NO831111L

NO831111L - Fremgangsmaate for fremstilling av blodtrykkssenkende midler.

Info

Publication number: NO831111L
Application number: NO831111A
Authority: NO
Inventors: James Walter Ryan; Alfred Chung
Original assignee: Univ Miami
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1983-03-28
Publication date: 1981-09-11
Also published as: DK105981A; PT72635B; NO156695B; JPH0667902B2; NO831113L; ES8305698A1; FI810725L; ES500254A0; ES519567A0; EP0038117A1; PL230076A1; JPH01250344A; CS174581A2; ES8403104A1; JPH0667901B2; JPH02209865A; JPH01246257A; PT72635A; ES8403448A1; ES519565A0

Abstract

Forbindelser med formelen:. hvor R er hydrogen, t-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-Ij-lysyl, ti-lysyl, L-arginyl, pyro-L-glutamyl eller R', hvor R' er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cylcLopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, tryptofyl, tyrosyl, glycyl, isoleucyl, leucyl, histidyl eller valyl, idet a-amirogruppen deri er i amidbinding med R; R. er hydrogen eller metyl; n er 0 eller 1, slik at når n er 0, er R, metyl, og når n er 1 og Rer metyl, er gruppeni D-konfigurasjonen; og Rer L-prolyl, L-3,4-dehydroprolyl,' L-3-hydroksyprolyl, k-4-hydroksyprolyl, Itiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-oksoprolyl, idet iniinoqruppen deri er i iirddbindinq med den tilsttende 0 fremstilles ved (A) kobling av en forbindelse mad formelen: ■i -C-;hvor Rj er en syrefølsom arninobeskyttende gruppe, og A, R, og n har den ovenfor angitte betydning, eller et reaktivt derivat derav, med en forbindelse med formelen:. hvor R^ enten er lik ^ som angitt ovenfor, eller Rer som angitt ovenfor. inneholdende en karbonylbeskyttende gruppe; (B) fjerning av den Rbeskyttende gruppe fra produktet fra trinn (A), (C) criBetning av produktet fra trinn (B) med en R-koblende forbindelse,. hvor R har den ovenfor angitte betydning, og, cm nødvendig, fjerning av den karbonylbeskyttende gruppen.Forbindelsen med formel (I) er inhibitorer for angiotensinamdannende enzymer.

Description

Det angiotensin-omdannede enzym (peptidyldipeptidhydrolase, heretter betegnet som ACE) inntar en sentral rolle i fysio-logien omkring hypertensjon. Enzymet er i stand til å om-danne dekapeptidet angiotensin I, som har følgende aminosyre-sekvens:

AspArgValTyrlleHisProPheHisLeu

til et oktapeptid, antiotensin II, ved at det katalyserer hydrolysen av angiotenzin I's nest siste peptidbinding, hvorved man frembringer en fjerning av karboksyl-sluttgruppen HisLeu.

Forskjellige kjemiske forbindelser som inngår i den etter-følgende forklaring, er angitt i den nedenfors.tående tabell med sine forkortelser:

ACE = angiotensin-omdannede enzym

Ala = L-alanin

Arg = L-arginin

Asp = L-aspartinsyre

Boe = t-butyloksykarbonyl

Bpoc = 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl

Bz = benzoyl

Cbo = benzyloksykarbonyl

Ddz = N-a,a-dimetyl-3,5-dimetyloksykarbonyl

Gly = glycin

His = L-histidin

Ile = L-isoleucin

Leu = L-leucin

Phe = L-fenylalanin

Ppoc = 2-fenylisopropyloksykarbonyl

Pro =„'L-prolin

APro = "L-3,4-dehydroprolin

Ser = L-serin

Trp = L-tryptofan

Tyr = L-ty.rosin

Val = L-valin

Angiotensin II er et meget sterkt blodtrykkshevende middel.

I tillegg til sin direkte blodtrykkshevende virkning, så .stimulerer også angiotensin II frigjøring av aldosteron som har en tendens til å heve blodtrykket ved at det holdes til-bake ekstracellulære salter og væsker. Angiotensin II

finnes i målbare mengder i blodet hos normale mennesker.

Det finnes imidlertid i forhøyede konsentrasjoner i blodet hos pasienter med nyrehypertensjon.

Nivået av ACE-aktivitet er vanligvis i overskudd, både i normale pasienter og i pasienter med hypertensjon, i forhold til den mengde som er nødvendig for å opprettholde det observerte nivå av angiotensin II. Man har imidlertid funnet at det skjer en betydelig blodtrykkssenkning . i hypertensive pasienter når disse behandles med ACE-inhibitorer [Gavras, I., ét al., New Engl. J. Med. 291, 817 (1974)].

Den rolle som ACE synes å ha i patogenesen for hypertensjon har gjort at man lenge har forsket for å finne inhibitorer for enzymet som kunne virke som blodtrykkssenkende midler.

Se f.eks. US-patentene 3.891.616, 3.947.575, 4.052.511 og 4.053.651. Reaktiviteten på ACE varierer markert avhengig av substratet. Mange peptider som kalles inhibitorer for den enzymatiske omdannelsen av angiotensin I til angiotensin II, er i virkeligheten substrater som har en lavere Michaelis-konstant (Km) enn angiotensin I. Slike peptider bør mer korrekt kalles konkurrerende substrater.

Tallrike syntetiske peptid-derivater har vist seg å være ACE-inhibitorer, se Ondetti et al, i US-patent 3.832,337 utstedt 27. august 1974. En meget effektiv inhibitor med høy biologisk aktivitet når den tilføres oralt, er D-3-merkapto-2-metylpropanoyl-L-prolin, betegnet SQ14225, beskrevet i US-patent 4.046.889 til Ondetti et al, utstedt 6. september 1977, og beskrevet i forskjellige vitenskapelige artikler av Cushman, D.W.. et al, Biochemistry 16_, 5484 (1977) og av Ondetti, M. et al,Science 196, 441.(1977). Inhibitoren —8 SQ14225 har vært rapportert å ha en 1,-g-verdi på 2,3 x 10 M.. Den I,.Q-verdi som er angitt av Cushman, et al, er den konsentrasjon av inhibitor som er nødvendig for å gi en 50% hemming av enzymet under et standardprøvesystem som inne-holder et substrat ved et nivå vesentlig over K m. Det er underforstått at I,b , U-verdiene lar seg direkte sammenligne, når man holder alle de virksomme faktorer som påvirker reaksjonen konstante. Disse faktorer innbefatter opprinn-else av enzym, dets renhet, det anvendte substrat og dets konsentrasjon, samt sammensetningen på prøvebufferen. Alle de I,.^-verdier som her er angitt, er utført i samme prøve-system og med samme enzym (human urinær ACE), og med et omtrentlig3K^-nivå av substrat, og resultatene lar seg derfor sammenligne.

Ved en analogi av det bedre kjente enzym karboksypeptidase A, har man utviklet en modell for den aktive posisjon i ACE og selve virkningsmåten for SQ14225. Det har vært postulert at den aktive posisjonen har en kationisk posisjon for binding av karboksylgruppen i substratet og en "lomme" eller "kløft" som er i stand til å binde sidekjeden på den C-terminale aminosyren, hvorved man får en spesiell sterk binding for den heterocykliske ringen på det terminale prolinresiduet. Det har vært postulert en lignende "lomme" for det nestsiste aminosyreresiduet, og publiserte data antyder et relativt strengt sterisk krav, ettersom D-formen av inhibitoren var vesentlig mer virksom enn sin stereo-isomer eller 3-metyl eller andre usubstituerte analoger. Sulfhydrylgruppen på inhibitoren som har vært postulert å

ha en aktiv posisjon nær det katalytiske sentrum, antas å spille en sentral rolle for inaktivering av enzymet ved en kombinasjon med den sinkgruppen som er vesentlig for den katalytiske aktiviteten. Substituenter på sulfhydrylgruppen, slik som en metylgruppe, og S-acetylderivatet, reduserte i vesentlig grad inhibitorens virkning. Se Cushman, D.W.,

et al., Biochemistry, slik dette er angitt ovenfor.

In vitro-studier. av den mekaniske ved hjelp av hvilken SQ14225 og dets analoger virker for å hemme ACE, har vært noe hindret ved at disse molekyler under vanlige betingelser har høy grad av ustabilitet. Man har f.eks. kunnet observere at en frisk vandig oppløsning med en konsentrasjon på 1 mg pr.

ml av SQ14225 ved en pH på 8, blir vesentlig mindre aktiv ved henstand i så lite som 30 minutter, og at aktiviteten fortsetter å synke etter hvert som oppløsningen står. Man antar at dette tap av aktivitet i vesentlig grad skyldes en dimerisering av SQ14225, som skjer ved sulfhydrylende-gruppene, hvorved det dannes et disulfid som i vesentlig grad er inaktivt som en inhibitor. Etter som den frie sulfhydrylgruppen er meget reaktiv og lett kan oksyderes til polare syregrupper, slik som sulfon- og sulfoksydgrupper, så kan det også være at det observerte in vitro-tap av aktivitet i vandige oppløsninger av SQ14225 ved henstand, til dels skyldes en eller flere slike oksydasjonsreaksjoner med dannelse av et sulfon eller sulfoksyd som ikke virker effektivt som en inhibitor for ACE.

I rapporter som hittil er tilgjengelige for klinisk prøving

av SQ14225, og i visse av disse refereres forbindelsen til under dets varemerke "Captopril", antyder at produktet er tilstrekkelig stabilt i normale magesekk- og tarmmiljø man finner hos de fleste pasienter til at midlet er en effektiv inhibitor for ACE når det tilføres oralt. Det er imidlertid ikke klart hvorvidt det er større eller mindre grupper av pasienter hvor SQ14225 i alt vesentlig er ineffektivt. På grunn av den høye reaktiviteten på den frie sulfhydrylgruppen, så vil SQ14225 lett kunne danne blandet disulfider med serum, cellulære proteiner, peptider eller andre forbindelser med frie sulfhydrylgrupper i det miljø som hersker i magesekken eller.i tarmen, foruten muligheten for en dimerdannelse eller oksydativ nedbrytning. Et blandet disulfid med protein kan være antigenisk, og enkelte allergiske reaksjoner er også blitt observert klinisk. Se Gavras, et al, New England J. Med.

292, 991 (1978). Hvis det dannes disulfider og oksydative nedbrytningsprodukter av SQ14225, så kan det i beste fall forventes å være i alt vesentlig ineffektive som inhibitorer. Det kan følgelig postuleres at dosereaksjonen for SQ14.225 vil

være variabel med hensyn til tilførselsmåte og for den enkelte pasient. Videre kan man hos enkelte pasienter forvente uønskede sideeffekter, og det kan være vanskelig å regulere en effektiv konsentrasjon av inhibitoren i kroppen.

Det er vanligvis vært antatt at tioesterforbindelser er høyreaktive ved at tioesterbindingen lett lar seg hydrolysere til en sulfhydrylgruppe og en karboksylisk gruppe. Tio-estere har følgelig ofte vært brukt som aktive estermellom-produkter for acylering under milde betingelser. Slike grupper, f.eks. acetyltio har vært brukt som blokkerende grupper bl.a. i ovennevnte Ondetti et al. patent. Tioestermellom-produktet har også vært angitt å opptre i biosyntesen av cykliske peptider slik som tyrocidin eller gramicidin S.

Se Lipmann, F. i Accounts Chem. Res. 6_, 361 (1973).

Forbindelser som er beslektet med SQ14225 er beskrevet i US-patentene 4.046.889, 4.052.511, 4.053.651, 4.113.715 og 4.154.840. Det er her blant annet beskrevet interessante analoger av SQ14225 ved at den fem-atomære heterocykliske ringen i prolin er erstattet med ringer inneholdende fire eller seks atomer. Den hemmende virkningen for slike analoger i forhold til SQ14225 er imidlertid ikke beskrevet. Hvis man bruker D-prolin istendefor L-prolin, så reduserer dette drastisk den hemmende virkningen for 3-merkapto-pro-panoylaminosyrer (Cushman, D.W., et al., se ovenfor).

Til dags dato har man ikke bestemt effekten av aminosyren

til venstre for svovelatomet i tioesterforbindelsene. Det har vært antatt at denne aminosyren virker som en ytter-ligere "gjenkjennelsesposisjon" for enzymet. Hvis dette er tilfelle, så skulle man forvente at en forbindelse med en aminosyre her kunne være en bedre inhibitor. Foreliggende søkere har funnet at forskjellige aminosyrer er effektive,

og at hydroksyproliner, prolin-L- og D,L-3,4-dehydroprolin, tiazolidin-4-karboksylsyre og L-5-okso-prolinderivater alle er effektive som blodtrykkssenkende midler og har høy hemmende virkning for ACE.

Foreliggende oppfinnelse angår en rekke fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser med følgende formel:

hvor R er hydrogen, tert-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl eller pyro-L-glutamyl, eller R<1>hvor R<1>er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl, cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, trytofyl, tyrosyl, isoleucyl, leucyl, glycyl, histidyl eller valyl og a-aminogruppen i disse forbindelser er i amidbinding med R; R^er hydrogen eller metyl; R_ er L-prolin, L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin, L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-okso-prolin, og hvor iminogruppen i disse forbindelser er i imidbinding med den tilstøtende n er 0 eller 1, slik at når n er 0, så er R^metyl; og når n=l og R^er metyl, så står

-gruppen

i D-konfigurasjonen. Disse forbindelser er inhibitorer for ACE og kan brukes som oralt effektive blodtrykkssenkende midler.

Av hensiktsmessighetsgrunner er alle de etterfølgende fremgangsmåter beskrevet på bakgrunn av de trinn som er nødvendig for å fremstille den forbindelsen hvor R er benzoyl, A er fenylalanyl, R1er metyl, R2er L-prolin og n er 1, dvs. N Ct -[3-N OL-benzoylfenylalanyl-tio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. For fagfolk vil det imidlertid være underforstått at man lett kan fremstille andre forbindelser ved at man kan innføre andre forønskede, grupper når dette måtte være passende isteden for de som er brukt for å illustrere de foreliggende fremgangsmåter. Således kan man i alle de etterfølgende fremgangsmåter bruke L^-3,4-dehydroprolin, D,L-3 , 4-dehydro-prolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin, L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-okso-prolin istedenfor L-prolin i alle de fremgangsmåter som er beskrevet i det etterfølgende. Videre kan alle de aminosyrer som er angitt for A brukes isteden for fenylalanin i disse fremgangsmåter. Videre kan andre forønskede forbindelser fremstilles ved å utføre passende substitusjoner hvis intet annet er angitt nedenfor.

I en rekke av de fremgangsmåter som er beskrevet i det etter-følgende, blir N -R^-tiofenylalanin, hvor R3er H, B , Boe eller Ddz, reagert med metakrylsyre eller ester eller 3-brom-2- metylpropionsyre, for derved å få fremstilt 3-Na<->R-)-.— _ .. | j fenylalanyltio-2-metylpropionsyre eller ester. Denne forbindelse kan så oppløses slik at det dannes 3-N -R3~fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre eller ester før denne forbindelsen reageres med L-Pro for å fremstille det forønskede produkt.

3- benzoyltio-2-D-metylpropionsyre, som brukes som utgangsfor-bindelse i de foreliggende fremgangsmåter for syntese av forbindelser med formel I, er kommersielt tilgjengelige fra Chemical Dynamics Corp., 3001 Hadley Road, South Plainfield, New Jersey.

I de følgende fremgangsmåter kan man bruke enhver hensikts-messig koplingsmetode for de trinn hvor dette kreves i tillegg til de som er angitt. Eksempler på koplingsmetoder innbefatter: blandet anhydrid (MA), dicykloheksylkarbodiimid (DCC), azid, N-etyloksykarbonyl-2-etyloksy-l,2-dihydrokinolin (EEDQ), N-isobutyloksykarbonyl-2-isobutyloksy-l,2-dihydro-kinolin, symmetrisk anhydrid, Woodwards reagens K (N-etyl-5-fenylisooksazolium-3<1->sulfonat) eller karbonyldiimidazol (CDI) metoder. For en oversikt over disse metoder og fremgangsmåter, se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl) vol. XV, del II, s. 1 og etterfølgende (1974).

På lignende måte kan man i de etterfølgende fremgangsmåter hvor man bruker en t-butyloksykarbonyl (Boe)-beskyttende gruppe, erstatte denne med enhver syrefølsom aminobeskyttende gruppe, slik som 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl (Bpoc), 2-fenylisopropyloksykarbonyl (Ppoc), benzyloksykarbonyl (Cbo) eller andre syrefølsomme N-aralkyloksykarbonyl-beskyttende grupper. Fjerning av de beskyttende grupper kan utføres på enhver kjent måte, f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre (TFA) i anisol, HC1 i eddiksyre, kald trifluormetansulfonsyre eller metanolisk ammoniakk. Se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), vol. XV, del I, s. 376 og de etterfølgende

(1974) .

I.

Ifølge en foretrukken fremgangsmåte blir N ct-t-butyloksykarbonyl-fenylalanin (Boc-Phe) omsatt med tiofenol i nærvær av et vanlig kjent koplingsmiddel og et vannfritt medium, hvorved man får fremstilt N -t-butyloksykarbonyl-tiofenylalaninfenylester. Dette gjøres ved å bruke MA-metoden i etylacetat.

I et annet trinn blir nevnte Boc-beskyttende gruppe fjernet ved å reagere produktet fra trinn 1 med trifluoreddiksyre (TFA) og anisol.. Produktet hvor de beskyttende grupper er fjernet blir så omsatt med hydrogenklorid i etanol, hvorved man får hydrogenkloridsaltet av tiofenylalaninfenylesteren. Den beskyttende gruppen kan også fjernes med hydrogenklorid eller hydrogenbromid i eddiksyre eller et organisk oppløs-ningsmiddel, metansulfonsyre eller en substituert metansulfonsyre. Sistnevnte forbindelse kan så reageres med benzoylklorid i en blanding av etylacetat og vann inneholdende Na2CC>2 for derved å få fremstilt N -benzoyltiofenylalaninfenylester.

I det tredje trinnet blir sluttproduktet fra trinn 2 omsatt med NaSH i etanol og i nærvær av nitrogen, hvorved man får N -benzoyltiofenylalanin (Bz-Phe-SH). Dette trinn er en modi-fikasjon av den fremgangsmåte som er beskrevet i Bull. Chem. Soc. Jap. 3%, 320 (1965) .

Alternativt kan fenylesteren fra trinn 1 omsettes med NaSH som beskrevet i trinn 3, hvorved man får fremstilt Boc-Phe-SH., Alternativt kan sistnevnte forbindelse fremstilles ved å kople Boc-Phe med H2S ved å bruke den blandede anhydrid-metoden. Se J. Am. Chem. Soc. 74_j_ 4726 (1952) . Benzoyl-tiof enylalaninet (Bz-Phe-SH) blir så fremstilt ved å bruke den fremgangsmåte som er angitt i trinn 2.

Som et annet alternativ kan Bz-Phe-SH fremstilles ved å reagere benzoylklorid med Phe i nærvær av NaOH. Dette produkt kan så koples med H2S ved å bruke den blandede an-hydridmetoden. Se J. Biol. Chem., 138, 627 (1941).

I et fjerde trinn ble denne tiosyren oppvarmet med metakrylsyre i nærvær av toluen, hvorved man får fremstilt 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-metyIpropionsyre.

Produktet fra dette trinn kan så oppløses i trinn 5, hvorved man fåe r N Ct-(3-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre ved utkrystallisering, væskekromatografi, motstrømsfordeling, ioneutbytning eller ved å bruke oppløsningsmidler slik som 3-nitro-D-tyrosinmetylester eller hydrazin, 3-nitro-D-tyrosin, metylester eller hydrazid, d-(+)-a-metylbenzylamin eller l-(-)-ct<->benzylamin, kinin, (-)-efedrin eller N,N-decykloheksyl-amin.

I et sjette trinn blir denne syren så koplet med L-prolin-t-butylester ved å bruke DCC eller MA-fremgangsmåtene, hvor-

ved man får fremstilt N Ct -[3-(N ct-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester. Denne esteren kan

så oppløses i en blanding av anisol og TFA hvorved man får fremstilt Na<->[3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. Alternativt kan produktet fra trinn 5 koples med hydroksysuccinimid ved å bruke DCC- eller MA-metodene, hvoretter produktet kan reageres med L-prolin, noe som gir det samme produkt. -

Den forannevnte fremgangsmåte for fremstilling av N ct -[3-(N ct-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin er foretrukket, fordi utbyttet vanligvis er høyt og produktet lett lar seg utkrystallisere.

I tillegg er denne fremgangsmåten foretrukket fordi fenyl-alanylgruppen kan oppnås enten i den rene L-, D- eller D,L-formen. Ved således å bruke Boc-L-Phe eller Boc-D-Phe som utgangsmateriale, så kan man få fremstilt Na<->[3-(Na<->benzoyl-L-fenylalanyltio-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin eller Na<->[3-(N ct-benzoyl-D-fenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. Ved å bruke en blanding av Boc-L-Phe og Boc-D-Phe så får man fremstilt D,L-formen.

Man kan bruke akrylsyre isteden for metakrylsyre i trinn 4, hvorved man får fremstilt 3-tiopropionsyrederivatet.

Ved å bruke den passende R-A-forbindelsen som fremstilles

ved fremgangsmåter som er beskrevet i US-patentsøknader nr-r 64.897 til 64.903 innsendt 14. august 1979, nr. 116.950 og 116.951 innsendt 30. januar 1980 og nr. 121.188 innsendt 3. mars 1980, isteden for Boc-Phe i trinn 1, å bruke de fremgangsmåter som er beskrevet i trinnene 1 og 3-6, så

får man fremstilt en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

II.

I en annen foretrukken fremgangsmåte blir N Ct-t-butyloksykarbonylfenylalanin først koplet til tiofenol som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 1 ovenfor, hvorved man får fremstilt N et-t-butyloksykarbonyl-tiofenylalaninfenylester.

I annet trinn blir denne esteren så omsatt med NaSH i etanol og i nærvær av nitrogen, hvorved man får tiosyren, N ct-t-butyl-oksykarbonyltiofenylalanin. Tiosyren kan også fremstilles ved å reagere N ct-t-butyloksykarbonylfenylalanin med E^ S som beskrevet under fremgangsmåte I.

I et tredje trinn blir tiosyren oppvarmet med metakrylsyre

i toluen, hvorved man får fremstilt 3-(N ct-t-butyloksykarbonyl-fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre.

I et fjerde trinn oppløser man dette produkt som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 5.

I et femte trinn fjerner man de beskyttende grupper fra det resulterende produktet ved en reaksjon med en blanding av TFA og anisol. Dette produkt blir så omsatt med benzoylklorid til 3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre. N Ct -[3-(N Ci-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin blir fremstilt som beskrevet under fremgangsmåte I, trinn 6.

Alternativt kan produktet fra trinn 4 koples med L-prolin-t-butylester ved å bruke DCC-.eller MA-metodene. De beskyttende grupper blir fjernet fra dette produkt med en reaksjon med TFA og anisol. Det resulterende produkt blir så omsatt med benzoylklorid for derved å fremstille den forønskede forbindelse .

Som et annet alternativ kan produktet fra trinn 4 koples med N-hydroksysuccinimid ved å bruke nevnte DCC- eller MA-metoder. Dette produkt blir så omsatt med L-prolin. Man fjerner de beskyttende grupper fra det resulterende produkt og omsetter dette med benzoylklorid som beskrevet ovenfor, hvorved man får det forønskede produkt.

I et tredje alternativ kan man fjerne de beskyttende grupper fra produktet fra trinn 2 ved å bruke en blanding av hydrogenklorid i eddiksyre, hvorved man får hydrogenkloridsaltet av Phe-SH. Dette produkt blir så oppvarmet med metakrylsyre og oppløst som beskrevet i trinn 3 og 4. Det resulterende produkt blir omsatt med benzoylklorid i Na^O^hvorved man oppnår den forønskede forbindelse.

Man kan bruke akrylsyre isteden for metakrylsyre i trinn 3, hvorved man får 3-tiopropionsyrederivatet. Enhver forønsket R-A-forbindelse slik denne er beskrevet ovenfor med hensyn til. fremgangsmåte I, kan brukes isteden for Boc-Phe i trinn 1 i denne fremgangsmåten. For å oppnå en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper, så vil en fjerning av R-gruppen i trinn 5 være unødvendig.

III.

I en tredje foretrukken fremgangsmåte blir■N Ct-benzoylfenylalanin (Bz-Phe) omsatt i nærvær av H-S idet man bruker MA-metoden, hvorved man får fremstilt N -benzoyltiofenylalanin (Bz-Phe-SH).

I det annet trinn blir Bz-Phe-SH omsatt med metakrylsyre som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 4 ovenfor.

Produktet i trinn 2 blir så oppløst i et tredje trinn slik det er beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 5 ovenfor.

I det fjerde trinnet blir det oppløste produkt koplet med L-prolin-t-butylester og så oppløst i TFA og anisol, noe som gir den forønskede forbindelse som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 6. Alternativt kan produktet fra trinn 3 koples med N-hydroksysuccinimid ved å bruke DCC- eller MA-metodene og så omsatt med L-prolin, noe som gir det.samme produkt.

Enhver ønskelig R-A-forbindelse som beskrevet ovenfor i forbindelse med fremgangsmåte I, kan brukes isteden for Bz-Phe i trinn 1 i denne fremgangsmåte, noe som gir en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper. Man kan bruke akrylsyre isteden for metakrylsyre i trinn 2, noe som gir 3-tiopropionsyrederivatet.

IV.

I denne fjerde fremgangsmåten blir N cx-benzoylfenylalanin (Bz-Phe) omsatt med tiofenol ved hjelp av MA-metoden, noe som gir N cx-benzoyltiofenylalaninfenylester.

Alternativt kan man bruke Boc-Phe isteden for Bz-Phe i trinn 1 ovenfor, og beskyttelsen på Boc-gruppen må da fjernes og etterpå omsettes nevnte gruppe med benzoylklorid hvorved man får fremstilt N cx-benzoyltiofenylalaninf enylesteren..

I et annet alternativ kan N-hydroksysuccinimid brukes i MA-reaksjonen i trinn 1 ovenfor.

I et annet trinn blir produktet fra trinn 1 omsatt med

NaSH, noe som gir N ct-benzoyltiofenylalanin som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 3 ovenfor.

Alternativt kan produktet fra trinn 1 reageres med H„S i en alkalisk oppløsning, noe som gir N ct-benzoyltiofenylalanin.

Se Naturwissenschaften, 4_0 , 242-243 (1953) .

I et tredje trinn blir produktet fra trinn 2 reagert med et overskudd av metakrylsyre, noe som gir 3-(N ct-benzoylfenyl-alanyltio) -2-metylpropionsyre.

I det fjerde trinn blir produktet fra trinn 3 oppløst på velkjent måte.

I et femte trinn blir det oppløste produkt reagert med N-hydroksysuccinimid ved anvendelse av MA-metoden fulgt av en reaksjon med L-prolin for dannelse av den ønskede forbindelse .

Alternativt kan t-butylesteren av L-prolin benyttes isteden for L-prolin i trinn 5 ovenfor. Dersom dette gjøres, må beskyttende grupper fjernes fra det resulterende produkt, f.eks. med TFA i nærvær av anisol for oppnåelse av detsønskede forbindelse.

Man kan bruke akrylsyre istedenfor metakrylsyre i trinn 3 ovenfor, hvorved man får fremstilt 3-tiopropionsyrederivatet. Enhver ønskelig R-A-forbindelse som beskrevet ovenfor kan brukes isteden for Bz-Phe i trinn 1, hvorved man får en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

v.

I en annen fremgangsmåte ble Boc-Phe først koplet med tiofenol som beskrevet i fremgangsmåte II, trinn 1 ovenfor, hvorved man får fremstilt N cx-t-butyloksykarbonyltiofenyl-alaninf enylester.

r Fenylesteren ble så omsatt med NaSH eller E^ S i en alkalisk oppløsning, noe som gir Boc-SH i et annet trinn som er beskrevet i fremgangsmåte II, trinn 2 ovenfor.

I det tredje trinnet blir produktet fra trinn 2 reagert med et overskudd av metakrylsyre,"hvorved man får fremstilt 3-(N cx-t-butyloksykarbonylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre, noe som er beskrevet i fremgangsmåte II, trinn 3 ovenfor.

I et fjerde trinn blir produktet fra tredje trinn oppløst

på velkjent måte, f.eks. ved hjelp av de fremgangsmåter som er beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 5 ovenfor.

I et femte trinn blir det oppløste produkt fra trinn 4 omsatt med HC1 i etylacetat. Det resulterende produkt blir reagert med benzoylklorid i en blanding av etylacetat og vann inneholdende Na^ CO^, noe som gir 3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre.

I et sjette trinn blir produktet fra trinn 5 reagert med N-hydroksysuccinimid ved hjelp av MA-metoden fulgt av en reaksjon med L-prolin eller dens t-butylester, noe som er beskrevet i fremgangsmåte IV, trinn 5 og dets alternativer, noe som vil gi den forønskede forbindelse.

Akrylsyre kan brukes isteden for metakrylsyre i trinn 3 hvorved man får fremstilt 3-tiopropionsyrederivatet. Enhver ønskelig R-A-forbindelse som beskrevet ovenfor kan brukes isteden for Boc-Phe i trinn 1, hvorved man får fremstilt en forbindelse med de forønskede gruppene R og A, hvorved man eliminerer trinn 5.

I en annen fremgangsmåte kan N-a,a-dimetyl-3,5-dimetyloksy-benzyloksykarbonylfenylalanin (Ddz-Phe) koples til 3-merkapto-2-metylpropionsyre ved hjelp av CDI-metoden i nærvær av trietanolamin (TEA), noe som vil gi 3-(Ddz-fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre. Fotofølsomme aminobeskyttende grupper forskjellig fra Ddz, slik som 6-nitroveratryloksykarbonyl eller 2-nitrobenzyloksykarboriyl kan også brukes.

I et annet trinn blir produktet fra trinn 1 oppløst på velkjent måte.

I det tredje trinnet blir det oppløste produkt fra trinn 2 koplet til t-butylesteren av L-prolin ved hjelp av DCC-

eller MA-metodene, noe som gir N ct -[3-(N ct-Ddz-fenylalanyltio) -2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et fjerde trinn fjerner man så de beskyttende grupper fra produktet fra trinn 3 ved hjelp av bestråling, noe som gir N Ct-[3-fenylalanyltio-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et femte trinn blir produktet fra trinn 4 koplet til et benzoylhalogenid, slik som benzoylklorid eller benzoyl-bromid, eller en aktiv benzoesyreester, slik som N-succin-imidyl-, p-nitrofenyl-, o-nitrofenyl-, benzotriazolyl-, 5-norbornen-2,3-dikarboksimidyl-, pentaklorfenyl- eller pentafluorfenylestere, for dannelse av Na<->[3-(Na<->benzoyl-fenylalanyltio-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et sjette trinn blir de beskyttende grupper fjernet fra esteren ved hjelp av TFA i anisol, noe som gir den for-ønskede forbindelse.

Man kan bruke 3-merkaptopropionsyre og 2-merkaptopropionsyre isteden for 3-merkapto-2-metylpropionsyre i trinn 1, noe som gir 3-tiopropionsyre og 2-tiopropionsyrederivatene. Videre kan man bruke enhver ønskelig gruppe isteden for^fenylalanin i trinn 1, hvorved man får fremstilt forbindelser med den forønskede A-gruppe. Ehver ønskelig R-gruppe kan koples til produktet fra trinn 4 ved å bruke R isteden for benzoylgruppen i de benzoylkoplingsforbindelser som brukes i trinn 5 i denne fremgangsmåten.

VII.

I en annen fremgangsmåte blir Ddz-Phe koplet til p-nitrofenol ved hjelp av DCC-metoden, noe som gir Na<->Ddz-fenylalanin-p-nitrofenolester. Den beskyttende gruppe Ddz kan erstattes med Bpoc, Ppoc eller Bz. p-nitrofenolestergruppen kan erstattes med enhver annen aktiv estergruppe, f.eks. av den type som er beskrevet i fremgangsmåte VI, trinn 5. Na<->Ddz-fenylalanin-p-nitrofenolesteren kan så omsettes med NaSH, noe som gir Ddz-tiofenylalanin.

I annet trinn blir produktet fra trinn 1 omsatt med metakrylsyre, noe som gir 3-(N ct-Ddz-fenylalanyltio)-2-metylpropionsyre.

I tredje trinn blir syren fra trinn 2 oppløst ved hjelp av vanlige kjente fremgangsmåter.

I fjerde trinn blir det oppløste produkt fra trinn 3 koplet til L-prolin-t-butylester ved benyttelse av DCC- eller MA-metoden slik dette er beskrevet i fremgangsmåte VI, trinn 3 ovenfor, noe som gir Na<->[3-(Na<->Ddz-fenylalanyltio-2-metyl-propanoy1]-L-prolin-t-butylester.

I. femte trinn fjerner man de beskyttende grupper fra esteren

i trinn 4 ved bestråling, noe som gir N Ct-[3-fenylalanyltio-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester slik dette ,er beskrevet i fremgangsmåte VI, trinn 4.

I sjette trinn blir produktet fra trinn 5 koplet til enhver benzoylkoplingsforbindelse beskrevet i trinn 5 i fremgangsmåte VI ovenfor, hvorved man får fremstilt N Ct -[3-(N Ct-benzoyl-fenylalanyltio)-2-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I et syvende trinn fjerner man de beskyttende grupper fra esteren fra trinn 6 ved hjelp av TFA i anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

Akrylsyre kan brukes istedenfor metakrylsyre i trinn 2 i

denne fremgangsmåten, noe som gir 3-tiopropionsyrederivatet. Enhverønskelig A-gruppe kan brukes isteden for fenylalanin

i trinn 1, hvorved man får en forbindelse med den forønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan koples til produktet fra trinn 5 ved å bruke R isteden for benzoylgruppen i de benzoylkoplingsforbindelser som er brukt i trinn 6.

VIII.-

I en annen fremgangsmåte blir den forønskede forbindelse syntetisert ved hjelp av vanlig kjent fast faseteknikk. Se Advan. Enzymol. , 3_2, 221 (1969) . En o-nitrobenzylharpiks eller en klormetylert harpiks kan brukes som.den faste fase.

I første trinn blir Boc-Pro koplet til harpiksen. Deretter fjerner man de beskyttende grupper fra prolin ved hjelp av

TFA.

I annet trinn blir 3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre koplet til prolinharpikskomplekset fremstilt i trinn 1, noe som skjer ved hjelp av DCC-metoden.

I det tredje trinnet blir den forønskede forbindelse avspaltet fra harpiksen. Hvis man bruker en o-nitrobenzylharpiks, så kan dette skje ved hjelp av bestråling. Hvis man bruker en klormetylert harpiks, så utføres avspaltningen ved hjelp av

HF.

Enhver ønskelig forbindelse kan brukes ved å anvende 3-R-A-S-2-metylpropionsyre, 2-R-A-S-propionsyre eller 3-R-A-S-propionsyre isteden for 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i trinn . 2.

IX.

I en annen fremgangsmåte blir benzoyltiofenylalanin (Bz-

Phe-SH) omsatt med 3-brom-2-metylpropionsyre, noe som gir 3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre. Klorid eller jod kan brukes isteden for brom i denne reaksjonen.

I annet trinn blir produktet fra trinn 1 koplet til t-butylesteren av L-prolin ved benyttelse av DCC- eller MA-metoden, hvoretter man fjerner de beskyttende grupper med TFA i ani-

sol, hvorved man får den forønskede forbindelse.

Ved å bruke 3-brompropionsyre eller 2-brompropionsyre isteden for 3-brom-2-metylpropionsyre<*>i trinn 1, så kan man få fremstilt 3-tiopropionsyre eller 2-tiopropionsyrederivatene.

Ved å bruke R-A-SH isteden for Bz-Phe-SH i trinn 1, vil man

få fremstilt forbindelser med de forønskede R- og A-grupper.

I en annen fremgangsmåte blir benzyloksykarbonylmerkaptan (Cbo-SH) omsatt med metakrylsyre til 3-benzyloksykarbonyl-tio-2-metylpropionsyre. Cbo kan erstattes med enhver annen ønskelig syrefølsom, aminobeskyttende gruppe.

I annet trinn blir produktet fra trinn 1 oppløst ved hjelp av velkjente fremgangsmåter.

I tredje trinn blir det oppløste produkt fra trinn 2 koplet

til t-butylesteren av L-prolin, fortrinnsvis ved å bruke DCC-metoden, noe som gir N cx-(3-benzyloksykarbonyltio-2-D-metyl-propanoy1)-L-prolin-t-butylester.

X.

I en annen fremgangsmåte blir tiofenylalaninhydroklorid omsatt med metakrylsyre til 3-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre. hydroklorid.

I annet trinn blir produktet fra trinn 1 omsatt med benzoylklorid ..i TEA til 3-(Na<->benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropionsyre..

I tredje trinn blir produktet fra trinn 2 oppløst ved hjelp av vanlige kjente fremgangsmåter.

I et fjerde trinn blir det oppløste produkt fra trinn 2 opp-løst ved hjelp av vanlige kjente fremgangsmåter.

I et fjerde trinn blir det oppløste produkt fra trinn 3 koplet til t-butylesteren ved L-prolin ved benyttelse av DCC-eller MA-metoden og de beskyttende grupper blir så fjernet fra det resulterende produkt med TFA i anisol for derved å få en forønsket forbindelse.

Akrylsyre kan brukes isteden for.metakrylsyre i trinn 1, noe som gir 3-tiopropionsyrederivatet. Enhver ønskelig A-SH-forbindelse kan brukes isteden for tiofenylalanin i trinn 1 for å få en forbindelse med den forønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan koples til produktet fra trinn 1 ved å bruke R isteden for benzoyl i benzoylkloridet i trinn 2.

XI.

I en annen fremgangsmåte blir 3-amino-2-metylpropionsyre først oppløst ved velkjente fremgangsmåter til 3-amino-2-D-metylpropionsyre.

I annet trinn blir dette produkt omsatt med natriumnitrit i HBr, noe som gir 3-brom-2-D-metylpropionsyre. Alternativt kan man bruke HC1 og HNO^for å gi 3-klor-2-D-metylpropionsyre. Som et annet alternativ kan 3-hydroksy-2-metylpropionsyre omsettes med PBr^til 3-brom-2-metylpropionsyre.

I et tredje blir produktet fra trinn 2 omsatt med N cx-benzoyltiofenylalanin (Bz-Phe-SH) til 3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre.

I det fjerde trinnet blir produktet fra trinn 3 koplet med t-butylesteren av L-prolin ved benyttelse av DCC- eller MA-metoden, og man fjerner de beskyttende grupper fra det resul terende produkt, f.eks. med TFA i anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

3-aminopropionsyre eller 2-aminopropionsyre kan brukes isteden for 3-amino-2-D-metylpropionsyre i trinn 2, for derved å få 3-tiopropionsyre eller 2-tiopropionsyrederivatene. Enhver R-A-SH-forbindelse kan brukes isteden for Bz-Phe-SH i trinn 3, noe som gir en forbindelse med de for-ønskede R- og A-grupper.

I alle de tilfeller hvor det er angitt at man har en D-konfigurasjon i metylsidekjeden på 3-merkapto-2-metylpropion-syregruppen, så er det underforstått at dette er ekvivalent til å angi at man har en S-konfigurasjon.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse danner basiske salter med forskjellige uorganiske og organiske baser, og slike salter ligger også innenfor oppfinnelsen. Nevnte salter innbefatter f.eks. ammoniumsalter, alkalimetallsalter som natrium- og kalsiumsaltet (som er de foretrukne), jord-alkalimetallsalter som kalsium- og magnesiumsalter, videre salter med organiske baser, f.eks. dicykloheksylaminsalt, benzatin, N-metyl-D-glukamin, hydrabaminsalter, salter med aminosyrer som arginin, lysin og lignende. Det er foretrukket å bruke de ikke-toksiske, fysiologisk akseptable salter, skjønt andre salter kan også brukes, f.eks. for å isolere eller å rense produktet, noe som er angitt i eksemplene i forbindelse med dicykloheksylaminsaltet.

Saltene fremstilles på vanlig kjent måte ved å omsette den frie syreformen av produktet med en eller flere ekvivalenter av en passende base, noe som gir det forønskede kation i et oppløsningsmiddel eller et medium hvor saltet er dårlig oppløselig eller uoppløselig, eller i vann og hvoretter man fjerner vannet ved frysetørking. Ved.å omsette saltet med en uoppløselig syre slik som en kation-utbytningsharpiks i hydrogenformen (f.eks. polystyrensulfonsyreharpikser som Dowex 50), eller med en vandig syre og så ekstrahere denne med et organisk oppløsningsmiddel, f.eks. etylacetat, diklormetan eller lignende, kan man oppnå den frie syreformen, hvis dette er ønskelig, og deretter danne et annet salt når dette måtte være passende.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Av hensiktsmessighetsgrunner har man i det etterfølgende beskrevet detaljer med hensyn til fremgangsmåter for fremstilling av N Ct -[3-(N ct-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl ] -L-prolin . Hvis intet annet er angitt, har man anvendt molare ekvivalenter av reaktantene.

I. -

Trinn 1. Syntese av N ct- t- butyloksykarbonyl- L- tiofenylalaninfenylester.

En oppløsning av 3,98 g Boc-L-Phe i ca. 20 ml redestillert etanol ble avkjølt til -20°C i et metanol-istørris-bad. Opp-løsningen ble tilsatt 2,04 ml N-etylmorfolin fulgt av 2,04 ml isobutylklorformat, og blandingen ble rørt i 3 minutter ved -15°C. 1,8 ml tiofenol ble tilsatt, og blandingen ble rørt i li time ved -15°C. Den ble så langsomt oppvarmet til romtemperatur og rørt i 2 timer. 20 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad. Den organiske fasen ble.vasket tre ganger med kaldt vann, tre ganger med kald IN sitronsyre, tre ganger med kald mettet natriumklorid, tre ganger med kald IN NaHCO^og til slutt tre ganger med en mettet kald natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved fordampning. Residuet ble utkrystallisert fra benzen-petroleter, noe som ga 3,68 g av hvite nåler med smeltepunkt på 113,5-114,"5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr og elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 2. Syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalaninfenylester

(i) 2 g av produktet fra trinn 1 ble tilsatt 2,0 ml anisol og avkjølt i et is-aceton-bad. Nevnte Na<->Boc-

gruppe ble fjernet ved røring av blandingen med 4 ml vannfritt TFA i romtemperatur i 30 minutter. TFA og anisol ble fjernet ved 30°C under høyvakuum inntil man fikk de første hvite krystaller.

(ii) Deretter tilsatte man 10 ml av en 5,7 molar hydro-genkloridoppløsning i etanol, og blandingen ble rørt i 10 minutter ved romtemperatur. 15 ml vannfri eter ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad i 30 minutter. Oppløsningen ble filtrert, og<*>krystallene vasket flere

ganger med eter. De ble så tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og<p>205'noe som ga 1'039hvite krystaller som dekomponerte ved 164,5-165 C.

(iii) 1,12 g av dette produktet, dvs. hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalaninfenylesteren, ble suspendert i 15 ml etylacetat under kraftig røring. Man tilsatte så

0,45 ml benzoylklorid. Blandingen ble dråpevis tilsatt en oppløsning av 1,01 g Na^O^ i 10 ml vann, og blandingen ble rørt kraftig i 30 minutter. Den ble så avkjølt i et isbad i 30 minutter og filtrert. Residuet ble vasket syv ganger med kaldt vann, en gang med kald etylacetat og to ganger med vannfri eter. Residuet ble så tørket i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5^ flere timer, noe som ga 1,32 g

hvite krystaller som dekomponerte ved 182-183°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 3. Syntese av N cx- benzoyl- L- tiofenylalanin

En strøm av nitrogen ble boblet inn i en oppløsning av 1,01 g NaSH i 25 ml vannfri etanol under kraftig røring, mens temperaturen ble holdt mellom 35-40°C. 2,17 g av produktet

. fra trinn 2 ble tilsatt iløpet av 15 minutter. Temperaturen på reaksjonsblandingen falt til.ca. 2 0°C etter at tilslutningen

var ferdig. Blandingen ble så kraftig rørt ved 20°C i 15

time. Etanolen ble fjernet ved 32°C, 30 ml vann ble til-

satt, og oppløsningen avkjølt i et isbad. Den ble så sur-

gjort til pH 2 med 50% r^SO^. Den ble så hensatt i et isbad

i 30 minutter og filtrert, hvoretter residuet ble vasket

flere ganger med kaldt vann og tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5*Residet ble omkrystallisert fra benzen og heksan, noe som ga 1,45 g hvite nåler som dekomponerte ved 108,5-109,5°C. Analyse av produktet ved IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 4. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropionsyre

En suspensjon av 285 mg av produktet fra trinn 3 og 86,1 yl metakrylsyre i 2 ml toluen ble kokt under tilbakeløp i

flere timer, inntil reaksjonen var fullstendig, noe som ble

påvist ved tynnsjiktskromatografi og papirelektroforese. Blandingen ble hensatt over natten ved romtemperatur, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning under høy-

o

vakuum ved 35 C, noe som ga et oljeaktig residuum. Dette ble utkrystallisert og omkrystallisert fra benzen-n-heksan

til 195 mg hvite krystaller med et smeltepunkt på 120-

122,5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elemen-tøranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi

viste at produktet var identisk med tittelforbindelsen.

Trinn 5. Oppløsning til 3r-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropionsyre

(A) Produktet fra trinn 4 ble flere ganger utkrys-

tallisert fra benzen til tittelforbindelsen. Ved å bruke

: en utfellingskrystall oppnådde man den ovennevnte forbindelse raskere og med høyere utbytte.

(B) Produktet fra trinn 4 ble oppløst i benzen, hvoretter man tilsatte en ekvivalent dicykloheksylamin og rørte

det hele i flere timer. Blandingen ble hensatt over natten ved 4°C og så filtrert, og krystallene ble vasket og tørket i et vakuumkammer. De ble så oppløst i en blanding av vann og etylacetat, og blandingen ble surgjort til pH 2 med konsentrert HC1 i et isbad. Blandingen ble så vasket med en oppløsning av mettet natriumklorid og tørket ved hjelp av magnesiumsulfat. Oppløsningen ble filtrert, og oppløsnings-midlet ble fjernet i et roterende fordampningskammer. Produktet ble så utkrystallisert fra benzen.

Trinn 6. Syntese av N Ct -[ 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl3- L- prolin

(A) (i) 2,5 mmol av produktet fra trinn 5 ble oppløst i 3 ml dimetylformamid (DMF) og avkjølt til 0°C i et is-aceton-bad. 2,5 mmol DCC i 1,5 ml DMF ble tilsatt, og blandingen rørt i 5 minutter ved 0°C. Oppløsningen ble tilsatt 2,5 mmol L-prolin-t-butylester i 1,5 ml DMF. Blandingen ble rørt over natten ved 4°C, og opparbeidet ved å tilsette 10 ml etylacetat og filtrert. Produktet ble vasket med 20 ml etylacetat, og de samlede etylacetatfraksjoner ble avkjølt i en dypfryser. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med en mettet natriumkloridoppløsning, en gang med kald 0,IN NaHCO^og tre ganger med mettet natriumklorid. Den organiske fasen ble så tørket med vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet under høyvakuum, noe som ga

et hvitt residuum.

(ii) Nevnte residuum ble suspendert i 4 ml anisol og omsatt med 8 ml TFA ;i 1?time ved romtemperatur under røring. TFA ble så fjernet ved fordampning i høyvakuum. Residuet ble oppløst i 1 ml tetrahydrofuran (THF) og kromatografert. De forønskede fraksjoner ble fordampet til tørrhet, oppløst

i en mindre mengde isopropanol og kromatografert om igjen.

De forønskede fraksjoner ga en olje som ble oppløst i THF, hvoretter sistnevnte ble fordampet under en strøm av nitrogen.' Sluttproduktet fikk man etter å ha fjernet det gjen- værende oppløsningsmiddel ved hjelp av fordampning i høy-vakuum.

(B) En kald oppløsning av 2,5 mmol DCC i DMF ble tilsatt dråpevis til en blanding av 2,5 mmol av produktet fra

trinn 5 og 2,5 mmol N-hydroksysuccinimid i DMF ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble rørt i 30 minutter ved 0°C og så over natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering, og bunnfallet vasket med etylacetat. Opp-løsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under redusert trykk, og residuet utkrystallisert fra benzen og heksan. Krystallene ble oppløst i kald THF, og oppløsningen ble tilsatt en kald oppløsning av 2,5 mmol L-Pro og 2,5 mmol NaHCO^i THF/vann. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten ved romtemperatur. THF ble fjernet ved fordampning ved 35°C. Vann ble tilsatt blandingen og pH justert til 9 ved hjelp av fast NaHC03. Den vandige fasen ble ekstrahert med etylacetat, ble så avkjølt i et isbad og surgjort til pH 2 ved hjelp av IN HC1 i nærvær av etylacetat. Den organiske fasen ble vasket to ganger med kaldt vann og så to ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning og residuet utkrystallisert fra eter og heksan, noe som ga tittelproduktet.

Alternative fremgangsmåter for syntese av N ct- benzoyl- L-tiofenylalanin (A) Boc-L-tiofenylalaninfenylesteren ble fremstilt som béskrevet i trinn 1. Deretter ble tiosyren, Boc-L-tiof enylalanin fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 3. Alternativt kan denne tiosyren fremstilles ved å omsette molare ekvivalenter av Boc-L-Phe og H2S ved hjelp av den blandede anhydridkoplingsmetoden som er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. 74^, 4726 (1952). Tiosyren blir omsatt med hydrogenklorid i etanol og hvoretter man reagerer produktet med benzoylklorid eller en aktiv ester av benzosyre slik det er beskrevet i trinn 2, noe som gir tittelproduktet. (B) N ct-benzoyl-L-Phe ble syntetisert ved å reagere ekvivalente mengder av benzoylklorid og L-Phe i natrium-hydroksydoppløsning som beskrevet i J. Bio. Chem., 138,

627 (1941). Produktet kan syntetiseres ved å reagere molare ekvivalente mengder av N ct-benzoy1-L-Phe og H2S ved å bruke den blandede anhydridkoplingsmetoden slik det er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. , 7_4, 4726 (1952).

Alternativ fremgangsmåte for syntese av 3-( N ct- benzoyl-L- f enylalanyltio) - 2- D- metylpropionsyre

Boc-L-tiofenylalanin ble fremstilt som beskrevet i fremgangsmåte IX, trinn 1 og 2. Hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalanin ble fremstilt ved å reagere Boc-L-tiofenylalanin med HC1 i eddiksyre under røring ved romtemperatur. Vannfri eter ble tilsatt og blandingen avkjølt i et isbad, hvoretter den ble filtrert og vasket flere ganger med eter. Residuet ble tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2^5'De*" resulterende produkt ble omsatt med metakrylsyre som beskrevet i trinn 4, hvorved man fikk hydrogenkloridsaltet av 3-L-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre. Dette produkt kan enten oppløses ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 5 og deretter reagere det med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii), noe som gir tittelforbindelsen, eller dette produkt kan omsettes med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii) og så oppløses.

II.

Trinn 1. Syntese av N ct- Boc- L- tiofenylalaninfenylester Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 1.

Trinn 2. Syntese av N ct- Boc- L- tiofenylalanin

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke produktet fra trinn 1 isteden for N ct-benzoyl-L-tiofenylalaninfenylesteren i fremgangsmåte I, trinn 3 og deretter bruke den fremgangsmåte som der er beskrevet. Alternativt kan tittelforbindelsen fremstilles ved å bruke fremgangsmåten fra

J. Am. Chem. Soc. 74, 4726 (195.2).

Trinn 3. Syntese av 3-( N ct- Boc- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke produktet fra trinn 2 isteden for N ct-benzoyl-L-tiofenylalanin i fremgangsmåte I, trinn 4 og bruke den fremgangsmåte som der er beskrevet.

Trinn 4. Oppløsning for å få fremstilt 3-( N ct- Boc- L- fenylalanyltio) - 2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å oppløse produktet fra trinn 3 slik det er beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 5.

Trinn 5. Syntese av N Ct -[ 3-( N Q.- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin (A) De beskyttende grupper ble fjernet fra produktet fra trinn 4 ved hjelp av TFA i anisol ved å bruke fremgangsmåten som er beskrevet i metode I, trinn 2(i). Det resulterende produkt ble så omsatt med benzoylklorid som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 2(111), noe som gir 3-(N ct-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre. Tittelforbindelsen kan fremstilles ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i metode I, trinn 6. (B) Ved å bruke produktet fra trinn 4 isteden for 3-(N ct-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i

fremgangsmåte I, trinn 6(A), og ved å bruke den fremgangsmåte som der er beskrevet, fåo r man fremstilt N Ct-(3-L-fenylalanyltio-2-D-metylpropanoyl)-L-prolin. Dette produkt kan så omsettes med benzoylklorid ved å. bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i metode I, trinn 2 (iii), noe som gir tittelforbindelsen.

Alternativt kan man bruke produktet fra trinn 4 isteden for 3-(N ct-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i metode I, trinn 6(B) og bruke den fremgangsmåte som der er beskrevet, hvorved man får fremstilt N ct -[3-(N ct-Boc-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-2-prolin. Man fjerner deretter de beskyttende grupper fra dette produkt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 2 (i). Tittelproduktet kan så fremstilles ved. å omsette det resulterende produkt med benzoylklorid som beskrevet i fremgangsmåte I, trinn 2(iii).

III.

Trinn 1. Syntese av N ct- benzoyl- D, L- tiofenylalanin Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å reagere molare ekvivalenter av N ct-benzoyl-D,L-Phe og f^S ved hjelp av den blandede anhydridkoplingsmetoden som i alt vesentlig er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. 74.' 4726 (1952).

Trinn 2. Syntese av 3-( N ct- beftzoyl- D , L- f enylalanyltio) - 2-me tylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke produktet fra trinn 1 istedenfor N ct-benzoyl-L-tiofenylalanin i fremgangsmåte I, trinn 4 og i alt vesentlig følge den der angitte fremgangsmåte.

Trinn 3. Oppløsning til 3-( N ct- benzoyl- D, L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten angitt i metode I,, trinn 5.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- D, L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke produktet fra trinn 3 i fremgangsmåte I, trinn 6 og i alt vesentlig bruke den metode som der er' angitt.

IV.

Trinn 1. Syntese av N ct- benzoyl- L- tiofenylalaninfenylester Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke benzoyl-L-fenylalanin istedenfor Boc-L-Phe i fremgangsmåte I, trinn 1 og bruke den fremgangsmåte som der er beskrevet.

Trinn 2. Syntese av N ct- benzoyl- L- tiofenylalanin Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 3 idet man brukte produktet fra trinn 1.

Trinn 3. Syntese av 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 4 og produktet fra trinn 2.

Trinn 4. Oppløsning til 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt.ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 5.

Trinn 5. Syntese av N Ct -[ 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Det resolverte produkt fra trinn 4 omsettes med N-hydroksysuccinimid ved benyttelse av MA-metoden. Det resulterende produkt omsettes deretter med L-prolin for dannelse av N ct -[3-(N ct-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin.

V.

Trinn 1. Syntese av N ct- Boc- L- tiofenylalaninfenylester Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 1.

Trinn 2. Syntese av N ct- Boc- L- tiofenylalanin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten som er angitt i metode I, trinn 3.

Trinn 3. Syntese av 3-( N ct- Boc- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode II, trinn 3.

Trinn 4. Oppløsning til 3-( Na- Boc- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 5.

Trinn 5. Syntese av 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ved å o bruke produktet fra trinn 4 istedenfor N Ct<->Boc-L-tio-fenylalaninesteren i metode I, trinn 2 og bruke den fremgangsmåte som der er angitt, fikk man fremstilt tittelproduktet .

Trinn 6. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte forbindelse ble syntetisert ved å bruke fremgangsmåten fra metode IV, trinn 5.

VI.

Trinn 1. Syntese av Na- benzoyl- L- fenylalanin

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å omsette benzoylklorid med fenylalanin i en NaOH-oppløsning.

Trinn 2. Syntese av 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved omsetning av N ct-benzoyl-L-f enylalanin med overskudd N-hydroksysuccinimid.ved benyttelse av MA-metoden, fulgt av omsetning av det resulterende produkt med 3-merkapto-2-metylpropionsyre. Noe racemisering kan opptre ved å bruke denne fremgangsmåten.

Trinn .3. Oppløsning til 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode. I, trinn 5.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 6(A).

VII.

Trinn 1. Syntese av Na- Ddz- L- tiofenylalanin

5 mmol N ct-Ddz-L-Phe syntetisert ved å følge metoden beskrevet

i Liebigs Ann. Chem., 763, 162 (1972) eller i Birr. C, Peptide, 1977, Proe. of the 12th Eur. Pept. Symp., Hanson H. og Jaknbke, H.D., Eds. (Elsevier-North Holland Pubs.)

p- 72, (1973), ble oppløst i DMF og avkjølt til 0°C i ét isaceton-bad. 5 mmol DCC i DMF ble tilsatt, og blandingen rørt i flere minutter ved 0°C. Oppløsningen ble tilsatt 5 mmol p-nitrofenol i DMF. Den ble så rørt over natten ved 4°C og oppløsningsmidlet fjernet ved fordampning. Etylacetat ble tilsatt og blandingen filtrert. Residuet ble vasket med etylacetat og de samlede etylacetatfraksjoner ble avkjølt i en dypfryser. Den organiske fase ble vasket tre ganger med kald IN NaHC03 og til slutt tre ganger med mettet NaCl, hvoretter den ble tørket over magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning under høyvakuum, og ved å bruke dette produkt istedenfor benzoyl-L-tiofenylalaninfenylester i metode I, trinn 3 fikk man fremstilt det ovennevnte produkt.

Trinn 2. Syntese av 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

Ved å o bruke produktet fra trinn 1 istedenfor N OL-benzoyl-L-tiof enylalanin i metode I, trinn 4 og bruke den der angitte fremgangsmåte, fikk man fremstilt tittelproduktet.

Trinn 3. Oppløsning til 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 5.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å bruke produktet fra trinn 3 istedenfor 3-(N ct-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i metode I, trinn 6(A) (i) og ved å bruke den fremgangsmåte som der er angitt..

Trinn 5. Syntese av Na-[ 3-( L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte forbindelse ble syntetisert ved oppløsning av produktet fra trinn 4 i THF og avkjøling til 20°C. Blandingen overføres deretter til et prøveglass og bestråles med lys av bølgelengde 35 nm i 5 timer. THF blir deretter fjernet ved å bruke en rotasjonsevaporator for dannelse av det navngitte produkt.

Trinn 6. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å reagere molare ekvivalenter av benzoylklorid"og produktet fra trinn 5 i en blanding av etylacetat og vann inneholdende NaHCO^.

Trinn 7. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å fjerne t-butylester-gruppen fra produktet fra trinn 6 ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 6(A)(ii).

VIII.

Trinn 1. Syntese av 2- metylpropanoyl- L- prolin- t- butylester En kald oppløsning av 2 mmol DCC i DMF ble dråpevis tilsatt en blanding av 2 mmol metakrylsyre og 2 mmol L-prolin-t-butylester i DMF ved 0°C. Blandingen ble rørt i 30 minutter og så over natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble frafiltrert og bunnfallet vasket med etylacetat. Opp-løsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under trykk, og residuet utkrystallisert fra benzen og heksan, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 2. Syntese av N ct- Ddz- L- tiofenylalanin

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode VII, trinn 1.

Trinn 3. Syntese av Na-[ 3-( Na- Ddz- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester

Ved å bruke produktet fra trinn 2 istedenfor benzoyl-L-tiof enylalanin og produktet fra trinn 1 istedenfor metakrylsyre ifølge metode I, trinn 4 fikk man fremstilt tittelproduktet.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( L- fenylalanyltio)- 2- metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte forbindelse ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten fra metode VII, trinn 5.

Trinn 5. Syntese av Na-[ 3-( Ntt- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester

Ovennevnte forbindelse ble syntetisert ved å bruke fremgangsmåten fra metode XIX, trinn 6.

Trinn 6. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- metylpropanoy1]- L- prolin

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å fjerne t-butyl-estergruppen fra produktet i trinn 5 ved hjelp av fremgangsmåten fra metode I, trinn 6(A) (ii).

Trinn 7. Oppløsning til Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio) - 2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode X, trinn 2.

IX.

Denne fremgangsmåten innbefatter bruken av vanlig.kjent fast faseteknologi for peptidsyntese. En generell referanse til denne teknologi er angitt i Advan. Enzymol. 3<_>2, 221 (1969).

Trinn 1. Kopling av L- Pro til en fast fase- harpiks

Ved hjelp av standardteknikk ble en oppløsning av Na<->Boc-L-Pro i etylacetat blandet med en fast harpiks med tilknyttede 3-nitro-4-brommetylbenzylamidgrupper i nærvær av diiso-propyletylamin. Overskuddet av Na<->Boc-L-Pro ble fjernet ved vasking med etylacetat, metanol og så diklormetan. En oppløsning av 25% TFA i diklormetan inneholdende 1 mg/ml indol ble så tilsatt harpiksen, hvortil det var bundet N - Boc-L-Pro, hvorved man fjernet de Boc-beskyttende grupper. Harpiksen ble så vasket med diklormetan.

Trinn 2. Kopling av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre til produktet fra trinn 1

En oppløsning av ovennevnte forbindelse og DCC i DMF og diklormetan (1:1) ble blandet med harpiksen fra trinn 1.

"Den angitte forbindelsen ble koplet til prolinet i dette trinn, og man fikk produktet N ct -[3-(N ct-benzoyl-L-fenylalanyltio) -2-D-metylpropanoyl ] -L-prolin koplet til o-nitrobenzyl-gruppene i harpiksen. Overskuddet av reaktanter ble fjernet ved vasking med etanol og så med diklormetan. Produktet ble tørket under en strøm av tørr nitrogen.

Trinn 3. Avspaltning av N cx -[3-(N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin fra harpiksen Materialet fra trinn 2 i metanol ble bestrålt med lys med en bølgelengde på 350 nm slik det er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. 97_, 1575 (1975). Det ovennevnte produkt ble utvasket fra harpiksen ved hjelp av etylacetat. Oppløsningsmidlet

ble fjernet ved fordampning, og man fikk tittelproduktet.

X.

Trinn 1. Kopling av L- Pro til en fast harpiks

L-Pro ble koplet til harpiksen som angitt i fremgangsmåte VIII, trinn 1.

Trinn 2. Kopling av 3- merkapto- 2- metylpropionsyre til

produktet fra trinn 1

Ved å bruke 3-Cbo-2-metylpropionsyre istedenfor 3-(N cx-benzoyl-L-f enylalanyltio) -2-D-metylpropionsyre i metode VIII, trinn 2 og bruke den fremgangsmåte som der er angitt, ble nevnte forbindelse koplet til L-Pro som var bundet til harpiksen. En oppløsning av TFA ble blandet med harpiksen, og dette fjernet Cbo-gruppen og.gir det ovennevnte produkt. Harpiksen ble vasket med etanol pg så med diklormetan..

Trinn 3. Kopling av L- Phe til produktet fra trinn 2

En oppløsning av N cx-Boc-L-Phe og DCC i DMF og diklormetan

(1:1) ble blandet med harpiksen fra trinn 2. Produktet ble koplet til merkaptogruppen av forbindelsen som var forbundet med harpiksen. Overskudd av reaktanter ble fjernet ved vasking med etanol og så diklormetan. En oppløsning av 25% TFA i diklormetan (1 mg/ml indol) ble blandet med harpiksen for å fjerne den Boc-beskyttende gruppen, noe som resulterte

i N cx-(3-L-fenylalanyltio-2-metylpropanoyl)-L-prolin bundet

til harpiksen. Overskuddet av TFA ble fjernet ved vasking med diklormetan.

Trinn 4. Kopling av benzoylgruppen til produktet i trinn 3

En oppløsning av benzoylklorid i DMF inneholdende 1 ekvivalent TEA ble blandet med harpiksen fra trinn 3. Benzoylgruppen

ble koplet til aminogruppen i Phe. Overskudd av reaktanter ble fjernet ved vasking med etanol og diklormetan, hvorved man fikk N cx -[3-(N cx-benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-metylpropanoyl]-L-prolin bundet til harpiksen.

Trinn 5. Avspaltning av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- metylpropanoyl]- L- prolin fra harpiksen

Det ovennevnte produkt ble avspaltet fra harpiksen ved å bruke fremgangsmåten fra metode VIII, trinn 3.

Trinn 6. Oppløsning til N cx-[ 3-( benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

XI.

Trinn 1. Syntese av L- tiofenylalaninhydroklorid L-tiofenylalaninfenylesterhydroklorid ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra Liebigs Ann. Chem. 576, 104 (1952).

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å.bruke fremgangsmåten fra Chem. Ber. 87, 1093 (1954) og Naturwissenschaften 40,

242 (1953)

Trinn 2. Syntese av 3-( L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre-hydroklorid

Ved å bruke L-tiofenylalaninhydroklorid istedenfor N-benzoyl-L-tiofenylalanin i metode I, trinn 4 og bruke den der angitte fremgangsmåte, fikk man fremstilt tittelproduktet.

Trinn 3. Oppløsning til 3- L- fenylalanyltio- 2- D- metylpropionsyre

Produktet fra trinn 2 ble oppløst ved å bruke fremgangs-

måten fra metode I, trinn 5 eller ved ioneutbytningskromato-grafi.

Trinn 4. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre 10 mmol N-succinimidylester av benzosyre ble oppløst i kald THF og oppløsningen tilsatt en kald oppløsning av 10 mmol av produktet fra trinn 3 og 10 mmol NaHC03i THF og vann. Reaksjonsblandingen ble rørt over natten ved romtemperatur. THF ble fjernet ved fordampning ved 35°C, og man tilsatte blandingen og pH justert ved hjelp av fast NaHC03. Den vandige fase ble ekstrahert med etylacetat, deretter avkjølt i et isbad og så surgjort til pH 2 ved hjelp av IN HC1 i nærvær av etylacetat. Den organiske fase ble vasket to ganger med kaldt vann og så to ganger med mettet natriumklorid. Den ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Opp-løsningsmidlet ble fjernet, ved fordampning, og residuet utkrystallisert fra eter og heksan, noe som ga tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av N01-[ 3-( N- benzoyl- L- f enylalanyltio)- 2- D-mety1]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble syntetisert ved hjelp av fremgangsmåten,1 i metode I, trinn 6(A).

XII.

Trinn 1. Syntese av 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

15 mmol 3-brom-2-metylpropionsyre ble oppløst i vandig IN

NaOH, og oppløsningen ble avkjølt i et isbad. En blanding

av 15 mmol N ct-benzoyl-L-tiofenylalanin og K^CO^ i vann ble tilsatt, og blandingen rørt over natten ved romtemperatur. Etter surgjøring med konsentrert saltsyre, ble den vandige oppløsningen ekstrahert med etylacetat og den organiske fase vasket med vann, tørket og konsentrert til tørrhet. Produktet ble så oppløst ved hjelp av fremgangsmåten i metode I, trinn 5, hvorved man fikk tittelproduktet. Alternativt kan 3-brom-2-D-metylpropionsyre brukes som utgangsmateriale, hvorved man kan eliminere sistnevnte trinn.

Trinn 2. Syntese av N Ct -[ 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl ]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten

i metode I, trinn 6(A).

XIII.

Trinn 1. Syntese av 3- L- fenylalanyltio- 2- metylpropionsyre Molare ekvivalenter av Na<->Boc-L-Phe og H2S ble omsatt ved å bruke den blandede anhydridkoplingsmetoden som er beskrevet 1 J. Am. Chem. Soc. 7_4, 4726 (1952) hvorved man fikk Na<->Boc-L-tiofenylalanin. Den Boc-beskyttende gruppen ble fjernet

ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 2 (i). I denne fremgangsmåten ble TFA og anisol fullstendig fjernet før man fortsetter. Ved å bruke det resulterende L-tiofenylalanin istedenfor N-benzoyl-L-tiofenylalanin i metode I, trinn 4

og bruke den der angitte fremgangsmåte, får man fremstilt tittelproduktet.

Trinn 2. Syntese av 3-( N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-metylpropionsyre

2 mmol av produktet fra trinn 1 ble suspendert i THF og vann (7:3) inneholdende 4 mmol NaHCO^under kraftig røring. 2 mmol benzoylklorid ved romtemperatur ble tilsatt, og blandingen rørt i en time. Etylacetat ble tilsatt og blandingen ble justert til pH 2 med IN saltsyre ved 0°C. Den organiske fasen ble vasket med mettet natriumklorid, tørket over magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning, og residuet ble utkrystallisert og omkrystallisert fra benzen og n-heksan, hvorved man fikk hvite krystaller.

Trinn 3. Oppløsning til 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Det ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 5.

Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoy li] - L- prolin

Ovennenvte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 6(A).

XIV.

Trinn 1. Oppløsning til 3- amino- 2- D- metylpropionsyre 3-amino-2-metylpropionsyre ble oppløst hvorved man fikk ovennevnte forbindelse ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i J. Biol. Chem. 236, 3283 (1961).

Trinn 2. Syntese av 3- brom- 2- D- metylpropionsyre

Produktet fra trinn 1 ble oppløst i vann og oppløsningen avkjølt til -5°C. Den ble så tilsatt litt NaN02og 48% HBr i vann. Blandingen ble rørt i \ time og så oppvarmet til romtemperatur, hvorpå oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning og man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten fra metode IX, trinn 1.

Trinn 4. Syntese av N Ct -[3-(N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten fra metode I, trinn 6(A).

XV.

Trinn 1. Oppløsning til 3- amino- 2- D- metylpropionsyre 3-amino-2-metylpropionsyre ble oppløst til den ovennevnte forbindelse ved hjelp av fremgangsmåten fra J.Biol. Chem. 236, 3283 (1961).

Trinn 2. Syntese av 3- brom- 2- D- metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra metode XI, trinn 2.

Trinn 3. Syntese av 3- benzoyltio- 2- D- metylpropionsyre

Ved å bruke tiobenzosyre istedenfor N-benzoyl-L-tiofenylalanin i metode XV, trinn 1 og bruke produktet fra trinn 2 og bruke den der angitte fremgangsmåte, så fikk man fremstilt ovennevnte produkt.

Trinn 4. Syntese av 3- merkapto- 2- D- metylpropionsyre Benzoylgruppen ble fjernet ved å bruke ammoniumhydroksyd på konvensjonell måte hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved først å omsette Bz-Phe som fremstilt i eksempel VI, trinn 1, med overskudd N-hydroksysuccinimid ved benyttelse av MA-metoden, og deretter omsetning av den resterende forbindelse med produktet fra trinn 4 for dannelse av tittelproduktet.

Trinn 6. Syntese av N ct -[3-(N ct- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropanoyl 3- L- prolin

Ovennevnte produkt ble fremstilt ved omsetning av produktet fra trinn 5 med L-prolin for dannelse av den ønskede forbindelse.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvor R er hydrogen, t-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl, pyro-L-glutamyl eller R <1> , hvor R' er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, tryptofyl, tyrosyl, glycyl, isoleucyl, leucyl, histidyl eller valyl, idet a-aminogruppen deri er i amidbinding med R; R^ er hydrogen eller metyl; n er 0 eller 1, slik at når n er 0, er R, metyl, og når n er1 og R^ er metyl, er gruppen.

i D-konfigurasjonen; og R2 er L-prolyl, L-3,4-dehydroprdlyl, D,L-3,4-dehydroprolyl, L-3-hydroksyprolyl, L-4-hydroksyprolyl, L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-oksoprolyl, idet iminogruppen deri er i imidbinding med den tilstøtende

karakterisert ved følgende trinn:(A) kobling av en forbindelse med formelen:

hvor R^ er en syrefølsom aminobeskyttende gruppe, og A, R-^ og n har den ovenfor angitte betydning, eller et reaktivt derivat derav, med en forbindelse med formelen:

hvor R2 enten er lik R2 som angitt ovenfor, eller R2 er som angitt ovenfor inneholdende en karbonylbeskyttende gruppe, (B) fjerning av den R3 -beskyttendé gruppe fra produktet fra trinn (A) , (C) j omsetning av produktet fra trinn (B) med en jR-koblende forbindelse, hvor R har den ovenfor angitte betydning, og, om nødvendig, fjerning av den karbonylbeskyttende gruppen.