NO763075L - - Google Patents

Description

Orgoteinderivater

Denne oppfinnelse vedrører orgoteinderivater og en

fremgangsmåte for deres fremstilling.

Organotein er trivialnavnet som navnerådet nedsatt i U.S.A. har. tildelt medlemmer av en familie av vannløselige protein-congenere i ialt vesentlig ren, injiserbar form, dvs. ialt vesentlig fri for andre proteiner som er sammenblandet med eller forbundet med dem i deres kilder. U.S. patentskrift nr. 3.758.682 har krav på farmasøytiske blandinger som omfatter orgotein.

Orgotein-metallproteinene er medlemmer av en familie av protein-congenere som har en karakteristisk kombinasjon av fysikalske, kjemiske, biologiske og farmakodynamiske egenskaper. Hver av disse congenere er fysikalskkarakterisert vedat de er den isolerte, ialt vesentlig rene form av et kuleformet, buffer-virkende og vannløselig protein som har en sterkt kompakt naturlig struktur, hvilken, selv om den er varme-labil, er stabil ved oppvarming i flere minutter ved 65°C ved pH 4-10. Kjemisk er hver av demkarakterisert vedå inneholde alle unntatt 0-2 av protein-arainosyrene; en liten prosentdel karbohydrat, ingen lipider, 0,1 til 1,0 % med metall tilveiebrakt av 1 til 5 gram-atomer pr. mol av ett eller flere chelaterte toverdige metaller som har en ione-radius på 0,60 til 1,00 Å, og ialt vesentlig ingen chelaterte enverdige metaller eller slike som er celle-gifter i molekylet. Arainosyre-blandingene i orgotein-congenerne har be-merkelsesverdig likeartet sammensetning uavhengig av de kilder hvorfra de er isolert.

Tabell 1 inneholder fortegnelser over fordelingen av aminosyre-restene, beregnet for en molekylvekt på 32.500, for flere orgotein-congenere.

Man kan se i tabell I at orgotein-congenere har fra 18-26 og vanligvis 20-23 lysingrupper, hvorav alle unntatt 1-3 har titrerbare (med trinitrobenzen-sulfonsyre) £-amino-grupper. Ett aspekt ved denne oppfinnelse er rettet mot orgoteinderivater hvori minst en del av orgotein-lysin-gruppene er alkylert og mot en fremgangsmåte for fremstilling av disse. Et annet aspekt ved denne oppfinnelse er rettet mot orgoteinderivater hvori minst en del av orgotein-lysin-gruppene er karbamylert og mot en fremgangsmåte for fremstilling av disse.

Man kan også se av tabell I at orgotein-congenere har fra 29-37 asparaginsyre og 21-38 glutaminsyre-grupper. Ifølge et annet aspekt er denne oppfinnelse rettet mot orgoteinderivater hvori minst en del av disse aminosyre-rester i fri syreform er forestret og mot en fremgangsmåte for fremstilling av disse.

Som det klart vil fremgå for en fagmann i industrien, så muliggjør noen forestrångs-reagenser og forhold at det kan foregå en samtidig alkylering av frie amino-grupper i orgotein-molekylet og forestring av karboksylsyregrupper. Slike N-alkylerte og forestrede orgoteiner og deres fremstilling utgjør også en del av denne oppfinnelse.

De naturlige orgotein-proteiner har blant annet anti-inflammatorisk aktivitet. Se U.S. patentskrift nr. 3.758.682.

De har også enestående høy superoksyd-dismutase-aktivitet. Se McCord&Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6.176, (1970); ibid,

246, 2.875 (1971). Den anti-inflammatoriske aktivitet til det naturlige protein er overraskende ialt vesentlig upåvirket av

forestring, N-alkylering eller karbamylering. Orgoteinderivatene i henhold til denne oppfinnelse er følgelig nyttige på samme

måte som de naturlige proteiner, for eksempel.ved behandling av inflammatoriske forhold hos pattedyr og andre dyr, så som åpen-baret i U.S. patentskrift nr. 3.758.682, og det vises her til innholdet i dette patentskrift. En vesentlig del av superoksyd-dismutase-aktiviteten til det naturlige protein er også opprettholdt i orgoteinderivatene i henhold til denne oppfinnelse, for eksempel inntil 20-100 % av aktiviteten til det naturlige protein.

N- ALKYLERT ORGOTEIN OG N-KARBAMYLERT ORGOTEIN

Som angitt ovenfor inneholder orgotein-congenere fra 18-26 lysin-grupper. Siden orgotein-molekylet utgjøres av to identiske peptid-kjeder (under enheter), foreligger halvparten av disse lysin-grupper i hver kjede, og disse kjeder er bundet tett men ikke-kovalent sammen under moderate temperatur- og pH-forhold. På grunn av rom-strukturen til orgotein-molekylet, er vanligvis £ -amino-gruppene til noen få lysin-grupper i hver kjede ikke titrerbare med trinitrobenzensulfonsyre (TBNS) og således ikke lett tilgjengelig for alkylering eller karbamylering. Det synes imidlertid også mulig med både alkylering og karbamylering av de ikke-titrerbare lysin- £-amino-grupper ved anvendelse av et meget aktivt alkylerings- eller karbamylerings-middel, for eksempel dimetylsulfat ved en alkalisk pH-verdi. Utstrekningen av alkyleringen eller karbamyleringen kari bestemmes ved minskning av TNBS-reaktive amino-grupper, idet det tas i betraktning at 1-3 av lysingruppene i det naturlige orgotein-protein ikke er titrerbare med TNBS. For eksempel gir storfe-orgotein resultat-

er for bare 18 av dets 20 til 22 lysingrupper. Man skal også huske på at monoalkylerte lysingrupper fortsatt er acylerbare slik at bare i utstrakt grad alkylerte orgoteiner viser reduksjon i acylerbare lysingrupper.

Di- og tri-alkylering eller karbamylering av lysin-gruppene kan etterfølges av å telle ladningsforandringen som vises ved elektroforese av det N-alkylerte eller N-karbamylerte produkt. For eksempel viste orgotein alkylert med dimetylsulfat ved en pH-verdi på 10 en ladningsforandring på -2 etter acylering med eddiksyreanhydrid sammenlignet med -20 for ikke-alkylert orgotein. På lignende måte viste orgotein N-karbamylert med metyl-isotiocyanat ved en pH-verdi på 9 en ladningsforandring på -2 etter 45 minutter.

Som kjent er den elektroforetiske mobilitet til et ion

en funksjon av den elektriske feltstyrke, netto-ladningen for ionet (innbefattet bundne motioner) og friksjonskoeffisient. Se for eksempel C. Tanford, "Physical Chemistry of Macromolecules", Wiley, New York (1966). Siden friksjonskoeffisienten er avhengig av molekyl-størreIse og -form og av oppløsningens sammensetning,

er sammenligninger av forskjellige proteiner ikke for informative. Ved imidlertid å sammenligne proteiner av lik størrelse og form,

i dette tilfelle orgotein-molekyler som er kjemisk modifisert med relativt små grupper, under identiske elektroforese-forhold, er netto-ladningen den eneste variable som påvirker denne elektroforetiske mobilitet.

Sammenligning av elektroforetiske mønstre til en rekke kjemisk modifiserte orgotein-molekyler er i samsvar med denne

konklusjon. Naturlig storfe-orgptein gir elektroforese hovedsakelig som ett bånd (bånd 1), sammen med små mengder av.bånd (bånd 2, 3, etc.) som, beveger seg raskere og som er likelig romfordelt foran hoved-båndet, og som representerer orgotein-molekyler med et større forhold mellom gruppene -COOH og -NH2enn slike molekyler som danner bånd 1. Behandling av naturlig storfe-orgotein méd for eksempel suksessivt høyere konsentrasjoner av eddiksyreanhydrid ved en pH-verdi på 7, eller méd metylisotiocyanat ved en pH-verdi på 9, fører til dannelse av en serie med suksessivt mer anodiske (migrering mot elektroden) elektroforetiske bånd ettersom suksessivt flere frie amino-grupper på orgotéin-molekylene blir acetylert eller karbamylert. I motsetning til dette gir behandling med dimetylsulfat en serie med bånd som er suksessivt mer katodiske (forskjøvet fra bånd 1 mot elektroden) ettersom suksessivt flere frie karbonylsyre-grupper på orgotein-molekylet blir forestret..

Et diagram av elektroforese-distansen i forhold til bånd-tall er relativt lineært ved lav grad av -COOH eller -NH2modifisering, men bøyes gradvis ved sterkere modifikasjon, siden det er en grense for hvor hurtig endog de mest sterkt ladede arter

. kan beveges gjennom oppløsning. De arter som migrerer hurtig, er også mer følsomme overfor salt-konsentrasjon, og blir merkbart retardert ved elektroforese av saltholdige prøver. Siden

ekstrapolering av mer enn ca. to bånd-stillinger ,ikke alltid er nøyaktige, er det derfor ved nøyaktig, ladningstelling nødvendig at den ukjente blir ko-elektroforest med eh oppløsning som inneholder alle bånd fra 1 og inntil den stilling som ér av interesse (for eksempel delvis acetylert eller delvis karbamylert orgotein). Alle de konvensjonelle protein-modifikasjonsreaksjoner som hittil er anvendt på orgotein-molekylet har vært forenlig med denne fortolkning, dvs. bånd-stiIlingene svarer til hele ladnings-forandringer fra det naturlige orgotein-molekyl. Både acetylering, karbamylering og N-metyltiokarbamylering gir båndene 2, 3, 4, 5, etc , og dette viser ai henholdsvis 1, 2, 3 og 4 fri amino-grupper har bli$t kjemisk modifisert. På samme måte gir succinyl-ering , som forandrer >vNH3+ grupper til r,-NHCCH2<CH>2<C0>2'"<g>rupper, båndene 3, 5, 7, 9, etc, og mer utstrakt karbamylering eller 0 s tipkarbamylering, som forandrer enda fler /^NHCNH-R og ~NHCNH-R- v grupper, gir båndene 6, 7, 8, 9, etc Forestring med dimetylsulfat eller.med etyldiazoacetat gir båndene -1, -2, -3, -4, etc, og

dette viser at henholdsvis 1, 2, 3 og 4 frie karboksylsyregrupper har blitt kjemisk modifisert.

Generelt sagt kan de fleste, for eksempel alle unntatt: 2*-4, av lysingruppene alkyleres, endog med mildere alkyleringsmidler, eller karbamyleres. Alle unntatt ca. ett av de til-gjengelige (TNBS titrerbare) lysingrupper i hver av orgotein-peptid-underenhetene kan polyalkyleres ved anvendelse av sterkere alkyieririgsforhold, for eksempel overskudd av dimetylsulfat,

0,04 M karbona t-buf f er, pH 10.

Som man kunne vente når ikke alle titrerbare lysin-amino-grupper blir alkylert eller karbamylert, ér fordelingen av alkyl-eller karbamy1-gruppehe på orgotein-mblekylét trolig uregelmessig siden ingen av de titrerbare lysin-amino-rgrupper synes unormalt lettalkylerbare eller omformbare til karbamylerte aminogrupper. På grunn av at orgoteiri-molekylet er sammensatt av to identiske peptid-kjeder, vil alkylgruppene på et delvis aikylert orgotein og de N-karbamylerte aminogrupper på et delvis karbamylert orgotein være fordeit.mer eller mindre tilfeldig langs hver peptid-underénhet, men mer eller mindre jevnt mellom de to kjeder. Siden

det vanligvis blir anvendt et enkelt alkylerings- eller karbamy ler ing smidde 1 , vil henholdsvis alle alkylgruppene og de karbamy lerte aminogrupper være identiske. Det er imidlertid mulig å

fremstille alkylerte orgoteinér og karbamylerte orgoteiner som har to eller flere forskjellige alkylgrupper i molekylet og ens-artet innen hver av molekylets kjeder.

En måte til å fremstille et blandet alkyl-orgotein, er ved å alkylere i trinn med forskjellige alkyleringsmidler. For eksempel kan en del av de titrerbare lysin- £-aminogrupper alkyleres med en moderat konsentrasjon av et alkyleringsmiddel, for eksempel jodacetamid, og resten av de reaktive aminogrupper kan alkyleres med en høyere konsentrasjon av et annet alkyleringsmiddel, for; eksempel dimetylsulfat* Hva som utgjør en lav eller høy konsentrasjon av alkyléringsraiddél vil avhenge av de relative omsetningsgrader med.protein-amino-grupper og med oppløsnings-middel og'vil således avhenge av pH ved omsetningen og av alkyleringsmidlet, og i en mindre utstrekning av buffre-middel og temperatur. En måte å fremstille et blandet N-karbamylert orgotein, er å karbamylere i trinn med forskjellige karbamyleringsmidler..

For eksempel kan en del av de titrerbare lysin- £-aminogrupper .karbamyleres méd et moderat reaktivt karbamyleringsmidde1, for

eksempel KNCO, og resten av de reaktive aminogrupper kan alkyleres méd et mer reaktivt karbamyleringsmidde1, for eksempel metylisocyanat. Reaktiviteten av et karbamyleringsmiddel avhenger av den relative omsetningsgrad med protein-amino-grupper og med omsetnings-oppløsningsmidlet og avhenger således av pH ved omsetningen og av karbamyleringsmidlet, og i en mindre utstrekning av buffer-middel og temperatur.

En annen metode til å fremstille et blandet alkylert eller blandet N-karbamylert orgotein, er ved hybridisering. Uttrykket hybridisering av orgotein refererer seg til dannelse av et blandet orgotein fra peptid-kjedene på to forskjellige orgotein-molekyler, for eksempel A2og B2, idet A og B er deres respektive peptid-kjeder. (A2+ B2^ 2AB). Ladningen på heterodimeren,

AB, ved elektroforese bør være gjennomsnittet av ladningene på homodimerene A2 og B2, idet det forutsettes at den samme del av hver underenhet er involvert i bindingen i alle tilfeller.

£-N-metyl-orgotein, fremstilt ved alkylering av det naturlige orgotein-molekyl i 0,04 M, pH 10, karbonatbuffer med overskudd av dimetylsulfat, £-N-etyl-orgotein, fremstilt ved

alkylering av orgotein på samme måte med dietylsulfat, £-N-propylkarbamyl-orgotein, fremstilt ved karbamylering av det naturlige orgotein-molekyl i 0,1 M, pH 7,6, tris eller fosfat-buffer med overskudd av propylisocyanat, og £ -N-metyltiokarbamyl-orgotein, fremstilt ved karbamylering av orgotein i 0,075 M natriumtetraborat med metylisotiocyanat, kan hver hybridiseres med naturlig orgotein eller med hverandre ved oppvarming sammen ved 50°C i 4 timer.

Som det vil fremgå kan disse semi-alkylerte og semi-karbamylerte orgotein-hybridmolekyler ytterligere alkyleres eller karbamyleres med et forskjellige alkylerings- eller karbamylerings-middel for fremstilling av et alkylert eller karbamylert orgotein-hybrid i hvilket henholdsvis alkylgruppene og de karbamylerte aminogrupper i en peptid-kjede er forskjellig fra gruppene i den

, andre kjede.

£-N-alkyl-orgoteinene og £-N-karbamy1-orgoteinene i henhold til denne oppfinnelse synes å ha ialt vesentlig den samme rom-struktur som det naturlige orgotein-molekyl. Innholdet av chelatert Cu ++ ' og Zn (gramatom pr. mol) er omtrent det samme som i orgotein. På samme måte som orgotein er de meget motstandsdyktige mot pronase og annen proteolytisk enzym§tisk avbygning.

Supéroksyd-dismutase (SOD) enzymatisk aktivitet er opprettholdt selv om den, når det dreier seg om karbamylerte orgo$einer, er forminsket i forhold til karbamyleringsgraden.

v Selv om den overveiende strukturelle modifikasjon av

det naturlige orgotein-molekyl som foregår ved dets alkylering eller karbamylering ved alkalisk pH, er mono-, di- og i mindre utstrekning tri-alkylering av £-amino-gruppene på lysin-

gruppene, når det dreier seg om alkylering, og karbamylering av disse £-amino-grupper, når det dreier seg om karbamylering,

så kan også samtidig de frie aminogrupper av arginin-restene derav og de frie karboksylgrupper av asparaginsyren og glutaminsyren derav, og også andre alkylerbare grupper som er til stede i molekylet, spesielt -0H bg imidazol-nitrogen, og muligens også guanidino-nitrogen, -SH, -SCH3, etc, bli alkylert eller karbamylert, i avhengighet av de anvendte forhold og reaktiviteten til alkyleringsmidlet eller karbamyleringsmidlet. Mens for eksempel alkylering ved en pH på 10 med jodacetamid bare synes å være £-N-alkylering, er alkyleringen med dimetylsulfat ved pH 10 mindre selektiv og det innføres da samtidig metylgrupper hvor som helst i molekylet. Slike ledsagende alkylerte orgoteiner som har £ -N-alky1-grupper, er inkludert i de nye for-bindélser i henhold til denne oppfinnelse. Når det dreier seg om karbamylering er imidlertid slike samtidig modifiserte grupper labile og hydrolysere lett i vandige oppløsninger i løpet av en dag eller mindre, avhengig av pH-verdien.

Forløpet av alkyleringen, så lenge som den involverer -COOH alkylering,bg av karbamyleringen, kan følges direkte av en forandring i total elektroforetisk ladning og av tilsynekomst av nye bånd ved elektroforese. På samme måte kan N-alkylering,

i den utstrekning den gjør en ellers acylerbar -NH2~gruppe motstandsdyktig mot acylering, følges av en reduksjon i antall acylerbare aminogrupper, i forhold til det naturlige orgotein-molekyl.

Den eksakte natur av N-alkyl- og N-karbamy1-gruppene, likeledes antallet av disse, er ikke kritisk så lenge som alkyl-eller karbamy1-radikalet er fysiologisk akseptabelt. På grunn av den høyere molekylvekt til orgotein-molekylet, endog når orgotein-molekylet er fullstendig alkylert eller karbamylert med alkyl- eller karbamy1-grupper av moderat molekylvekt, for eksempel ^100, er anslaget på den totale kjemiske sammensetning relativt liten, dvs. mindre enn 10 %. Alkylering og karbamylering har heller ingen tilsynelatende betydelig virkning på den kompakte rom-struktur til molekylet og den resulterende stabilitet, for

eksempel overfor oppvarming il time ved 60°C, og på angrep av proteolytiske enzymer.

Som det vil fremgå må også alkyl- eller karbamy1-gruppen være én som stammer fra et a lky ler ing s- r- eller karbamy ler ingsmiddel som er i stand til henholdsvis å alkylere og å karbamylere

en aminogruppe i vann eller en buffér-oppløsning, siden om-setningén vanligvis utføres i en slik.

Slike alkyleringsmidler innbefatter diprimære alkyl-sulfater: (RO)2S02 (<R>= = CH3,CH2H5, n-C3H7, n-<C>4Hg), aktiverte alkylhalogenider: ICH2C0X (X = OH, NH2), benzyl- og allyl-bromider, aktiverte vinylgruppers CH2= CHX (X = CN, S0CH3, SOC2'H5, C0CH3) , reduktive alkyleringsmidler ; RCOR ' + BH^ eller BH3CN" (R,R = H, CH3, C2H5, CgH5).

Med hensyn til en metode for reduktiv alkylering av proteiner med arbmatiské. aldehyder og natriumcyanoborhydrid, se Friedman,M. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 6, 1974, 183-185, og med hensyn til alkylering med akrylonitril, se Means Feeney, "Chemical Modifications of.Proteins", kapittel 6, sidene 114-rll7! Fletcher, J. S. , Biochem J. 98 34C (1966) ; Friedman, M. et ai., J. Amer. Chem. Soc. 87, 3672 (1965); og Friedman, M. et al. ,: J. Org. Chem, 31, 2888 (1966).

Eksertipler på egnede karbamyleringsmidler innbéfatter alkalimetalicyanater, for eksempel NaNCO, KNCO; alkylisocyanater og alkylisotiocyanater, for eksempel RNCO og RNCS hvor R = CH3,C2H2, n-C3H^, n-C^Hg, n-CgH^^; og arylisocyanater og isotiocyanater, for eksempel fenylisocyanat og fenylisotiocyanat.

Selv om.metallcyanater omsettes med mange typer av sidekjeder, så er det bare omsetningen med aminogrupper for å

omdanne dem til urinstoffgrupper som frembringer et stabilt produkt.

Omsetningen av alkylisocyanater og -isotiocyanater med orgotein er fullstendig analog med omsetningen av cyanater med orgotein, bare mye raskere. De langkjedede isocyanater er mindre reaktive enn de kortkjedede.isocyanater.

Omsetningen av orgotein med isocyanater og isotiocyanater kan vanligvis bekreftes ved anvendelse av et reagens som innførér en fluorescerende gruppe i molekylet, for eksempel fluorescerende isotiocyanat. Dette reagens er likt ålkylisocyanat og omsettes med åminogruppené på orgotein for å.gi substituerte tiourinstoffer. Imidlertid reduserer endog en lav substitusjons-grad SOD-aktiviteten til orgotein merkbart på grunn av omfanget av fluoresceringen. Mono- og disubstituerte orgoteiner er ikke stabile i oppløsning og blir. sakte mer heterogene på grunn av underenhet-utveksling og hydrolyse.

N-ALKYLERTE ORGOTEINBR

Siden den eksakte kjemiske natur til alkylradikalet

ikke er kritisk, i den utstrekning det ikke er fysiologisk toksisk i orgotein-molekylet og kan dannes på lysin-£ -amino-gruppene, medregnes cyklopentyl, cykloheksyl, mentyl, likeledes cykloalkyl, cykloheksylmetyl, /3-cyklopentylpropyl, likeledes cykloalkylalkyl, benzyl, p-xylyl og fenetyl og likeledes aralkyl som ekvivalenter til de foretrukne hydrokarbpn-alkylgrupper beskrevet ovenfor, i den utstrekning de kan fremstilles. Som ekvivalenter regner man også alkyl med 1-8, fortrinnsvis 1-4, karbonatomer, og mest foretrukket metyl eller etyl som bærer én eller flere, fortrinnsvis én, enkle substituenter, for eksempel karboksy, cyano, karbaloksy og amido, for eksempel karboksymetyl, cyanometyl, karbetoksymetyl, karbometoksymetyl og likeledes karbo-lavere-alkoksymetyl, karbamylmetyl og de tilsvarende substituerte etyl-grupper, for eksempel -CH2CH2COOH, -CH2CH2CSN, -CH2CH2CONH2 og -CH2CH2COOR hvor R er for eksempel metyl eller etyl, -CH2CH2SOCH3,

-CH2CH2SOC2H5og -CH2CH2COCH3.

De alkylerte orgoteiner i henhold til denne oppfinnelse er således orgotein-congenere som innbefatter slike som stammer fra storfe, sauer, hester, svin, hunder, kaniner, marsvin, kyllinger og mennesker, hvor minst ett, for eksempel 1, 2, 3, 4, 5 og opp til alle (ca. 18-26) av deres titrerbare aminogrupper er alkylert, dvs. bærer en usubstituert eller substituert alkylgruppe.

Ved den foretrukne utførelse er de alkylerte aminogrupper slike som har formelen

hvor R er H, CH3, C2H5, n-C3H7<iso-C3H7, eller andre alkylgrupper med opp til 7 karbonatomer, -COOH, -COO-LA, -CONH-LA, -CON(LA)2,

-C2N, -CH2-C=N, -Ph, -COPh, -CH2OH eller -CH(CH3)OH i hvilke LA er lavere alkyl med 1-4 karbonatomer og Ph er usubstituert fenyl eller fenyl som bærer 1-3 enkle substituenter, for eksempel metyl, klor, brom, nitro, amido og metoksy, karbometoksy eller

karboetoksy, for eksempel p-tolyl, sym.-xylyl, p-amidofenyl, m-klorfenyl og p-metoksyfenyl. Slike orgoteiner har formelen

hvor n er et helt tall fra 1 til ca. 26, fortrinnsvis minst 10 og mer foretrukket 10-18, og summen av m og n er det totale antall titrerbare frie aminogrupper i den umodifiserté congener og R har de betydninger som er angitt ovenfor, fortrinnsvis H eller IA, for eksempel metyl eller etyl, og "Org" er resten av orgotein-molekylet. Noen av de alkyleringsmidler som anvendes ved fremgangsmåten i henhold til denne oppfinnelse, vil samtidig alkylere noen av, de frie syregrupper på orgotein-molekylet. Disse alkylerte orgoteiner kan angis med formelen

hvor "Org", R, m og n har de ovenfor angitte betydninger, Y er antall alkylerte frie karboksylsyregrupper, for eksempel fra én opp til ca. 8, fortrinnsvis 2-6, og x er de gjenværende frie karboksylsyregrupper i orgotein-molekylet.

Reagenser som er nyttige for å innføre karboksymetyl-

og karbamylmetylgrupper, er henholdsvis jodeddiksyre og jodacetamid, Jodeddiksyre kan danne stabile produkter med cystein-(sulfhydryl), lysin- (amino), histidin- (imidazol-nitrogen) og metionin- (sulfid-svovel) rester i proteiner. Siden karboksymetylering av hvilke som helst av disse grupper, unntatt metionin,

øker den netto negative ladning på orgotein-proteinet ved pH

8,4, kan elektroforese kvantitere den totale reaksjon (unntatt karbbksymetylering av metionin og karboksymetylering av det andre imidazol-nitrogen).

I naturlig orgotein omsettes jodeddiksyre og jodacetamid

i overveiende grad, om ikke utelukkende, med lysin-arainogrupper„ Selv ora frie tiolgrupper omsettes flere størrelsesordener raskere

med jodeddiksyre enn aminene gjør, så omsettes ikke de første

fem grupper i orgotein som blir karboksynretylert, merkbart hurtigere enn de neste 10-20 grupper gjør. Dette er i samsvar med omsetningen av p-merkuribenzoat medOrgotein-sulfhydrylers det er ingen omsetning med holo-protein. Selv med apo-protein,

som gir en p-merkuri-benzoat-sulfhydryl-omsetning (selv om den

er sakte under ikke-denaturerende forhold), gav ikke jodeddiksyre med et 10-folds molart overskudd ved pH 7 noen minskning av sulfhydryl-innholdet (bestemt spektrometrisk ved p-merkuri-benzoat-titrering) etter flere uker ved 4°C. pH-avhengigheten ved karboksyleringsreaksjonen er, så som vist ved elektroforese, forenelig med omsetning av lysin (pK>8) og ikke av histidin (pK < 6), siden graden av omsetningen ved identiske opprinnelige konsentrasjoner øker jevnt ettersom pH nærmer seg 9, og med ingen merkbar omsetning ved eller under nøytral tilstand hvor histidin fortsatt skulle være uprotonisert og reaktiv. På den annen side viste etylklorformiat-titrering på histidin bare 5 histidingrupper i karboksynretylert orgotein under forhold som fremviste 16 grupper i naturlig orgotein.

Bevis for at verken metionin eller histidin er tilgjengelig for omsetning i naturlig storfe-orgotein ble tilveiebrakt ved et forsøk hvorved orgotein ble inkubert med 0,2 M jodacetamid i 0,5 M fosfat-buffer med pH 6,5 i 48 timer. Alkylering av metionin eller dobbelt alkylering av histidin skulle ha gitt et mer positivt ladet protein ved pH 8,4, men elektroforese viste ingen forandring i SOD^aktivitet eller bånd-mønster.

Lysin-amino-gruppene i orgotein omsettes imidlertid bestemt med jodacetat. Det i utstrakt grad karboksymetylerte orgotein migrerer ved elektroforese på lignende måte som acetylert orgotein, men har lavere SOD-aktivitet (ca. 20 % av aktiviteten til umodifisert orgotein-protein).

I tillegg til N-metyl-"storfe"-orgoteiner og orgoteiner i de etterfølgende eksempler, er andre eksempler på N-alkyl-storfe-orgoteiner i henhold til denne oppfinnelse N-etyl-orgotein, N-propyl-orgotein og N-benzyl-orgotein, hvor det i hvert tilfelle er 9 slike alkylgrupper i hver av de to underenheter på orgotein-molekylet, og de tilsvarende orgoteiner hvor det er et gjennomsnitt på henholdsvis 1, 6 eller 10 slike alkylgrupper i hver slik underenhet, og de tilsvarende congenere fra hver av disse som stammer fra mennesker, sauer, hester, svin, hunder, kaniner, marsvin og kyllinger.

N- KARBAMYLERTE ORGOTEINER

De karbamylerte orgoteiner i henhold til denne oppfinnelse er orgotein-congenere, innbefattet slike som stammer fra storfe, sauer, hester, svin, rotter, hunder, kaniner, marsvin, kylling og mennesker, idet minst ett, for eksempel 1, 2, 3, 4, 5 og opp til alle (ca. 18-26), av deres titrerbare aminogrupper er karbamylert; dvs. bærer en usubstituert eller substituert -CONH- eller -CSNH-gruppe. Ved en foretrukket utførelse er de karbamylerte amino-grupper slike som har formelen

hvor X er 0 eller S, og R er CH3, C2H5, n-C3H7, iso-C3H7, n-C8H17 eller andre alkylgrupper med opp til 12 karbonatomer, Ph, eller når X er 0 også et hydrogenatom, og Ph er usubstituert fenyl eller fenyl som bærer 1-3 enkle substituenter, for eksempel metyl, klor, brom, nitro, amido og metoksy, karbometoksy eller karbo-étoksy, foreksempel p-tdlyl, sym.-xylyl, p-amidofenyl, m-klor-fenyl og p-metoksyfenyl. Slike orgoteiner har formelen

hvor n er et helt tall fra 1 til ca. 26, fortrinnsvis minst 2 og mer foretrukket ca. 6 til 10, og summen av m og. n er det totale antall titrerbare frie aminogrupper i den umodifiserte congener, X er 0 eller S, R har de ovenfor angitte betydninger, fortrinnsvis H eller alkyl med 1-8 karbonatomer, og "Org" er resten av orgotein-molekylet.

Spesielt foretrukne karbamylerte orgoteiner er alkylkarbamyl- og alkyltiokarbamyl-orgoteiner hvor alkylgruppen er usubstituert alkyl med 1-8 karbonatomer, for eksempel metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, okty1.

Siden den eksakte kjemiske natur til karbamy1-gruppen ikke er kritisk, i den utstrekning den ikke er fysiologisk toksisk i orgotein-molekylet og kan dannes på lysin £ -amino-gruppene, medregnes slike som ellers svarer til ovennevnte formel hvor R er cyklopentyl, cykloheksyl, mehtyl, likeledes cykloalkyl, cykloheksylmetyl,/3-cyklopentylpropyl, likeledes cykloalkylalkyl, benzyl, p-x<y>lyl og fenetyl og likeledes aralkyl som ekvivalenter tilde foretrukne alkylkarbamyl-orgoteiner beskrevet ovenfor, i den utstrekning de kan fremstilles. Som ekvivalenter regner man også slike hvor R er alkyl med 1-8, fortrinnsvis 1-4, karbonatomer, og mest foretrukket metyl eller etyl som bærer én eller flere,

fortrinnsvis én, andre substituenter, for eksempel fluorescéinyl.

André eksempler på N-karbamyl-storfe-orgoteinér i henhold til denne oppfinnelse, i tillegg til de N-karbamylerte "storfe"- >orgoteiner i de etterfølgende eksempler, er tilsvarende N-karbamyl-orgotein, N-propylkarbamylorgotéin, N-etylkarbamy1-orgotein og N-metyltiokarbamyi-orgotein hvor det i hvert tilfelle er 9 slike karbamylgrupper i hver av de to underenheter

på orgotein-molekylet, og de tilsvarende orgoteiner hvor det

i hyer slik underenhet er ét gjennomsnitt, på henholdsvis 1, 6 eller 10 slike karbamylgrupper, og de tilsvarende congenere

for hver av disse som stammer fra mennesker, sauer, hester,

svin, hunder, kaniner, marsvin, kyllinger og rotter.

FORESTRET ORGOTEIN

Som angitt ovenfor inneholder orgotein-congenere ca. 50-68 glutamin- og asparagin-rester, men bare ca. 20-27 av disse

har frie ,syre-grupper. Siden orgotein-molekylet er dannet av to identiske eller nesten identiske peptidkjeder (underenheter), er halvparten av disse aminosyre-rester i hver kjede, hvilke er .fast men ikke kovaleht bundet sammen under,moderate temperatur-bg pH-xorhpid. Forestring forandrer ladningen på orgotein-molekylet , og Vanligvis kan bare opp til ca. 10 og fortrinnsvis opp til ca. 6 til 8 av disse frie syre-grupper forestres og fortsatt , opprettholde strukturen til det naturlige molekyl, hvorpå stabilitet og benyttelse som medikament er avhengig.

Forestringen av karboksyisyregruppene kan kvantiteres ved å telle ladningsforandringen som vises ved elektroforese. Om ønskes kan det forestrede orgotein hybridiseres, med naturlig orgotein, så som beskrevet senere, og derved redusere antallet med forestrede karboksylsyre-grupper i molekylet til det halve.

På grunn av at orgotein-molekylet er sammensatt av to \ identiske peptidkjeder, er estergruppene trolig fordelt mer eller mindre jevnt mellom dé to kjeder.. Siden det vanligvis anvendes

et enkelt forestringsmiddel, vil alle ester-gruppene være idehtiské. Det er imidlertid mulig å fremstille forestrede

orgoteiner som har to eller flere forskjellige ester-grupper i

molekylet og endog innen hver kjede derav.

^ .?L En måte til å fremstillé en blandet ester av orgotein.

er véd å forestre trinnvis med forskjellige forestringsmidler.

For eksempel kan en del av de frie syre-grupper forestres med ét forestringsmiddel med lav konsentrasjon, for eksempel dietyl-sulfat, pgen annen del av syre-gruppene kan forestres med et annet forestringsmiddel med høyere konsentrasjon, for eksempel diazbmétan. Hva som utgjør en lav eller høy konsentrasjon av forestringsmiddel vil avhenge av dets relative omsetningsgrad med protein-syre-grupper og med oppløsningsmidde1 og vil således avhenge av pH ved omsetningen og av.forestringsmidlet, og i en mindre utstrekning av buffer-middel og temperatur.

En annen metode til å fremstille en blandet orgotein-ester er ved hybridisering. Uttrykket hybridisering av orgotein refererer seg til dannelse av et blandet orgotein fra underenhet-kjedene av to forskjellige orgotein-molekyler, for eksempel A2og B2, idet A og B er deres respektive peptid-kjeder. (a2+

t*2^-A>2AB). Ladningen av heterodimeren, AB, bør ved elektroforese være gjennomsnittet av ladningene for homodimerene A2

og B2, idet det forutsettes at samme del av hver underenhet er involvert i bindingen i alle tilfeller.

Hver av metyl-orgotein og etyl-orgotein kan hybridiseres med naturlig orgotein eller med hverandre ved oppvarming med et lite overskudd av naturlig orgotein ved 50°C i 4 timer. Elektroforese av de resulterende heterodimerer viser en blanding av bånd som ligger mellom båndene for naturlig orgotein og båndene for det forestrede orgotein før hybridiseringen.

Det er klart at disse semi-forestrede orgotein-hybridmolekyler kan forestres ytterligere med et forskjellig forestringsmiddel for å danne et forestret orgotein-hybrid i hvilket estergruppene i en peptid-kjede er forskjellig fra gruppene i den andre.

De forestrede orgoteiner i henhold til denne oppfinnelse synes å ha ialt vesentlig den samme romstruktur som det naturlige orgotein-molekyl. Innholdet av chelatert Cu og Zn (gram-atomer pr. mol) er omtrent det samme som for orgotein. På samme måte som orgotein er de meget motstandsdyktige mot pronase og annen proteolytisk enzymatisk avbygning. Superoksyd-dismutase-enzymatisk (SOD) aktivitet er ikke tydelig redusert før mer enn ca. 6-8 karboksylsyre-grupper er forestret.

Den eksakte natur av de forestrede grupper, og likeledes det eksakte antall forestrede grupper, er ikke kritisk så lenge som den forestrede gruppe er fysiologisk akseptabel. På grunn av den høye molekylvekt til orgotein-molekylet, endog når orgotein-molekylet er forestret med forestrende grupper med moderat molekylvekt, for eksempel < 160, er anslaget på den totale kjemiske sammensetning relativt liten, dvs. mindre enn 5 %. Selvsagt har forestringen av de frie karboksylsyre-grupper tydeligvis et dyptgående anslag på det isoelektriske punkt og resulterende elektroforetisk mobilitet, men som omtalt ovenfor, så lenge, som forestringen ér begrenset til ca. 10 eller mindre

med glutamin- og asparagiri-syregrupper, har den ikke noen til-' synelatende betydelig virkning på den kompakte rom-struktur til molekylet og følgelig på stabiliteten, for eksempel ved oppvarming i .1 time ved 60°C, og på angrep av proteolytiske enzymer.

Det er klart at den forestrende gruppe også må være

en som.stammer fra et forestringsmiddel som er istand til å

forestre én karboksylsyre-gruppé i vann eller buffer-oppløsning,

siden omsetningen vanligvis utføres deri. Slike forestringsmidler innbefatter dimetyl- og dietyl-sulfat, diazometan bg andre diazo-forbinde Iser, for eksempel med formelen N2CH2COX

hvor X er for eksempel 0CH3, O<C>2H5, NH2ellerNHCH2CONH2, og

andre estere bg amider av diazoeddiksyre som mangler, reaktive grupper, for eksempel karboksyl eller imino.

Med hensyn til metoder for å fremstille slike estere,

se Methods in Enzymology, Vol. XI, side 612 (1967); K.T. Fry et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 30 489 (1968); G.R. Delpierre og J.S. Fruton, PNAS, 56 1817 (1966).

Mer spésielt er denne oppfinnelse rettet mot -COOH forestret orgotein hvor ester-gruppen fortrinnsvis har opp til 4 karbonatomer, for eksempel en monohydrisk alkanol, for eksempel metyl, etyl, og mest foretrukket metyl.

Siden den eksakte kjemiske natur til.esterradikalet

ikke er kritisk, og så lenge som det ikke er fysiologisk toksisk

og kan dannes på orgoteinets frie syregrupper, medregnes slike som bærer ett, to eller flere enkle substituenter, for eksempel

halogen, alkoksy, karb-alkoksy, karbamido, etc.,.spesielt slike hvor ester-gruppen som bærer substituenten eller substituentene,

er metyl, som ekvivalenter med de foretrukne alkyl-forestrings-grupper beskrevet ovenfor, i den utstrekning at de kan dannes.

Som ekvivalenter regner man således i tillegg til forestret

orgotein hvori de; forestrede syregrupper er -COOCH^, slike hvor ester-rgruppene er -C00R hvor R er -CH2C0X hvori X er OCH^,

OC2H5, NH2, NHCH2CONH2 eller CH2CH2-fenyl, eller hvor R er CH(fen<y>l)2.

Forestringen av -COOH gruppene kan følges av opptelling av lådningsforahdingen, vist ved elektroforese, sammenlignet med for naturlige orgoteiner.

Som kjent er den elektroforetiske mobilitet til et ion en funissjon av den elektriske feltstyrke, netto-ladningen for ionet (innbefattet bundne mot-ioner) og friksjonskoeffisient.

Se for .eksempel C. Tanford, "Physical Chemistry of Macromolecules", Wiley, New York (1966). Siden friksjonskoeffisienten er avhengig av molekyl-størrelse og -form og av oppløsningens sammensetning, er sammenligninger av forskjellige proteiner ikke informative* Ved imidlertid å sammenligne proteiner av lik størrelse og form, i dette tilfelle orgotein-molekyler som er kjemisk modifisert med relativt små grupper, under identiske elektroforese-forhoid, er netto-ladningen den eneste variable

som påvirker denne elektroforetiske mobilitet.

Sammenligning av elektroforetiske mønstre til en rekke kjemisk modifisert^orgotein-molekyler er i samsvar med denne konklusjon. Naturlig storfe-orgotein gir elektroforese hovedsakelig som ett bånd (bånd 1), sammen med små mengder av bånd

(bånd 2,3, etc.) som beveger seg raskere og som er likelig rom-for de lt foran hoved-båndet, og som representerer orgotein-molekyler med et større forhold mellom gruppene -COOH og -NHj enn slike molekyler som danner bånd 1. Forestring av suksessivt større antall av de frie -COOH grupper på det naturlige storfe-orgotein fører til dannelse av en serie med suksessivt mer katodiske (migrering mot den negative elektrode) elektroforetiske bånd ettersom suksessivt flere karboksylsyregrupper på orgotein-molekylet blir forestret.

Et diagram av den elektroforetiske distanse i forhold til bånd-ta11 er relativt lineært ved lav grad av -COOH modifisering, men bøyes gradvis ved sterkere modifisering, siden det er en grense for hvor hurtig endog de mest sterkt ladede arter kan beveges gjennom oppløsning. De arter som migrerer hurtig, er også mer følsomme Overfor salt-kohsentrasjon, og blir merkbart retardert ved elektroforese av salt-holdige prøver. Siden ekstrapolering av mer enn ca. to bånd-stillinger ikke alltid er nøyaktig, er det derfor nødvendig ved nøyaktig ladnings-teIling

at den ukjente blir ko-elektroforest med en oppløsning som inneholder alle bånd fra 1 og inntil den stilling som er av interesse (for eksempel delvis acetylert orgotein).

Alle de.konvensjonelle protein-modifikasjonsreaksjoner som hittil er anvendt på orgotein-molekylet har vært forenlig med denne fortolkning, dvs. at bånd-stillingene svarer til hele ladnings-forandringer fra det naturlige orgotein-molekyl. Forestring med dimetylsulfat eller med etyldiazoacetat gir båndene

-1, -2, ^-3, -4, etc., og dette viser at henholdsvis 1, 2, 3 og 4 frie karboksylsyregrupper er blitt kjemisk modifiserte

Generelt sagt kan for det meste bare ca. åtte av de frie -COOH grupper bli forestret uten skadelige virkninger. Forsøk på å forestre mer enn 6-8 -COOH grupper, dvs. forestre mer enn tre -COOH grupper på hver av de to orgotein-peptid-underenheter, fører vanligvis til denaturering og tap av superoksyd-dismutase-aktivitet.

Som man kunne vente når ikke noen av de titrerbare frie karboksyl-grupper.synes unormalt lette å forestre, er fordelingen av de ester-dannende. grupper på;orgotein-molekylet trolig uregelmessig. På grunn av at orgotein-molekylet er sammensatt av to identiske peptid-kjeder, vil ester-gruppene på et delvis forestret orgotein være mer eller mindre tilfeldig fordelt langs hver peptid-underenhet#men mer eller mindre jevnt mellom de to kjeder. Siden det vanligvis blir anvendt et enkelt forestringsmiddel, vil alle estergruppene være identiske. Det er imidlertid

mulig å fremstille forestrede orgoteiner som har to eller flere forskjellige ester-grupper i molekylet.og endog innen hver av molekylets kjeder.

En måte til å fremstille et blandet forestret orgotein, er å forestre trinnvis med forskjellige forestringsmidler, For eksempel kan en del av de frie -COOH grupper forestres med ett forestringsmiddel, for eksempel dimetylsulfat, og resten av de reaktive -COOH grupper kan forestces med et annet forestringsmiddel, f<p>r eksempel etyldiazoacetat;

En annen metode til å fremstille et blandet forestret orgotein, er ved hybridisering. Uttrykket hybridisering av orgotein refererer seg til dannelse av et blandet orgotein fra underenhets-kjeder på to forskjellige orgotein-molekyler, for eksempel,^A2 og B2 / idet A og B er deres respektive peptid-rkjeder, ( A2 + B2 ^=^- 2AB) . Ladningen på heterodimeren, AB, bør ved elektroforese være gjennomsnittet av ladningene til homodimerene A2 og B2' idet det forutsettes at den samme del av hver underenhet er involvert i bindingen i alle tilfeller.

Metyl-forestret orgotein, fremstilt ved forestring av ca. 6 frie syregrupper på orgotein-molekylet med dimetylsulfat, og karboksymetyl-rforestret orgotein, fremstilt ved forestring av det naturlige orgotein-molekylet med etyldiazoacetat, kan hver hybridiseres med naturlig orgotein eller med hverandre ved oppvarming sammen med 50°C i 4 timer.

Andre eksempler på orgotein-derivater i henhold til denne,oppfinnelse, i tillegg til storfe-orgotein-derivatené i

de etterfølgende eksempler, er tilsvarende derivater av andre orgotein-congenere.

Andre eksempler på forestrede storfe-orgoteiner, er . karbometoksymetyl-orgotein og karbamyImetyl-orgotein, hvor det i hvert tilfelle er 3-4 slike forestrede grupper i hver av de to underenheter på orgotein-molekylet, og de tilsvarende forestrede orgoteiner hvor det er respektivt- 1 eller 2 slike éster-grupper i hver underenhet, og de tilsvarende congenere for hver av disse som stammer fra mennesker, sauer, hester, svin, hunder, kaniner, marsvin og kyllinger.

Orgotein-derivatené kan isoleres fra reaksjonsoppløsningen,

fortrinnsvis etter dialyse for å fjerne uvedkommende ioner, ved konvensjonell lyofilisering, for eksempel på den måte som er

beskrevet i U.S. patentskrift nr. 3.658.682. Om ønskes kan orgotein-derivater først renses ved. ionebytte-harpiks-kromatografering, elektroforese og/eller gelfiltrering ved anvendelse av en polymer som virker som en molekyl-sil.

Filtrering gjennom et mikropore-filter med pore-størreIse på 0,01-0,22 mikron på en aseptisk måte i sterile glass, even-tuelt etter justering av ionestyrke med NaCl og/eller natriumfosfat, for eksempel inntil den er isotonisk, vil tilveiebringe

en bakterielt steril oppløsning som er egnet for administrering ved injeksjon. Filtrering gjennom en 0,1 mikron's pore-filter vil også redusere eller eliminere pyrogener i oppløsningen.

De farmasøytiske blandinger i henhold til denne oppfinnelse omfatter en orgotein-ester i henhold til denne oppfinnelse og en farmasøytisk akseptabel bærer. Form og karakter for denne bærer bestemmes selvsagt under hensynstagen til administrasjons-måten

Den farmasøytiske blanding er fortrinnsvis i form av et sterilt, injiserbart preparat, for eksempel som en steril, injiser-bår vandig oppløsning. Oppløsningen kan dannes i samsvar med kjent teknikk ved anvendelse av de ovenfor nevnte bærere. Det

sterile, injisérbare preparat kan også være en steril, injiserbar oppløsning eller suspensjon i hvilket som helst ikke-toksisk

, parenteralt akseptabelt fortynningsmiddel eller oppløsningsmiddel, eller det kan være et lyofilisert pulver for rekohstruering med

et slikt oppløsningsmidde1.

Blandingene i henhold til denne oppfinnelse inneholder en effektiv enhetsdosis-mengde av et orgotein-derivat i henhold

til denne oppfinnelse, dvs. at orgotein-derivatet er til stede

i en konsentrasjon som er effektiv til å fremkalle den ønskede respons hår en enhetsdosis av blandingen blir administrert på den måte som er passende for den spesielle farmasøytiske bærer.

Flytende blandinger, både topiske og injiserbare, inneholder

for eksempel vanligvis ca. 0,5 til 20 mg av orgotein-derivatet pr. 0,25. til 10 ml, fortrinnsvis 0,5 til 5 ml, unntatt I.V.-infusjons-oppløsninger som også kan være mer fortynnet, for eksempel 0,5 til 20 mg orgotein-derivat pr. 50-1.000 ml, fortrinnsvis 100-500 ml, med infusjons-oppløsning. Tabletter, kapsler og suppositorier inneholder vanligvis 0,1 til 25 mg, fortrinnsvis 1 til 10 mg, med orgotein-derivat pr. enhet.

Orgotein-derivatet blir vanligvis administrert ved inndrypping eller ved injeksjon, for eksempel intramuskulært, sub-kutant, intravenøst eller intradermalt. I.M. er foretrukket, unntatt i tilfeller som sjokk hvor I.V. noen ganger foretrekkes på grunn åy at denne administrasjonsmåte begynner å gi virkning raskere, og ved visse lokaliserte sykdommer, for eksempel stråling eller annen cystitis, hvor lokal injisering, infusjon og/eller inndrypping ofte er mer effektivt. Individuelle dosiser faller vanligvis innen området 0,5 til 20 mg. Det foretrukne område er for mennesker ca. 0,5 til 8 mg, og for hester ca. 5,0 - 10,0 mg. Den eksakte dosis er ikke kritisk og avhenger av sykdommens type og alvor-

Orgotein-derivatene i henhold til denne oppfinnelse er på samme måte som orgotein effektiv ved behandling av en rekke forskjellige infiammatoriske tilstander, innbefattet slike hvor syntetiske anti-inflammatoriske midler har begrenset nytte, for eksempel på grunn av toksiske.bi-virkninger ved langvarig anvendelse.

Mer spesielt er disse orgotein-derivater effektive til å forbedre inflammatoriske tilstander og mildne virkningene av disse, for eksempel slike som har forbindelse med urin-organene og

-leddene, i forskjellige pattedyr. De er nyttige til å lindre

symptomene som er forbundet med reumatrid, ostep og post-trauma-tisk artritt, og.også bursitt, tendonitt, etc.

Med hensyn til ytterligere detaljer vedrørende hvorledes man skal isolere utgangs-orgotein-congenere og hvorledes man skal

benytte orgotein-derivatene 1 henhold til denne oppfinnelse, innbefattet administrasjonsmåter, dosis-former, dosis-kurer og også inflammatoriske og andre tilstander som ér mottagelige for behandling med forestrede orgoteiner, se U.S.. patentskrift nr. 3.758.682, som ved referanse innlemmes i denne beskrivelse.

Det antas at en fagmann i industrien, uten ytterligere omstendelig arbeide, ved anvendelse av den forutgående beskrivelse kan benytte foreliggende oppfinnelse i full utstrekning. De følgende foretrukne spesifikke utførelser skal derfor bare

betraktes som illustrerende og ikke på noen måte som begrensende fra resten av åpenbarelsen.

EK5 EMPEL IA

En oppløsning av 5 mg storfe-orgotein i 4 ml med 0,04 M karbonat-buffer ble behandlet med 20^ul dimetylsulfat og pH ble holdt ved 10,0 ved tilsetning av 0,5 M NaOH. Base-opptaket hadde en halv-tid på ca. 37 minutter. Elektroforese viste SOD-aktive bånd 1 til -5 (gjennomsnitt -3). Etter dialyse, lyofilisering og gjen-oppløsning i 1 ml vann, hadde proteinet fortsatt dets SOD-aktivitet og uforandret innhold av Cu ++ og Zn ++i forhold til det ubehandlede orgotein. Acetylering av en oppløsning med 85 ^ug/ml av det modifiserte protein med totalt 3^ul eddiksyreanhydrid i 0,4 ml borat-buffer ved pH 9, gav én gjénnomsnitt-lig elektroforetisk ladnings-forandring på bare ca. -2, sammenlignet med -20 for naturlig orgotein i samme oppløsning. Véd pH 10 er derfor dlmetylsulfat-behandlet orgotein i utstrakt grad N-metylert, dvs. ca. 18 grupper pr. molekyl.

EKSEMPEL 2A

Man følger fremgangsmåten fra eksempel IA, og anvender henholdsvis de tilsvarende congenere som sta mer fra mennesker, sauer, hester, sviii, hunder, kaniner, marsvin og kyllinger som utgangsmaterialer. I hvert tilfelle blir alle unntatt ca. en lysingruppe på hver underenhet av orgotein-molekylet, alkylert.

EKSEMPEL 3A

Fremgangsmåten fra eksempel IA følges, men man anvender dietylsulfat i stedet for;dimetylsulfat. Egenskapene til det resulterende 6-N-etylerte orgotein er ialt vesentlig de samme som egenskapene til det £-N-metylerte orgotein.

EKSEMPEL 4A

£-amino-gruppene på lysin-restene på.storfe-orgotein ble karboksymetylert1 med 0,2 M natriumjodacetat ved, omgivelsenes temperatur under de forhold og med de resultater som er angitt nedenfor.

Fra disse "elektroforetiske mønstre fremgår det at det ikke foregikk nbén N-alkylering ved pH 3,8 og 5,0 og at ved pH 9,2 ble gjennomsnittlig cå. 3 -CB^COO"" grupper innført i løpet av 2 1/2 timer. Cå. 5 slike grupper ble innført i løpet av 6 1/2 timer og ca. 18 slike grupper ble innført i løpet av 72 timer på £-amino-nitrogen-atomene.

Av de elektroforetiske mønstre av det således behandlede orgotein fremgår dét at ved pH 6 ble mindre énn halvparten av orgotein-molekylene alkylert, ved pH 7 hadde etter 2 dager orgotein-molékylene ét gjennomsnitt på én £-amino-gruppe alkylert med én -CI^COO" gruppe, og etter 5 dager var gjennomsnittlig to slike grupper pr. molekyl innført. Ved pH 10 var gjennomsnittlig mer enn tre slike grupper innført etter 2 1/2 timer og etter 6 1/2 timer var det gjénnbmsnittlig innført mer enn 10 slike grupper pr. molekyl.

Produktene av alle de ovennevnte alkylerihger hvor

-CH2C00~ grupper ble onnført, var blandinger av 6-amino-alkylerte orgoteiner inneholdende varierende antall av slike grupper, så

som godtgjort ved fremkomst av en flerhet med bånd med varierende elektroforetiske mobiliteter.

EKSEMPEL IB Usubstituert karbamylert orgotein

En oppløsning ay 3,7 mg orgotein (storfe-congener) og 14 mg KNCO i 2 ml 0,025 M natriumfosfat-buffer ved pH 7,5 ble inkubert ved 4,C. Elektroforese av aliquote prøver i løpet av

54 dager viste tilsynekomst av en serie med SOD-aktive bånd

som var mer anodiske enn for naturlig orgotein. Den gjennomsnittlige ladnings-forandring sammen med området av aktive bånd

på begge sider av gjennomsnittet for prøvene, er angitt nedenfor ..

EKSEMPEL 2B Alky1-karbamylerte orgoteiner Porsjoner på 50^ul av orgotein (storfe-congener) i 0,1 M tris- eller.fosfat-buffer med pH 7,6 og ved en konsentrasjon på 10. mg/ml ble omsatt ved 4°C med 1^ul av enten propylisocyanat eller oktylisocyanat i forskjellige tidsperioder. I to tilfeller ble 2 yul ytterligere propylisocyanat tilsatt etter to dager. Antall med innførte propylkarbamy1- og oktylkarbamy1-grupper,ble bestemt ved gjennomsnittlig ladnings-forandring, så som bestemt ved elektroforese, som vist nedenfor. Gjennomsnittlig ladninqs- forandrinq

EKSEMPEL 3B Alkyl-karbamvlerte orgoteiner

Fremgangsmåten fra eksempel 2B ble gjentatt, ved anvendelse av 10 mg orgotein i 1 ml med 0,1 M fosfat-buffer méd pH 7,6 og 1 ml propyl- eller oktyl-isocyanat. Oppløsningen ble holdt ved 25°C i 4 timer og undersøkt elektroforetisk. Så ble det til hver satt 1 ml med isocyanat. Etter inkuberihg ved 4°C natten over, ble oppløsningene igjen undersøkt elektroforetisk

og dialysert. De karbamylerte proteiner Var mindre oppløselige i avionisert vann og ble delvis utfeldt ved dialyse, men var oppløselige i 0,15 M saItoppløsning. Antall karbamylerte lysin-

grupper er vist nedenfor.

EKSEMPEL 4B N-metyl-tiokarbamyl-orgotein

Til en oppløsning av 5 mg orgotein i 4 ml med 0,075 M Na2B407 med pH 9 ble det satt 10 ^.ul CH3NCS., og blandingen ble ristet i ett minutt inntil CH^NCS var oppløst. Etter inter-valler ble det tått ut prøver på 50 ^ul og disse ble bråkjølt med 0,4 ml med 0,1 M natriumacetat-buffer medpH 5,3. Det kom til syne en hvit utfeining av svovel (så som vist ved dets lukt ved brenning og dets oppløselighet i CS2) etter mellom 6 og 22 timer. Etter 22 timer ved romtemperatur ble den gjenværende reaksjonsblanding bråkjølt med 0,5 ml av 1 M acetat-buffer med pH.5,3 og ble dialysert under hyppig bytte av vann i 2 dager. Den dialyserte oppløsning ble kort sentrifugert 'for å fjerne den hvite uklarhet i oppløsningen.

Elektroforese av de prøver som var tatt fra oppløsningen, viste dannelse av en serie med tiltagende mer anodiske SOD-aktive bånd.- Analyse av prøvene med cytokrom C forsøk ved pH 7,8 (McCord & Fridbvich, J. Biol. Chem. 6049-6055 (1969)) viste et fall i SOD-aktivitét med mer utstrakt modifisering.

Det dialyserte 22 timers omsetningsprodukt fremviste ved elektroforese et hurtig-bevegelig anodisk bånd, opprettholdt 18 % av SOD-aktiviteten til det naturlige orgotein-protein og inne-holdt 2,06 GAPM Zn++ og 1,76 GAPM Cu<++>(sammenlignet med 2,26 GAPM Zn++ og 2,08 GAPM Cu<++>i umodifisert orgotein). Alle pro-duktené var oppløselige og opprettholdt chelatert Cu og Zn og minst en del av superoksyd-dismutase-aktiviteten til det umodifiserte protein.

EKSEMPEL 5B N-fluoresceihylkarbamy1-orgotein

En* oppløsning av 100 mg orgotein (storfe-congener) og 6 mg fluorescein-isotiocyanat i 10 ml med 0,14 M fosfat-buffer med pH 8,5 ble holdt ved 4°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble satt til en kromatogréfisk kolonne av mikroporøs tverrbundet

dekstran ("Sephadex G-50", Pharmacia, Upsala, Sverige) og eluert derifra med bbrat-bufret salt-oppløsning med pH 8 (0,15 M). De eluerte fraksjoner med gult protein ble dialysert mot vann. Det

dialyserte protein som ble utfeldt (20 mg), var intenst gult og fluorescerende og var lett oppløselig i borat-bufret salt-oppløsnirig méd pH 8. Elektroforese viste at de 96 mg med opp-løselig protein bestod av ca. halvparten med mono-karbamylert orgotein (-3 ladningsforandring) sammen med noe dobbelt og tre-dobbelt karbamy lert orgotein (-6 og -9 ladningsforandringer) og uomsatt orgotein. Den gjenoppløste utfeining synes å være noe mer omfattende modifisert protein, siden elektroforese viste et hurtig anodisk fett.

Det oppløselige protein ble kromatografert på en svakt basisk (DEAE-celluiose) ione-bytte-koionhe med pH på 6 med 0,01 til 0,2 M lineær gradient av fosfat-buffer. De mono-karbamylerte og di-karbamylérite orgoteiner ble isolert, dialysert og lyofilisert.

Det mono-karbamylerte orgotein var SOD-aktiv ved elektroforese og var flekket med NBT-riboflavin. I henhold til cytokrom C forsøk ved pH 7,5, hadde det 48 % av SOD-aktiviteten til naturlig orgotein. Ved Ungar-bio-prøven fremviste proteinet ca.

50 % av aktiviteten til naturlig orgotein.

En oppløsning av det mono-karbamylerte orgotein som ble lagret ved 4°C i22 uker, ble forandret til en blanding av orgotein, mono-karbamylert prgotein og di-karbamylért orgotein (tilsynelatende resultat åy hybridisering), og noe av ikke-protein-fluorescerende-forbindeIse (tilsynelatende resultatet av hydrolyse av

tiourinstoff-gruppen på karbamylert orgotein for å gi fritt aminofluorescein). V

Ved å følge fremgangsmåten i eksemplene ovenfor, men ved som utgangsmateriale å anvende de respektive orgotein-congenere som stamme- fra mennesker, sauer, hester, svin, hunder,

kaniner, marsvin, rotjter og kyllinger, dannes de tilsvarende karbamylerte derivater av disse congenere.

EKSEMPEL 1C Metyl-forestring

En oppløsning (125^ug/ml) av 0,5 mg storfe-rorgotein og 0,5 % volum/volum av dimetylsulfat,i 4 mi med 0,05 M acetat-buffer blir holdt ved pH 5 i 100 minutter. Elektroforetisk analyse av reaksjonsproduktet viser SOD-aktive bånd fra +1 til - 6

(gjennomsnitt -4). Produktet er orgotein med et gjennomsnitt på 4 -COOCH^ grupper.

EKSEMPEL 2C Metyl-forestring

En oppløsning av 0,5 mg storfe-orgotein og 10^ul dimetylsulfat i 4 ml vann ble holdt ved konstant pH ved tilsetning av 0,1 M NaOH. Graden av base-opptak i pH-området 7-10 var klart uavhengig av pH og av tilsetningen av 0,25 mol natriumfosfat-buffer. Elektroforese viste dannelse av mer katodisk SOD-aktive bånd med en begynneIseshastighet på ca. -0,5 ladning/time. Etter 21 timer, hovedsakelig ved pH 7-8, ble oppløsningen analysert

med hensyn til N-metylering og forestring, som beskrevet nedenfor. N-metylering kunne ikke påvises. (a) Acetylering av en 0,5 ml aliquot av det forestrede orgotein med 1^ul eddiksyreanhydrid + 3^ul 6 M NaOH ved 4°C gav en oppløsning hvis elektroforese-mønster var et hurtig-bevegelig anodisk bånd som var likt det til acetylert naturlig orgotein, og dette beviser at de frie amino-grupper var upåvirket under forestringen. (b) En 1 ml's aliquot av den forestrede orgotein-oppløsning ble justert til en pH .på 10,5 og ble lagret innelukket i en ekssikator sammen med NaOH-pellets. Selv om de katodiske bånd-mønstre av bånd 1 til -4 var stabile ved pH 7-9, så forsvant de katodiske bånd ved pH 10,5 gradvis i løpet av én periode på 4 dager ettersom de elektroforetiske mønstre til naturlig orgotein synte seg på nytt. Protein-metylestere hydrolyseres vanligvis lett ved alkaliske pH-verdier, og dette bekrefter at de mer katodiske bånd som viste seg etter forestringen, var orgotein-estere.

Av det foregående er det klart at dimetylsulfat ved pH 7-10 etter to timer forestrer gjennomsnittlig én -COOH gruppe pr. molekyl, etter fire timer ca. 2 pr. molekyl og fortsetter der-etter å øke antall forestrede -COOH grupper inntil et maksimum på ca. 6 pr. molekyl.

Ved å følge fremgangsmåten fra eksamplene 1C og 2C, og ved anvendelse i hve£t tilfelle av de tilsvarende orgotein-congenere som stammer fra henholdsvis mennesker, sauer, hester, svin, hunder, kaniner, marsvin og kyllinger som utgangsmaterialer,

blir gjennomsnittlig ca. fire karboksylsyre-grupper på orgotein-molekylet omdannet til metylestere derav.

Ved å følge fremgangsmåten fra eksemplene 1C og 2C, og ved anvendelse av dietylsulfat i stedet for dimetylsulfat, blir

orgotein-estere med fra ett til seks frie karboksylsyre-grupper omdannet til etylestere derav. Egenskapene til de resulterende forestrede orgoteiner er ialt vesentlig de samme som for metyl-forestrét orgotein.

De forestrede orgoteiner kan om ønskes renses ytterligere ved ione-bytte-kromatografering for å skille fra hverandre arterie méd forskjellige netto-ladninger, og følgelig forskjellig grad av forestring. Ved for eksempel eluering av 200 mg orgotein gjennom en DEAE "Sephadex" kolonne på 2,5 x 40 om med 4 liter av eri 0,01 M til 0,2 M lineær gradient av tris-buffer méd pH 8,5, skilles orgotéin-båndene fra hverandre, idet dé elektroforetisk mer katodiske bånd elueres først. Ved en slik fremgangsmåte kan blandingen av metyl-forestrede orgoteiner fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 1C, skilles i fraksjoner

som hovedsakelig inneholder 1, 2,3, 4, 5 eller 6 metylester-grupper pr. orgotein-molekyl. Slik fraksjonering av delvis mpdifisert orgotein ved ione-bytte-kromatografi kan anvendes på hvilken som helst modifisert orgotéin hvis molekyl-ladning avhenger av graden av modifisering,

for eksempel metyl-forestret orgotein, karbetoksymetyl-forestret orgotein og N-acetylert orgotein.

EKSEMPEL 3C Karbetoksymetyl-forestring

Etyldiazoacetat blir fremstilt ved omsetning av glycin-etylester med salpetersyrling, så som i "Organic Synthesis", Coll. Vol. IV, s. 424, men ved anvendelse av CCl^i stedet for CH2C12for å ekstrahere etyldiazoacetatet fra vandig oppløsning.

2 ml av tilnærmet 1 M etyidiazoacetat/CCl^-oppløsning

anbringes i en kolbe på. 25 ml og nesten all CCl^blir inndampet under aspirator-trykk. Det blir tilsatt én oppløsning av 9 mg storfe-orgotein/3 ml vann og så roteres dette for å dispergere den organiske fase. Oppløsningen blir lagret Ved 4°C og rotert i noen dager. Reaksjonsblandingen blir værende heterogen helt igjennom. Elektroforese viser gradvis dannelse av mer katodiske SOD-aktive protein-bånd -1 til -6. Den gjennomsnittlige ladnings-forandring er 1,2 ettér 5 dager og 3 etter 12 dager. Produktet

er én blanding av karbetoksymetyl-orgotein-estére som etter 5

° dager har enten en eller to slikéV estergrupper pr. molekyl, og ettér 12 dager fra 1 til 6 slike estergrupper.

Den vandige fase blir så filtrert og-avsaltet ved kromatografisk fraksjonering ved anvendelse av en 10 cm 3's

"Sephadex G-25" kolonne. Protein-fraksjonene blir lyofilisért

og gjenoppløst i 2 ml vann, og pH blir hevet fra 3,7 til 5,6 med

2<y>ul av 1 M NaOH. Elektroforese viser ingen forandring fra

før avsalting og lyofilisering. Omsetning på nytt med denne oppløsning i en måned under de samme forhold som ovenfor, gir fettlignende protein ved elektroforese med mindre SOD-aktivitet og ikke noe materiale mer katodisk enn bånd -6.

EKSEMPEL 4C Metyl-forestring

Ved å følge fremgangsmåten i eksemplene 1 og 2, ble storfe-orgotein alkylert under de forhold som er angitt i tabellen nedenfor.

Produktet fra eksempel (a) hadde et gjennomsnitt på 2 forestrede -COOH grupper pr. molekyl, og produktet fra eksempel (b) et gjennomsnitt på 4 slike grupper. Nærværet av en flerhet av katodiske bånd beviser at de forestrede produkter består av., en flerhet med forestrede orgoteiner som inneholder fra én og opp til 6 estergrupper pr. molekyl.

EKSEMPEL 5C Metylester/N-acetyl-hybrid

Til en oppløsning (125 ^ug/ml) av 0,5 mg metyl-forestret orgotein, fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 1, ble det satt 0,5 mg fullstendig N-acetylert orgotein. Elektroforese av blandingen viste båre ett bånd svarende til metyl-forestret orgotein pluss det anodiske bånd svarende til N-acetyl-orgotein. Etter at blandingen var oppvarmet ved 50°C.i 4 timer, viste imidlertid elektroforese at det var dannet flere nye arter (ved bånd-stillingene +7 til +11) og at det var over 50 % forminsking av de opprinnelige N-acetyl- og metyl-ester-orgotein-bånd.

De nye arter dannet ved oppvarming av blandingen av modifiserte orgoteiner, er hybrider (heterodimerér) som inneholder en underenhet av hver av N-acetyl-orgotein (inneholdende 10 N-acetyl-lysingrupper pr. underenhet) dg metyl-forestret orgotein (inneholdende 0 til 3 -COOMe grupper pr. underenhet).

Hybridene kan isoleres fra deres likevektsblanding med N-acetyl- og -COOMe orgoteiner (homodimerer) ved ione-bytte-kromatografi ved lav temperatur, så som beskrevet i eksempel 2C.

De isolerte heterodimerér kan ved lagring fortsette å re-hybridisere for å gjendanne en blanding som også inneholder begge homodimerene. Graden av re-hybridisering er avhengig av temperaturen og er lav ved lave temperaturer.

De foregående eksempler kan gjentas med lignende

suksess ved å innsette de ålment eller spesifikt beskrevne reaktanter og/eller driftsforhold i henhold til denne oppfinnelse i stedet for dem som er anvendt i de foregående eksempler.

Av den foregående beskrivelse kan en fagmann i industrien lett konstantere de vesentlige trekk ved denne oppfinnelse, og kan, uten å avvike fra dens ånd og omfang, gjøre forskjellige forandringer og modifikasjoner aV oppfinnelsen for å avpasse den tii forskjellige anvendelser og forhold.

Claims (33)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av injiserbare orgotein-derivater som har anti-inflammatbrisk aktivitet, karakterisert ved å omsette orgotein med (a) et alkyleringsmiddel eller et karbamyleringsmiddel for å fremstille henholdsvis et N-alkylert orgotein med en alkylgruppe eller et N-karbamylert orgotein med en karbamylgruppe på minst én lysin- £-aminogruppe derav, eller (b) et forestringsmiddel for å fremstille et forestret orgotein hvor opp til 10 av de frie karboksylsyregrupper på orgotein-proteinmolekylet er forestret.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert v é d at det anvendes et orgotein som stammer fra storfe.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, k a r a k t e r i s e r t ve d at orgotein omsettes med et alkyleringsmiddel under anvendelse av slike alkyleringsforhold. at det fremstilles et alkylert orgotein som har minst 10 alkylerte £-aminogrupper pr. molekyl.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, karakterisert ved at det anvendes slike alkyleringsforhold at det fremstilles et alkylert orgotein med minst 18 alkylerte ^-amino-grupper pr. molekyl.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav.3, karakterisert ved at det som alkyleringsmiddel anvendes et di-primært alkylsulfat, et aktivert alkylhalogenid, en aktivert vinylforbindelse eller et reduktivt alkyleringsmiddel.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, karakterisert ved at det som alkyleringsmiddel anvendes et dialkyl-sulfat hvor hvert alkyl er alkyl med 1-4 karbonatomer.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, hvorved det som alkyleringsmiddel anvendes dimetylsulfat.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 1,. karakterisert ved at orgotein omsettes med et karbamyleringsmiddel under anvendelse av slike reaksjonsforhold at det fremstilles et karbamylert orgotein med minst to karbamylerte £-aminogrupper pr. molekyl.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, kar akter i- sert ved at det anvendes slike reaksjonsforhold at det fremstilles et karbamylert orgotein med ca. 6 til 10 karbamylerte £-aminogrupper pr. molekyl.

10. \ Fremgangsmåte i henhold til krav 8, karakterisert ved at det som karbamyleringsmiddel anvendes et , alkaiimetallcyanat, alkylisocyanat, alkylisotiocyanat <,> ar <y>l isocyanat eller arylisotiocyanat.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, k a r a k t e r i - s e r ved at det som karbamy ler ingsmiddel anvendes at alkaiimetallcyanat; alkylisocyanat eller alkylisotiocyanat hvor alkylgruppen inneholder opp til 12 karbonatomer.

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, karakterisert ved at det som karbamyleringsmiddel anvendes et alkylisocyanat hvor alkylgruppen inneholder 1-8 karbonatomer eller et alkaiimetallcyanat.

13. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, karakterisert ved at det som karbamyleringsmiddel anvendes et alkylisotiocyanat hvor alkylgruppen består av 1-8 karbonatomer.

14. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at orgotein omsettes i en vandig oppløsning med et forestringsmiddel som forestrer karboksylsyrer i vandig opp-løsning eller buffer-oppløsning.

15. Fremgangsmåte i henhold til krav 14, karakterisert ved at det som forestringsmiddel anvendes dimetyl-eller dietyl-sulfat, et azid med formelen N2 CH2 COX hvor X er 0C <H>3, OC2H5, NH2 eller NHCH2 CQN <H>2 eller en annen ester eller amid av diazoeddliksyre som mangler en reaktiv gruppe.

16. Frem <g> angsmåte i henhold til krav 14, karakteri sert ved at det som forestringsmiddel anvendes et som danner alky lesterle med 1 til 4 karbonatomer.

17. Fremgangsmåte i henhold til krav 14, karakterisert ved at det som forestringsmiddel anvendes et som \ danner metylestere.

18. Fremgangsmåte i henhold til krav 14, karakterisert ved at det som forestringsmiddel anvendes dimetylsulfat. • !

19. Orgoteinderivat valgt fra gruppen bestående av et alkylert orgotein hvori det er til stede en alkylgruppe med opp til 8 karbonatomer på minst en lysin-£ -aminogruppe derav? et N- karbaftylert orgotein hvori det er til stede en karbamylgruppe på minst en lysin-t-aminogruppe ; og et forestret orgotein hvori opp til 10 av de f±ie karboksylsyregrupper på orgotein-proteih molékylet er forestret.

20. Orgoteinderivat i henhold til krav 19, karakterisert ved at orgoteinet stammer fra storfe.

21. Alkylert. orgotein i henhold til krav 19, kar a k teri sert ved at det inneholder minst 10 alkylerte £-aminogrupper pr. molekyl.

22. Alkylert orgotein i henhold til krav 19, k a r å k - ter i.sert ved at det inneholder minst 18 alkylerte £-aminogrupper pr. molekyl.

23. Alkylert orgotein i henhold til krav ^. karakterisert vedat alkyl inneholder 1-4 karbonatomer.

24.A lkylert orgotein i henhold til krav 19, k a r a k terisert ved. at alkyl er metyl.

25. Karbamylert orgotein i henhold til krav 19, karakterisert ved at det inneholder minst to karbamylerte E-aminogrupper pr. molekyl.

26. Karbamylert orgotein i henhold til krav 19, karakterisert ved at det inneholder ca. 6 til 10 karbamy lerte ^-aminogrupper pr. molekyl.

27. Karbamylert orgotein i henhold til krav 19, karakterisert ved at den karbamylerte aminogruppe ha "X IC formelen -NHCNHR hvor X er 0 eller S og R er alkyl med opp til 12 karbonatomer eller, når X er 0, også et hydrogenatom.

28. Karbamylert orgotein i henhold til krav 27, karakterisert ved at X ér 0 og R er alkyl med 1-8 karbonatomer eller et hydrogenatom.

29. Karbamylert orgotein i henhold til krav 27, k a r a k - terisért ved at X er S og R er alkyl med 1-8 karbonatomer.

30. Forestret orgotein i henhold til krav 19, k a r a k ter iser t v e d at det inneholder opp til 8 forestrede karbroksylsyregrupper pr. molekyl.

31. Forestret orgotein i henhold til krav 19, karakterisert ved at estergruppene er alkylestere med 1 til 14 karbonatomer..

32* Forestret orgotein i henhold til krav 19, karakterisert ved at estergruppene er metylestere.

33. Farmasøytisk blanding som, blandet med en farmasøytisk akseptabel bærer, omfatter en anti-inflammatorisk effektiv enhetsdosismengde av et orgoteinderivat i henhold til krav 19 i