benzoylbromid eller en aktiv benzosyreester slik som N-succinimidyl, p-nitrofenyl, o-nitrofenyl, benzotriazolyl, 5-norbornen-2,3-dikarboksimidy1, pentaklorfenyl eller penta-fluorfenylestere, noe som gir benzoylfenylalanin (Bz-Phe).

I et annet trinn blir sistnevnte produkt koblet til 3-merkapto-2-metylpropionsyre, noe som gir 3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre.

I et tredje trinn blir produktet fra trinn 2 oppløst ved hjelp av velkjente fremgangsmåter.

I et fjerde trinn ble det oppløste produkt koblet til t-butylesteren av L-prolin ved hjelp av DCC- eller MA-metoden, noe som gi-r N0- [ 3-(Na-benzoylf enylalanyltio) -2-metylpropanoyl ] -L-prolin-t-butylester. De beskyttende grupper blir fjernet fra denne esteren med TFA i anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

Man kan bruke 3-merkaptopropionsyre eller 2-merkaptopropionsyre istedenfor 3-merkapto-2-metylpropionsyre i trinn 4,

noe som gir 3-tiopropionsyre og 2-tiopropionsyrederivatene henholdsvis. Enhver ønskelig R-A-forbindelse som beskrevet ovenfor, kan brukes istedenfor Bz-Phe i trinn 2 i denne fremgangsmåten, noe som vil gi en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

VII.

I en annen fremgangsmåte kan N-a,a-dimetyl-3,5-dimetyloksy-benzyloksykarbonylfenylalanin (Ddz-Phe) kobles til 3-merkapto-2-metylpropionsyre ved hjelp av CDI-metoden i nævær av trietanolamin (TEA), noe som vil gi 3-(Ddz-fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre. Fotofølsomme aminobeskyttende grupper forskjellig fra Ddz, slik som 6-nitroveratryloksykarbonyl eller 2-nitrobenzyloksykarbonyl kan også brukes.

I et annet trinn blir produktet fra trinn 1 oppløst på velkjent måte.

I det tredje trinnet blir det oppløste produkt fra trinn 2 koblet til t-butylesteren av L-prolin ved hjelp av DDC- eller MA-metodene, noe som gir N a -[3-(N a-Ddz-fenylalanyltio)-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et fjerde trinn fjerner man så de beskyttende grupper fra produktet fra trinn 3 ved hjelp av bestråling, noe som gir N°-[3-fenylalanyltio-2-metylpropanoy1]-L-prolin-t-butylester.

I et femte trinn blir produktet fra trinn 4 koblet til enhver av de benzoylkoblingsforbindelser som er beskrevet i fremgangsmåte VI, trinn 1 ovenfor, hvorved man får fremstilt N<0->[3-(Na<->benzoylfenylalanyltio-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester .

I et sjette trinn blir de beskyttende grupper fjernet fra esteren ved hjelp av TFA i anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

Man kan bruke 3-merkaptopropionsyre og 2-merkaptopropionsyre istedenfor 3-merkapto-2-metylpropionsyre i trinn 1, noe som gir 3-tiopropionsyre og 2-tiopropionsyrederivatene. Videre kan man bruke enhver ønskelig gruppe istedenfor fenylalanin i trinn 1, hvorved man får fremstilt forbindelser med den forønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan kobles til produktet fra trinn 4 ved å bruke R istedenfor benzoylgruppen i de benzoylkoblingsforbindelser som er beskrevet i trinn 1 i fremgangsmåte VI som brukes i trinn 5 i denne fremgangsmåten.

VIII.

I en ytterligere fremgangsmåte blir 2-(4-bifenyl)-2-propyl-oksykarbonylfenylalanin (Bpoc-Phe) koblet til 3-merkapto-2-metylpropionsyre ved hjelp av CDI-metoden som er beskrevet. i fremgangsmåte VII, trinn 1 ovenfor. Bpoc kan brukes istedenfor 2-fenylisopropyloksykarbonyl (Ppoc) eller man kan bruke andre syrefølsomme N-aralkyloksykarbonyl-beskyttende grupper.

I det annet trinn blir 3-(Na<->Bpoc-fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre fremstilt i trinn 1 oppløst ved hjelp av velkjente fremgangsmåter.

I det tredje trinnet blir det oppløste produktet fra trinn 2 koblet til L-prolin-t-butylesteren som beskrevet i fremgangs-måo te VI, trinn 3, noe som gir N 0( -[3-(N Ot-Bpoc-fenylalanyltio)-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et fjerde trinn blir esterens beskyttende grupper fjernet med fortynnet TFA i diklormetan, noe som gir N<0->[3-(fenylalanyltio) -2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et femte trinn blir produktet fra trinn 4 koblet til en benzoylforbindelse som beskrevet i fremgangsmåte VI, trinn 1.

I et sluttrinn så blir de beskyttende grupper fjernet fra produktet i trinn 5 ved hjelp av TFA i anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

Man kan bruke 3-merkaptopropionsyre og 2-merkaptopropionsyre istedenfor 3-merkapto-2-metylpropionsyre i trinn 1, noe som gir 3-tiopropionsyre og 2-tiopropionsyrederivatene. Videre kan man bruke enhver ønskelig A-gruppe istedenfor fenylalanin i trinn 1, hvorved man får forbindelser med den forønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan kobles til produktet fra trinn 4 ved å bruke R istedenfor benzoylgruppen i benzoylkoblingsforbindelser som beskrevet i trinn 1 i fremgangsmåte VI, som brukes blant annet i trinn 5 i denne fremgangsmåten.

IX.

I en annen fremgangsmåte blir 3-amino-2-metylpropionsyre først oppløst ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter til 3-amino-2-D-metylpropionsyre.

I annet trinn ble produktet fra trinn 1 omsatt med HBr i natriumnitritt til 3-brom-2-D-metylpropionsyre. \

I tredje trinn ble produktet fra trinn 2 omsatt med tiobenzosyre til 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre. Man kan bruke tioeddiksyre istedenfor tiobenzosyre i denne reaksjonen.

I et fjerde trinn blir produktet fra trinn 3 omsatt med en alkalisk oppløsning, f.eks. metanol og ammoniakk, til 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre.

I et femte trinn ble Na<->benzoylfenylalanin (Bz-Phe) omsatt med N-hydroksysuccinimid ved hjelp av MA-metoden, og det resulterende produkt omsatt med produktet fra trinn 4 til 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre som angitt i trinn 3 i fremgangsmåte V.

I det sjette trinn ble produktet fra trinn 5 omsatt med N- - hydroksysuccinimid ved hjelp av MA-metoden, og produktet ble omsatt med L-prolin til den forønskede forbindelse som angitt i fremgangsmåte V, trinn 5.

Ved å bruke 3-aminopropionsyre eller 2-aminopropionsyre istedenfor 3-amino-2-D-metylpropionsyre i trinn 2, kan man fremstille 3-tiopropionsyre eller 2-tiopropionsyrederivatene. Enhver R-A-forbindelse kan brukes istedenfor Bz-Phe i trinn 5 for å få en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

I alle de tilfeller hvor det er angitt at man har en D-kon-figurasjoh i metylsidekjeden på 3-merkapto-2-metylpropion-syregruppen, så er det underforstått at dette er ekvivalent til å angi at man har en S-konfigurasjon.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse danner basiske salter med forskjellige uorganiske og organiske baser, og slike salter ligger også innenfor oppfinnelsen. Nevnte salter innbefatter f.eks. ammoniumsalter, alkalimetallsalter som natrium- og kalsiumsaltet (som er de foretrukne), alkali-jordmetallsalter som kalsium- og magnesiumsalter, videre salter med organiske baser, f.eks. dicykloheksylaminsalt, benzatin, N-metyl-D-glukamin, hydrabaminsalter, salter med aminosyrer som arginin, lysin og lignende. Det er fore-trukket å bruke de ikke-toksiske, fysiologisk akseptable

salter, skjønt andre salter kan også brukes, f.eks. for å isolere eller å rense produktet, noe som er angitt i eksemp-lene i forbindelse med dicykloheksylaminsaltet.

Saltene fremstilles på vanlig kjent måte ved å omsette den frie syreformen av produktet med en eller flere ekvivalenter av en passende base, noe som gir det forønskede kation i et oppløsningsmiddel eller et medium hvor saltet er dårlig oppløselig eller uoppløselig, eller i vann og hvoretter man fjerner vannet ved frysetørking. Ved å omsette saltet med en uoppløselig syre slik som en kation-utbytningsharpiks i hydrogenformen (f.eks. polystyrensulfonsyreharpikser som Dowex 50), eller med en vandig syre og så ekstrahere denne med et organisk oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat, diklormetan eller lignende, kan man oppnå den frie syreformen, hvis dette er ønskelig, og deretter danne et annet salt når dette måtte være passende.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Av hensiktsmessighetsgrunner har man i det etterfølgende beskrevet detaljer med hensyn til fremgangsmåter for fremstilling av N cx -[3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropano-yl ]-L-prolin. Hvis intet annet er angitt, har man anvendt molare ekvivalenter av reaktantene.

I.

Trinn 1. Syntese av Nq- t- butyloksykarbonyl- L- tiofenylalaninfenylester

En oppløsning av 3,98 g Boc-L-Phé i ca. 20 ml redestillert etanol ble avkjølt til -20°C i et metanol-is-tørris-bad. Oppløsningen ble tilsatt 2,04 ml N-etylmorfolin fulgt av 2,04 ml isobutylklorformat, og blandingen ble omrørt i 3 minutter ved -15°C. 1,8 ml tiofenol ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 1£ time ved -15°C. Den ble så langsomt oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. 2 0 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med kaldt vann, tre ganger med kald IN sitronsyre, tre ganger med kald mettet

natriumklorid, tre ganger med kald IN NaHC03og til slutt tre ganger med en mettet kald natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved fordampning. Resten ble utkrystallisert fra benzen-petroleter, noe som ga 3,68 g av hvite nåler med smeltepunkt på 113,5-114,5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr og elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 2. Syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalaninfenylester (i) 2 g av produktet, fra trinn 1 ble tilsatt 2,0 ml anisol og avkjølt i et is-aceton-bad. Nevnte N<Q->Boc-gruppe ble fjernet ved omrørting av blandingen med 4 ml vannfritt TFA i romtemperatur i 30 minutter. TFA og anisol ble fjernet ved 30°C under høyvakuum inntil man fikk de første hvite krystaller.

(ii) Deretter tilsatte man 10 ml av en 5,7 molar hydrogen-kloridoppløsning i etanol, og blandingen ble omrørt i 10 minutter ved romtemperatur. 15 ml vannfri eter ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad i 30 minutter. Oppløsningen ble filtrert, og krystallene vasket flere ganger med eter. De ble så tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5'noe som9a 1/03 g hvite krystaller som dekomponerte ved 164,5-165°C.

(iii) 1,12 g av dette produktet, dvs. hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalaninfenylesteren, ble suspendert i 15 ml etylacetat under kraftig ormrøring. Man tilsatte så 0,45 ml benzoylklorid, Blandingen ble dråpevis tilsatt en oppløsning av 1,01 g Na2C03i 10 ml vann, og blandingen ble omrørt kraftig i 30 minutter. Den ble så avkjølt i et isbad i 30 minutter og filtrert. Resten ble vasket syv ganger med kaldt vann, en gang med kald etylacetat og to ganger med vannfri eter. Resten ble så tørket i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5 1 flere timer, noe som ga 1,32 g hvite krystaller som dekomponerte ved 182-183°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 3. Syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalanin

En strøm av nitrogen ble boblet inn i en oppløsning av 1,01 g NaSH i 25 ml vannfri etanol under kraftig omrøring, mens temperaturen ble holdt mellom 35-40°C. 2,17 g av produktet fra trinn 2 ble tilsatt iløpet av 15 minutter. Temperaturen på reaksjonsblandingen falt til ca. 20°C etter at tilslut- ningen var ferdig. Blandingen ble så kraftig omrørt ved 20°C i lj time. Etanolen ble fjernet ved 32°C, 30 ml vann ble tilsatt, og oppløsningen avkjølt i et isbad. Den ble så surgjort til pH 2 med 50% H2SC>4. Den ble så hensatt i et isbad i 30 minutter og filtrert, hvoretter resten ble vasket flere ganger med kaldt vann og tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og ^2^5*Resten ble omkrystallisert fra benzen og heksan, noe som ga 1,45 g hvite nåler som dekomponerte ved 108 , 5-109 , 5°C. Analyse av produktet av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 4. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

En suspensjon av 285 mg av produktet fra trinn 3 og 86,1 yl metakrylsyre i 2 ml toluen ble kokt under tilbakeløp i flere timer, inntil reaksjonen var fullstendig, noe som ble påvist ved tynnsjiktskromatografi og papirelektroforese. Blandingen ble hensatt over natten ved romtemperatur, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning under høy-vakuum ved 35°C, noe som ga en oljeaktig rest. Dette ble utkrystallisert og omkrystallisert fra benzen-n-heksan til 195 mg hvite krystaller med et smeltepunkt på 120-122,5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste av produktet var identisk med tittelforbindelsen.

Trinn 5. Oppløsning til 3-( Na- benzoy1- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre (A) Produktet fra trinn 4 ble flere ganger utkrystallisert fra benzen til tittelforbindelsen. Ved å bruke en ut-fellingskrystall oppnådde man den ovennevnte forbindelse raskere og med høyere utbytte. (B) Produktet fra trinn 4 ble oppløst i benzen, hvoretter man tilsatte en evkvialent dicykloheksylamin og omrørte

det hele i flere timer. Blandingen ble hensatt over natten ved 4°C og så filtrert, og krystallene ble vasket og tørket i et vakuumkammer. De ble så oppløst i en blanding av vann og etylacetat, og blandingen ble surgjort til pH 2 med en oppløsning av mettet natriumkiorid og tørket ved hjelp av magnesiumsulfat. Oppløsningen ble filtrert, og oppløsnings-midlet ble fjernet i et roterende fordampningskammer. Produktet ble så utkrystallisert fra benzen.

Trinn 6. Syntese av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin (A) (i) 2,5 mmol av produktet fra trinn 5 ble oppløst i 3 ml dimetylformamid (DMF) og avkjølt til 0°C i et is-aceton-bad. 2,5 mmol DCC i 1,5 ml DMF ble tilsatt, og blandingen omrørt i 5 minutter ved 0°C. Oppløsningen ble tilsatt 2,5 mmol L-prolin-t-butylester i 1,5 ml DMF. Blandingen ble om-rørt over natten ved 4°C, og opparbeidet ved å tilsette 10 ml etylacetat og filtrert. Produktet ble vasket med 20 ml etylacetat, og de samlede etylacetatfraksjoner ble avkjølt i en dypfryser. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med en mettet natriumkloridoppløsning, en gang med kald 0,IN NaHCO^ og tre ganger med mettet natriumkiorid. Den organiske fasen ble så tørket med vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Opp-løsningsmidlet ble fjernet under høyvakuum, noe som ga en hvitt rest. (ii) Nevnte rest ble suspendert i 4 ml anisol og omsatt med 8 ml TFA i I3time ved romtemperatur under omrøring. TFA ble så fjernet ved fordampning i høyvakuum. Resten ble oppløst i 1 ml tetrahydrofuran (THF) og kromatografert. De forønskede fraskjoner ble fordampet til tørrhet, oppløst i en mindre mengde isopropanol og kromatografert om igjen. De forønskede fraksjoner ga en olje som ble opp-løst i THF, hvoretter sistnevnte ble fordampet under en strøm av nitrogen. Sluttproduktet fikk man etter å ha fjernet det gjenværende oppløsningsmiddel ved hjelp av fordampning i høy-vakuum. (B) En kald oppløsning av 2,5 mmol DCC i DMF ble tilsatt dråpevis til en blanding av 2,5 mmol av produktet fra

trinn 5 og 2,5 mmol N-hydroksysuccinimid i DMF ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C og så over

natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering, og bunnfallet vasket med etylacetat. Opp-løsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under redusert trykk, og resten utkrystallisert fra benzen og heksan. Krystallene ble oppløst i kald THF, og oppløsningen ble tilsatt en kald oppløsning av 2,5 mmol L-Pro og 2,5 mmol NaHCO^

i THF/vann. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. THF ble fjernet ved fordampning ved 35°C. Vann ble tilsatt blandingen og pH justert til 9 ved hjelp av fast NaHC03. Den vandige fasen ble ekstrahert med etylacetat, ble så avkjølt i et isbad og surgjort til pH 2 ved hjelp av IN HC1 i nærvær av etylacetat. Den organiske fasen ble vasket to ganger med kaldt vann og så to ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning og resten utkrystallisert fra eter og heksan, noe som ga tittelproduktet.

Alternative fremgangsmåter for syntese av Na- benzoyl- L-tiofenylalanin (A) Boc-L-tiofenylalaninfenylesteren ble fremstilt som beskrevet i trinn 1. Deretter ble tiosyren, Boc-L-tiofenylalanin fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 3. Alternativt kan denne tiosyren fremstilles ved å omsette molare ekvivalenter av Boc-L-Phe og H2S ved hjelp av den blandede anhydridkoblingsmetoden som er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. _74, 4726 (1952) . Tiosyren blir omsatt med hydrogenklorid i etanol og hvoretter man reagerer produktet med benzoylklorid eller en aktiv ester av benzosyre slik det er beskrevet i trinn 2, noe som gir tittelproduktet. (B) Na-benzoyl-L-Phe ble syntetisert ved å reagere ekvivalente mengder av benzoylklorid og L-Phe i natriumhydroksyd-oppløsning som beskrevet i J. Bio. Chem., 138, 627 (1941). Produktet kan syntetiseres ved å reagere molare ekvivalente mengder av Na<->benzoyl-L-Phe og H2S ved å bruke den blandede anhydridkoblingsmetoden slik det er beskrevet i J.Am. Soc, 74 , 4726 (1952) .

Alternativ fremgangsmåte for syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio) - 2- D- metylpropionsyre

Boc-L-tiofenylalanin ble fremstilt. Hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalanin ble fremstilt ved å reagere Boc-L-tiofenylalanin med HC1 i eddiksyre under omrøring ved romtemperatur. Vannfri eter ble tilsatt og blandingen avkjølt i et isbad, hvoretter den ble filtrert og vasket flere ganger med eter. Resten ble tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P^ O^. Det resulterende produkt ble omsatt med metakrylsyre som beskrevet i trinn 4, hvorved man fikk hydrogenkloridsaltet av 3-L-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre. Dette produkt kan enten oppløses ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 5 og deretter reagere det med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii), noe som gir tittelforbindelsen, eller dette produkt kan omsettes med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2(iii) og så oppløses.

II.

Trinn 1. Syntese av N cx- Cbo- L- fenylalaninpentaklorfenylester En oppløsning av 15 mmol Cbo-L-Phe i ca. 60 ml nylig destillert etylacetat ble avkjølt til -20°C i metanol-is-tørris-bad. Oppløsningen ble tilsatt 15 mmol N-etylmorfolin fulgt av 15 mmol isobutylklorformat, og oppløsningen ble rørt i flere minutter ved -15°C. 15 mmol pentaklorfenol ble tilsatt, og blandingen omrørt i lj time ved -15°C, den ble så langsomt oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer.

100 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad. Den organiske fasen ble vasket flere ganger med kaldt vann, kald mettet natriumkiorid, kald IN NaHCO^og tilslutt med kald mettet natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert, hvoretter oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning. Resten ble utkrystallisert fra etylacetat, noe som ga tittelproduktet med et smeltepunkt på 153,5-154°C.

Trinn 2. Syntese av hydrogenbromidsaltet av L- fenylalanin-pentaklorf enylester

Produktet fra trinn 1 ble omsatt med hydrogenbromid i eddik syre under omrøring ved romtemperatur i 4 5 minutter. Vannfri eter ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad. Opp-løsningen ble filtrert, og bunnfallet vasket flere ganger med eter. Det ble så tørket over natten i vakuum over NaOH-pellets og P^O^, hvorved man fikk tittelproduktet med et dekomponeringspunkt på 178-180°C.

Trinn 3. Syntese av N cx- benzoyl- L- fenylalaninpentaklorfenylester

Ved å bruke produktet fra trinn 2 istedenfor hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalanin i eksempel I, trinn 2(iii) og ved å bruke den fremgangsmåte som der er beskrevet, ble tittelforbindelsen fremstilt med et smeltepunkt på 161-162°C.

Trinn 4. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

En oppløsning av 10 mmol av produktet fra trinn 3 i omdestil-lert dioksan ble tilsatt en oppløsning av 10 mmol 3-merkapto-2-metylpropionsyre i dioksan som var nøytralisert med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil den var fullstendig, noe som kunne påvises ved tynnsjiktskromatografi. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk ved 30°C og etylacetat ble tilsatt, hvorpå blandingen ble avkjølt i et isbad og vasket med 0,IN HC1

og så flere ganger med mettet natriumkloridoppløsning. Opp-løsningsmidlet ble fjernet ved fordampning etter tørking over vannfritt magnesiumsulfat, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 5. Oppløsning til 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel I, trinn 5.

Trinn 6. Syntese av N cx -[ 3- N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel I, trinn 6(A).

III.

Trinn 1. Syntese av N cx- benzoyl- L- fenylalanin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å reagere molare ekvivalenter av benzoylklorid og L-Phe i en NaOH-oppløsning ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i J. Biol. Chem., 138, 627 (1941) .

Trinn 2. Syntese av 3- merkapto- 2- metylpropionsyre

En blanding av 50 g tioeddiksyre og 40,7 g metakrylsyre ble holdt på et dampbad i en time og så hensatt ved romtemperatur i 18 timer. Etter at reaksjonen var fullstendig, så

ble reaksjonsblandingen destillert i vakuum, og den forønskede 3-acetyltio-2-metylpropionsyre ble utskilt i den fraksjon som kokte mellom 128,5 og 131°C og så konsentrert til tørrhet. Produktet på 3,4 g ble oppløst i en blanding av 10,5 ml

vann og 6,4 ml konsentrert ammoniakk. Etter en time ble reaksjonsblandingen fortynnet med vann og filtrert. Filtratet ble ekstrahert med etylacetat og surgjort med konsentrert HCl, mettet med NaCl og ekstrahert to ganger med etylacetat. Sistnevnte ekstrakter ble vasket med mettet NaCl og konsentrert til tørrhet, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropionsyre

En oppløsning av 25 mmol N cx-benzoyl-L-Phe i redestillert etylacetat ble avkjølt til -20°C i et metanol-is-tørris-bad. Oppløsningen ble så tilsatt 25 mmol N-etylmorfolin fulgt av

25 mmol isobutylklorformat, og blandingen ble omrørt i et par minutter ved -15°C. 50 mmol N-hydroksysuccinimid ble tilsatt, og blandingen omrørt i li time ved -15°C. Blandingen ble så oppvarmet til romtemperatur og man tilsatte 25 mmol 3-merkapto-2-metylpropionsyre, nøytralisert med N-etylmorfolin, og det hele ble omrørt til reaksjonen var fullstendig, noe som ble påvist ved tynnsjiktskromatografi. Etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad

og surgjort til pH 3 med IN saltsyre. Den organiske fase ble vasket flere ganger med kaldt vann, deretter med kald NaCl og så ble den tørket over vannfritt magnesiumsulfat og

filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning,

og resten utkrystallisert fra benzen og petroleter, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 4. Oppløsning til N a -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke den fremgangsmåte, som er beskrevet i eksempel I, trinn 5.

Trinn 5. Syntese av N0-[ 3-( Na- benzoy1- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

En oppløsning av 10 mmol av produktet fra trinn 4 i redestillert etylacetat avkjølt til -20°C i metanol-is-tørris-bad. Oppløsningen ble tilsatt 10 mmol N-etylmorfolin fulgt av 10 mmol isobutylklorformat, og det hele ble omrørt et par minutter ved -15°C. 10 mmol N-hydroksysuccinimid ble så tilsatt, og blandingen omrørt i 1| time ved -15°C. Blandingen ble så oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad og den organiske fase vasket flere ganger med kaldt vann, kald IN NaHC03og til slutt med kald mettet NaCl. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning, og resten utkrystallisert fra benzenpetroleter, hvorved man fikk N-hydroksysuccinimidesteren av 3-(Na<->benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre. Dette produkt ble oppløst i THF og så ble oppløsningen tilsatt en kald oppløs-ning av 10 mmol L-Pro i THF:vann (1:1) inneholdende NaHCO^. Blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur, etylacetat ble tilsatt og blandingen avkjølt i et isbad. Den organiske fase ble vasket med kaldt vann, kald IN sitronsyre, kald mettet NaCl, kald IN NaHC03og til slutt med kald mettet NaCl. Den organiske fasen ble så tørket over vannfri magnesiumsulfat og filtrert, hvorpå oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning. Resten ble utkrystallisert fra eter og heksan, hvorved man fikk tittelproduktet.

IV.

Trinn 1. Syntese av 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

Ddz-L-Phe ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten fra Liebigs Ann. Chem., 763, 162 (1972) eller Birr, C, Peptide, 1972 , Proe. of the 12th Eur. Pep-t. Symp., Hanson, H. og Jaknbke, H.D., Ed., North-Holland Publishers, s. 72 (1973). En oppløsning av 10 mmol Ddz-L-Phe i redestillert dioksan ble avkjølt i et aceton-is-tørris-bad til -20°C. Oppløs-ningen ble tilsatt 10 mmol 1,1-dikarbonyldiimidazol (CDI) i dioksan. Oppløsningen ble omrørt ved -10°C i 2 timer og så tilsatt en kald oppløsning av 10 mmol 3-merkapto-2-metylpropionsyre i dioksan som var nøytralisert med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -10°C inntil reaksjonen var fullstendig, hvoretter blandingen ble oppvarmet til romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk ved 30°C og etylacetat ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt i et isbad og vasket med 0,IN HC1 og så flere ganger med mettet natriumkiorid. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning etter tørking over vannfritt magnesium-sulf at, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 2. Oppløsning til 3-( NQ- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Trinn 3. Syntese av Na-[ 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte forbindelse ble syntetisert ved å bruke produktet fra trinn 2 istedenfor 3-(N cx-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i eksempel I, trinn 6(A)(i) og ved å bruke den der angitte fremgangsmåten.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpro-panoyl ]- L- prolin- t- butylester

Produktet fra trinn 3 ble oppløst i THF og avkjølt til 20°C. Blandingen ble overført til ampulle og bestrålt med lys som hadde en bølgelengde på 350 nm i 5 timer. THF ble fjernet ved fordampning og man fikk tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoy1]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å bruke produktet fra trinn 4 i eksempel I, trinn 2 (iii) og bruke den fremgangsmåte som der er angitt.

Trinn 6. Syntese av Nq-[ 2-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble oppnådd ved å fjerne t-butylestergruppen fra produktet fra trinn 5 og bruke fremgangsmåten fra eksempel I, trinn 6(A)(ii).

V.

Trinn 1. Syntese av 3-( Na- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

Na-Bpoc-L-Phe ble syntetisert ved å bruke fremgangsmåten fra Heiv. Chem. Acta 51, 614 (1968) . Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke N-Bpoc-L-Phe istedenfor Ddz-L-Phe i fremgangsmåte VI, trinn 1 og bruke den der angitte fremgangsmåte .

Trinn 2. Oppløsning slik at man fikk 3-( NQ- Bpoc- L- fenylalanyltio) - 2- D- metylpropionsyre

Trinn 3. Syntese av Na-[ 3-( Na- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ved å bruke produktet fra trinn 2 istedenfor 3-(Na<->benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i eksempel I, trinn 6(A)(i) og bruke fremgangsmåten der, så fikk man fremstilt tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av N cx-[ 3-( L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpro-panoyl ]- L- prolin- t- butylester

Produktet fra trinn 3 ble oppløst i metylenklorid inneholdende 0,5% TFA og omrørt i 10 minutter. TFA og metylenklorid ble fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av N 01 -[ 3-( N 0(- benzoy1- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke produktet fra trinn 4 i eksempel I, trinn 2 (iii) og bruke den der angitte fremgangsmåte.

Trinn 6. Syntese av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å fjerne t-butylestergruppen fra produktet fra trinn 5 ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel I, trinn 6(A)(ii).

VI.

Trinn 1. Kobling av L- Pro til en fast harpiks

L-Pro ble koblet til en harpiks ved benyttelse av standard metodikk (se Advan. Enzymol., 3_2 , 221 (1969) ved blanding av en oppløsning av N cx-Boc-L-Pro i etylacetat med en fast fase-harpiks som har 3-nitro-4-brommetylbenzylamid-grupper festet dertil, i nærvær av diisopropyletylamin. Overskudd Na<->Boc-L-Pro ble deretter fjernet ved vasking med etylacetat, metanol og deretter diklormetan. En oppløsning 25% trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan inneholdende 1 mg)ml indol ble deretter tilsatt til harpiksen med Na<->Boc-L-Pro bundet dertil hvilket resulterte i fjerning av Boc-beskyttelsesgruppen. Harpiksen ble deretter vasket med diklormetan.

Trinn 2. Kobling av 3- merkapto- 2- metylpropionsyre til produktet fra trinn 1

En oppløsning av 3-Cbo-2-metylpropionsyre og DCC i DMF og diklormetan (1:1) ble blandet med harpiksen fra trinn 1 hvilket resulterte i at tittelforbindelsen ble koblet til

L-Pro som var bundet til harpiksen. Overskudd reaktanter

ble fjernet ved vasking med etanol og deretter diklormetan. Produktet ble tørket under en strøm av tørr nitrogen. En oppløsning TFA ble blandet med harpiksen slik at Cbo-gruppen ble fjernet og harpiksen ble igjen vasket med etanol og deretter med diklormetan.

Trinn 3. Kobling av L- Phe til produktet fra trinn o 2

En oppløsning av Na<->Boc-L-Phe og DCC i DMF og diklormetan (1:1) ble blandet med harpiksen fra trinn 2. Produktet ble koblet til merkaptogruppen av forbindelsen som var forbundet med harpiksen. Overskudd av reaktanter ble fjernet ved vasking med etanol og så diklormetan. En oppløsning av 25% TFA i diklormetan (1 mg/ml indol) ble blandet med harpiksen for å fjerne den Boc-beskyttende gruppen, noe som resulterte i N cx-(3-L-fenylalanyltio-2-metylpropanoyl)-L-prolin bundet til harpiksen. Overskuddet av TFA ble fjernet ved vasking med diklormetan.

Trinn 4. Kobling av benzoylgruppen til produktet i trinn 3

En oppløsning av benzoylklorid i DMF inneholdende 1 ekvivalent TEA ble blandet med harpiksen fra trinn 3. Benzoylgruppen ble koblet til aminogruppen i Phe. Overskudd av reaktanter ble fjernet ved vasking med etanol og diklormetan, hvorved man fikk N cx -[3-(N cx-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-metylpropanoyl]-L-prolin bundet til harpiksen.

Trinn 5. Avspaltning av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- metylpropanoyl]- L- prolin fra harpiksen

Det ovennevnte produkt ble avspaltet fra harpiksen ved bestråling under anvendelse av lys med en bølgelengde på 350 nm som beskrevet i J. Am. Chem., 97, 1575 (1975). Produktet ble vasket fra harpiksen ved anvendelse av etylacetat. Opp-løsningsmidlet ble fjernet ved anvendelse av en roterende evaporator for dannelse av tittelproduktet.

Trinn 6. Oppløsning av N cx-[ 3-( benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel IV, trinn 2.

VII.

Trinn 1. Syntese av 3-( N cx- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre- t- buty lester

N cx-Bpoc-L-Phe ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet av Sieber et al., Heiv. Chem. Acta 5JL, 614 (1968). 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre ble omsatt med 2-metylpropen i nærvær av svovelsyre for dannelse av 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester. Den benzoylbeskyttende gruppen ble fjernet ved anvendelse av konvensjonelle beskyttelsesfjernende metoder ved bruk av ammonium-hydroksyd, ammoniakk i metanol eller natriummetoksyd i metanol. Tittelforbindelsen ble fremstilt ved kobling av Na<->Bpoc-L-Phe med den således oppnådde 3-merkapto-2-D-metylpropionsyre-t-butylester ved bruk av koblingsmetoden med aktiv ester.

Trinn 2. Syntese av trifluoracetatsaltet av 3- L- fenylalanyltio) - 2- D- metylpropionsyre- t- butyoester

Produktet fra trinn 1 ble oppløst i metylenklorid inneholdende 0,5% TFA og omrørt i 10 minutter. Metylenkloridet og overskudd av TFA ble fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre- t- buty lester

15 mmol av produktet fra trinn 2 ble suspendert i etylacetat under kraftig.omrøring. Deretter tilsatte man 15 mmol benzoylklorid ved romtemperatur. Blandingen ble dråpevis tilsatt en oppløsning av 32 mmol NaHCO^i vann, og blandingen omrørt i time. Den ble så avkjølt i et isbad i ytterligere en time, og etylacetat ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt i et isbad og vasket med vann, IN sitronsyre og så flere ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsnings-midlet ble fjernet ved fordampning etter tørking over vann fritt magnesiumsulfat, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

t-butylgruppen ble fjernet fra produktet fra trinn 3 ved bruk av konvensjonelle beskyttelsesfjernende metoder.

Trinn 5. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoy1]- L- prolin

Produktet fra trinn 4 ble koblet med N-hydroksysuccinimid ved anvendelse av DCC- eller MA-metoden for dannelse av N-succinimidylesteren, som deretter ble omsatt med L-

prolin for dannelse av N cx -[3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin.

VIII.

Trinn 1. Syntese av 3- merkapto- 2- D- metylpropionsyre Tittelproduktet ble fremstilt ved fjerning av den benzoylbeskyttende gruppen fra 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre ved anvendelse av konvensjonelle beskyttelsesfjernende metoder.

Trinn 2. Syntese av 3-( N cx- Boc- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Tittelforbindelsen ble fremstilt ved kobling av forbindelsen fremstilt i trinn 1 med Na-Boc-L-Phe ved benyttelse av koblingsmetoden med aktiv ester.

Trinn 3. Syntese av trifluoracetatsaltet av 3- L- fenylalanyltio- 2- D- metylpropionsyre

Produktet fra trinn 2 ble suspendert i 4 ml anisol og omsatt med 8 ml TFA i 12time ved romtemperatur under omi"øring. Anisol og overskudd av TFA ble fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Tittelforbindelsen ble fremstilt ved omsetning av produktet

fra trinn 3 med benzoylklorid i NaHCO^-oppløsning.

Trinn 5. Syntese av NQ-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoy1]- L- prolin

Produktet fra trinn 4 ble koblet med N-hydroksysuccinimid ved anvendelse av DCC- eller MA-metoden for dannelse av N-succinimidylesteren, som deretter ble omsatt med L-prolin for dannelse av Na-[3-(Na-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metyl-propanoyl ]-L-prolin.

IX.

Trinn 1. Syntese av 3-( Na- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 1 og bruke 3-merkapto-2-D-mety1-propionsyre (fremstilt ved fjerning av den benzoylbeskyttende gruppen fra 3-benzoyltio-2-D-metylpropionsyre ved bruk av konvensjonelle metoder) istedenfor dets t-butylester.

Trinn 2. Syntese av NQ-[ 3-( Na- Bpoc- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

En kald oppløsning av 10 mmol DCC i DMF og inneholdende 10 mmol 1-hydroksybenzotriazol ble dråpevis tilsatt en blanding av 10 mmol av produktet fra trinn 1 og 10 mmol L-prolin-t-butylester i DMF. Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C og så over natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering, og bunnfallet vasket med etylacetat. Oppløsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under redusert trykk, og resten utkrystallisert fra eter og heksan, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av trifluoracetatsaltet av N cx-[ 3- L- fenylalanyltio- 2- D- metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 2 og bruke produktet fra trinn 1 istedenfor den nevnte angitte 3-(N cx-Bpoc-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre-t-butylester.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoy1- L- fenylalanyltio- 2- D-metylpropanoy 1 ]- L- prolin- t- butylester

Ved å bruke produktet fra trinn 3 istedenfor TFA-saltet av 3-L-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre-t-butylester i metode I, trinn 3 og bruke den fremgangsmåte som der er angitt, fikk man fremstilt ovennevnte produkt.

Trinn 5. Syntese av N cx -[ 3- N cx- benzoyl- L- fenylalanyl)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode II, trinn 5(B)(ii)

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvor R er hydrogen, t-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl, pyro-L-glutamyl eller R', hvor R' er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, tryptofyl, tyrosyl, glycyl, isoleucyl, leucyl, histidyl eller valyl, idet a-aminogruppen deri er i amidbinding med R; R^er hydrogen eller metyl; n er 0 eller 1, slik at når n er 0, er R^ metyl, og når n er 1 og R^er metyl er gruppen

i D-konfigurasjonen; og R2er L-prolyl, L-3,4-dehydroprolyl, D,L-3,4-dehydro-prolyl, L-3-hydroksyprolyl, L-4-hydroksyprolyl, L-tiazolidin-4-karboksylsyre, eller L-5-oksoprolyl, idet iminogruppen deri er imidbinding med den tilstøtende

karakterisert vedfølgende trinn: (A) omsetning av en forbindelse med formelen:

hvor n har den ovenfor angitte betydning, eller et reaktivt derivat derav, med en forbindelse med formelen: hvor R^er en syrefølsom aminobeskyttende gruppe og A har den ovenfor angitte betydning, for dannelse av en forbindelse med formelen:

hvor R^, A og n har de ovenfor angitte betydninger, (B) fjerning av den R^-beskyttende gruppen fra produktet fra trinn (A), (C) omsetning av produktet fra trinn (B) med en R-koblende forbindelse, idet R har den ovenfor angitte be-tydnina, for dannelse av en forbindelse med formelen:

hvor R, A, R^og n har den ovenfor angitte betydning, (D) kobling av en forbindelse med formel V med en forbindelse med formelen:

hvor R2enten er lik R_ som angitt ovenfor, eller R2er som angitt ovenfor inneholdende en karbonylbeskyttende gruppe, og, om nødvendig, fjerning av den karbonylbeskyttende gruppen.