NO763390L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å

studere enzymatiske og andre biokjemiske reaksjoner av den type i hvilken materialet hvis aktivitet eller konsentrasjon skal bestemmes, påvirker et substrat som er spesifikt for den biokjemiske reaksjon.

Fremgangsmåten er bl.a. beregnet på anvendelse for bestemmelse av enzymatisk aktivitet, særlig for enzymer av typen serin-proteaser (thrombin, plasmin, trypsin etc.). Flere av disse enzymer . regulerer koaguleringen av blod og fibrinolyse, og for-styrrelser i de normale enzymmengder gir grunn til patologiske forandringer som blødninger eller thrombose.

Fremgangsmåten kan også anvendes for å studere, immunologiske reaksjoner som antigen-antilegemekoblinger. Blant andre systemer som også kan undersøkes, er inhibitor-enzymkoblinger, reseptor-hormonkoblinger og reseptor-sterdidkoblinger.

Det er tidligere kjent å studere enzymatiske reaksjoner ved hjelp av "enzymelektroder" hvor pot ensialdifferansen over mem-branene, som er spesifikk for avfallsproduktene av reaksjonen, måles. Se også Gough D. A. og Andrade J. D. , Enzyme Electrodes, Science Vol. 180, s. 380-384-

Ved undersøkelse av immunologiske reaksjoner er det kjent å anvende nikkelmetalliserte glassplater på hvilke antigener er blitt adsorbert' under dannelse av et lag på overflaten, slik at når glassplaten neddykkes i en oppløsning inneholdende anti-:legemer, er der en kobling mellom antigenene og antilegemene med det resultat at tykkelsen av skiktet øker. Koblingen påvises ved å måle tykkelsen av skiktet optisk ved hjelp av et ellipsometer.

Se også Rothen A., Immunologic and enzymatic reactions carried

out at a solid-liquid interface, Physiol. Chem . & Physics 5, 1973.

Det er også tidligere kjent å bestemme enzymatisk aktivitet ved hjelp av en ledningsevnemetode, se Lawrence A. J. og Moores G. R., Conductometry in Enzyme Studies, Eur. J. Biochem. 24

(1972) , s. 538-546-.

Det er også kjent.at organiske molekyler kan adsorberes på elektrodeoverflat er og forandre elektrodenes elektriske egenskaper, se Bockris J. 0'M. og Reddy A.K.N., Modern Electro-chemistry, Plenum Press, Vol. 2, kapittel 7-

Også spesielle substrater med høy følsomhet overfor

enzymene som er på tale, er blitt utviklet, særlig av den type amidsubstrat er som . har den iboende evne å hydrolyseres i nærvær

av enzymet under dannelse av kromofore produkter-. Den inntred-ende forandring i farver kan lett måles spektrofotometrisk,

f.eks. ved hjelp av et optisk absorpsjonsspektrometer. Et substrat som er nyttig for optisk påvisning av enzymaktivitet og som .letter klinisk undersøkelse av f.eks. mengdene av antithrombin ■ og prothrombin, er beskrevet i U.S. patent 3-884-896.

En ulempe ved den optiske bestemmelsesmetode er at et temmelig komplisert og dyrt apparat er nødvendig, og at en betraktelig mengde substrat kreves for målingsmetoden. Videre er det ikke mulig å undersøke den enzymatiske aktivitet direkte i blodet på grunn av blakningeh av blodet. Istedet er det nød-vendig å arbeide med plasma (de røde blodceller fjernet) eller serum (også fibrinogenet fjernet).

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en enkel metode ved hvilken de nevnte ulemper er eliminert.. Oppfinnelsen kjennetegnes så hovedsakelig ved at først måles kapasitansen mellom to elektroder i nærvær av bare substratet, og deretter måles kapasitansen med det materiale tilsatt hvis aktivitet eller konsentrasjon skal bestemmes, hvorved forandringen i kapasitans pr. tidsenhet eller totalforandringen i kapasitans er et mål på aktiviteten eller konsentrasjonen av materialet.

I det følgende vil foreliggende oppfinnelse bli beskrevet mere detaljert under henvisning til de vedlagte tegninger hvor figur 1 viser et elektrisk måleapparat for måling av kapasitansen mellom elektrodene, figur 2 viser et forenklet ekvivalent koblingsdiagram for måleanordningen,

figur 3 viser en kurve av den målte kapasitans som en funksjon

av tiden når substrat tilsettes,

figur 4 viser et skjemiatisk riss av fremgangsmåten for å ber

stemme enzymatisk aktivitet,

figur 5 viser en kurve av dekningen av adsorberte subst rat-molekyler (ca. l/ c^) som en funksjon av substratkonsen-trasjonen i oppløsningen,

figur 6 viser et skjematisk riss av fremgangsmåten ved under-søkelse av en immunologisk reaksjon, og

figur 7 viser et skjematisk riss av fremgangsmåten ved under-søkelse av en biokjemisk reaksjon i hvilken substratet i . den omgivende oppløsning påvirkes.

I den første eksempelvise utførelsesform beskrives oppfinnelsen i forbindelse med bestemmelse av. enzymatisk aktivitet av serin-proteaser. Oppfinnelsen bygger på det forhold at substratet som anvendes, har den iboende evne til å adsorberes på

en metallisk flate og desorberes i nærvær av enzymene som er på tale. 1 figur 1 er vist et måleapparat ved hjelp av hvilket vekselspehningsimpedansen mellom to plat inaelektroder 2, 3 som er neddykket i en oppløsning 4, måles. Målingsapparatet består av en impedansbro 1, en signalgenerator 5 Og en forsterker med en nulldetektor 6. Fra begynnelsen av inneholder måleanordningen bare en pufferoppløsning med pH 8,2 og ionestyrke 0,15. Ved denne pH-verdi og ionestyrke har de undérsøkte enzymer som er på tale, optimal aktivitet. Da ionestyrken er høy, forårsaker dette elektrodepolariseringseffekter hvis målingen bedømmes ved en relativt lav frekvens (100 kHz i dette tilfelle). Seriemot-standen R^ bestemmes av ledningsevnen av elektrolytten og kapasitansenC2hovedsakelig av elektrodepolari seringen og et mulig adso.rbert lag av molekyler.

I henhold til figur 1 fremgår det at måleanordningen er for-bundet på en slik måte at den utgjør en av grenene av impedans-broen. Hvis nu en liten mengde av et polypeptidsubstrat av den type som er nevnt i US patent 3.884-896, tilsettes til pufferopp- løsningen, varierer den målte kapasitans C som en funksjon av tiden, se figur 3. Kapasitansen Q avtar som en funksjon av tiden, se kurve a på figur 3, avhengig av det forhold at poly-pept idniol ekyler adsorberes på elektrodeflat ene. Gradvis fåes en balanse -mellom polypeptidmolekylene i oppløsning og molekylene adsorbert på el ektrodeflat ene. Et monomolekylært skikt av subst ratmolekyler antaes da å være adsorbert på el ektrodeflat ene.

Hvis nu en enzymoppløsning med evne til å spalte av poly-peptidet tilsettes ved punkt A på figur 3, vil målingen av kapasitansen Cg igjen være forandret. Kapasitansen Cg øker og vender tilbake til sin opprinnelige verdi, se kurve b på figur 3« Forandringen i kapasitansen avhenger hovedsakelig av det forhold

at det tilsatte enzym påvirker det adsorberte polypeptid. Det tilsatte enzym kan f.eks. være thrombin, trypsin eller plasmin (serin-proteaser) , som hydrolyserer polypeptidsubstrat et hvorved de adsorberte molekyler fullstendig eller delvis kommer løs eller "forbrukes", slik at kapasitansen av måleanordningen forandres. Forandringen i kapasitansen pr. tidsenhet, den opprinnelige helning av kurven b på figur 3, er et mål på den enzymatiske aktivitet .

Måleanordningen kan kalibreres ved hjelp av en kjent mengde enzym. Kalibreringskurven kan så anvendes ved måling av en opp-løsning med en ukjent mengde enzym. Ved måling i blodplasma er mengden av antienzym av interesse. Den nevnte mengde kan bestemmes ved å tilsette en kjent mengde enzym på blodplasmaet. Efter noen få minutter når antienzymer er inhibert, måles den gjenværende mengde enzym. Hvis denne metode bedømmes for to for-skjellige enzym- eller plasmamengder, kan den opprinnelige mengde antienzym ekstrapoleres.

Den nu beskrevne metode for bestemmelse av enzymatisk aktivitet er skjematisk illustrert på figur 4, hvor figur 4a viser måleanordningen med elektrodene neddykket i substratoppløsningen, hvor substratmolekylene S er fordelt blant molekylene i oppløs-ningen og molekyler adsorbert på elektrodeoverflat ene. Ved lav konsentrasjon holdes forholdet mellom dem konstant. Når konsentrasjonen øker, vil elektrodeflat ene gradvis bli fylt, og en mindre og mindre del av de tilsatte molekyler vil bli adsorbert.

I figur 5 illustrerer et diagram tykkelsen av laget ved for- skjellige konsentrasjoner av polypeptidsubstrat et (mengden av polypeptid av konsentrasjon 1 mM i 0,5 ml pufferoppløsning). Diagrammet illustrerer at antagelig adsorberes et monoskikt av peptidmolekyler ved høye peptidkonsentrasjoner. En ytterligere tilsetning av substratet øker da hovedsakelig antallet av molekyler i oppløsningen.

Hvis nu et enzym tilsettes, se figur 4b, vil enzymmole-kylene E påvirke molekyler i oppløsningen såvel som adsorberte molekyler. I figur 4c er illustrert hvordan seriekapasitansen Cg varierer som en funksjon av tiden under tilsetning av substratmolekyler S og deretter enzymmolekyler E. Da måleanordningen bare påviser forandringer i antallet av adsorberte molekyler, er det ønskelig at en så stor del som mulig påvirker de adsorberte molekyler. • Et optimum i følsomhet er derfor, ventet i nærvær av en viss mengde tilsatt peptid. Ved en lav peptidkonsentras jon er der et tap i følsomhet fordi elektrodeflat ene har en liten fyllingseffektivitet og ved høye konsentrasjoner påvirker det meste av det tilsatte enzym molekyler i oppløsningen. Målinger indikerer også at et slikt optimum eksisterer.

I det nettopp beskrevne eksempel består, substratet av et polypeptid av typen beskrevet i US patent nr. 3.884*896 med føl-somhet overfor thrombin og andre proteolytiske enzymer av typen peptid-peptidohydrolaser. Substratet som har vært anvendt, hydrolyseres i nærvær av.de angjeldende enzymer og frembringer et kromofort produkt som kan måles spektrofotometrisk. Substratet som har vært anvendt, er på ingen måte optimalt for den elektriske bestemmelse som er beskrevet, hovedsaken er at substratet adherer omhyggelig til elektrodene og at en betraktelig del løsner ved den enzymatiske hydrolyse som bevirker en betraktelig forandring . i kapasitansen av metallelektrodene. Substratet skal derfor adhere på en slik måte at den "følsomme" binding er tilgjengelig for enzymet . Forsøk har vist at substratet ikke helt skal mette overflaten, for en optimal påvisningseffektivitet.

I eksemplet som er beskrevet., har substratet også vært tilsatt til pufferoppløsningen i måleanordningen hvorpå substratet adsorberes på metallelektrodene. Et alternativ er å forsyne-elektrodene med et substratlag før målingen, dvs.'å anvende for-fremstilte elektroder og studere den resulterende forandring i kapasitans når disse elektroder dyppes i angjeldende enzymopp-løsning. Det er følgelig ikke nødvendig at substratet adsor-

beres på metallelektroden, substratet kan f.eks. være kjemisk bundet til elektrodeoverflat en forut satt at substratmolekylene har slike egenskaper at den "følsomme<11>binding er tilgjengelig for enzymet og at en del eller alle substratmolekylene løsner når enzymet påvirker molekylet.

Figur 6 viser et eksempel hvori måleanordningen anordnes

for å studere en immunologisk reaksjon av typen ant igen-ant i-legemebinding. I overensstemmelse med det nettopp beskrevne eksempel måles kapasitansen mellom to elektroder 2, 3 ve<3 hjelp av en impedansbro 1 med de samme konstruktive trekk som den i figur 1. Elektrodeflat ene er enten preparert med antigener fra begynnelsen av eller elektrodene har vært neddykket i en oppløs-ning av antigener hvorved antigener er adsorbert på elektrodeflatene og kapasitansen er målt i dette tilfelle. Derpå neddykkes elektrodene i oppløsningen inneholdende antilegemer hvorved antilegemene bindes til de adsorberte antigener, slik at laget på elektrodeoverflat ene øker, dvs. kapasitansen Cg avtar.

Figur 6a illustrerer elektrodene neddykket i.en pufferoppløs-

ning 4 og når antigenmolekyler (betegnet med S) tilsettes, er der en adsorpsjon på elektrodeflat ene av antigenmolekyler inntil til slutt balanse oppstår mellom antigener i oppløsningen og antigener adsorbert på elektrodeflat en, se figur 6b. I figur 6c er til slutt tilsetningen av antilegemer E til oppløsningen illustrert. Noen av antilegemene er bundet til antigener i oppløs-ningen, og noen av dem til antigener på elektrodeflat en. Selv her er der til slutt balanse, se kurve 6b som illustrerer seriekapasitansen Cg mellom elektrodeflatene som en funksjon av tiden ved tilsetning av antigener (S) og antilegemer (E). Begynnelses-helningen av kurven efter tilsetning av antilegemene (E) bestemmes av konsentrasjonen av antilegemer, som gir et kvantitativt mål på denne. Et kvantitativt mål på konsentrasjonen av antilegemer kan også bedømmes fra hele kapasitansforandringen under tilsetning av antilegemer. 1 det nu beskrevne eksempel består det spesifikke substrat av antigener hvis molekyler må ha evnen til å

adhere til elektrodene på en slik måte at molekylene av antilegemene er i stand til å bindes til antigenmolekylene og videre at antigen-antilegemeskiktet som dannes, skal holdes sterkt nok

på elektroden. Hvis antigen-antilegemekomplekset løsner fra elekt rodef laten,. virker denne metode som i det foregående eksempel .

Selv for antilegemebestemmelse er der en optimal konsentrasjon antigener avhengig av balansen som inntrer mellom antigener i oppløsningen og antigener på elektrodeflat en og selv en" balanse mellom enkelte og bundne antigen- hhv. antilegeme-molekyler..

I tilfelle stoffet som skal undersøkes, bare påvirker substratet i oppløsningen, utføres metoden på følgende vis.

Når, et stoff tilsettes til oppløsningen i måleanordningen hvilket stoff påvirkerbare substratet i oppløsningen, vil konsentrasjonen av substratmolekyler avta. For å opprettholde balanse mellom substrat i oppløsningen og adsorbert substrat, vil det adsorberte substrat løsne fra elektrodeflat en og føre til en av-tagning av skiktet på el ektrodeflat en og en økning i kapasi-

tansen c , se figur 7d. Kapasitansforandringen pr. tidsenhet, helningen av kurven når angjeldende stoff tilsettes, bestemmes av konsentrasjonen av stoffet som gir et kvantitativt mål på dette. Det samme gjelder for den totale kapasitansf orandririg (efter lang tid) som følgelig kan anvendes som et mål på konsentrasjonen eller aktiviteten av angjeldende stoff.

I mange tilfelle påvirker det tilsatte stoff både substratet

i oppløsning og substratet på elektrodene. Kapasitansforandringen avhenger da av to prosesser, men er fremdeles et kvantitativt mål på konsentrasjonen eller aktiviteten av tilsatt stoff.

I de beskrevne eksempler ble platinaelektroder anvendt.

Som elektrodemateriale kan også andre metaller anvendes. Metaller som kobber, sølv, molybden, titan, gull, palladium og nikkel-krom har vist seg også å virke som elekt rodemat er ia-le. Det innsees imidlertid at også andre typer av elektroder som halvlederelek-troder kan anvendes. For eksemplene gjelder videre at impedans-broeri fortrinnsvis er forsynt med avgitte effekter som viser kapasitansforandringen pr. tidsenhet ("øyeblikkelig enzymaktivitet") og totalkapasitansforandring ("integrert-enzymaktivitet") for angjeldende prøve.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte ved undersøkelse av enzymatiske og andre bio^ -kjemiske reaksjoner, ved hvilken et stoff hvis aktivitet/konsentrasjon skal bestemmes, påvirker et substrat spesifikt for' den biokjemiske reaksjon, karakterisert ved at kapasitansen i en måleanordning inneholdende elektroder belagt, med substrat, bestemmes som en kontrollverdi, hvorpå stoffet, hvis aktivitet/konsentrasjon skal bestemmes, innføres i måleanordningen, hvorpå der taes en måling av forandringen i kapasitans, hvorved et kvantitativt mål på aktivitet/konsentrasjonen av stoffet som er tilstede i prøven og påvirker det spesifikke substrat bundet til elektrodene, fåes.

2. Fremgangsmåte, ifølge krav 1, karakterisert ved at subst rat laget på elektrodeflatene dannes ved neddykning av elektrodene i en oppløs-ning inneholdende substrat med evne til å adsorberes på elektrodeflatene.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at når stoffet hvis aktivitet eller konsentrasjon skal bestemmes, tilsettes, dissosieres substratmolekylene adsorbert på elektrodeflåtene helt eller delvis.

4» Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at de adsorberte substratmolekyler under tilsetning av stoffet hvis aktivitet eller konsentrasjon skal bestemmes, binder de tilsatte molekyler hvorved lagtykkelsen på elektrodeflat ene øker.

5 i Fremgangsmåte ifølge krav 1.-4, karakterisert ved at kapasitansen mellom elektrodene måles ved hjelp av en elektrisk impedansbro.

6.F remgangsmåte ifølge krav 1-5, karakterisert ved at serin-proteaser bestemmes, hvorved substratet består av syntetiske spaltbare polypeptider spesifikke for serin-proteaser.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at substratet har formelen:

og salter derav, hvor R^ er hydrogen, alkylcarbonyl med 1 - 12 carbonatomer, . ui-aminoalkyl-carbonyl med 1-12 carbonatomer i rett kjede, cyclohexyl-carbonyl, u>-c <y> cl oh ex <y>l alk <y>l -carbon <y> 1 med 1-6 carbonatomer i en rett kjede, 4-aminoethyl-cyclohexyl-carbonyl, .benzoyl, benzoyl substituert med én eller flere substituenter valgt fra halogen, methyl, amino og fenyl, uu-fenyl-alkyl-carbonyl med 1-6 carbonatomer i en rett kjede, benzensulfonyl, 4-toluensulfonyl eller Na-benzoyl-fenylalanyl; R^ er' fenyl, benzyl, 4-hydroxybenzyl , 4_methoxybenzyl eller 4-methylbenzyl; R 3 er rettkjedet, forgrenet eller cyclisk alkyl med 3 - 8 carbonatomer, fenyl eller benzyl; n er 3 eller 4j R^ er hydrogen eller guanyl; og R^ er fenyl, nitrofenyl, methyl-nitrofenyl, dinitrofenyl, nafthyl, nitronafthy1, kinolyl eller nit rokinolyl.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4?karakterisert ved at de adsorberte substratmolekyler er inhibitorer for molekylene hvis aktivitet eller konsentrasjon skal bestemmes.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 43 karakterise r't ved at de adsorberte substratmolekyler er reseptorer for hormoner hvis aktivitet eller konsentrasjon skal bestemmes.

10. Elektroder belagt med biokjemisk spesifikt substrat for bestemmelse av stoffer med enzymatisk, immunologisk eller annen biokjemisk aktivitet hvor substratet påvirkes av stoffet som skal bestemmes, slik at kapasitansen i en målecelle med de belagte elektroder forandres sammenlignet med kont rollverdiene målt i måleanordningen i fravær av stoffet som påvirker substratet.