NO168306B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av en inhibitor forangiotensin-omdannende enzym - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av en inhibitor for angiotensin-omdannende enzym for bruk ved behandling av høyt blodtrykk.

Angiotensin-omdannende enzym (peptidyldipeptidhydrolase, i det følgende betegnet ACE) opptar en sentral rolle innen fysiologien for hypertensjon. Enzymet kan omdanne dekapeptidet angiotensin I, som har sekvensen

AspArgValTyrIleHi sProPheHi sLeu

til et oktapeptid, angiotensin II, ved fjerning av karboksy-termlnalgruppen HisLeu. Symbolene for de forskjellige kjemiske del-grupperinger forklares i nedenstående tabell.

Ala - L-alanin

Arg = L-arginin

Asp - L-aspartinsyre

< Glu - pyro-L-glutaminsyre

Gly ■= ,glycin

Hip - Hippursyre (benzoyl-glycin)

His - L-histidin

Ile - L-isoleucin

Leu - L-leucin

Phe - L-fenylalanin

Pro « L-prolin

A Pro - L-3,4-dehydroprolin

Ser - L-serin

Trp - L-tryptofan

Tyr - L-tyrosin

Val - L-valin

ACE - Angiotensin-omdannende enzym

Hepes - N-2-hydroksyetylpiperazin-N<*->2-etansulfonsyre Angiotensin I dannes ved innvirkning av enzymet renin, en endopeptidase som finnes i nyren, andre vev og plasma, og som virker på et serum ot-2-globulin.

Blodtrykket påvirkes av visse peptider som finnes i blodet. Et av disse, angiotensin II, er et kraftig pressorstoff (blodtrykksforhøyende middel). Et annet, bradykinin, et nonapeptid med sekvensen ArgProProGlyPheSerProPheArg er et kraftig depressorstoff (blodtrykkssenkende middel). I tillegg til en direkte pressorvirkning stimulerer angiotensin II frigjøring av aldosteron som har tendens til å forhøye blodtrykket ved å forårsake retensjon av ekstracellulære salter og fluider. Angiotensin II finnes i målbar mengde i blodet hos normale mennesker. Det finnes imidlertid i forhøyede konsentrasjoner i blodet hos pasienter med renal hypertensjon.

Nivået for ACE-aktivitet er vanligvis i overskudd, hos både normale og hypertensive mennesker, i forhold til en mengde som er nødvendig for å opprettholde observerte nivåer av angiotensin II. Det er imidlertid funnet at betydelig blodtrykkssenkning oppnås hos hypertensive pasienter ved behandling med ACE-inhibitor. [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med., 291, 817 (1974 )].

ACE er en peptidyldipeptidhydrolase. Den katalyserer hydrolysen av den nest siste peptidbinding ved C-terminalenden i en rekke acylerte tripeptider og større polypeptider med en ublokkert a-karboksylgruppe. Virkningen av ACE resulterer i hydrolytisk spalting av den nest siste peptid-bindingen fra karboksyl-terminalenden og gir som reaksjons-produkter et dipeptid og en rest.

Eeaktiviteten til enzymet varierer betydelig avhengig av substratet. Minst en type peptidbinding, som har nitrogen-atomet supplert med prolin, blir ikke hydrolysert i det hele tatt. Den tilsynelatende Michaelis-konstant (Km) varierer fra substrat til substrat over flere størrelsesordner. Med hensyn til en generell omtale av de kinetiske parametre for enzymkatalyserte reaksjoner skal det vises til Lehninger, A., Biochemistry, 2. utgave, Worth Publishers, Inc., New York, 1975, sidene 189-195. Mange peptider som er betegnet inhibitorer for den enzymatiske omdannelse av angiotensin I til angiotensin II er i virkeligheten substrater som har en lavere Km-verdi enn angiotensin I. Slike peptider er mer korrekt betegnet konkurrerende substrater. Eksempler på konkurrerende substrater er bradykinin, og peptidet BPP5a (også betegnet SQ20475) fra slangegift, hvis sekvens er

<GluLysTrpAlaPro.

Flere syntetiske peptidderivater har vist seg å være ACE-inhibitorer av Ondetti et al. i US patent 3.832.337.

Den rolle ACE spiller i patogenesen av hypertensjon har tilskyndet en forskning etter inhibitorer av enzymet som kan virke som antlhypertensive legemidler. Se f.eks. US patenter 3.891.616, 3.947.575, 4.052.511 og 4.053.651. En meget effektiv inhibitor, med høy biologisk aktivitet ved oral administrasjon, er D-3-merkapto-2-metylpropanoyl-L-prolin, betegnet S014225, beskrevet i US patent 4.046.889, og i vitenskapelige artikler av Cushman, D.W., et al., Biochemistry, 16, 5484 (1977 ), og av Ondetti, M. , et al., Science, 196, 441 (1977). Inhibitoren SQ14225 er rapportert å ha en l5ø-verdi på 2,3 x 10~<®>M. 150-verdien rapportert av Cushman et al., er konsentrasjonen av inhibitor som skal til for å gi 505É inhibering av enzymet ved et standard prøvesystem inneholdende substratet ved et nivå vesentlig over Km. Det vil forstås at 150-verdier er direkte sammenlignbare når alle potensielle faktorer som påvirker reaksjonen holdes konstant. Disse faktorer inkluderer kilden for enzym, dets renhet, substratet som anvendes og dets konsentrasjon, og sammen-setningen av prøvebufferen. Alle Isø-data som er rapportert heri er oppnådd med det samme prøvesystem og samme enzym (menneskeurin ACE) og med et omtrentlig V4 Km-nivå av substratet og er derfor i seg selv ensartet. Uoverensstemmelser med data oppnådd av andre forskere kan observeres. Og slike uoverensstemmelser eksisterer virkelig 1 littera-turen av ukjente grunner. Se f.eks. I50-verdiene for BPP()a rapportert av Cushman, D.W., et al., Experientia, 29, 1032

(1973) og av Dorer, F.E., et al., Biochlm. Blophys. Acta, 429, 220 (1976).

Virknlngsmåten til S014225 har blitt basert på en modell av det aktive sted 1 ACE utviklet gjennom analogi med det bedre kjente beslektede enzym, karboksypeptidase A. Det aktive sted ble postulert å ha et kationisk punkt for binding av karboksyl-endegruppen i substratet og en lomme eller spalte som kunne binde sidekjeden i C-terminal aminosyren og gi en særlig fast binding for den heterocykliske ring i en terminal prolinrest. En lignende lomme for den nest siste aminosyre-rest ble postulert, og de publiserte data foreslo en temmelig streng sterisk betingelse, siden D-formen for inhibitoren var mer vesentlig virkningsfull enn dens stereoisomer eller 3-metyl- og usubstituerte analoger. Sulfhydrylgruppen i inhibitoren, som er postulert å være bundet ved det aktive sted nær det katalytiske senter, ble antatt å spille en sentral rolle ved inaktivering av enzymet ved å kombinere med sinkdelen som er kjent for å være vesentlig for katalytisk aktivitet. Substituenter på sulfhydrylgruppen, slik som en metylgruppe, og et S-acetylderivat, reduserte i vesentlig grad inhibitorens virkningsgrad. Se Cushman, D.W. , et al., Biochemistry, som nevnt ovenfor.

In vitro-studier av mekanismen ved hjelp av hvilken SQ14225 og dens analoger virker for å inhibere ACE har vært noe vanskeliggjort av ustabiliteten til disse molekyler under omgivende betingelser. Det er f.eks. observert at en frisk vandig oppløsning med konsentrasjon, f.eks. 1 mg pr. ml SQ14225 ved en pH-verdi på ca. 8, blir vesentlig mindre aktiv ved henstand i så kort tid som 30 minutter, og at aktiviteten fortsetter å avta etter henstand av oppløsningen i lengre tidsrom. Det antas at dette aktivitetstap hovedsakelig er resultatet av dimerisering av SQ14225 som forekommer ved sulfhydrylendegruppene hvorved det dannes et disulfld som overveiende er Inaktivt som en Inhibitor. Siden den frie sulfhydrylgruppen er meget reaktiv og lett kan oksyderes til polare sure grupper slik som sulfon- og sulfoksydgrupper, kan det også være at det observerte in vitro-tap av aktivitet i vandige oppløsninger av SQ14225 ved henstand i en viss grad er en følge av en eller flere slike oksydasjonsreaksjoner, med dannelse av en sulfon eller sulfoksyd som ikke virker effektivt 6om en inhibitor for ACE.

Slike rapporter om S014225-klinisk testing som er tilgjengelige, og hvorav noen viser til forbindelsen under betegnelsen "Captopril", foreslår at produktet er tilstrekkelig stabilt i de normale mage- og tarmmiljøer hos de fleste pasienter for å være en effektiv inhibitor for ACE ved oral administrasjon. Det er imidlertid ikke klart om det kan være en gruppe pasienter for hvilke S014225 er vesentlig ineffektiv. På grunn av den høye reaktivitet til den frie sulfhydrylgruppen, kunne S014225 lett danne blandede disulfider med serum, cellulære proteiner, peptider eller andre fri sulfhydryl-gruppeholdige stoffer 1 mage- eller tarmkanalen, i tillegg til muligheten for reaksjoner med dimerdannelse eller oksydativ nedbrytning. Et blandet disulfld med protein kan være antigenisk og det er slik at man av og til klinisk har observert allergiske reaksjoner, se Gavras, et al., New England J. Med., 298, 991 (1978). Disulfider og oksydative nedbrytningsprodukter av S014225 kan, hvis de dannes, i beste fall forventes å være overveiende ineffektive som inhibitorer. Det kan følgelig postuleres at doseresponsen til S014225 kan variere med adminlstrasjonsbetingelser og blant enkeltpasienter. Dessuten, kan det i det minste hos noen pasienter oppstå uønskede bivirkninger og opprettholdelse av en effektiv konsentrasjon av inhibitoren i kroppen kan være vanskelig å regulere.

Tioesterforbindelser antas generelt å være meget reaktive fordi tioester-blndingen er lett hydrolyserbar til en sulfhydryldel og en karboksyllsk del. Tloestere anvendes følgelig ofte som aktive ester-mellomprodukter for acylerlng under milde betingelser. Slike grupper som f.eks. acetyltlo har blitt benyttet som blokkerende grupper 1 de ovennevnte patenter. Det er også postulert at tioester-mellomprodukter forekommer 1 biosyntesen av cykliske peptider slik som tyrocldln eller gramlcldln S, kfr. Llpamnn, F. 1 Accounts Chem. Res., 6, 361 (1973).

Tioesterforbindelser med virkningsfull ACE-lnhlberende aktivitet og oral effektivitet som anti-hypertensive midler, er beskrevet i US patentene 4.695.585; 4.698.355, 4.707.490 og 4.777.298.

Forbindelser som er beslektet med S014225 er beskrevet av Ondetti, et al., i US patentene 4.046.889, 4.052.511, 4.053.651,5.113.715 og 5.154.840. Av interesse beskrives analoger av SQ14225 som har den 5-leddede heterocykliske ring i prolin erstattet med en 4- eller 6-leddet ring. De inhiberende virkninger til slike analoger 1 forhold til S014225 er ikke beskrevet. Bruk av D-prolin i stedet for L-prolin er rapportert drastisk å redusere den inhiberende virkningsgrad til 3-merkaptopropanoylaminosyrer (Cushman, D.W., et al., supra).

Bruk av L-3,4-dehydroprolin i stedet for prolin har blitt studert i flere systemer. Substitusjon av L-3,4-APro i 7—stillingen i bradykinin gir et bradykininderivat som har betydelig redusert fysiologisk aktivitet, kfr. Fisher, G.H., et al., Arch. Biochem. Biophys., 189, 81 (1978). På den annen side vil substitusjon av L-3,4-APro ved 3-, 5-, 8- eller 9-stillingen i ACE-inhibitor BPPga fremme dens inhiberende aktivitet, kfr. Fisher, G.H. et al., FEBS Letters, 107, 273

(1979). I US patent 4.707.490 har man funnet at forbindelsene som har APro, som er beskrevet i nevnte søknad, har høy inhiberende virkningsgrad og anti-hypertensiv effektivitet. I øyeblikket kan det imidlertid ikke gis noen logisk begrun-nelse på forskjel1igartetheten i observerte resultater etter innsettelse av APro i stedet for prolin. Man har likeledes intet klart bilde av virkningene til andre prolinderivater eller analoger substituert ved forskjellige steder på ACE-inhibltorer.

Hittil har virkningen av aminosyren til venstre for svovel-atomet i tioesterforbindelsene beskrevet i inngitte søknader, ikke blitt bestemt. Det antas at denne aminosyren virker som et ekstra gjenkjennelsessted for enzymet. Dersom dette er tilfelle, ville det forventes at en forbindelse med en aminosyre her ville være en bedre inhibitor. Man har funnet at mange aminosyrer, substituerte aminosyrer eller analoge forbindelser kan anvendes for A i nedenstående formel I for tilveiebringelse av effektive anti-hypertensive midler og effektive inhibitorer for ACE. Det skal her vises til US patent 4.734.420. Man har funnet at hydroksyprolinene, prolin, L- og D,D-3,4-dehydroprolin, tiazolidin-4-karboksyl-syre og L-5-oksoprolinderivater alle er effektive antlhypertensive midler og har høy inhiberende virkning for ACE.

I US patenter 4.698.355, 4.692.459, 4.707.490 og 4.777.298 har man funnet at forbindelser med formel I var effektive anti-hypertensive midler og har høy inhiberende virkning for ACE. Ved tidspunktet for inngivelse av disse søknader hadde man ikke undersøkt noen salter av disse forbindelser og visste således ikke om saltene ville være.effektive. Man har nå fremstilt salter av disse forbindelser og har bestemt at de er effektive anti-hypertensive midler og kraftigvirkende inhibitorer for ACE.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles nye inhibitorer for angiotensin-omdannende enzym for bruk ved behandling av høyt blodtrykk, og disse har den generelle formel:

hvor R er hydrogen, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, benzoyl, cyklopentylkarbonyl, tert.-butyloksykarbonyl, cyklopentylkarbonyl-L-lysyl eller pyro-L-glutamyl,

Å er L-fenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptofyl, L-isoleucyl, L-leucyl eller L-valyl, hvor a-amlnogruppen er 1 amidbinding med R, forutsatt at fenylalanyl er racemlsk når R er benzoyl,

Ri er hydrogen eller metyl,

R2 er L-prolln, L-3,4-dehydroprolln eller D,L-3,4-dehydro-prolin, hvor imlnogruppen er i lmldblndlng med tilstøtende

>O0-gruppe, og

n er 0 eller 1, idet når n ■= 0, så er Ri metyl,

og farmasøytisk akseptable salter derav.

Disse forbindelsene med formel I fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at

1) en forbindelse med formelen:

omsettes med R2 for oppnåelse av en forbindelse med formelen: i hvilke formler R3 er acetyl, og R^, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, 2) fra den i trinn 1) oppnådde forbindelse fjernes R3, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: 3) den i trinn 2) oppnådde forbindelse omsettes med en forbindelse med formelen R-A-OH, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen:

hvor R, A, Ri, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger,

og, om ønsket, omdanner en oppnådd forbindelse til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Det er foretrukket at reaksjonen i trinn 1) utføres enten i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol eller dicykloheksylkarbodiimid, og reaksjonen i trinn 3) utføres i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol.

Videre er det foretrukket at R2 i trinn 1) også har en beskyttelsesgruppe for karboksyl, som fjernes i trinn 2). Videre er det foretrukket at R er benzoyl, A er fenylalanyl, Ri er metyl, R2 er prolin og n er 1.

Alle de ovenfor angitte forbindelser er inhibitorer for ACE og er nyttige som oralt effektive anti-hypertensive midler.

Salter av forbindelser med formel I

Forbindelser med formel I danner basiske salter med forskjellige uorganiske og organiske baser. Slike salter inkluderer ammoniumsalter, alkalimetallsalter, jordalkali-metallsalter, salter med organiske baser, salter med aminosyrer og lignende. Eksempler på alkalimetallsalter er natrium- eller kaliumsaltene. Eksempler på jordalkalimetall-salter er kalsium- eller magnesiumsaltene. Eksempler på organiske basesalter er benzatin-, N-metyl-D-glukamin- eller hydrabaminsaltene. Eksempler på aminosyresalter er arginin og lysin. Natrium-, kalium- og lysinsaltene er foretrukne. Likeledes er ikke-toksiske, fysiologisk akseptable salter foretrukket.

Saltene dannes ved omsetning av den frie syren av forbindelsene med formel I med en ekvivalent av den egnede basen som gir det ønskede kation i et oppløsningsmiddel eller medium i hvilket saltet er uoppløselig, eller i vann og fjerning av vannet ved frysetørking.

Saltene som fremstilles ifølge oppfinnelsen inhiberer omdannelsen av dekapeptidet angiotensin I til angiotensin II og er derfor nyttig ved reduksjon eller lindring av angiotensin-relatert hypertensjon. Virkningen av enzymet renin på angiotensinogen, et pseudoglobulin i blodplasma, produserer angiotensin I. Angiotensin I omdannes av angiotensin-omdannende enzym (AE) til angiotensin II. Det sistnevnte er et aktivt pressorstoff som har blitt implisert som det kausative middel i forskjellige former for hypertensjon i forskjellige pattedyrarter, f.eks. rotter og hunder. Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse griper inn i angiotensinogen (<renln.>) angiotensin I ^ACEJ angiotensin II-sekvensen ved å inhibere angiotensin-omdannende enzym og redusere eller eliminere dannelsen av pressorstoffet angiotensin II. Ved administrasjon av et preparat inneholdende ett eller en kombinasjon av salter av forbindelsene med formel I, vil angiotensinavhengig hypertensjon i pattedyrartene som lider under en slik tilstand bli dempet. En enkelt dose, eller fortrinnsvis to eller fire oppdelte daglige doser, tilveiebragt på en basis av fra 0,1 til 100 mg pr. kg pr. dag, fortrinnsvis 1-50 mg pr. kg pr. dag, er passende når det gjelder å redusere blodtrykk som angitt i dyremodellforsøkene beskrevet av S.L. Engel, T.R. Schaeffer, M.E. Waugh og B. Rubin, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 143

(1973). Stoffet blir fortrinnsvis administrert oralt, men parenterale veier slik som subkutant, intramuskulært, intravenøst eller intraperitonealt kan også anvendes.

Saltene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for oppnåelse av en blodtrykksreduksjon ved inkorporering i preparater slik som tabletter, kapsler eller eliksirer for oral administrasjon eller i sterile oppløs-ninger eller suspensjoner for parenteral administrasjon. Omkring 10-500 mg av et salt eller en blanding av salter av forbindelsene med formel I sammenblandes med en fysiologisk akseptabel bærer, eksipient, bindemiddel, preserverings-middel, stabiliseringsmiddel, smaksstoff, osv., i en enhetsdoseform ifølge akseptert farmasøytisk praksis. Mengden av aktivt stoff i disse preparater er slik at en passende dose I det angitte området oppnås.

Som illustrasjon på hjelpestoffer som kan inkorporeres i

tabletter, kapsler og lignende, kan følgende angis: et bindemiddel slik som tragantgummi, akacia, maisstivelse eller gelatin; et hjelpestoff slik som dikalsiumfosfat; et disintegreringsmiddel slik som maisstivelse, potetstivelse, alginsyre og lignende; et smøremiddel slik som magnesium-stearat; et søtningsmiddel slik som sukrose, laktose eller sakkarin; et smaksstoff slik som peppermynte, olje av vintergrønn eller kirsebær. Når doseringsenhetsformen er en kapsel, kan den i tillegg til de ovenfor angitte materialer Inneholde en væskeformig bærer slikk som fettolje. Forskjellige andre materialer kan være til stede som belegg eller for på annen måte å modifisere doserlngsenhetens fysiske form.

Tabletter kan f.eks. belegges med skjellakk, sukker eller begge deler. En sirup eller eliksir kan inneholde den aktive forbindelse, sukrose som søtningsstoff, metyl- og propyl-parabener som preservativer, et fargestoff og et smaksstoff slik som kirsebær- eller appelsinsmak.

Sterile preparater for injeksjon kan formuleres ifølge konvensjonell farmasøytisk praksis ved oppløsning eller suspensjon av det aktive stoff i en bærer slik som vann for injeksjon, en naturlig forekommende vegetabilsk olje slik som sesamolje, kokosolje, peanøttolje, bomullsfrøolje, osv., eller en syntetisk fettbærer slik som etyloleat eller lignende. Buffere, preservativer og lignende kan inkorporeres etter behov.

Oppfinnelsen vil bli bedre forstått under henvisning til de følgende spesifikke eksempler som beskriver detaljer ved syntesen og brukseffektiviteten til de ovennevnte forbindelser. I disse eksemplene ble det benyttet tynnsjiktskromatografi (TLC) under anvendelse av si 1isiumdioksydgelplater. De numeriske oppløsningsmiddelsystemer benyttet i TLC-metodene er som følger: (1) er metanol :kloroform, 1:1 (volumdeler ). (2) er benzen: vann: eddiksyre , 9:1:9 (volumdeler). (3) er eddiksyre: vann: n-butanol 26:24:150 (volumdeler). (4) er n-buta-nol :pyridin:eddiksyre: vann , 15:10:3:12 (volumdeler). (5) er kloroform:metanol:ammoniumhydroksyd, 60:45:20 (volumdeler). Bufrene fra papirelektroforese var: pH 1,9 - maursyre:eddiksyre:vann, 3:2:25 (volumdeler); pH 5,0 - dietylen- glykol:eddiksyre:pyridin:vann, 100:6:8,5:885 (volumdeler). Tert-butyloksykarbonyl-, benzoyl-, acetyl-, formyl-, propanoyl-, butanoyl-, fenylacetyl- og fenylpropanoyl-derivatene av aminosyrene er kommersielt tilgjengelige.

Eksempel 1

ACE- aktlvitetsbestemmelse

For de fleste av de beskrevne forsøk ble enzymet bestemt i 0.05M Hepes-buffer, pH 8,0 inneholdende 0,1M NaCl og 0,75M Na2S04. Det benyttede substrat var benzoyl-GlyHis-Leu ved en sluttkonsentrasjon på 1 x 10"<4>M, (Km x 2 x 10~<4>M), sammen med ca. 130.000 cpm av [3H]benzoylGlyHisLeu (25 Ci/mmol). Enzymet ble fortynnet i den ovenfor angitte buffer slik at 40 pl bufret enzym kunne hydrolysere 1356 substrat ved en 15 minutters inkubasjon ved 37<*>C. For å initiere prøvebestem-melsen ble 40 pl enzym og 10 pl vann eller inhibitor oppløst i vann preinkubert i 5 minutter ved 37°C. Substrat, 50 pl, ble deretter tilsatt for å initiere reaksjon og oppløsningen ble inkubert i 15 minutter ved 37° C. For å avslutte reaksjonen ble 1 ml 0,1M HC1 tilsatt, hvoretter 1 ml etylacetat ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i en rotasjonsblander og kort sentrifugert for å separere fasene.

En aliquot, 500 pl, av etylacetatlaget ble overført til en væskescinti1lasjonsprøveflaske inneholdende 10 ml "Riafluor". For bestemmelse av 150-verdier ble enzymaktivitet i nærvær av inhibitor ved en rekke forskjellige konsentrasjoner sammen-lignet med aktiviteten i fravær av inhibitor. En grafisk fremstilling av inhibitorkonsentrasjon mot % inhibering ga <1>50-verdier.

Eksempel 2

Syntese av 3- acetvltiopropanovl- L- prolin- t- butvlester

3-acetyltiopropansyre, 0,865 g, ble oppløst i 2 ml redestillert tetrahydrofuran (THF) og avkjølt til 0°C. En avkjølt oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid, 1,2031 g i 2 ml THF ble tilsatt, hvoretter en avkjølt oppløsning av L-prolin-t-

butylester, 1 g, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0<*>C 1 1 time og deretter ved 4<*>C natten over. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert, og bunnfallet vasket med etylacetat. Oppløsningsmidler i filtratene ble fjernet under redusert trykk i en rotasjonsfordamper. Resten le oppløst i etylacetat som deretter ble vasket tre ganger med kald IN sitronsyre, to ganger med mettet NaCl, to ganger med kald IN NaHCC<3 og tre ganger med mettet NaCl. Oppløsningen ble tørket over vannfritt MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk i en rotasjonsfordamper ved 30<*>C, hvilket ga et klart, fargeløst oljeaktig produkt i et utbytte på omtrent 87#. Produktet migrerte som en enkelt flekk ved tynnsjiktskromatografi i fem oppløsningsmiddel-systemer.

Eksempel 3

Syntese av 3- merkaptopropanovl- L- prol in

Produktet fra eksempel 2, 3-acetyltiopropanoyl-L-prolin-t-butylester, 0,5 g, ble blandet med 4,5 ml 5, 5N metanolisk ammoniakk ved romtemperatur under nitrogen i 1 time for å fjerne acetylgruppen. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet ved 25°C i en rotasjonsfordamper. Etter at produktet var opptatt i metanol og inndampet to ganger til i rotasjonsfordamperen, ble den klare oljeaktige rest oppløst i etyleter, vasket to ganger med 5% kaliurobisulfat og en gang med mettet NaCl, tørket over MgS04 og filtrert. Det rester-ende oppløsnlngsmiddel ble fjernet i vakuum, hvilket ga et klart oljeaktig produkt, som migrerte som en enkelt flekk ved tynnsjiktskromatografi i tre separate oppløsnlngsmiddel-systemer. Den t-butylester-beskyttende gruppe ble fjernet ved omsetning med trifluoreddiksyre i anisol.

Eksempel 4

Ved å benytte 2-acetyltlopropansyre, i stedet for 3-acetyltiopropansyre i eksempel 2 og ved vesentlig å følge metodene i eksemplene 2 og 3, oppnås 2-merkaptopropanoyl-L-prolin. Ved å fjerne den t-butylester-beskyttende gruppen med trifluoreddiksyre i anisol som et første trinn, kan dicykloheksyl-aminsaltet dannes for å hjelpe spaltingen av isomerer. Den acetyl-beskyttende gruppe kan fjernes i et annet trinn under anvendelse av metanolisk ammoniakk, som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 5

Syntese av 3- merkapto- 2- metvl- propanovl- L- 3- hvdroksvprolin L-3-hydroksyprolin, 1 mmol, oppløses i DMF, og oppløsningen avkjøles til -15*C. Oppløsningen nøytraliseres ved tilsetning av 1 ekvivalent N-etylmorfolin. I en separat reaksjons-beholder ved -10"C blandes en ekvivalent 3-acetyltio-2-metyl-propansyre i et like stort volum DMF med 1,1 ekvivalent av 1,1'-karbonyldiimidazol, og oppløsningen omrøres i 1 time.Den første oppløsning inneholdende L-3-hydroksyprolin blandes med den andre inneholdende 3-acetyltio-2-mertylpropansyre under opprettholdelse av temperaturen ved —10°C. Den kombinerte oppløsning omrøres i 1 time ved -10"C. Oppløsningen får deretter oppvarmes langsomt til romtemperatur. Oppløsnings-midlet fjernes i en rotasjonsfordamper under redusert trykk ved 40<*>C. Etylacetat (25 ml) tilsettes, og oppløsningen avkjøles til 0°C. 2 ml IN sitronsyre tilsettes, de to fasene blandes og får deretter skille seg. Fasene separeres med en skilletrakt, og den organiske fasen vaskes to ganger til med 2 ml IN sitronsyre, to ganger med mettet NaCl og tørkes til slutt over vannfritt MgS04. MgS04 fjernes ved filtrering, og oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper. Resten oppløses i og omkrystalliseres fra et ikke-polart oppløs-nlngsmiddel slik som benzen for dannelse av 3-acetyltio-2-D,L-metylpropanoyl-L-3,4-hydroksyprolin. Når 2-D-metyl-isomeren ønskes, blir resten oppløst i acetonitril (omtrent 3 ml), og oppløsningen oppvarmes til 40<*>C. En ekvivalent dicykloheksylamin tilsettes, og oppløsningen hensettes ved romtemperatur natten over. Krystallene oppsamlet ved filtrering og vaskes tre ganger med acetonitril. Når ytterligere rensing er nødvendig, kan materialet omkrystalliseres fra isopropanol. Den acetyl-beskyttende gruppe kan fjernes som 1 eksempel 3.

Eksempler 6- 8

Ved å benytte D.L-3,4-dehydroprolin, L-4-hydroksyprolin eller L-tiazolidin i stedet for L-3-hydroksyprolin i eksempel 5 og ved vesentlig å følge metodene som angitt i eksempel 5, oppnås følgende forbindelser.

Eksempel 9

Ved å benytte 3-acetyltiopropansyre eller 2-acetyltiopropansyre I stedet for 3-acetyltio-2-metylpropansyre i eksemplene 5-8, oppnås likeledes D,L-3,4-dehydroprolin-, L-3-hydroksyprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tiazolidinderivatene ved i det vesentlige å følge de beskrevne metoder.

Eksempel 10

Syntese av N0t- r3-( Na- acetvl- L- fenvIalanvItio )- 2- D- metvl-propanovl"! - L- 3- hydroksyprol in

En oppløsning av Na<->acetyl-L-fenylalanin i redestillert dimetylformamid (DMF) avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved —20'C. Til denne oppløsning tilsettes det en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved —10<*>C i 2 timer og tilsettes deretter til en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i 1 ml DMF som ble nøytralisert med N-etylmorfol in. Reaksjonsblandingen omrøres ved -10*C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Oppløsnings-midlet fjernes under redusert trykk ved 40<*>C, og etylacetat tilsettes deretter til resten. Blandingen avkjøles i et isbad og vaskes med 0,1N NaCl, og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Det organiske oppløsnlngsmiddel fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved hjelp av "Sephadex LH-20<tm>"-kolonne-kromatografi under anvendelse av 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med isopropanol. Toppfraksjonene oppsamles, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket gir det ønskede produkt.

Eksempler 11 - 18

Ved å benytte Na<->acetylglycin, Na<->acetylalanin, I^-acetyl-tryptofan, ^-acetyltyrosin, Na<->acetylisoleucin, Na<->acetyl-leucin, ^-acetylhistidin eller Na<->acetylvalin i stedet for Na<->acetylfenylalanin i eksempel 10 og ved i det vesentlige å følge metoden i eksempel 10, oppnås følgende forbindelser:

Eksempel 19

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tiazolidinderivatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene i eksemplene 3-9 i stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i eksemplene 10-18 og ved 1 det vesentlige å følge metoden 1 eksempel 10.

Eksempel 20

Ved å benytte Na<->formyl-, Na<->propanoyl-, Na<->butanoyl-, Na-fenylacetyl- eller Na<->fenylpropanoylderivatene av L-Phe, Gly, L-Ala, L-Trp, L-Tyr, L-Ile, L-Leu, L-His og L-Val 1 stedet for N°-acetylderlvatene 1 eksemplene 1019 og ved vesentlig å følge metoden i eksempel 10, oppnås formyl-, propanoyl-, butanoyl-, fenylacetyl- og fenylpropanoylderlvatene.

Eksempel 21

Syntese av y^- rs- Cy^- tert- butvloksvkarbonvl- L- fenvlalanvl-tlo)- 2- D- metylpropanovl1- L- 3- hvdroksvprolln

En oppløsning av Na<->tert-butyloksykarbonyl-L-fenylalanln (Na<->Boc-L-Phe) 1 redestillert DMF, avkjøles 1 et is-tørris-acetonbad ved -20°C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldlimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved -10'C i 2 timer og tilsettes deretter til en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i DMF som nøytraliseres med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen omrøres ved —10<*>C i ytterligere 1 time og deretter langsomt oppvarmes til romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved 40"C, og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles i et isbad og vaskes med 0,1N HC1 og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04« Produktet renses ved væskekromatograf i på "Sephadex G10<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med THF:isopropanol. Toppfraksjonene oppsamles, og oppløsnings-midlet fjernes under redusert trykk, hvilket-ga det ønskede produkt.

Eksempler 22 - 29

Ved å benytte Na<->Boc-glycin, Na<->Boc-alanin, N0(-Boc-tryptofan , Na<->Boc-tyrosin, Na<->Boc-isoleucin, Na<->Boc-leucin, Na<->Boc-histidin eller Na<->Boc-valin 1 stedet for Na<->Boc-Phe 1 eksempel 21 og ved vesentlig å følge metodene 1 eksempel 21, oppnås følgende forbindelser:

Eksempel 30

D.L-3,4-dehydroprolln-, L-4-hydroksyprolln- og L-tiazolidin-derlvatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene i eksemplene 3-9 1 stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolln 1 eksemplene 21-29 og ved vesentlig å følge metoden 1 eksempel 21.

Eksempel 31

Syntese av Na- cvklopentylkarbonvl- L- fenvlalanin

En kald oppløsning av 2,06 g dicykloheksylkarbodilmid 1 10 ml diklormetan ble tilsatt til en oppløsning av 1,4114 g cyklopentankarboksylsyre i 5 ml diklormetan ved -5*C. Dette ble fulgt av tilsetning av 4,28 g L-fenylalaninbenzoylester-toluensulfonatsalt 1 10 ml DMF som ble nøytralisert med 1,36 ml N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time og deretter ved romtemperatur i 3 timer. Dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og 50 ml etylacetat ble tilsatt til filtratet. Den organiske fase ble vasket inntil nøytral tilstand, tørket over vannfritt MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra isopropanol og heksan, hvilket ga 2,35 g hvite krystaller med et smeltepunkt på 88-89'C. Elementanalyse av disse krystaller ga følgende: Beregnet: C 75,19; H 7,17; N 3,9855

Funnet: C 74,96; H 7,17; N 4,09

Benzylesteren ble fjernet ved hydrogenolyse med 2 g 10$ palladlum-på-karbon i absolutt alkohol. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og etanolen ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra eter og heksan, og dette ga 1,15 g hvite krystaller av det ønskede produkt med et smeltepunkt på 107-108°C. Elementanalyse av disse krystaller ga følgende:

Beregnet: C 68,94; H 7,33; N 5,36

Funnet: C 68,90; H 7,32; N 5,34

Produktet ble funnet å være homogent under anvendelse av papir-elektroforese ved pH 1,9 og ved pH 5,0 og under anvendelse av TLC med oppløsningsmiddelsystemer 1, 2 og 3. Det fremstilte produkt ble forkortet til Na<->cpc-L-Phe.

Eksempel 32

Syntese av N^- rs- f^- cvklopentvlkarbonvl- L- fenvlalanvltio)- 2-D- metylpropanoyl1- L- 3- hvdroksvprolln

En oppløsning av forbindelsen fra eksempel 31 i 0,5 ml redestillert DMF avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved -20*C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved -10'C i 2 timer og blandes deretter med en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i DMF som nøytraliseres med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandingen omrøres ved -10*C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved -40*C og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles og vaskes med 0,1N HC1, og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved "Sephadex LH-20<tm>"-kolonnekromatografi under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og eluert med isopropanol. Toppfraksjonene oppsamles, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket gir det ønskede produkt.

Eksempler 33 - 40

Ved å benytte benzoylestertoluensulfonatsaltene av glycin, L-alanin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-Isoleucin, L-leucin,

L-histidin eller L-valin i stedet for L-Phe-saltet i eksempel 31 og ved vesentlig å følge metodene i eksempel 31 og 32, oppnås følgende forbindelser.

Eksempel 41

D.L-3,4-dehydroprolln-, L-4-hydroksyprolln- og L-tiazolin-derlvatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene 1 eksemplene 3-12 1 stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-hydroksyprolln 1 eksemplene 32-40 og ved vesentlig å følge metoden 1 eksempel 32.

Eksempel 42

Syntese av Na-( 3- L- fenvlaIanvltlo- 2- D- metvlpropanovll- L- 3-hydroksyprolln

Produktet fra eksempel 21 behandles for å fjerne beskyttelsen ved omrøring av en blanding av produktet, anlsol og vannfri trlfluoreddiksyre (TFA) ved romtemperatur i 1 time. Anlsol og TFA fjernes under redusert trykk ved 35°C, og resten tritureres med vannfri eter. Den hvite resten renses ved vaeskekromatografi på "Sephadex G-10<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med 5# eddiksyre. Toppfraksjonene oppsamles og frysetørkes, hvilket gir 17,5 mg av det ønskede produkt.

Eksempler 43 - 50

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåten i eksempel 42 fjernes på samme måte beskyttelsen fra produktene i eksemplene 22-29, og følgende forbindelser oppnås:

Eksempel 51

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tlazolidln-derivatene oppnås på samme måte ved å fjerne beskyttelsen fra forbindelsene beskrevet 1 eksempel 30. Denne fjerning foretas ved vesentlig å følge metoden 1 eksempel 42.

Eksempel 52

Syntese av N- hvdroksvsuccinlmldesteren av cvklopentan-karboksvlsvre

En kald oppløsning av 11,4 g dicykloheksylkarbodllmld 1 DMF ble tilsatt dråpevis til en blanding av 5,71 g cyklopentankarboksylsyre og 5,76 g N-hydroksysuccinimid i DMF ved 0'C. Reaksjonsblandingen be omrørt ved 0<*>C i 30 minutter og deretter ved 4°C natten over. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og bunnfallet ble vasket med etylacetat. Oppløsningsmidler fra det kombinerte filtrat ble fjernet under redusert trykk og resten ble krystallisert fra benzen og heksan, hvilket ga 5,77 g hvite krystaller med et smeltepunkt på 72,5-73°C. Det infrarøde absorpsjonsspektrum i kloroform ga et typisk spektrum for N-hydroksysuccinimidestere. Elementanalyse av krystallene ga følgende resultater:

Beregnet: C 59,63; H 8,83; N 8,18

Funnet: C 59,74; H 8,85; N 8,24

Produktet ble vist å være homogent under anvendelse av papir-elektroforese ved pH 1,9 og 5,0 og ved benyttelse av TLC med oppløsningsmiddelsystemer 1, 2 og 3.

Eksempel 54

Syntese av Na- cvklopentvlkarbonvl- Nc- tert- butvloksvkarbonvl-L- lysin- N- hvdroksysuccinimidester

En oppløsning av 1,027 g av produktet fra eksempel 56 og 346 mg N-hydroksysucclnlmld 1 10 ml CH2C12 ble avkjølt til -5*C. Til denne oppløsning ble det under omrøring tilsatt en kald oppløsning av 680 mg dlcykloheksylkarbodllmld 1 5 ml CB^C^. Reaksjonsblandlngen ble omrørt ved CC 1 30 minutter og deretter ved 4<*>C natten over. Krystallinsk dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og ble vasket med etylacetat. Det kombinerte filtrat ble vasket to ganger med IN NaHC03, to ganger med vann og til slutt med en oppløsning av mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket over vannfritt MgS04, filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra isopropanol, hvilket ga 0,844 g hvite krystaller med et smeltepunkt på 140,5<*>C. Det infrarøde absorpsjonsspektrum i kloroform ga et typisk spektrum for N-hydroksysuccinimidestere. Elementanalyse av krystallene ga følgende:

Beregnet: C 57,39; H 7,57; N 9,56

Funnet: C 57,10; H 7,57; N 9,61

Eksempel 55

Syntese av Na- cvklopentvlkarbonvl- Nc- tert- butvloksvkarbonvl-L- lvsyl- L- fenvlalanin

En oppløsning av 220 mg av produktet fra eksempel 57 i 2 ml dioksan ble tilsatt dråpevis til en blanding av 99,1 mg L-fenylalanin og 51 mg NaH03 i en blanding av 2 ml vann og 1 ml DMF. Reaksjonsblandlngen ble omrørt ved romtemperatur natten over og dioksan ble fjernet med en rotasjonsfordamper ved 35<*>C. Etylacetat (10 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandlngen, avkjølt, surgjort til pH 2 med 0,1N HC1, og den vandige oppløsning ble kassert. Den organiske fasen ble vasket med isvann, en oppløsning av mettet NaCl og tørket over vannfritt MgSC^; og oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsfordamper. Resten ble krystallisert fra eter og petroleumeter

(kp. 30-60'C), hvilket ga 95 mg av et hvitt fast stoff med et smeltepunkt på 90-92<*>C. Produktet ble vist å være homogent under anvendelse av papirelektroforese ved pH 1,9 og ved å benytte TLC med oppløsningsmiddelsystemer 1, 2, 3 og 4. Elementanalyse ga:

Beregnet: C 63,78; H 8,03; N 8,58

Funnet: C 63,40; H 8,07; N 8,34

Eksempel 56

Syntese av Na- r3-( Na- cvklopentylkarbonyl- Nc- tert- butyloksy-karbonvl - L- ly syl - L- f en vi alanvltio )- 2- D- metylpropanoyll- L- 3-hydroksvprolin

En oppløsning av produktet fra eksempel 55 i redestillert DMF avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved 20°C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyl-dilmidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved -10°C i 2 timer og blandes deretter med en kald oppløsning av 36 mg 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i 1 ml DMF som ble nøytralisert med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandlngen omrøres ved —10°C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk ved 40°C og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles i et isvannbad og vaskes med IN sitronsyre og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsnings-midlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved "Sephadex LH-20<tm>"-kolonnekromatografi under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med THF:isopropanol, 3:7 (volumdeler). Toppfraksjonene oppsamles og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket ga det ønskede produkt som kan forkortes som NCx-[3-(Nc-cpc-N-Boc-L-Lys-L-Phe-tio )-2-D-metylpropanoyl]-L-3-hydroksyprolin.

Eksempel 57

Syntese av ^- rs- CN^- cvklopentvlkarbonvl- L- lvsvl- L- fenvl-alanvltlo )- 2- D- metvlpropanovll- L- 3- hvdroksvprolln N<c->Boc-gruppen fjernes fra lysln ved omrøring av en blanding av produktet fra eksempel 56 med anlsol og vannfritt trifluoreddiksyre (TFA) ved romtemperatur i 1 time. Anlsol og TFA fjernes under redusert trykk ved 35<*>C, og resten tritureres med vannfri eter. Resten renses ved væskekromato-grafl på "Sephadex G-10<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm kolonne og elueres med 5% eddiksyre. ToppfraksJonene oppsamles og frysetørkes, hvilket gir det ønskede produkt som kan forkortes som Na<->[3-(Na<->cpc-L-Lys-L-Phe-tio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-3-hydroksyprolin.

Eksempler 58 - 65

Ved å benytte glycin, L-alanin, L-tryptofan, L-tyrosin, L—isoleucin, L-leucin, L-histidin eller L-valin 1 stedet for L-fenylalanin i eksempel 55 og ved i det vesentlige å følge fremgangsmåtene i eksemplene 55, 56 og 57, oppnås følgende forbindelser:

65 N<0->[3-(Na<->cyklopentylkarbonyl-L-lysyl-L-alanyl-tio )-2-D-metylpropanoyl]-L-3-hydroksyprolin

Eksempel 66

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolin- og L-tiazolidinderivatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene fra eksemplene 3-9 i stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i eksemplene 56 og 58-65, og ved vesentlig å følge fremgangsmåtene i eksemplene 56 og 57.

Eksempel 67

Fremstilling av NQ. Nc- bls- t- butvloksvkarbonvl- L- lvsvl- L-fenvlalaninbenzvlester

En oppløsning av N<a>,N<c->t-butyloksykarbonyl-L-lysin (i det følgende bis-Boc-L-Lys), L-fenylalaninbenzylestertoluen-sulfonsyre og N-etylmorfolin i DMF og diklormetan, avkjøles i et isbad under omrøring. En oppløsning av 0,826 g dicykloheksylkarbodiimid i 2 ml diklormetan tilsettes til den ovenfor angitte reaksjonsblanding. Reaksjonsblandlngen omrøres i et Isvannbad i 1 time og deretter ved romtemperatur natten over. Dicykloheksylurea fjernes ved filtrering, og produktet vaskes i etylacetat. Oppløsningsmidlene i de kombinerte filtrater fjernes under redusert trykk med en rotasjonsfordamper ved 40'C. Etylacetat (25 ml) tilsettes til resten, og den organiske oppløsning vaskes inntil nøytral tilstand. Den organiske fasen tørkes over vannfritt MgS04, filtreres og deretter fjernes oppløsningsmidlet med en rotasjonsfordamper. Materialet krystalliseres fra isopropanol og eter, utbytte 1,01 g av hvite nåler, smp. 103-104,5<0>C. Materialet er homogent på alle TLC- og elektroforesesystemer. Elementanalyse ga:

Beregnet: C 68,84; H 6,05; N 7,64

Funnet: C 68,58; H 6,05; N 7,56

Eksempel 68

Fremstilling av Na. Nc- bls- t- butvloksvkarbonvl- L- lvsvl- L-fenvlalanln

De benzoylester-beskyttende gruppe på forbindelsen 1 eksempel 67 fjernes ved katalytisk hydrogenolyse med lOSt (ved vekt) Pd-på-karbon 1 Iseddlk og 15 ml etanol ved 1,4 kg/cm<2> H2 ved romtemperatur natten over. Katalysatoren fjernes ved filtrering. Oppløsnlngsmiddel fjernes med en rotasjonsfordamper. Materialet krystalliseres fra isopropanol og benzen.

Eksempel 69

Frems11Iling av Na- f 3- Na. Nc- b i- butvloksvkarbonvl- L- lvsvl- L-fenvlalanvltio)- 2- D- metvlpropanovl" l - L- prolln

En oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i 1,0 ml DMF tilsettes til en oppløsning av produktet i eksempel 68 i DMF ved -15°C. Reaksjonsblandlngen omrøres ved -10°C i 1 time og deretter tilsettes en blanding av 3-merkapto-2-D-metyl-propanoyl-L-prolin og N-etylmorfolin i DMF. Reaksjonsblandlngen omrøres ved -10°C i ytterligere 1 time og oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. DMF ble fjernet under redusert trykk med en rotasjonsfordamper ved 40'C og 7 ml etylacetat og 2 ml IN sitronsyre tilsettes deretter, Den organiske fase vaskes to ganger med IN sitronsyre og to ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen tørkes over vannfritt MgS04 og filtreres deretter. Oppløs-nlngsmiddel fjernes under anvendelse av en rotasjonsfordamper. Resten renses ved "Sephadex G-24<tm>" (1,2 x 99 cm)-kolonnekromatografi med n-butanol:eddiksyre:H20 (4:1:5 ved volum).

Eksempel 70

Ved å benytte N°,N^.N^-triadamtyloksykarbonyl-L-arginin (i det følgende betegnet tri-Adoc-L-arginin) i stedet for bis-Boc-L-Lys og ved å følge vesentlig samme fremgangsmåte som i eksempel 67 oppnås tilsvarende tri-Adoc-L-Arg-derivater av L—Phe-benzylester. Tri-Adoc-L-Arg fremstilles ifølge Jager, G. og Geiger, R., Chem. Ber. 103, 1727 (1970).

Eksempel 71

Ved å benytte benzylestrene av Gly, Ala, Trp, Tyr, Ile, Leu, His eller Val i fremgangsmåten i eksemplene 67 og 70 oppnås de tilsvarende bis-Boc-L-Lys- og tri-Adoc-L-Arg-derivatene. Nevnte benzylestere er kommersielt tilgjengelige. Benzyl-ester-beskyttende grupper fjernes vesentlig som beskrevet i eksempel 68.

Eksempel 72

Forbindelsene som resulterer fra eksemplene 68, 70 og 71, omsettes med en hvilken som helst av forbindelsene som resulterer fra fremgangsmåtene fra eksemplene 3-9, ved i det vesentlige å følge metodene i eksempel 68, og man oppnår derved de tilsvarende bis-Boc-L-Lys og tri-Adoc-L-Arg-derivatene. Bis-Boc og trl-Adoc-beskyttende grupper fjernes ved behandling med trifluoreddiksyre i anlsol.

Ved i det vesentlige å følge fremgangsmåtene i eksemplene 2-9 og 67-72, oppnås en familie av tiolesterforbindelser som har den generelle formel:

hvor

R er pyro-L-glutamyl;

A er L-fenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptofyl, L-isoleucyl, L-leucyl eller L-valyl, hvis a-aminogruppe er i amidblnding med R;

Ri er hydrogen eller metyl;

R2 er L-prolin, L-3,4-dehydroprolin eller D,L-3,4-dehydro-prolin, hvis iminogruppe er i imidbinding med >O0; og n er 0 eller 1 slik at når n - 0, er Rj metyl,

Eksempel 73

Svntese av Na- r3-( Na- benzovl- L- trvptofvltio)- 2- D- metvlpropanovll- L- 3- hvdroksvprolln

En oppløsning av Na<->benzoyl-L-tryptofan i redestillert dimetylformamid (DMF) avkjøles i et is-tørris-acetonbad ved

-20'C. Til denne oppløsning tilsettes en kald oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i DMF. Oppløsningen omrøres ved - 10°C i 2 timer og tilsettes deretter til en kald oppløsning av 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-3-hydroksyprolin i DMF som nøytraliseres med N-etylmorfolin. Reaksjonsblandlngen omrøres ved -10<*>C i ytterligere 1 time og oppvarmes langsomt til romtemperatur. Oppløsningsmidler fjernes under redusert trykk ved 40°C, og etylacetat tilsettes til resten. Blandingen avkjøles i et isbad og vaskes med 0,1N HC1 og deretter tre ganger med mettet NaCl-oppløsning. Oppløsningsmidlet fjernes med en rotasjonsfordamper etter tørking over vannfritt MgS04. Produktet renses ved vaeskekromatografi på "Sephadex LH-20<tm>" under anvendelse av en 1,2 cm x 95 cm kolonne og elueres med isopropanol. ToppfraksJonene oppsamles, og oppløsningsmidlet fjernes under redusert trykk, hvilket gir det ønskede

produkt.

Eksempler 74 - 81

Ved å benytte Na<->benzoyl-L-tyrosin, Na<->benzoyl-L-histidin, Na<->benzoyl-L-fenylalanin, Na<->benzoyl-glycin, Na<->benzoyl-L-alanin, Na<->benzoyl-L-isoleucin, Na<->benzoyl-L-leucin eller N^benzoyl-L-valin i stedet for Na<->benzoyl-L-tryptofan i eksempel 73 og ved vesentlig å følge fremgangsmåtene i eksempel 73 oppnås følgende forbindelser:

Eksempel 82

D,L-3,4-dehydroprolin-, L-4-hydroksyprolln- og L-tiazolidin-derlvatene oppnås på samme måte ved å benytte produktene 1 eksemplene 3-9 1 stedet for 3-merkapto-2-D-metylpropanoyl-L-hydroksyprolin i eksemplene 73-81 og ved vesentlig å følge metodene 1 eksempel 73.

Eksempel 83

Syntese av 2- benzoyIfenvlalanvItlopropansvre

En oppløsning av benzoylfenylalanln 1 30 ml redestillert dlmetylformamld (DMF) avkjøles til -20°C. En oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol i 10 ml redestillert DMF tilsettes dråpevis under kraftig omrøring. Temperaturen får ikke overskride -14*C. Etter tilsetningen omrøres oppløsningen ved -10*C i 2 timer. D,L-tiomelkesyre i redestillert DMF på forhånd nøytralisert med redestillert N-etylmorfolin, tilsettes deretter under kontinuerlig omrøring ved -10°C i 1 time. Oppløsningen oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur. Et omtrentlig likt volum etylacetat tilsettes. Blandingen avkjøles og nøytraliseres deretter med konsentrert HC1 i mettet NaCl. Den organiske fasen vaskes deretter tre ganger med undermettet NaCl, dvs. 5 volumdeler mettet NaCl fortynnet med 1 volumdel vann. I noen tilfeller observeres et trelagssystem. I slike tilfeller oppbevares det midtre laget og kombineres med den lavere vandige fasen. Den organiske fasen tørkes over vannfritt MgS04, filtreres og anbringes i rotasjonsfordamperen for å fjern oppløsnlngsmiddel. Den kombinerte vandige fase og midtre fase surgjøres ved 0<*>C med konsentrert HC1 til pH 2 og ekstraheres tre ganger med etylacetat. Den organiske fasen vaskes med mettet NaCl og tørkes over vannfri magnesiumsulfat, filtreres og rotasjons-fordampes. En klar olje innvinnes.

Eksempel 84

Syntese av Na- r2-( Na- benzovl- L- fenvlalanvltio- propanovll- L-3. 4- dehydroprolin

Boc-L-3,4--dehydroprolin (213 mg, 1 mmol ) ble behandlet for å fjerne beskyttende gruppe med 1 ml vannfri trifluoreddiksyre i 1 time. Vannfri etyleter, 3 ml, ble tilsatt. Oppløsnings-midler ble fjernet under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 30°C. Resten ble vasket tre ganger med eter og deretter tørket i en vakuumeksikator over NaOH.

En oppløsning av 358 mg (1 mmol) av produktet fra eksempel 89 I 3 ml redestillert DMF, ble avkjølt til -20°C i et tørris-acetonbad. En oppløsning av 1,1'-karbonyldiimidazol, 171 mg (1,05 mmol) i 1 ml redestillert DMF ble tilsatt dråpevis og temperaturen i reaksjonsblandlngen ble holdt ved fra —10* C til —15<*>C. Reaksjonsblandlngen ble omrørt i 2 timer. En kald oppløsning av L-3,4-dehydroprolintrifluoracetat i 2 ml DMF (nøytralisert med trietylamin) ble tilsatt. Reaksjonsblandlngen ble oppvarmet langsomt til romtemperatur. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet med rotasjonsfordamper under anvendelse av høyvakuum ved 35°C. Resten ble oppløst i 10 ml etylacetat og 2 ml H2O. Blandingen ble surgjort med IN HC1 til pH 2 ved 0"C og ble blandet. Den organiske fasen ble separert og oppsamlet. Den vandige fasen ble ekstrahert tre ganger til med 5 ml etylacetat.

Den kombinerte organiske fase ble vasket to ganger med B^O, tre ganger med mettet NaCl og ble deretter avfarget med trekull. Den organiske fase ble tørket med vannfritt MgSC>4 og deretter filtrert. Filtratet ble inndampet til tørrhet på en rotasjonsfordamper og et oljeaktig produkt, 366 mg, ble oppnådd. Produktet ble renset ved kromatografi på "Sephadex LH-20<tm>" (1,2 x 98 cm) ekvilibrert og eluert med metanol. Fraksjoner på 150 dråper (2,9 ml) ble oppsamlet. Den ønskede forbindelse ble eluert i fraksjoner 24-29. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet med en rotasjonsfordamper.

Ytterligere rensing ble oppnådd ved et annet kromatograf1-trinn på "Sephadex LH-20<tm>". Den andre kolonnen ble ekvilibrert og eluert med isopropanol, toppfraksjoner ble oppsamlet, og oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved rotasjons-fordamping. Produktet var omtrent 9556 rent bedømt ved tynnsjiktskromatografi i oppløsningsmiddelsystemer 2 og 3.

Eksempel 85

Fremstilling av N- r3-( benzovI- D- fenvlalanvltio)- 2- D- metvl-propanovl- L- prolin

a. Fremstilling av N- T3-( HC1• H- D- fenvlalanvltlo)- 2- D- metvl-propanovl- L- prolln

En oppløsning av 531 mg (2 mmol) Boc-D-fenylalanin i 3 ml redestillert dimetylformamid (DMF) ble avkjølt til -20'C g omrørt kraftig. 1,1'-karbonyldiimidazol (341 mg, 2,1 mmol) I 3 ml DMF (ved -10" C) ble tilsatt, og den resulterende oppløsning ble omrørt ved -10"C i 2 timer. En oppløsning av 2-D-metyl-3-merkaptopropanoyl-L-prolin (456 mg, 2,1 mmol) i 2 ml DMF og 0,285 ml N-etylmorfol in (2,1 mmol) ble tilsatt, og reaksjonsblandlngen ble omrørt ved -10'C i 1 time. Blandingen ble langsomt oppvarmet til romtemperatur. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved en rotasjonsevaporator ved 35<*>C. Resten ble oppløst 1 etylacetat (25 ml) og 3 ml vann ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt til 0"C og deretter surgjort med 0,3 ml konsentrert HC1. Den organiske fasen ble vasket en gang med kald fortynnet EC1, tre ganger med vann og tre ganger med mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket over vannfritt MgSC-4 og deretter filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet med rotasjonsevaporator og dette ga en oljeaktig rest. Produktet ble renset på en kolonne (2,2 x 98 cm) av ••Sephadex LH-20" ekvilibrert og utviklet med isopropanol/tetrahydrofuran (7:3 volumdeler). Fraksjoner (5,6 ml hver) ble oppsamlet. Fraksjoner 34-38 ble kombinert. Fraksjoner 33, 39, 40 og 41 ble kombinert, oppløsnings-midler fjernet og påført på nytt på kolonnen av "Sephadex LH-20". Fraksjoner 37-40 av det rekromatograferte materiale og fraksjoner 34-38 av det første kromatogra-ferte materiale ble ytterligere renset på en kolonne (1,2 x 98 cm) av silisiumdioksydgel ekvilibrert og utviklet med etylacetat. Fraksjoner (5,0 ml hver) ble oppsamlet. Fraksjoner 22-29 ble kombinert og oppløsnlngs-middel fjernet med en rotasjonsevaporator. Resten ble oppløst i en 1 ml vannfri trifluoreddiksyre inneholdende 0,5 ml anlsol. Deproteksjon forløp ved romtemperatur i en % time. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved 35"C. Resten ble oppløst i 1 ml etylacetat mettet med hydrogenklorid. Vannfri eter, 5 ml, ble tilsatt ved 0"C og dette ga et hvitt bunnfall. Etter 1 time ved 0<*>C ble det hvite faste stoff oppsamlet ved filtrering og vasket fem ganger med eter. Produktet ble tørket natten over i en vakuumeksikator over NaOH og P2O5. Utbytte 381 mg.

b. Fremstilling av N- r3-( benzovl- D- fenvlalanvltio)- 2- D- metvI-propanovl1- L- prolln

Produktet fra trinn a. ovenfor, N-[3-(HCl-H-D-fenylalanyl-tio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolin (93 mg, 0,23 mmol), ble omsatt med benzoylklorid (0,029 ml, 0,25 mmol) i 0,5 ml redestillert vannfritt dioksan (0°C) og 0,099 ml (0,71 mmol) N-etylmorfolln. Reaksjonsblandlngen ble omrørt kraftig ved romtemperatur 1 3 timer. Benzoylklorid, 0,015 ml og N-etylmorfolin, 0,018 ml, ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 1 time. Oppløsnlngsmiddel ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved 30<*>C. Resten ble oppløst 1 en liten mengde av øvre og nedre fase av n-butanol/eddiksyre/H20 (4:1:5) og ble påført på en kolonne (1,2 x 98 cm) av "Sephadex G-25" ekvilibrert for fordelingskromato-graf1. Kolonnen ble utviklet med øre fase som bevegelig fase (2,6 ml fraksjoner). Fraksjoner 15-24 ble kombinert g oppløsnlngsmiddel fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppsamlet i en liten mengde etylacetat og ytterligere renset på silisiumdioksydgel (1,2 x 95 cm kolonne) ekvilibrert og utviklet med etylacetat (5 ml fraksjoner). Fraksjonene som inneholdt hovedtoppen ble kombinert og oppløsnlngsmiddel fjernet. Materialet ble ytterligere renset ved kromatografi på "Sephadex LH-20" (1,8 x 89 cm kolonne) ekvilibrert og utviklet med isopropanol/tetrahydrofuran (7:3 volumdeler). Fraksjoner (5,7 ml hver) ble oppsamlet og det ønskede materiale ble eluert i fraksjoner 15-18 (utbytte 98 mg). Sluttproduktet oppførte seg som et rent stoff ved papirelektroforese ved pH 5,0 og 2,0 og ved tynnsjiktskromatografi.

Eksempel 86

Fremstilling av N- r3-( benzovl- D. L- fenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovll- L- prolln

Ved anvendelse av en 50:50-blanding av Boc-D-fenylalanin og Boc-L-fenylalanin i fremgangsmåtene i eksempel 85 ovenfor, ble N[3-(benzoyl-D,L-fenylalany1tio)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolin fremstilt.

Eksempel 87

Fremstilling av N-( 2- benzovlfenvlalanvltlopropanovl)- L-<p>rolln- og N- O- benzovlfenvlalanvltlopropanovl)- L- prolln-derlvater

Den ønskede forbindelsen fremstilles ved at man benytter enten 2-merkaptopropanoyl-L-prolin eller 3-merkaptopropanoyl-L-prolin i stedet for 2-D-metyl-3-merkaptopropanoyl-L-prolin i fremgangsmåtene i eksemplene 85-86 ovenfor, og omsetter merkaptoforbindelsen med enten Boc-D-Fenylalanin, Boc-L-fenylalanin, eller en 50:50-blanding derav.

Merkaptoforbindelsene kan fremstilles under anvendelse av de metoder som er beskrevet i en hvilket som helst av ovennevnte US patenter.

Eksempel 88

Fremstilling av L- 3. 4- dehvdroprolin-. D. L- 3. 4- dehvdroprolin-.

L- 3- hvdroksvprolin-. L- 4- hvdroksyprolin- og L- tiazolidln- 4-karboksvlsvrederivater

Den ønskede forbindelse fremstilles under anvendelse av den passende merkaptoforbindelse hvorved man i stedet for L—prolin i fremgangsmåten i eksemplene 85-87 ovenfor anvender L-3,4-dehydroprolin, D,L-3,4-dehydroprolin, L-3-hydroksyprolin, L-4-hydroksyprolin eller L-tiazolidin-4-karboksyl-syre.

De passende merkaptoforbindelsene kan fremstilles under anvendelse av metodene beskrevet I US patenter 4.698.355 og 4.777.298.

Eksempel 89

Fremstilling av D- alanvl-. D- trvptofvl-. D- tvrosvl-, D- lsoleucvI-. D- leucvl-. D- hlstidvl- og D- valvlderlvater

Den ønskede forbindelse fremstilles ved at man i stedet for Boc-D-fenylalanin i fremgangsmåtene i eksemplene 887 og 88 ovenfor benytter Boc-D-alanin, Boc-D-tryptofan, Boc-D-tyrosin, Boc-D-isoleucin, Boc-D-leucin, Boc-D-histidin eller Boc-D-valin.

Eksempel 90

Fremstilling av D. L- alanvl-. D. L- trvptofvl-. D. L- tvrosvl-.

D. L- lsoleucvl-. D. L- leucvl-. D. L- hlstldvl- og D. L- valvlderlvater

En 50:50-blandlng av Boc-D-A og Boc-L-A, hor A er alanin, tryptofan, tyrosin, isoleucin, leucin, histidin eller valin, benyttes I stedet for blandingen av Boc-D-fenylalanin og Boc-L-fenylalanin i fremgangsmåten i eksemplene 86-88 ovenfor, for oppnåelse av de ønskede forbindelsene.

Eksempel 91

Ved å benytte den passende forbindelse i stedet for benzoylklorid i eksemplene 85 og 87-90 ovenfor og benytte velkjente fremgangsmåter, oppnås formyl-, acetyl-, propanoyl-, butanoyl-, fenylacetat-, fenylpropanoyl-, cyklopentankarbonyl-, cyklopentankarbonyl-L-lysyl-, pyro-L-glutamyl-L-lysyl-, L-lysyl-, L-arginyl- og pyro-L-glutamylderivater.

Eksempel 92

Fremstilling av N- r3-( benzovl- L- fenvlalanvltlo)- 2- metvl-propanovl"! - L- 5- okso- proI ln L-glutaminsyre, 10 mmol ble omsatt med 11 mmol av syre-kloridet av metakrylsyre i 35 ml IN natriumhydroksyd. Etter 60 minutter ved romtemperatur ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 2N BX1 til en pH-verdi på omkring 2. Reaksjons-produktet ble ekstrahert to ganger med et like stort volum etylacetat. Den organiske fasen ble redusert til et lite volum ved rotasjonsfordampning og produktet ble krystallisert ved tilsetning av etyleter. Det faste produkt ble oppsamlet ved filtrering. 6 mmol av produktet ble omsatt med 6 mol cykloheksylkarbodiimid i 25 ml vannfri tetrahydrofuran ved 0<*>C i 1 time og deretter ved 4'C natten over. Dicykloheksyl-ureaforbindelsen ble fjernet ved filtrering. Oppløsnings-midlet i filtratet ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Det resulterende anhydrld (5 mmol) ble opplost 1 3 ml vannfritt THF og 6 ml vannfri etyleter. Til sistnevnte oppløsning ble det tilsatt dicykloheksylamin, 5 mmol i 2 ml etyleter, og dette ga metakryloyl-L-5-okso-prolin. Saltet ble omdannet til den frie syren ved tilsetning av 2N HC1 til pH 2,0. Produktet ble ekstrahert 1 etylacetat. Den organiske fasen ble inndampet til tørrhet og produktet krystallisert fra en blanding av heksan og etylacetat. Metakryloyl-L-5-okso-prolin, 3 mmol 1 5 ml toluen, ble omsatt med tiomelkesyre, 3 mmol, ved tilbakeløpskoking 1 1 time og dette ga 3-acetyltio-2-metyl-propanoyl-L-5-okso-prolin. Produktet ble krystallisert i en blanding av etylacetat og heksan. 3-acetyltio-2-metylpropanoyl-L-5-okso-prolin ble deproteksjonsbehandlet i flytende NH3 i metanol i nærvær av anlsol. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en rotasjonsevaporator. Produktet ble oppløst i etylacetat og den organiske fasen vasket med kald fortynnet HC1. Oppløsningsmidlet i den organiske fasen ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppløst i dimetylformamid, 4 ml, og 1-hydroksybenzotiazol, 2 mmol, og N-hydroksysuccin-imidesteren av benzoyl-L-fenylalanin, 2 mmol, ble tilsatt. Reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur i 48 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppløst i et lite volum etylacetat. Den organiske fasen ble vasket med kald fortynnet HC1 og deretter mettet NaCl. Den organiske fasen ble tørket over MgS04. MgS04 ble fjernet ved filtrering og oppløsningsmidlet i filtratet ble fjernet ved rotasjonsfordampning. Resten ble oppløst i 0,5 ml THF. Den resulterende oppløsning ble påført på en kolonne (2,5 x 100 cm) av "Sephadex LH-20" ekvilibrert og utviklet med THF. Fraksjonene inneholdende det ønskede produkt (detekterbart ved dets absorpsjon ved 280 nm) ble kombinert og oppløsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordampning under høyt vakuum.

Eksempel 93

Fremstilling av natrlumsaltet av N^ rS- fNft- benzoyl- D. L-fenvlalanvltlo )- 2- D- metvlpropanovll- L- prolln

NaHC03 (0,5 mmol) av en IM oppløsning) ble tilsatt til 234,3 mg (0,5 mmol) av Na<->[3-(Bz-D,L-fenylalanyltlo)-2-D-metyl-propanoyl]-L-prolln i 1 ml absolutt etanol under omrøring. Oppløsnlngsmldler ble fjernet ved rotasjonsfordampning ved omtrent 35<*>C. Frisk etanol ble tilsatt til den oljeaktige rest og igjen ble oppløsnlngsmiddel fjernet ved hjelp av rotasjonsfordampning. Fremgangsmåten ble gjentatt en gang til med absolutt alkohol og deretter to ganger med benzen. Den hvite resten ble tørket i en vakuumeksikator over P2O5. Omkrystallisering fra 95% etanol og benzen ga 135 mg (55,156 utbytte) av hvit krystaller med et dekomponeringspunkt på 185-186<*>C (mykner ved 153<*>C). Infrarød analyse under anvendelse av en KBr-pellet viste zwitterionbånd ved 1398 og 1600 cm"* og et tioesterbånd ved 1682 cm"<*>. Papirelektroforese ved pH 2 og 5 og tynnsj iktskromatograf i (sillslum-dioksydgelplater) under anvendelse av tre separate oppløs-ningsmiddelsystemer viste bare en flekk som kunne detekteres under UV-lys ved kort bølgelengde etter reaksjon med fenazin-metosulfat-reagenser.

Elementæranalyse for C25<H>27<N>2s^a05'2^2°:

Beregnet: C 57,02; H 5,93; N 5,32; S 6,09

Funnet: C 56,37; H 5,59; N 5,30; S 5,99

Eksempel 94

Fremstilling av kalslumsaltet av N°- r3-(^- benzoyl- D. L-fenylalanvltlo)- 2- D- metylpropanovll- L- prolin

Kaliumsaltet av nevnte forbindelse ble fremstilt ved å følge fremgangsmåten i eksempel 93 under anvendelse av IM KHCO3 i stedet for IM NaHCC^. Omkrystallisering ga 70 mg av et hvitt fast stoff med et dekomponeringspunkt på 132-134<*>C. Infrarød analyse, papirelektroforese og tynnsjiktskromatografi ga verdier identiske med de for det tilsvarende natriumsalt i eksempel 93.

Eksempel 95

Fremstilling av L- lvslnsaltet av N0;- r3-( N0t- benzovl- D. L-fenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovn- L- prolln

En oppløsning av 73,1 mg (0,5 mmol) L-lysln fri base 1 0,3 ml avlonlsert vann, ble tilsatt dråpevls under omrøring til en oppløsning av 234,3 mg (0,5 mmol) Na<->[3-(Na<->benzoyl-D,L-fenylalanyltlo)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolln 1 1 ml absolutt alkohol. Oppløsningsmidler ble fjernet ved rotasjonsfordampning hvilket ga en hvit rest. Frisk absolutt alkohol ble tilsatt og på nytt ble oppløsningsmidlet fjernet ved hjelp av en rotasjonsevaporator. Fremgangsmåten ble gjentatt to ganger til med absolutt alkohol og deretter to ganger med benzen. Sluttutbyttet var 0,292 g (dekomponeringspunkt 152-154,4'C) etter tørking il en vakuumeksikator over P205« Omkrystallisering fra absolutt alkohol, noen dråper vann og benzen ga et utbytte på 141 mg av et hvitt bunnfall som hadde et dekomponeringspunkt på 162 ,5-163,5'C (myknet ved 160'C). Infrarød analyse under anvendelse av KBr-pellet vist zwitterionbånd ved 1389 og 1620 cm-<*>, karbonyl- og amidbånd ved 1641 cm"<1> og et tioesterbånd ved 1678 cm-<1>. Papirelektroforese ved pH 6 og tynnsjiktskromatografi (silisiumdioksyd-gelplater) under anvendelse av tre separate oppløsnings-middelsystemer viste tilstedeværelsen av både den nevnte forbindelse og lysin.

Ytterligere fysiologisk akseptable salter kan fremstilles ved å benytte en passende base i stedet for NaHC03, KHCO3 eller lysin i eksemplene 93-95 og ved i det vesentlige å følge de nedenstående beskrevne metoder. Selv om eksemplene 95-97 beskriver fremstillingen av saltene av forbindelsen Na<->[3-(Na<->benzoyl-D,L-fenylalanyltlo)-2-D-metylpropanoyl]-L-prolin, vil det forstås at fysiologisk akseptable salter av enhver forbindelse med formel I kan fremstilles på samme måte.

Farmakologiske forsøk

A. Den inhiberende aktivitet til produktet fra eksempel 84 In vitro ble målt ved hjelp av systemet som beskrevet i

eksempel 1. Enzympreparatet ble renset fra menneskeurin som beskrevet av Ryan, J.W., et al., Tlssue and Cell 10, 555 (1978). Tabell 1 viser 150-verdien for produktet fra eksempel 84. Isg-verdien er konsentrasjonen av inhibitor som skal til for å gi 50* inhibering av enzymet under et standard-prøvesystem inneholdende substrat ved et nivå vesentlig under Km.

B. Oral effektivitet

Rotter (210-290 g legemsvekt) ble fastet natten over og deretter bedøvet med intraperitoneal pentobarbital, 50-60 mg/kg. Trachesostomi ble foretatt og dyrene ble mekanisk ventilert. En kanyle ble innført i en lårvene for injeksjon av angiotensin I, og en annen kanyle ble innført i en felles karotid-arterie for direkte måling av arterie-blodtrykk. Heparin, 1.000 enheter, ble injisert via lårvenen for å hindre koagulering. Blodtrykket ble målt ved hjelp av en trykk-transducer forbundet med en polygraf. Rottene ble injisert med 160-400 ng/kg angiotensin I i 20 pl av 0,9 g % NaCl; en mengde angiotensin I som er tilstrekkelig til å heve det midlere arterie-blodtrykk med 27-50 mm Hg. Etter at responsen hos en gitt ovenfor angiotensin I var opprettet, ble den respektive forbindelse ved 5,5-23 pmol/kg (legemiddel oppløst i 0,15 ml H2O pluss 10 pl IN NaHC03) gitt via et magerør. Ved bestemte tidsintervaller ble effektene av 160-400 ng/kg angiotensin I på det midlere arterie-blodtrykk testet. Resultatene er vist i tabell 2. Dosen av den spesielle forbindelse er vist i parentes etter nummeret på den aktuelle forbindelse. For eksempel 84 indikerer (23) at 23 pmol/kg av forbindelsen fra eksempel 84 ble administrert oralt. Tiden, i minutter, etter oral administrasjon av den spesielle forbindelse, når effektene av angiotensin I ble testet, er angitt i parentes etter "% av kontroll"-angivelsen.

C. Den inhiberende virkning til produktet fra eksempel 85 in vitro, ble målt i prøvesystemet beskrevet i eksempel 1.Enzympreparatet ble renset fra menneskeurin som

beskrevet av Ryan, J.W., et al., Tissue and Cell 10, 555

(1978). Tabell 4 nedenfor viser 150-verdien for forbindelsen i eksempel 85. 150-verdien er konsentrasjonen av inhibitor som skal til for å gi 5056 inhiber ing av enzymet under anvendelse av et standard prøvesystem inneholdende substrat ved et nivå vesentlig under Kro.

D. Oral effektivitet for natriumsaltet av N^- rS- d^- benzc- vl-D. L- fenvlalanvltio )- 2- D- metvlpropanovn- L- prolin Rotter (150-190 g legemsvekt) ble sultet natten over og deretter bedøvet med intraperitoneal pentobarbital, 50-60 mg/kg. Trachesostomi ble foretatt og dyrene ble ventilert mekanisk. En kanyle ble innført i en lårvene for injeksjon av angiotensin I, og en annen kanyle ble innført i en halspulsåre for direkte måling av arterieblodtrykk. Heparin, 1000 enheter, ble injisert via lårvenen for å hindre koagulering. Blodtrykket ble målt med en trykk-transducer forbundet med en polygraf. Rottene ble injisert med 400 ng/kg angiotensin I i 20 pl av 0,9 g ¥> NaCl; hvilket representerer en mengde av angiotensin I som er tilstrekkelig til å heve det midlere arterieblodtrykk med 45 mm Hg. Etter at mottageligheten hos en gitt rotte for angiotensin I var etablert, ble den ovenfor angitte forbindelse ved 10 pmol/kg (legemiddel oppløst 1 0,15 ml H2O pluss 10 pl IN NaHC03) gitt via et magerør. Ved tidsintervaller ble effektene av 400 ng/kg angiotensin I på midlere arterieblodtrykk testet. Resultatene var som følger: E. Intravenøs effektivitet til kal Iumsal tet av benzovl- D. L- fenvlalanvltlo)- 2- D- metvlpropanovl1- L- prolln Den Intravenøse effektivitet til nevnte forbindelser ble undersøkt ved hjelp av metoden som beskrevet i eksempel 98 med unntagelse av at 1 pmol/kg av legemidlet ble gitt intravenøst. De oppnådde resultater var følgende:

Claims (4)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en inhibitor for angiotensin-omdannende enzym for bruk ved behandling av høyt blodtrykk, og som har formelen: hvor R er hydrogen, formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, benzoyl, cyklopentylkarbonyl, tert.-butyloksykarbonyl, cyklopentylkarbonyl-L-lysyl eller pyro-L-glutamyl, A er L-fenylalanyl, glycyl, L-alanyl, L-tryptofyl, L-isoleucyl, L-leucyl eller L-valyl, hvor a-aminogruppen er i amidbinding med R, forutsatt at fenylalanyl er racemisk når R er benzoyl, Ri er hydrogen eller metyl, R2 er L-prolin, L-3,4-dehydroprolln eller D,L-3,4-dehydro-prolin, hvor iminogruppen er i imidbinding med tilstøtende >C-0-gruppe, og n er 0 eller 1, idet når n ■= 0, så er R^ metyl, og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at

1) en forbindelse med formelen: omsettes med R2 for oppnåelse av en forbindelse med formelen:

1 hvilke formler R3 er acetyl, og Rj_, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, 2) fra den i trinn 1) oppnådde forbindelse fjernes R3, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: 3) den i trinn 2) oppnådde forbindelse omsettes med en forbindelse med formelen R-A-OH, hvorved det oppnås en forbindelse med formelen: hvor R, A, Rj, R2 og n har de ovenfor angitte betydninger, og, om ønsket, omdanner en oppnådd forbindelse til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Analogi fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen i trinn 1) utføres enten i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol eller dicykloheksylkarbodiimid, og reaksjonen i trinn 3) utføres i nærvær av 1,1'-karbonyldiimidazol.

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at R2 i trinn 1) også har en beskyttelsesgruppe for karboksyl, som fjernes i trinn 2).

4. Analogi fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at R er benzoyl, A er fenylalanyl, R^ er metyl, R2 er prolin og n er 1.