DE10254703A1

DE10254703A1 - Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen

Info

Publication number: DE10254703A1
Application number: DE2002154703
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr. Trebbe; Nico KÖHLING; Uwe GLÄSEL; Frank HÜPPMEYER; Tilo Dr. Weiß; Michael Dr. Frank
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2002-11-23
Filing date: 2002-11-23
Publication date: 2004-06-17
Also published as: AU2003293686A1; WO2004048602A1; EP1563086A1

Abstract

Mit einer Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen soll eine Lösung geschaffen werden, mit der möglichst einfach und schnell Enzymaktivitäten direkt in Lösung ohne Derivatisierung oder andere Probenvorbereitung bestimmt werden können. DOLLAR A Dies wird erreicht durch einen Träger (2), auf dem wenigstens ein Elektrodenarray (3) angeordnet ist, welches mit einem Polymerfilm (6), self-assembled monolayers (SAM) oder Silanen beschichtet ist, wobei auf die Beschichtung adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen.

Enzyme werden in der Technik für verschiedene Zwecke eingesetzt, beispielsweise in Waschmitteln oder Reinigungsmitteln sowie in der Lebensmittelindustrie. Wesentlich ist dabei die Kenntnis der Aktivität der Enzyme, deshalb richtet sich der Preis für Enzyme auch nicht nach deren Gewicht bzw. Volumen, sondern nach deren Aktivität, d.h. ihrer tatsächlichen Wirksamkeit. Die Kenntnis der Aktivität von Enzymen, z.B. in Wasch- und Reinigungslaugen, und die daraus resultierende bedarfsgerechte Dosierung von anderen Komponenten können zu einer gesteigerten Leistungsfähigkeit des Produktes bei vermindertem Rohstoffeinsatz führen. Auch in der Lebensmittelindustrie macht die Kenntnis um die tatsächliche Wirksamkeit des Enzyms in Herstellungsprozessen einen entscheidenden Faktor zur Steigerung der Effizienz von Produktionsabläufen aus.

Es sind verschiedene Lösungen zur Bestimmung der Enzymaktivität bekannt geworden, die sich im großtechnischen Maßstab jedoch bisher nicht durchgesetzt haben.

So ist aus WO 00/75360 A2 ein Verfahren und eine Apparatur zur Enzymdetektion bekannt, bei welchem der Abbau eines bioabbaubaren Polymers durch das zu detektierende Enzym beobachtet wird. Der Abbau wird dabei durch eine Quarzmikrowaage, Oberflächenplasmonenresonanz, Ellipsometrie, Impedanzspektroskopie oder kapazitive Messungen verfolgt. Bei all diesen Verfahren wird der Abbau eines bioabbaubaren Polymers als signalgebender Mechanismus verwandt.

Die Verwendung solcher abbaubarer Biopolymere ist jedoch mit verschiedenen Nachteilen verbunden. Vor allem sind solche Sensoren aufgrund der aufwendigen Präparationen geeignet dünner Filme auf den entsprechenden Transducerstrukturen nicht praxistauglich.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Lösung zu schaffen, mit der möglichst einfach und schnell Enzymaktivitäten direkt in Lösung ohne Derivatisierung oder andere Probenvorbereitung bestimmt werden können.

Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art gelöst durch einen Träger, auf dem wenigstens ein Elektrodenarray angeordnet ist, welches mit einem Polymerfilm, self-assembled monolayers (SAM) oder Silanen beschichtet ist, wobei auf die Beschichtung adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht ist.

Mit einer derartigen Vorrichtung ist eine einfache und schnelle Bestimmung von Enzymaktivitäten direkt in Lösung ohne Derivatisierung oder andere Probenvorbereitung möglich, so dass bisher aufwendige Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität erheblich vereinfacht werden. Die Oberfläche des Transducers über dem Ektrodenarray wird so modifiziert, dass ein Substrat adsorptiv gebunden werden kann. Die Modifikation kann unter anderem durch chemische Oberflächenbehandlung, wie beispielsweise eine Silanisierung, oder durch die Abscheidung einer dünnen Polymermembran erreicht werden. Je nach Oberfläche des Transducers können verschiedene potentielle Substrate adsorptiv immobilisiert werden. Taucht ein so hergestellter Sensor in eine Lösung, die ein Enzym enthält, das in der Lage ist, das immobilisierte Substrat abzubauen, ändern sich unter anderem die impediometrischen Eigenschaften der Membran. Diese können sehr einfach in elektrische Signale umgewandelt und entsprechend verarbeitet werden.

Im Gegensatz zum Abbau eines Polymers wird erfindungsgemäß der Abbau von vorzugsweise Monomeren bzw. Oligomeren, die adsorptiv an den Sensor gebunden sind. Wesentliche Vorteile sind eine einfachere, sehr günstige und reproduzierbare Herstellung der Substratfilme auf den Transduceroberflächen und die Möglichkeit, die Vorrichtung in situ zu regenerieren.

Für jede Enzymklasse, deren Aktivität mit einem Sensor nach dem Prinzip des Substratverzehrs nachgewiesen wird, muss ein spezieller Film auf der Transduceroberfläche immobilisiert werden. Da bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung lediglich die adsorbierten Substrate entsprechend angepasst werden müssen, ist der Aufwand für die Entwicklung eines neuen Systems relativ gering. Experimentell aufwendige optische Methoden oder andere aufwendige Verfahren werden nicht benötigt.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass das Substrat aus Monomeren oder Oligomeren besteht. Adsorptiv gebundene Monomere können zum Nachweis der Aktivität von Enzymen eingesetzt werden, die reaktiv wirken, wie z.B. Oxidasen oder Reduktasen. Durch die reaktive Umwandlung der Monomere ändern sich ihre dielektrischen Eigenschaften, die ebenfalls nachgewiesen werden können.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass das Elektrodenarray als Interdigitalelektrodenarray ausgebildet ist. Mit solchen, kammartige Elektrodenfinger aufweisenden Strukturen können impediometrische Effekte mit großer Empfindlichkeit bestimmt werden. Diese Art der Elektrodenanordnung ist deshalb für die Vorrichtungen besonders geeignet.

Bei Verwendung eines Interdigitalelelctrodenarrays sind die Elektrodenfinger bevorzugt etwa 10 μm breit und in einem Abstand von ebenfalls etwa 10 μm zueinander angeordnet.

Als Material für den Polymerfilm hat sich als besonders geeignet Polystyrol oder Polyvinylchlorid herausgestellt. Zur Verbesserung der Filmbildung wird diesen Polymeren jeweils bevorzugt noch ein geeigneter Weichmacher zugesetzt. Die Polymere werden allgemein aus Lösung aufgebracht, z.B. nach dem etablierten Verfahren des Drop-, Dip- oder Spin-Coatings.

Die Dicke der Polymerschicht beträgt bevorzugt 1–5 μm. Die Schichtdicke der adsorptiv gebundenen Monomere oder Oligomere liegt im Nanometerbereich.

In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung ist vorgesehen, dass der Träger des Sensors aus Glas besteht, alternativ können auch andere Materialien für den Träger eingesetzt werden, beispielsweise Kunststoff, SiO₂ auf Si, Al₂O₃, SiC oder SiN_x. Als Elektrodenmaterial ist Platin besonders gut geeignet, es sind aber auch alle anderen, in der Dünnschichttechnologie etablierten elektrischen Leiter, wie Gold, Silber, Platin-Iridium oder auch Poly-Silizium möglich.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung ist vorgesehen, dass auf dem Träger nebeneinander mehrere Elektrodenarrays angeordnet sind, auf deren jeweiligen Polymerfilm zur Bestimmung unterschiedlicher Enzyme unterschiedliche Substrate aufgebracht sind. Es ist somit möglich, mit nur einer Vorrichtung gleichzeitig die Aktivität verschiedener in einer Lösung enthaltenen Enzyme zu bestimmen.

Die Erfindung schlägt auch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen mit einer vorbeschriebenen Vorrichtung vor, das sich dadurch auszeichnet, dass die Vorrichtung in eine Enzymlösung eingetaucht und die zeitliche Änderung der impediometrischen Eigenschaften des Systems gemessen und ausgewertet wird.

Durch die in der Lösung enthaltenen Enzyme wird das immobilisierte Substrat mehr oder weniger schnell abgebaut, wodurch sich die impediometrischen Eigenschaften bzw. der kapazitive Widerstand des Systems verändert, was leicht in elektrische Signale umgewandelt und entsprechend ausgewertet werden kann. Das Verfahren kann mit einer Vorrichtung problemlos mehrfach ausgeführt werden, Versuche haben ergeben, dass durchaus ein System zehnmal eingesetzt werden kann, bis die immobilisierte Substratschicht vollständig abgebaut ist. Anschließend kann die Vorrichtung erneut eingesetzt werden, indem erneut die Enzymsubstrate adsorptiv angebunden werden. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ohne weiteres re generiert und dann erneut verwendet werden.

Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese zeigt in:
1 eine schematische Ansicht eines erfindungsgemäßen Aufbaus im stark vergrößerten Maßstab,
2 ein Interdigitalelektrodenarray in gegenüber 1 nochmals vergrößertem Maßstab und
3 vier mit vier verschiedenen Vorrichtungen aufgenommenen Messkurven.
Eine Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen ist in 1 allgemein mit 1 bezeichnet. Diese Vorrichtung 1 weist zunächst einen Träger 2 auf, der z.B. aus Glas besteht. Auf diesem Träger 2 ist ein Interdigitalelektrodenarray (IDA) angeordnet, beispielsweise photolitographisch aufgebracht, die kammartig ineinandergreifenden Elektrodenfinger sind mit 3 bezeichnet. Diese Elektrodenfinger 3 sind abwechselnd mit einer (elektrischen) Zuleitung 4 oder Ableitung 5 verbunden, wie dies genauer aus 2 zu erkennen ist. Die sensitive Fläche des Interdigitalelektrodenarrays ist mit F bezeichnet.
Der Abstand der Elektrodenfinger zueinander beträgt beim Ausführungsbeispiel 10 μm, die Breite eines Elektrodenfingers liegt in derselben Größenordnung, d.h. ebenfalls bei 10 μm, die Länge eines Elektrodenfingers beträgt 1 mm, die Breite der Zuleitung 4 bzw. Ableitung 5 liegt demgegenüber in einer Größenordnung von 200 μm. Die Periodizität, in der sich die Elektrodenanordnung wiederholt, liegt vorzugsweise bei 25.
Das so auf dem Träger 2 gebildete Interdigitalelektrodenarray ist mit einem beim Ausführungsbeispiel kreisförmigen Polymerfilm 6 beschichtet, welcher beispielsweise einen Durchmesser von 2 mm aufweist und vorzugsweise aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid besteht. Außenseitig ist an diesen Polymerfilm 6 adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aus Monomeren oder Oligomeren gebunden, die Dicke dieser zeichnerisch nicht dargestellten Substratschicht liegt im Nanometerbereich.
Anders als in 1 dargestellt, kann auf einem Träger 2 nicht nur ein einziger Transducer realisiert werden, sondern es können nebeneinander auf dem gleichen Träger mehrere Transducer verwirklicht werden, in dem dementsprechend nebeneinander mehrere Interdigitalelektrodenarrays mit Filmbeschichtung vorgesehen werden.
Zur Herstellung eines solchen Transducers 1 wird das Interdigitalelektrodenarray bevorzugt im photolitographischen Verfahren auf dem Träger 2 hergestellt. Anschließend wird vorzugsweise eine Laminierfolie aufgeklebt, die über dem Interdigitalelektrodenarray einen kreisrunden Ausschnitt freiläßt. In diesen Ausschnitt wird eine Lösung des Polymers und vorzugsweise eines Weichmachers in THF bzw. einer Mischung aus THF-Cyclohexanon (7:3) aufgetropft und der Polymerfilm 6 bildet sich nach der Verdunstung des Lösungsmittels aus. Anschließend wird adsorptiv an den Polymerfilm 6 ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht.
Als ein solches Abbauedukt wird beispielsweise ein Protein eingesetzt. So wurde z.B. speziell ein Bovines Serum Albuminum BSA als Protein verwendet. Dazu wurde eine 1 Gew.%-ige Lösung von BSA in 60 mM TRIS, 0,5 mM MgCl₂, pH-Wert = 6,7 hergestellt und die einsetzende Schaumbildung abgewartet. Mittels einer Eppendorfpipette (0,5 bis 10 μl) wurden je 4 μl der BSA-Lösung in den mit dem Polymerfilm 6 beschichteten Bereich gegeben. Bis zum Einsatz eines derartig Protease-sensitiven Aktivitätssensors wird dieser staubfrei und trocken gelagert. Das auf der Polymerschicht 6 eingetrocknete Protein ist wasserlöslich, auf einen separaten Abwaschschritt kann aber verzichtet werden, wenn der Sensor in der gerührten Hintergrundlösung für ca. 10 min eintaucht. Bevor die Proteasezugabe erfolgt, ist es aber auch möglich, die Vorrichtung nach dem Abspülen der überstehenden Proteinlösung bis zum Einsatz zu lagern und erst später einzusetzen.
Die Polymerschicht 6 wird bevorzugt aus einer Lösung aufgebracht, und zwar unter Zugabe eines Weichmachers, beispielsweise von 30 Gew.% TBTC, das Aufbringen erfolgt vorzugsweise nach den etablierten Verfahren des Drop-, Dip- oder Spin-Coatings.
Taucht man eine vorbeschriebene Vorrichtung 1 in eine Lösung, die ein Enzym enthält, das in der Lage ist, das immobilisierte Substrat abzubauen, ändern sich die impediometrischen Eigenschaften des Systems, was sehr einfach in elektrische Signale umgewandelt und entsprechend verarbeitet werden kann.
3 zeigt vier verschiedene Messkurven von vier verschiedenen Vorrichtungen, wobei die Wechselstromleitfähigkeit über der Zeit bei einer Frequenz von 10 kHz wiedergegeben ist. Diese Frequenz hat sich als besonders effektiv herausgestellt, der Pfeil an der obersten Messkurve in 3 zeigt den Zeitpunkt, zu dem der Lösung Protease zugegeben wurde.
Derartige Vorrichtungen können grundsätzlich mehrfach ver wandt werden. Sie sind selbstverständlich nicht vollständig reversibel, da die absorbierten Enzymsubstrate verbraucht werden. In Untersuchungen hat sich jedoch gezeigt, dass Vorrichtungen durchaus mehrere Male, beispielsweise bis zu 10 Male, verwendet werden können, bevor die Enzymsubstrate erneut adsorptiv an die Polymerschicht gebunden werden müssen. Eine solche Regeneration ist problemlos möglich.
Mit einer derartigen Vorrichtung ist grundsätzlich eine Online-Bestimmung der Enzymaktivität möglich. Somit kann beispielsweise die bedarfsgerechte Zugabe von oberflächenaktiven Substanzen in Geschirr- und Waschmaschinen gewährleistet werden. Einerseits kann man somit die notwendige Menge an Enzymlösung genau dosieren, andererseits können Substanzen, die das Enzym in seiner Funktionsweise beeinträchtigen (z.B. aufgrund ihrer Basizität), erst nach dem enzymatischen Reaktionsschritt zudosiert werden.

Claims

Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, gekennzeichnet durch einen Träger (2), auf dem wenigstens ein Elektrodenarray (3) angeordnet ist, welches mit einem Polymerfilm (6), selfassembled monolayers (SAM) oder Silanen beschichtet ist, wobei auf die Beschichtung adsorptiv ein vom zu bestimmenden Enzym abbaubares Substrat aufgebracht ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus Monomeren oder Oligomeren besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Elektrodenarray als Interdigitalelektrodenarray (3) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenfinger (3) des Interdigitalelektrodenarrays etwa 10 μm breit sind und in einem Abstand von etwa 10 μm zueinander angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass der Polymerfilm (6) aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht (6) eine Dicke von 1–5 μm aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (2) aus Glas besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger (2) nebeneinander mehrere Mikroelektrodenarrays angeordnet sind, auf deren Polymerfilm zur Bestimmung unterschiedlicher Enzyme unterschiedliche Substrate aufgebracht sind.
Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen mit einer Vorrichtung nach einem oder mehreren der Patentansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung in eine Enzymlösung eingetaucht und die zeitliche Änderung der impediometrischen Eigenschaften des Systems gemessen und ausgewertet wird.