NO831114L

NO831114L - Fremgangsmaate for fremstilling av blodtrykkssenkende midler

Info

Publication number: NO831114L
Application number: NO831114A
Authority: NO
Inventors: James Walter Ryan; Alfred Chung
Original assignee: Univ Miami
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1983-03-28
Publication date: 1981-09-11
Also published as: DK105981A; PT72635B; NO156695B; JPH0667902B2; NO831113L; ES8305698A1; FI810725L; ES500254A0; ES519567A0; EP0038117A1; NO831111L; PL230076A1; JPH01250344A; CS174581A2; ES8403104A1; JPH0667901B2; JPH02209865A; JPH01246257A; PT72635A; ES8403448A1

Description

Det angiotensinomdannende enzym (peptidyldipeptidhydrolase, heretter betegnet som ACE) inntar en sentral rolle i fysio-logien omkring hypertensjon. Enzymet er i stand til å om-danne dekapeptidet angiotensin I, som har følgende amino-syresekvens:

AspArgValTyrlleHisProPheHisLeu

til et oktapeptid, angiotensin II, ved at det katalyserer hydrolysen av angiotensin I's nest siste peptidbinding, hvorved man frembringer en fjerning av karboksyl-slutt-gruppen HisLeu.

Forskjellige kjemiske forbindelser som inngår i den etter-følgende forklaring, er angitt i den nedenforstående tabell med sine forkortelser:

ACE = angiotensin-omdannende enzym

Ala = L-alanin

Arg = L-arginin

Asp = L-aspartinsyre

Boe = t-butyloksykarbonyl

Bpoc = 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl

Bz = benzoyl

Cbo = benzyloksykarbonyl

Ddz = N-a,a-dimetyl-3,5-dimetyloksykarbonyl

Gly = glycin

His = L-histidin

Ile = L-isoleucin

Leu = L-leucin

Phe = L-fenylalanin

Ppoc = 2-fenylisopropyloksykarbonyl

Pro = L-prolin

APro = L-3,4-dehydroprolin

Ser = L-serin

Trp = L-tryptofan

Tyr = L-tyrosin

Val -= L-valin

Angiotensin II er et meget sterkt blodtrykkshevende middel.

I tillegg til sin direkte blodtrykkshevende virkning, så stimulerer også angiotensin II frigjøring av aldosteron som har en tendens til å heve blodtrykket ved at det holdes tilbake ekstracellulære salter og væsker. Angiotensin II finnes i målbare mengder i blodet hos normale mennesker.

Det finnes imidlertid i forhøyede konsentrasjoner i blodet hos pasienter med nyrehypertensjon.

Nivået av ACE-aktivitet er vanligvis i overskudd, både i normale pasienter og i pasienter med hypertensjon, i forhold til den mengde som er nødvendig for å opprettholde det observerte nivå av angiotensin II. Man har imidlertid funnet at det skjer en betydelig blodtrykkssenkning i hyper-tensive pasienter når disse behandles med ACE-inhibitorer [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med. 291, 817 (1974)].

Den rolle som ACE synes å ha i patogenesen for hypertensjon har gjort at man lenge har forsket for å finne inhibitorer for enzymet som kunne virke som blodtrykkssenkende midler.

Se f.eks. US-patentene 3.891.616, 3.947.575, 4.052.511 og 4.053.651. Reaktiviteten på ACE varierer markert avhengig av substratet. Mange peptider som kalles inhibitorer for den enzymatiske omdannelsen av angiotensin I til angiotensin II, er i virkeligheten substrater som har en lavere Michaelis-konstant (Km) enn angiotensin I. Slike pepetider bør mer korrekt kalles konkurrerende substrater.

Tallrike syntetiske peptid-derivater har vist seg å være ACE-inhibitorer, se Ondetti et al, i US-patent 3.832.337 utstedt 27. august 1974. En meget effektiv inhibitor med høy biologisk aktivitet når den tilføres oralt, er D-3-merkapto-2-metylpropanoyl-L-prolin, betegnet SQ14225, beskrevet i US-patent 4.046.889 til Ondetti et al, utstedt 6. september 1977, og beskrevet i forskjellige vitenskapelige artikler av Cushman, D.W. et al, Biochemistry .16, 5484 (1977) og av Ondetti, M. et al, Science 196,441 (1977). Inhibitoren SQ14225 har vært rapportert å ha en I5Q-verdi på 2,3x10 — 8M. Den I,. Q-verdi som er angitt av Cushman, et al, er den konsentrasjon av inhibitor som er nødvendig for å gi en 50% hemming av enzymet under et standardprøvesystem som inneholder et substrat ved et nivå vesentlig over K m. Det er underforstått at I,.^-verdiene lar seg direkte sammenligne, når man holder alle de virksomme faktorer som påvirker reaksjonen konstant. Disse faktorer innbefatter opprinnelse av enzym, dets renhet, det anvendte substrat og dets konsentrasjon, samt sammensetningen på prøvebuf feren. Alle de I,. Q-verdier som her er angitt, er utført i samme prøvesystem og med samme enzym (human urinær ACE), og med et omtrentlig r> hK m-nivå av substrat, og resultatene lar seg derfor sammenligne.

Ved en analogi av det bedre kjente enzym karboksypeptidase A, har man utviklet en modell for den aktive posisjon i ACE og selve virkningsmåten for SQ14225. Det har vært postulert at den aktive posisjonen har en kationisk posisjon for binding av karboksylgruppen i substratet og en "lomme" eller "kløft" som er i stand til å binde sidekjeden på den C-terminale aminosyren, hvorved.man får en spesiell sterk binding for den heterocykliske ringen på den terminale prolin-rest. Det har vært postulert en lignende "lomme" for den nestsiste aminosyreresten, og publiserte data antyder et relativt strengt sterisk krav, ettersom D-formen av inhibitoren var vesentlig mer virksom enn sin stereoisomer eller 3-metyl eller andre usubstituerte analoger. Sulfhydrylgruppen på inhibitoren som har vært postulert å ha en aktiv posisjon nær det katalytiske sentrum, antas å spille en sentral rolle for inaktivering av enzymet ved en kombinasjon med den sink-gruppen som er vesentlig for den katalytiske aktiviteten. Substituenter på sulfhydrylgruppen slik som en metylgruppe,

og S-acetylderivatet, reduserte i vesentlig grad inhibi-torens virkning. Se Cushman, D.W., et al., Biochemistry, slik dette er angitt ovenfor.

In vitro-studier av den mekanisme ved hjelp av hvilken SQ14225 og dets analoger virker for å hemme ACE, har vært noe hindret ved at disse molekyler under vanlige betingelser har høy grad av ustabilitet. Man har f.eks. kunnet observere at en frisk vandig oppløsning med en konsentrasjon på 1 mg pr. ml av SQ14225 ved en pH på 8, blir vesentlig mindre aktiv ved henstand i så lite som 30 minutter, og at aktiviteten fortsetter å synke etter hvert som oppløsningen står. Man antar at dette tap av aktivitet i vesentlig grad skyldes

en dimerisering av SQ14225, som skjer ved sulfhydrylende-gruppene, hvorved det dannes et disulfid som i vesentlig

grad er inaktivt som en inhibitor. Etter som den frie sulfhydrylgruppen er meget reaktiv og lett kan oksyderes til polare syregrupper, slik som sulfon- og sulfoksydgrupper, så kan det også være at det observerte in vitro-tap av aktivitet i vandige oppløsninger av SQ14225 ved henstand, til dels skyldes en eller flere slike oksydasjonsreaksjoner med dannelse av et sulfon eller sulfoksyd som ikke virker effektivt som en inhibitor for ACE.

I rapporter som hittil er tilgjengelige for klinisk prøving av SQ14225, og i visse av disse refereres forbindelsen til under dets varemerke "Captopril", antyder at produktet er tilstrekkelig stabilt i normale magesekk- og tarmmiljø man finner hos de fleste pasienter til at midlet er en effektiv inhibitor for ACE når det tilføres oralt. Det er imidlertid ikke klart hvorvidt det er større eller mindre grupper av pasienter hvor SQ14225 i alt vesentlig er ineffektivt. På grunn av den høye reaktiviteten på den frie sulfhydrylgruppen, så vil SQ14225 lett kunne danne blandet disulfider med serum, cellulære proteiner, peptider eller andre forbindelser med frie sulfhydrylgrupper i det miljø som hersker i mage-sekken eller i tarmen, foruten muligheten for en dimerdannelse eller oksydativ nedbrytning. Et blandet disulfid med protein kan være antigenisk, og enkelte allergiske reaksjoner er også blitt observert klinisk. Se Gavras, et al, New England J. Med. 298, 991 (1978). Hvis det dannes disulfider og oksy-dative nedbrytningsprodukter av SQ14225, så kan det i beste fall forventes å være i alt vesentlig ineffektive som inhibitorer. Det kan følgelig postuleres at dosereaksjonen for SQ14225 vil være variabel med hensyn til tilførselsmåte og for den enkelte pasient. Videre kan man hos enkelte pasienter forvente uønskede sideeffekter, og det kan være vanskelig å regulere en effektiv konsentrasjon av inhibitoren i kroppen.

Det har vanligvis vært antatt at tioesterforbindelser er høyreaktive ved at tioesterbindingen lett lar seg hydro-lysere til en sulfhydrylgruppe og en karboksylisk gruppe. Tioestere har følgelig ofte vært brukt som aktive estermellom-produkter for acylering under milde betingelser. Slike grupper, f.eks. acetyltio har vært brukt som blokkerende grupper bl.a. i ovennevnte Ondetti et al. patent. Tioester-mellomproduktet har også vært angitt å opptre i biosyntesen av cykliske peptider slik som tyrocidin eller gramicidin Si-

Se Lipmann, F. i Accounts Chem. Res. 6, 361 (1973).

Forbindelser som er beslektet med SQ14225 er beskrevet av Ondetti et al., i US-patentene 4.046.889, 4.052.511, 4.053.651, 4.113.715 og 4.154.840. Det er her blant annet beskrevet interessante analoger av SQ14225 ved at den fem-atomære heterocykliske ringen i prolin er erstattet med ringer inne-holdende fire eller seks atomer. Den hemmende virkningen for slike analoger i forhold til SQ14225 er imidlertid ikke beskrevet. Hvis man bruker D-prolin istedenfor L-prolin, så reduserer dette drastisk den hemmende virkningen for 3-merkaptopropanoylaminosyrer (Cushman, D.W., et al., se ovenfor) .

Til dags dato har man ikke bestemt effekten av aminosyren

til venstre for svovelatomet i tioesterforbindelsene. Det har vært antatt at denne aminosyren virker som en ytterligere "gjenkjennelsesposisjon" for enzymet. Hvis dette er tilfelle, så skulle man forvente at en forbindelse med en aminosyre her kunne være en bedre inhibitor. Foreliggende søkere har funnet at forskjellige aminosyrer er effektive, og at hydroksyproliner, prolin-L- og D,L-3,4-dehydroprolin, tia-zolidin-4-karboksylsyre og L-5-oksoprolinderivater alle er effektive som blodtrykkssenkende midler og har høy hemmende virkning for ACE.

Foreliggende oppfinnelse angår en rekke fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser med følgende formel:

hvor R er hydrogen, tert-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glytamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl eller pyro-L-glutamyl, eller R', hvor R' er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, trytofyl, tryosyl, isoleucyl, leucyl, glycyl, histidyl eller valyl, og a-amino-gruppen i disse forbindelser er i amidbinding med R; R^er hydrogen eller metyl; R^er L-prolin, L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin, L-tiazolidin-4-karbok-sylsyre eller L-5-oksoprolin, og hvor iminogruppen i disse forbindelser er i imidbinding med den tilstøtende 0

-C-

n er 0 eller 1, slik at når n er 0, så er R^metyl; og når n=l og R, er metyl, så står -CH -CH-gruppen i D-konfigura-CH3

sjonen. Disse forbindelser er inhibotorer for ACE og kan brukes som oralt effektive blodtrykkssenkende midler.

Av hensiktsmessighetsgrunner er alle de etterfølgende fremgangsmåter beskrevet på bakgrunn av de trinn som er nød-vendig for å fremstille den forbindelsen hvor R er benzoyl,

A er f enylalanyl, R., er metyl, R er L-prolin og n er 1,

dvs. N a -[3-N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. For fagfolk vil det imidlertid være underforstått at man lett kan fremstille andre forbindelser ved at man kan innføre andre forønskede grupper når dette måtte være passende istedenfor de som er brukt for å illustrere de foreliggende fremgangsmåter. Således kan man i alle de etterfølgende fremgangsmåter bruke L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin, L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-oksoprolin istedenfor L-prolin i

i alle de fremgangsmåter som er beskrevet i det etterfølg- . ende. Videre kan alle de aminosyrer som er angitt for A brukes istedenfor fenylalanin i disse fremgangsmåter.

Videre kan andre forønskede forbindelser fremstilles ved

å utføre passende substitusjoner hvis intet annet er angitt nedenfor.

I en rekke av de fremgangsmåter som er beskrevet i det etter-følgende, blir IS^-R^-tiofenylalanin, hvor R 3 er H, Bz , Boe eller Ddz, reagert med metakrylsyre eller ester eller 3-brom-2- metylpropionsyre, for derved å få fremstilt 3-Na<->R3-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre eller ester. Denne forbindelse kan så oppløses slik at det dannes 3-Na<->R^-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre ester før denne forbindelsen reageres med L-Pro for å fremstille det forønskede produkt.

odot

I andre fremgangsmåter blir N -R^-fenylalanin eller N -R^~ fenylalanin aktive estere hvor R^er Bz, Bpoc, Ddz, reagert med 3-merkapto-2-metylpropionsyre eller en ester av denne, for derved å få fremstilt 3-Na<->R4-fenylalanyltio-2-metylpropionsyre eller en ester. Denne forbindelsen kan så opp-løses for å danne 3-N°-R^-fenylalanyltio-2-D-metylpropionsyre eller en ester av denne før den reageres med L-Pro for å danne det forønskede produkt. I andre fremgangsmåter blir 3- R^-tio-2-metylpropionsyre eller en ester av denne hvor R^er Cbo, acetyl eller amino, oppløst for å danne 3-R^-tio-2- D-metylpropionsyre eller en ester av denne før man utfører en reaksjon med R-A.

3- benzoyltio-2-D-metylpropionsyre, som brukes som utgangs-forbindelse i det foreliggende fremgangsmåter for syntese av forbindelser med formel I, er kommersielt tilgjengelige fra Chemical Dynamics Corp., 3001 Hadley Road, South Plainfield, New Jersey.

I de følgende fremgangsmåter kan man bruke enhver hensikts-messig koblingsmetode for de trinn hvor dette kreves i tillegg til de som er angitt. Eksempler på koblingsmetoder innebefatter: blandet anhydrid (MA), dicykloheksylkarbodi- imid (DCC), azid, N-etyloksykarbonyl-2-etyloksy-l,2-di-hydrokinolin (EEDQ), N-isobutyloksykarbonyl-2-isobutyloksy-1,2-dihydrokinolin, symmetrisk anhydrid, Woodwards reagens K (N-etyl-5-fenylisooksazolium-3'-sulfonat) eller karbonyldi-imidazol (CDI) metoder. For en oversikt over disse metoder og fremgangsmåter, se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl) vol. XV, del II, s. 1 og etterfølgende (1974).

På lignende måte kan man i de etterfølgende fremgangsmåter hvor man bruker en t-butyloksykarbonyl (Boe)-beskyttende gruppe, erstatte denne med enhver syrefølsom aminobeskyttende gruppe, slik som 2-(4-bifenyl)-2-propyloksykarbonyl (Bpoc), 2-fenylisopropyloksykarbonyl (Ppoc), benzyloksykarbonyl (Cbo) eller andre syrefølsomme N-aralkyloksykarbonylbeskytt-ende grupper. Fjerning av de beskyttende grupper kan utføres på enhver kjent måte, f.eks. ved hjelp av trifluoreddiksyre (TFA) i anisol, HC1 i eddiksyre, kald trifluormetansulfon-syre eller metanolisk ammoniakk. Se Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), vol. XV, del I, s. 376 og de etter-følgende (1974) .

I.

I en foretrukken fremgangsmåte blir metakrylsyre først koblet med N-hydroksysuccinimid fulgt av en reaksjon med L-prolin, noe som gir 2-metylpropenoyl-L-prolin.

Alternativt kan metakryloylklorid omsettes med L-prolin,

noe som gir den samme forbindelsen som nevnt ovenfor.

Som et annet alternativ til første trinn så kan metakrylsyre kobles med L-prolin-t-butylester ved å bruke MA-metoden, noe som gir t-butylesteren av 2-metylpropenoyl-L-prolin, hvor-fra man fjerner de beskyttende grupper med TFA, noe som gir 2-metylpropenoyl-L-prolin.

I det annet trinn blir sistnevnte forbindelse oppvarmet med Na<->benzoyltiofenylalanin (Bz-Phe-SH) i nærvær av toluen, noe som gir den forønskede forbindelsen.

Alternativt kan t-butylesteren av 2-metylpropenoyl-L-prolin brukes istedenfor 2-metylpropenoyl-L-prolin i trinn 2 ovenfor. De beskyttende grupper må fjernes fra produktet med TFA, noe som gir den forønskede forbindelsen.

Man kan bruke akrylsyre istedenfor metakrylsyre, eller alternativt kan man bruke akryloylklorid istedenfor metakryloylklorid i trinn 1, noe som gir 3-tiopropionsyre-derivatet. Enhver ønskelig R-A-SH-forbindelse kan brukes istedenfor Bz-Phe-SH i trinn 2 i denne fremgangsmåte, noe som gir en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

II.

I denne fremgangsmåten blir 3-acetyltio-2-metylpropionsyre koblet til L-prolin-t-butylester, fortrinnsvis ved å bruke DCC-metoden, noe som gir N<0->(3-acetyltio-2-metylpropanoyl)-L-prolin-t-butylester.

I annet trinn blir produktet fra trinn 1 oppløst i en alkalisk oppløsning, f.eks. en blanding av metanol og ammoniakk, hvorved man får N -(3-merkapto-2-metylpropanoyl)-L-prolin-t-butylester .

I tredje trinn blir produktet fra trinn 2 oppløst, f.eks. ved hjelp av et metallgelatkompleks.

I det fjerde trinn blir det oppløste produkt koblet til N<0->benzoylfenylalanin (Bz-Phe), noe som gir Na<->[3-(Na<->benzoyl-benzylalanyltio-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin-t-butylester.

I det femte trinnet fjerner man de beskyttende grupper fra produktet i trinn 4 ved hjelp av TFA i anisol, noe som gir den forønskede forbindelse.

3-acetyltiopropionsyre eller 2-acetyltiopropionsyre kan brukes istedenfor 3-acetyltio-2-metylpropionsyre i trinn 1

i denne fremgangsmåte, noe som gir 3-tiopropionsyre eller 2-tiopropionsyrederivatene. Enhver ønskelig R-A-forbindelse

fremstilt ved de metoder som er beskrevet i US-patentsøknader nr. 064.897 til og med 064.903, inngitt 14. august 1979, søknader nr. 116.950 og 116.951 inngitt 30. januar 1980

og søknad nr. 121.188 inngitt 3. mars 1980, kan brukes istedenfor Bz-Phe i trinn 4 , noe som gir en forbindelse med de forønskede R- og A-grupper.

III.

I en annen fremgangsmåte hvor man bruker fast faseteknikk, blir Boc-Pro koblet til en fast fase, slik som o-nitro-benzylharpiks, hvoretter man fjerner de beskyttende grupper ved anvendelse av trifluoreddiksyre (TFA) i anisol.

I et annet trinn blir 3-Cbo-tio-2-metylpropionsyre koblet

til prolinharpikskomplekset fra trinn 1, noe som skjer ved hjelp av DCC-metoden. Acetylgruppen blir så fjernet ved behandling med en alkalisk oppløsning, f.eks. metanol og ammoniakk.

I det tredje trinnet, blir beskyttet fenylalanin koblet til produktet fra trinn 2. Fenylalaninet er beskyttet ved hjelp av Boe, Bpoc, Ppoc eller enhver annen syrefølsom beskytt-

ende gruppe.

I det fjerde trinn blir de beskyttende grupper fjernet ved hjelp av TFA.

I det femte trinn blir produktet fra trinn 4 koblet til enhver benzoylkoblingsforbindelse, f.eks. benzoylhalogenider slik som benzoylklorid eller benzoylbromid, eller en aktiv benzosyreester slik som N-succinimidyl-, p-nitrofenyl-, o-nitrofenyl-, benzotriazolyl-, 5-norbornen-2,3-dikarboksimidyl-, pentaklorfenyl- eller pentafluorfenylestere.

I det sjette trinn blir N oi -[3-(N ot-benzoylfenylalanyltio)-2-metylpropanoyl]-L-prolin avspaltet fra harpiksen. Hvis en o-nitrobenzyl-harpiks anvendes, oppnås spalting ved bestrål-ning. Dersom klormetylert harpiks benyttes, oppnås spaltning ved bruk av HF.

I syvende trinn blir produktet fra trinn 6 oppløst ved hjelp av velkjente fremgangsmåter, noe som gir den forønskede forbindelse.

Hvis N cx-benzoylfenylalanin blir brukt istedenfor den beskyttende fenylalaninforbindelsen i trinn 3, så kan trinnene 4

og 5 elimineres.

3-acetyltiopropionsyre eller 2-acetyltiopropionsyre kan brukes istedenfor 3-acetyltio-2-metylpropionsyre i trinn 2, noe som gir 3-tiopropionsyre eller 2-tiopropionsyrederivatene. Enhver ønskelig A-gruppe kan brukes istedenfor fenylalanin i trinn 3, noe som gir en forbindelse med den forønskede A-gruppe. Enhver ønskelig R-gruppe kan kobles til produktet fra trinn 4 ved å bruke R istedenfor benzoylgruppen i den benzoylkoblingsforbindelse som er brukt i trinn 5.

I alle de tilfeller hvor det er angitt at man har en D-konfigurasjon i metylsidekjeden på 3-merkapto-2-metylpropion-syregruppen, så er det underforstått at dette er ekvivalent til å angi at man har en S-konfigurasjon.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse danner basiske salter med forskjellige uorganiske og organiske baser og slike salter ligger også innenfor oppfinnelsen. Nevnte salter innbefatter f.eks. ammoniumsalter, alkalimetallsalter som natrium- og kalsiumsaltet (som er de foretrukne), alkali-jordmetallsalter som kalsium- og magnesiumsalter, videre salter med organiske baser, f.eks. dicykloheksylaminsalt, benzatin, N-metyl-D-glukamin, hydrabaminsalter, salter med aminosyrer som arginin, lysin og lignende. Det er foretrukket å bruke de ikke-toksiske, fysiologisk akseptable salter, skjønt andre salter kan også brukes, f.eks. for å isolere eller å rense produktet, noe som er angitt i eksemplene i forbindelse med dicykloheksylaminsaltet.

Saltene fremstilles på vanlig kjent måte ved å omsette den frie syreformen av produktet med en eller flere ekvivalenter av en passende base, noe som gir det forønskede kation i et oppløsningsmiddel eller et medium hvor saltet er dårlig opp-løselig eller uoppløselig, eller i vann og hvoretter man fjerner vannet ved frysetørking. Ved å omsette saltet med en uoppløselig syre slik som en kation-utbytningsharpiks i hydrogenformen (f.eks. polystyren-sulfonsyreharpikser som Dowex 50), eller med en vandig syre og så ekstrahere denne med et organisk oppløsningsmiddel f.eks. etylacetat, diklor-metan eller lignende, kan man oppnå den frie syreformen,

hvis dette er ønskelig, og deretter danne et annet salt når dette måtte være passende.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Av hensiktsmessighetsgrunner har man i det etterfølgende beskrevet detaljer med hensyn til fremgangsmåter for fremstil-. ling av N cx -[3-(N cx-benzoylfenylalanyltio)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin. Hvis intet annet er angitt, har man anvendt

molare ekvivalenter av reaktantene.

I.

Trinn 1. Syntese av N cx- t- butyloksykarbonyl- L- tiofenylalaninfenylester

En oppløsning av 3,98 g Boc-L-Phe i ca. 20 ml redestillert etanol ble avkjølt til -20°C i et metanol-is-tørris-bad. Oppløsningen ble tilsatt 2,04 ml N-etylmorfolin fulgt av

2,04 ml isobutylklorformat, og blandingen ble omrørt i 3 minutter ved -15°C. 1,8 ml tiofenyl ble tilsatt, og blandingen ble omrørt i 1^ time ved -15°C. Den ble så lang-somt oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. 2 0 ml etylacetat ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med kaldt vann, tre ganger med kald IN sitronsyre, tre ganger med kald mettet natriumklorid, tre ganger med kald IN NaHCO^og til slutt tre ganger med en mettet kald natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble så fjernet ved fordampning. Resten ble utkrystallisert fra benzen-petroleter, noe som ga 3,68 g av hvite nåler med smeltepunkt på 113,5-114,5°C.

Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr og elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 2. Syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalaninfenylester

(i) 2 g av produktet fra trinn 1 ble tilsatt 2,0 ml anisol og avkjølt i et is-aceton-bad. Nevnte N<0->Boc-

gruppe ble fjernet ved omrøring av blandingen med 4 ml vannfritt TFA i romtemperatur i 30 minutter. TFA og anisol ble fjernet ved 30°C under høyvakuum inntil man fikk de første hvite krystaller. (ii) Deretter tilsatte man 10 ml av en 5,7 molar hydro-genkloridoppløsning i etanol, og blandingen ble omrørt i 10 minutter ved romtemperatur. 15 ml vannfri eter ble tilsatt, og blandingen avkjølt i et isbad i 30 minutter. Opp-løsningen ble filtrert, og krystallene vasket flere ganger med eter. De ble så tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5'noe som ga 1,039hvite krystaller som dekomponerte ved 164,5-165°C. (iii) 1,12 g av dette produktet, dvs. hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalanin-fenylesteren, ble suspendert i 15 ml etylacetat under kraftig omrøring. Man tilsatte så 0,45 ml benzoylklorid. Blandingen ble dråpevis tilsatt en oppløs-ning av 1,01 g Na2CO^ i 10 ml vann, og blandingen ble omrørt kraftig i 30 minutter. Den ble så avkjølt i et isbad i 30 minutter og filtrert. Resten ble vasket syv ganger med kaldt vann, en gang med kald etylacetat og to ganger med vannfri eter. Resten ble så tørket i et vakuumkammer over NaOH-pellets og V^ O^ i flere timer, noe som ga 1,32 g hvite krystaller som dekomponerte ved 182-183 C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 3. Syntese av N cx- benzoyl- L- tiofenylalanin

En strøm av nitrogen ble boblet inn i en oppløsning av 1,01 g

NaSH i 25 ml vannfri etanol under kraftig omrøring, mens temperaturen ble holdt mellom 35-40°C. 2,17 g av produktet fra trinn 2 ble tilsatt iløpet av 15 minutter. Temperaturen på reaksjonsblandingen falt til ca. 20°C etter at tilslut-ningen var ferdig. Blandingen ble så kraftig omrørt ved 20°C i li time. Etanolen ble fjernet ved 32°C, 30 ml vann ble tilsatt, og oppløsningen avkjølt i et isbad. Den ble så surgjort til pH 2 med 50% H2S04. Den ble så hensatt i et isbad i 30 minutter og filtrert, hvoretter resten ble vasket flere ganger med kaldt vann og tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5'Resten ble omkrystallisert fra benzen og heksan, noe som ga 1,4 5 g hvite nåler som dekomponerte ved 108-5-109,5°C. Analyse av produktet ved IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromato-graf i viste at produktet var tittelforbindelsen.

Trinn 4. Syntese av 3-( N a- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- metylpropionsyre

En suspensjon av 285 mg av produktet fra trinn 3 og 86,1 yl metakrylsyre i 2 ml toluen ble kokt under tilbakeløp i flere timer, inntil reaksjonen var fullstendig, noe som ble på-vist ved tynnsjiktskromatografi og papirelektroforese. Blandingen ble hensatt over natten ved romtemperatur, og oppløsningsmidlet ble fjernet ved fordampning under høyvakuum ved 35°C, noe som ga en oljeaktig rest. Dette ble utkrystallisert og omkrystallisert fra benzen-n-heksan til 195 mg hvite krystaller med et smeltepunkt på 120-122,5°C. Analyse av produktet ved hjelp av IR, nmr, elementæranalyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi viste at produktet var identisk med tittelforbindelsen.

Trinn 5. Oppløsning til 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-metylpropionsyre

(A) Produktet fra trinn 4 ble flere ganger utkrystallisert fra benzen til tittelforbindelsen. Ved å bruke en ut-fellingskrystall oppnådde man den ovennevnte forbindelse raskere og med høyere utbytte. (B) Produktet fra trinn 4 ble oppløst i benzen, hvoretter man tilsatte en ekvivalent dicykloheksylamin og om-rørte det hele i flere timer. Blandingen ble hensatt over natten ved 4°C og filtrert, og krystallene ble vasket og tørket i et vakuumkammer. De ble så oppløst i en blanding av vann og etylacetat, og bladningen ble surgjort til'pH 2 med konsentrert HC1 i et isbad. Blandingen ble så vasket med en oppløsning av mettet natriumklorid og tørket ved hjelp av magnesiumsulfat. Oppløsningen ble filtrert, og oppløs-ningsmidlet ble fjernet i et roterende fordampningskammer. Produktet ble så utkrystallisert fra benzen. Trinn 6. Syntese av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D- metylpropanoy1]- L- prolin (A) (i) 2,5 mmol av produktet fra trinn 5 ble oppløst i 3 ml dimetylformamid (DMF) og avkjølt til 0°C i et is-aceton-bad. 2,5 mmol DCC i 1,5 ml DMF ble tilsatt, og blandingen omrørt i 5 minutter ved 0°C. Oppløsningen ble tilsatt 2,5 mmol L-prolin-t-butylester i 1,5 ml DMF. Blandingen ble om-rørt over natten ved 4°C, og opparbeidet ved å tilsette 10 ml etylacetat og filtrert. Produktet ble vasket med 20 ml etylacetat, og de samlede etylacetatfraksjoner ble avkjølt i en dypfryser. Den organiske fasen ble vasket tre ganger med en mettet natriumkloridoppløsning, en gang med kald 0,IN NaHC03og tre ganger med mettet natriumklorid. Den organiske fasen ble så tørket med vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet under høyvakuum, noe som ga en hvit rest. (ii) Nevnte rest ble suspendert i 4 ml anisol og omsatt med 8 ml TFA i li time ved romtemperatur under omrøring. TFA ble så fjernet ved fordampning i høyvakuum. Resten ble oppløst i 1 ml tetrahydrofuran (THF) og kromatografert. De forønskede fraksjoner ble fordampet til tørr-het, oppløst i en mindre mengde isopropanol og kromatografert omigjen. De forønskede fraskjoner ga en olje som ble oppløst i THF, hvoretter sistnevnte ble fordampet under en strøm av nitrogen. Sluttproduktet fikk man etter å ha fjernet det gjenværende oppløsningsmiddel ved hjelp av fordampning i høyvakuum. (B) En kald oppløsning av 2,5 mmol DCC i DMF ble tilsatt dråpevis til en blanding av 2,5 mmol av produktet fra trinn 5 og 2,5 mmol N-hydroksysuccinimid i DMF ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C og så over natten ved 4°C. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering, og bunnfallet vasket med etylacetat. Opp-løsningsmidlene fra de samlede filtrater ble fjernet under redusert trykk, og resten utkrystallisert fra benzen og heksan. Krystallene ble oppløst i kald THF, og oppløsningen ble tilsatt en kald oppløsning av 2,5 mmol L-Pro og 2,5 mmol NaHCO^i THF/vann. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. THF ble fjernet ved fordampning ved 35°C. Vann ble tilsatt blandingen og pH justert til 9-ved hjelp av fast NaHCO^. Den vandige fasen ble ekstrahert med etylacetat, ble så avkjølt i et isbad og surgjort til pH 2 ved hjelp av IN HC1 i nærvær av etylacetat. Den organiske fasen ble vasket to ganger med kaldt vann og så to ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble så tørket over vannfritt magnesiumsulfat og filtrert. Oppløsnings-midlet ble fjernet ved fordampning og resten utkrystallisert fra eter og heksan, noe som ga tittelproduktet. Alternative fremgangsmåter for syntese av Na- benzoyl- L- tiofenylalanin (A) Boc-L-tiofenylalaninfenylesteren ble fremstilt som beskrevet i trinn 1. Deretter ble tiosyren, Boc-L-tiofenylalanin fremstilt ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 3. Alternativt kan denne tiosyren fremstilles ved å omsette molare ekvivalenter av Boc-L-Phe og H2S ved hjelp av den blandede anhydridkoblingsmetoden som er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. 74./ 4726 (1952) . Tiosyren blir omsatt med hydrogenklorid i etanol og hvoretter man reagerer produktet med benzoylklorid eller en aktiv ester av benzosyre slik det er beskrevet i trinn 2, noe som gir tittelproduktet. (B) Na<->benzoyl-L-Phe ble syntetisert ved å reagere ekvivalente mengder av benzoylklorid og L-Phe i natrium-hydroksydoppløsning som beskrevet i J. Bio. Chem., 138,

627 (1941) . Produktet kan syntetiseres ved å reagere molare ekvivalente mengder av N cx-benzoyl-L-Phe og I^S ved å bruke den blandede anhydridkoblingsmetoden slik det er beskrevet i J. Am. Chem. Soc, 7_4 , 4726 (1952).

Alternativ fremgangsmåte for syntese av 3-( Na- benzoyl- L-fenylalanyltio)- 2- D- metylpropionsyre

Boc-L-tiofenylalanin ble fremstilt som beskrevet. Hydrogenkloridsaltet av L-tiofenylalanin ble fremstilt ved å reagere Boc-L-tiofenylalanin med HC1 i eddiksyre under omrøring ved romtemperatur. Vannfri eter ble tilsatt og blandingen avkjølt i et isbad, hvoretter den ble filtrert og vasket flere ganger med eter. Resten ble tørket over natten i et vakuumkammer over NaOH-pellets og P2°5*Det resulterende produkt ble omsatt med metakrylsyre som beskrevet i trinn 4, hvorved man fikk hydrogenkloridsaltet av 3-L-fenylalanyltio-2- metylpropionsyre. Dette produkt kan enten oppløses ved å bruke fremgangsmåten fra trinn 5 og deretter reagere det med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii), noe som gir tittelforbindelsen, eller dette produkt kan omsettes med benzoylklorid som beskrevet i trinn 2 (iii) og så oppløses. ;II. ;Trinn 1. Syntese av 3- acetyltio- 2- metylpropanoyl- L- prolin- t-butylester ;3- acetyltio-2-metylpropionsyre ble omsatt med L-prolin-t-butylester under anvendelse av DCC-metoden for dannelse av tittelforbindelsen. ;Trinn 2. Syntese av 3- merkapto- 2- metylpropanoyl- L- prolin- t-butylester ;Produktet fra trinn 1 ble oppløst i en blanding av metanol og konsentrert ammoniakk, og etter en time ble blandingen fortynnet med vann og filtrert. Filtratet ble ekstrahert med etylacetat og så surgjort med konsentrert saltsyre, mettet med natriumklorid og ekstrahert to ganger med etylacetat. Etylacetatekstraktene ble vasket med mettet natriumklorid og konsentrert til tørrhet, hvorved man fikk tittelproduktet. ;Trinn 3. Oppløsning til 3- merkapto- 2- D- metylpropanoyl- L-prolin- t- butylester ;Produktet fra trinn 2 ble oppløst ved hjelp av væskekromatografi eller ved å danne et metallgelatkompleks, hvorved man fikk det forønskede produkt. ;Trinn 4. Syntese av Na-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester ;Benzoylklorid ble omsatt med fenylalanin i en NaOH-oppløsning for dannelse av N cx-benzoylfenylalanin (Bz-Phe) som beskrevet i J. Biol. Chem., 138, 627-629 (1941). Bz-Phe ble omsatt med overskudd N-hydroksysuccinimid under anvendelse av MA-metoden. Det resulterende produkt ble deretter omsatt med produktet fra trinn 3 for dannelse av tittelforbindelsen. ;Trinn 5. Syntese av N cx -[ 3-( N cx- benzoyl- L- fenylalanyltio)-2- D- metylpropanoyl]- L- prolin ;Ovennevnte produkt ble syntetisert ved å fjerne t-butylestergruppen fra produktet fra trinn 4 ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel I, trinn 6(A)(ii). ;III. ;Trinn 1. Syntese av 3- benzoyloksykarbonyltio- 2- metylpropionsyre Ved å bruke benzyltioformat istedenfor Na-benzoyl-L-tiofenylalanin i eksempel I, trinn 4 og bruke den der angitte fremgangsmåte, ble ovennevnte produkt fremstilt. ;Trinn 2. Oppløsning til 3- benzoyloksykarbonyltio- 2- D- metylpropionsyre ;Ovennevnte produkt ble fremstilt ved å oppløse produktet fra trinn 1 ved hjelp av utkrystallisering som et salt eller ved væskekromatografi. ;Trinn 3. Syntese av N°-[ 3-( benzyloksykarbonyltio)- 2- D- mety1-propanoyl]- L- prolin- t- butylester ;Ved å bruke produktet fra trinn 2 istedenfor 3-(Na<->benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i metode I, trinn 6(A) ;(i) og bruke den der angitte fremgangsmåte, fikk man frem- ;stilt tittelproduktet.;Trinn 4. Syntese av Na-( 3- merkapto- 2- D- metylpropanoyl)- L- prolin Produktet fra trinn 3 ble suspendert i anisol og omsatt med HBr i eddiksyre i i time ved romtemperatur. Etyleter ble tilsatt blandingen og avkjølt til 0°C i en time. Bunnfallet ble frafiltrert og vasket flere ganger med vannfri eter. Det forønskede produkt ble tørket i vakuum over NaOH-pellets og P2^5*

Trinn 5. Syntese av N cx -[ 3- N cx-( benzoyl- L- fenylalanyltio)- 2- D-mety lpropanoyl]- L- prolin

Tittelproduktet ble oppnådd ved omsetning av produktet fra trinn 4 med benzoylklorid og ved deretter vesentlig å følge fremgangsmåten i metode eksempel I, trinn 4 ovenfor.

IV.

Trinn 1. Syntese av 3- acetyltio- 2- metylpropionsyre- o- nitro-benzylester 10 mmol 3-acetyltio-2-metylpropionsyre i 2-fluor-1,3,5-tri-nitrobenzen (FTNB) ble tilsatt en oppløsning av 10 mmol o-nitrobenzylalkohol i FTNB under omrøring ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble omrørt i li time, og oppløsnings-midlet fjernet ved fordampning, hvorved man fikk tittelproduktet .

Trinn 2. Oppløsning av 3- acetyltio- 2- D- metylpropionsyre- o-nitrogenzylester

Produktet fra trinn 1 ble optisk oppløst ved å bruke væskekromatografi, hvorved man fikk tittelproduktet.

Trinn 3. Syntese av 3- acetyltio- 2- D- metylpropionsyre Produktet fra trinn 2 ble belyst ved hjelp av lys med en belysning på 350 nm som beskrevet i J. Am. Chem. Soc. 9 7, 1575 (1975).

Trinn 4. Syntese av N CX-( 3- acetyltio- 2- D- metylpropanoyl)- L- -

prolin- t- butylester

Ved å bruke produktet fra trinn 3 istedenfor 3-(N<Q->benzoyl-L-fenylalanyltio)-2-D-metylpropionsyre i metode I, trinn 6(A)(i) og bruke den der angitte fremgangsmåte, fikk man fremstilt tittelproduktet.

Trinn 5. Syntese av N cx-( 3- merkapto- 2- D- metylpropanoyl)- L-prolin- t- butylester

Produktet fra trinn 4 ble oppløst i en blanding av konsentrert ammoniakk, metanol og anisol. Etter en time ble opp-løsningsmidlet fjernet under redusert trykk, og resten utkrystallisert fra benzen og heksan og man fikk fremstilt tittelproduktet.

Trinn 6. Syntese av N cx -[ 3-( N cx- benzoy1- L- fenylalanyltio)- 2-D- metylpropanoyl]- L- prolin- t- butylester Tittelproduktet ble oppnådd ved omsetning av produktet fra trinn 5 med benzoylklorid og deretter ved vesentlig å følge fremgangsmåten angitt i eksempel I, trinn 4 ovenfor.

Trinn 7. Syntese av N0-[ 3-( Na- benzoyl- L- fenylalanyltio- 2- D-metylpropanoyl]- L- prolin

t-butylestergruppen ble fjernet fra produktet i trinn 6 ved å bruke fremgangsmåten fra metode I, trinn 6(A)(ii) noe som ga tittelproduktet.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvor R er hydrogen, t-butyloksykarbonyl, cyklopentankarbonyl-L-lysyl, pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-lysyl, L-arginyl, pyro-L-glutamyl eller R', hvor R <1> er formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, fenylacetyl, fenylpropanoyl, benzoyl eller cyklopentankarbonyl; A er fenylalanyl, alanyl, tryptofyl, tyrosyl, glycyl, isoleucyl, leucyl, histidyl eller valyl, idet cc-aminogruppen deri er i. amidbinding med R; R^ er hydrogen eller metyl; n er 0 eller 1, slik at når n er 0, er R^ metyl, og når n er1 og R^ er metyl, er gruppen

i D-konfigurasjonen; og R2 er L-prolyl, L-3,4-dehydroprolyl, D,L-3,4-dehydroprolyl, L-3-hydroksyprolyl, L-4-hydroksyprolyl, L-tiazolidin-4-karboksylsyre eller L-5-oksoprolyl, idet iminogruppen deri er i imidbinding med den tilstøtende

karakterisert ved at man omsetter en forbindelse med formelen:

hvor R^ , R2 og n har den ovenfor angitte betydning, med en forbindelse med formelen:

hvor R og A har den ovenfor angitte betydning.