CS203992B2 - Method of making the injectable derivates of the ergothein with antiinflammation effect - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby injikovatelných derivátů orgoteinu, majících protizánětlivou účinnost.

Jako orgoiein se označují členy skupiny vodorozpustných analogů bílkovin v prakticky čisté, ínjikovatelné podobě, tj. prakticky neobsahují jiné bílkoviny, které je doprovázejí nebo jsou s nimi sdruženy ve zdrojích jejich výskytu. V patentovém spisu USA

758 682 se popisují farmaceutické prostředky obsahující orgotein.

Orgoteinové rnethanoproteiny jsou členy skupiny analogů bílkovin vyznačujících se charakteristickým souhrnem fyzikálních, chemických, biologických -a - farmakodynamickýoh vlastností. Každý z těchto- analogů je fyzikálně charakterizován tím, že je isolovanou, prakticky čistou formou globulární, ve vodě a v pufru rozpustné bílkoviny, mající vysoce kompaktní přirozenou stavbu, která — ačkoliv je citlivá vůči teplu — je stálá při zahřívání při teplotě 65 °C při pH až 10 po- několik - minut. Po chemické stránce sa každý z -těchto· analogů vyznačuje tím, že obsahuje v molekule všechny bílkovinové aminokyseliny až na 0 až 2, malé procento uhlohydrátů, žádné tuky, - 0,1 až 1,0 % kovu následkem obsahu. 1 až 5 gramatomů/mol nejméně jednoho chelátovaného dvojmocné- ho kovu, majícího průměr iontů v rozmezí od 0,60 do 1,00 X'¹⁰ m, a prakticky žádné chelátované jednomooné kovy nebo ty 'kovy, které jsou buněčnými jedy.

Složení -orgoteinových analogů, pokud jde o aminokyseliny, je značně neměnné bez o.hledu na zdroj, z něhož jsou izolovány.

V tabulce I je uvedeno rozdělení zbytků aminokyselin u několika orgoteinových analogů, uvažováno pro molekulovou hmotnost 32 500.

Z - tabulky I je zřejmé, že orgoteinové analogy -mají 18 až 26, obvykle 20 a 23 lysinových skupin, z nichž všechny až na 1 až 3 mají titrovatelné (kyselinou - trinitrobenzensulfonovou) ε-aminoskupiny. Vynález se proto týká způsobu výroby derivátů orgoteinu, u nichž alespoň část lysinových -skupin orgoteinu je alkylována, -a dále derivátů - orgoteinu, u nichž alespoň část lysinových skupin orgoteinů je karbamoylována.

Z tabulky I je dále patrné, že -orgoteinové analogy mají 29 až 37 skupin kyseliny -asparágové a 21 až 38 skupin -kyseliny- glutamové. Vynález se proto dále týká způsobu výroby derivátů orgoteinu, u nichž alespoň část zbytků těchto aminokyselin ve formě volné kyseliny je esterifikována.

Tabulka I

Aminokyselinové složení několika orgoteinových analogů (Počet zbytků v 1 molu, molekulová hmotnost =32 500)

Aminokyseliny červené krvinky

	játra, hovězí skot	hovězí skot	ovce	kůň	vepř	pes
alanin	19	19	18	18	18	16
arginin	8	8	10	6	'8	8
kyselina asparagová	37	36	35	35	31	29
cystin-1/2	6	6	6	6	6	6
kyselina glutamová	21	23	22	30	28	30
glycin	53	52	52	51	52	53
histidin	16	16	14	20	16	15
isoleucin	18	18	18	14	16	18
leucin	17	17	17	18	16	16
lysin	22	21	23	26	23	20
methionin	2	2	2	2	2	6
fenylalanin	8	8	7	9	8	8
prolin	12	13	15	10	10	10
serin	17	17	14	14	13	20
threonin	26	25	20	16	27	20
tryptofan1	0	0	0	0	0	0
tyrosin1 2	2	2	2	0	4	2
valin	33	32	31	29	29	34
součet	317	315	306	304	307	311

pokračování tab. 1 Aminokyseliny	králík	krysa	červené krvinky morče kuře	člověk	rozmezí
alanin	19	22	22	23	22	16—23
arginin	8	7	8	8	8	6—10
kyselina asparagová	34	30	34	36	37	29—37
cystin-1/2	6	6	4	10	8	4—10
kyselina glutamová	25	38	29	26	28	21—3'8
glycin	54	54	53	56	51	51-56
histidin	17	20	15	17	14	14—20
isoleucin	16	16	1’8	15	17	14—18
leucin	19	12	17	12	20	12-20
lysin	21	18	20	21	23	18—26
methionin	3	4	2	3	1	1-6
fenylalanin	9	6	8	8	8	6—9
prolin	13	10	12	13	12	10—15
serin	18	18	18	15	19	13—20
threonin	21	17	17	18	18	16—27
tryptofan1	0	0	0	1	2	0—2
tyrosin2	0	2	l?	2	(J	0—4
valin	31	32	32	30	30	29—35
součet	315	315	309	317	318	304—318

¹ kolorimetrické stanovení ² průměr analýzy aminokyselin a spektrofotometrického stanovení

Jak je odborníkům zřejmé, některá eisterifikační činidla a podmínky jsou schopny současně alkylovat volné aminoskupiny v molekule orgoteinu a esterifikovat skupiny karboxylové kyseliny. Výroba taikovýchto N-alkylových a esterifikovaných orgoteinů je rovněž částí vynálezu.

Přírodní orgoteinový protein se mezi jiným vyznačuje protizánětli-vou účinností, jak je uvedeno v patentovém spisu US 3 758 682. Má rovněž jedinečně vysokou aktivitu sufperoxidové dismutázy, jak je popsáno McCordem a Fridovicihem v časopisu J. Biol. Chem., 244, 6,176, (1970) a 246, 2,875, (1971).

Překvapivě se protizánětlivá účinnost přírodního proteinu esterifikací, N-alkylací nebo karbaimylací prakticky nemění. Proto jsou deriváty orgoteinu podle vynálezu použitelné týmž způsobem jako přírodní orgotein, například pro léčení zánetlivých stavů u savců a jiných zvířat, jak je popsáno v patentovém spisu US 3 758 682.

Podstatná část aktivity superoxidové dismutázy přírodního proteinu je rovněž zachována u derivátů orgoteinu podle vnálezu, například 20 až 100 % aktivity přírodního proteinu.

jak bylo výše uvedeno, obsahují _ analogy orgoteinu 1'8 až 26 lysinových skupin. Poněvadž molekula orgoteinu sestává ze dvou shodných peptidových řetězců (podjednotek), je polovina těchto· lysinových skupin v každém z těchto řetězců, které se spolu pevně, nikoliv však kovalentně spojí za mírných podmínek teploty a pH. Vzhledem k prostorové stavbě molekuly orgoteinu nejsou obvykle ε-aminoskupiny několika málo lysinů v každém z uvedených řetězců titrovatelné kyselinou ti^.niitool^t^i^2^e^n^su]^l^o^r^ovou a proto nejsou snadno· dostupné pro alkylaci nebo· karbamoylaci. Avšak jak alkylace, tak karbamoylace netitrovatelných lysinových ε-aminoskupin se zdá být též možná za použití vysoce aktivního alkylačního nebo· karOamoylačního činidla, například dimethylsulfátu při pH v alkalické oblasti.

Rozsah alkylace nebo karbamoylace může být určen podle snížení počtu aminoskupin reagujících s kyselinou tгinitrobenzensulfrnovou, s přihlédnutím k . okolnosti, že 1 až 3 lysiny přírodního orgOteinového proteinu jsou netitrovatelné kyselinou trinítrobenzensulfonovou. Například u orgoteinu z hovězího skotu se takto zjistí pouze 18 z jeho· 20 až 22 lysinů. Je třeba mít rovněž na mysli, že mrnralⁱkylrvané lysiny jsou stále ještě acylovatelné, takže pouze do značné míry alkylované orgoteiny se vyznačují snížením počtu acylovatelných lysinových skupin.

Dialkylace a ítialkylace nebo kaг0amrylace lysinových skupin se může sledovat podle změny náboje při elektroforéze N-alikylovaného nebo N-kat0amoylrvanéhr produktu. Ták například u orgoteinu alkylovaného dimethylsulfátem při pH 10 dojde ke změně náboje —2 po acylaci anhydridem octovým ve srovnání s —20 u nealkylovanéhr orgoteinu. Podobně u orgoteinu N-karbamoylovaného methylisothiokyanátem při pH 9 dojde ke změně náboje —2 po 45 minutách.

Jak je známo, elektroforetícká · pohyblivost iontu je funkcí intenzity elektrického pole, účinného náboje iontu (včetně vázaných opačných iontů) a součinitele tření, viz například C. Tanford „Physical Chenistry of Maoromolecules“, nakladatelství Wiley, New York (1969). Poněvadž souí^ii^itel tření závisí na velikosti a tvaru molekuly a na složení roztoku, nejsou srovnání různých proteinů příliš informativní. Avšak při porovnávání proteinů podobné velikosti a tvaru, v tomto případě molekul orgoteinu, chemicky modifikovaných poměrně malými skupinami, za identických elektroforetických podmínek je jedinou proměnnou veličinou ovlivňující tuto elektroforetidkou · pohyblivost účinný náboj.

S touto úvahou je v souhlasu elektroíerotické chování řady chemicky modifikovaných molekul orgoteinu. Přírodní orgotein hovězího skotu skýtá při elektroforéze převážně jedno rozhraní (pás 1), s menším množstvím rychleji se pohybujících rozhraní (pás 2,3 atd.), rovnoměrně vzdálených před hlavním rozhraním, představujících molekuly orgoteinu s větším poměrem počtu skupin -COOH k -NHž, než jaký mají molekuly tvořící rozhraní 1.

Zpracováním přírodního orgoteinu z hovězího skotu, například postupně vyššími koncentracemi anhydridu octového při pH 7 nebo· methylisothiokyanátem -při pH 9 vznikne řada postupně více anodických (pohybujících se ke kladné elektrodě) elektroforetických pásů, jak se postupně stále více volných aminoskupin molekul orgoteinu acetyluje nebo kar0amoyluje. Naopak zpracováním dimethylsulfátem se získá řada pásů postupně více katodických (vzdálených od pásu 1 směrem k záporné elektrodě), jak se postupně stále více volných skupin karboxylových kyselin molekuly orgoteinu esterinkuje.

Grafické znázornění závislosti vzdálenosti, kterou proběhlo rozhraní od startu, na čísle pásu je poměrně lineární u nízkých rozsahů přeměny skupin -COOH nebo -NH2, avšak postupně se zákřivuje při vyšších stupních přeměny, poněvadž existuje mez, jak rychle se i nejvíce nabité složky _ mohou roztokem pohybovat. Rychleji se pohybující složky jsou též citli^vější na koncentraci soli a jsou podstatně zpomaleny při elektroforéze· vzorků obsahujících sůl.

Z tohoto důvodu — protože extrapolace poloh více než asi dvou pásů není vždy přesná — je pro přesné stanovení náboje třeba, aby neznámá látka byla podrobena společné elektroforéze s roztokem, který obsahuje všechny pásy od 1 až po příslušnou polohu (například -částečně acetylovaný nebo částečně kaг0omrylrvaný orgotein).

Všechny běžné reakce pro modifikaci proteinů, které byly až · dosud aplikovány na molekulu orgoteinu, souhlasí s touto interpretací, to jest polohy pásů odpovídají celkovým. změnám náboje oproti molekule přírodního orgoteinu. Jak acetylace, tak karbamoylace a N-methythiOka·rba·mrylace skýtají pásy 2, 3, 4, 5 atd., což naznačuje, že 1, 2, 3, popřípadě 4 volné aminoskupiny byly chemicky modifikovány. Podobně sukcinylace, kterou se skupiny ~NH3⁺ mění na · skupiny

-NHOCHCHaCOO—,

II o

skýtá pásy 3, 5, 7, 9 atd., a extenzivnější karbamoylace nebo thiokarbamoylace, které mění ještě další skupiny na skupiny

-NHCNH—R a

II .

O ~NHCNH—R,

II s

skýtá ' pásy 6, 7, 8, 9 atd. Esterifikací dimethylsulfátem nebo ethyldiazoacetátem se získají pásy —1, —2, —3, —4 atd,, což naznačuje, že 1, 2, 3, popřípadě 4 skupiny karboxylové kyseliny byly chemicky modifikovány.

Obecně řečeno, většina, například všechny lysiny až na 2 a 4, mohou být alkylovány, dokonce i mírnějšími alkylačními činidly, nebo karbamoylovány. Všechny až asi na jednu z dostupných (tj. titrovatelných kyselinou trinitro'brnzrnsulf onovou) lysinových skupin v každé z paptidových podjednotek orgoteinu mohou být polyaikylovány použitím silnějších alkylačních podmínek, například - - nadbytkem dimethylsulfátu, 0,04 M uhličitanového pufru při pH 10.

Jak lze očekávat , když méně než všechny z titrovatelných lysinových aminoskupin jsou alkylovány nebo karbamoylovány, je rozložení alkylových nebo karbamoylových skupin na molekule orgoteinu pravděpodobně náhodné, poněvadž žádná z titrovatelných lysinových' aminoskupin se nezdá abnormálně snadno alkylovatelná nebo přeměnitelná na karbamoylované aminoskupiny. Protože molekula orgoteinu se skládá ze dvou shodných peptidových řetězců, budou alkylové skupiny částečně alkylovaného orgoteinu a N-kar.bamoylované aminoskupiny částečně karbamoylovaného orgoteinu rozloženy více nebo méně náhodně po každé z obou peptidových podjednotek, avšak více nebo méně stejně u obou těchto řetězců. Poněvadž se obvykle používá jediného alkylačního nebo karbamoylačního činidla, budou všechny alkylové skupiny popřípadě karbamoylované aminoskupiny ' shodné. Je však též možné připravit alkylované orgoteiny a karbamoylované orgoteiny, které mají dvě nebo více rozdílných alkylových 'skupin v molekule, a dokonce v každém z obou řetězců.

Jednou cestou, jak připravit orgotein se smíšenými alkylovými skupinami, je alkylace ve stupních za použití různých alkylačních činidel. Tak například je možno část titrovatelných lysinových ε-aminoskupin alkylovat ' za použití mírné koncetrace jednoho- alkylačního činidla, například jodacetamídu, a zbytek reaktivních aminoskupin alkylovat použitím vyšší koncentrace jiného alkylačního činidla, například -dimethylsulfátu. Co se rozumí nízkou nebo- vysokou koncentrací alkylačního činidla, bude záviset na poměrných - reakčních rychlostech s proteinovými aminoiskupinami a -s rozpouštědlem ' a tak bude záviset na pH reakčního prostředí a na alkylačním činidle a v menší míře i n^la pufru a teplotě.

Jedním ze způsobů, jak připravit orgotein se -smíšenými N-karbamoylovanými skupinami, je karbamoylovat ve stupních za použití různých karbamoylačních činidel. Tak například -část titrovatelných lysinových ε-aimÍnos.kupin může být karbamoylována mírně reaktivním karbamoylačním činidlem, například KNCO, a zbytek reaktivních aminoskupin může být karbamoylován reaktivnějším karbamoylačním činidlem, například methylisokyanátem. Reaktivita karbamoylačního činidla závisí na -poměrných rychlostech reakce -s proteinovými aminoskupinami a s reakčním rozpouštědlem a tím i na pH reakčního prostředí a na karbamoylačním činidle a v menší míře i na pufru a teplotě.

Jinou metodou, jak připravit smíšený alkylovaný nebo - smíšený N-karbamoylovaný orgotein, je hybridizace. Pojmem hybridizace orgoteinu -se rozumí tvorba smíšeného orgoteinu z peptidových řetězců dvou různých molekul orgoteinu, například Az a Bž, přičemž A a B představují jejich příslušné peptidové řetězce (A2 + Bž^2 AB). Náboj heterodimeru, AB, při elektroforéze by měl být průměrem náboje homodimerů A2 a B2, za předpokladu, že ve všech případech se spojení účastní táž -část každé z obou podjednotek.

Jak ε-N-methylorgotein, vyrobený alkylací molekuly přírodního orgoteinu nadbytkem dimethylsulfátu v 0,04 M uhličitanovém pufru o pH - 10, tak ε-N-ethylorgotein, připravený alkylací orgoteinu týmž způsobem diethylsulíátem, tak i ε-N-propylkarbamoylorgotein, připravený karbamoylací molekuly přírodního orgoteinu nadbytkem -propylisokyanátu v 0,1 M roztoku tris nebo fosforečnanového pufru o pH 7,6, nebo konečně ε-N-^f^n^^^lthiokarbamoylorgotein, vyrobený karbamoylací orgoteinu methylisokyanátem v 0,075 M - roztoku tetraborit^anu sodného, všecny mohou být hydridovány s přírodním orgoteinem nebo spolu navzájem společným zahříváním při teplotě - 50 °C po dobu 4 hodin.

Jak je zřejmé, mohou být tyto hybridní semialkylované a semikarbamoylované molekuly orgoteinu dále alkylovány nebo karbamoylovány odlišným alkylačním nebo karbamoylačním činidlem -za -vzniku hybridního alkylovaného nebo karbamoylovaného orgoteinu, u něhož -alkylové skupiny a popřípadě karbamoylované - aminoskupiny v jednom· -peptidovém řetězci se liší od těchto skupin v druhém řetězci.

ε-N-alkylorgoteiny a ε-N-karbamoylorgoteiny podle vynálezu se zdají mít prakticky tutéž prostorovou strukturu jako -molekula přírodního orgoteinu. Obsah chelatovaných Cu⁺⁺ a Zn++ iontů (počet gramatomů na 1 mol] je přibližně -týž jako u orgoteinu. Podobně jako orgotein jsou - vysoce odolné vůči pronáze a degradaci jinými proteolytickými enzymy. Enzymatická aktivita superoxidové dismutázy je zachována, ačkoliv v případě karbamoylovaných orgoteinů je snížena v závislosti na stupni 'karbamoylace.

Ačkoliv převažující strukturní modifikací molekuly přírodního orgoteinů, k níž dochází při jeho .alkylaci nebo karbamoylaci při pH v alkalické oblasti, je v případě alkylace monoalkylace, dialkylace a v menším rozsahu trialkylace ε-N-aminoskupin jeho lysinových zbytků, a v případě karbamoylace pak karbamoylace těchto ε-aminoskupin, mohou. být volné aminoskupiny jeho argininových zbytků a volné skupiny karboxylových kyselin zbytků kyseliny esparágové a kyseliny glutamové, jakož i jiné alkylovatelné skupiny přítomné v molekule, zejména skupiny -OH, a imidazolový dusík a popřípadě též guanidinový dusík, skupiny -SH, -SCH3 atd. rovněž současně alkylovány nebo karbamoylovány podle použitých podmínek a reaktivity alkylacního nebo karba'moylačního činidla. Tak například zatímco při pH 10 se alkylace jodacetamidem zdá být pouhou ε-N-alkylací, je alkylace dimethylsulfátem při pH 10 méně selektivní a současně se jí zavádějí methylové skupiny jinam do molekuly. Rovněž takovéto průvodně alkylované orgoteiny, mající ε-N-alkylové skupiny, jsou zahrnuty .mezi nové sloučeniny podle vynálezu. Avšak v případě karbamoylace jsou takovéto· souběžně modifikované skupiny labilní a snadno hydrolyzovatelné ve vodných roztocích během jednoho dne nebo i během kratší doby, což závisí na hodnotě pH.

Průběh alkylace, pokud zahrnuje alkylaci -COOH-skupin, a průběh karbamoylace je možno sledovat přímo podle změny celkového elektroforetického náboje a podle vzniku nových pásů při elektrolOi^é^zz\ Podobně může být N-alkylace, poněvadž přeměňuje jinak acylovatelnou skupinu -N--I2 na skupinu odolnou vůči acylaci, sledována podle snížení počtu acylovatelných aminoskupin ve srovnání s molekulou přírodního orgoteinů.

Přesná povoha N-alkylových a N-karbamoylových skupin, jakož i jejich počet není rozhodujícím činitelem, pokud jen je alkylový nebo karbamoylový zbytek fyziologicky vhodný. Vzhledem k vyšší molekulové hmotnosti molekuly orgoteinů, i když je molekula orgoteinů plně alkylována nebo karbamoylována alkylovými nebo karbamoylovými skupinami nižší molekulové hmotnosti, například g 100, je vliv na celkové chemické složení poměrně malý, to jest menší než . 100 procent. Alkylace a karbamoylace rovněž nemá žádný výrazný účinek na prostorové uspořádání molekuly a na výslednou stabilitu, například vůči zahřívání při teplotě 60 stupňů Celsia po dobu 1 hodiny a vůči napadení proteolytickými enzymy.

Jak bude dále zřejmé, musí alkylová nebo karbamoylová skupina rovněž pocházet z alkylačního nebo karbamoylačního činidla, schopného· alkylovat, popřípadě karbamoylovat aminOskupinu ve vodě nebo v roztoku pufru, poněvadž se · reakce obvykle · provádí v tomto prostředí.

Takováto alkylační činidla zahrnují primární dialkylsírany: (ROžSOž kde R=CH3, C2H5, n-CsHz, n-Ci-lH, aktivované alkylhalogenidy: JCH2COX, kde X = 0H, NH2, benzylbromid a allylbromid, aktivované vinylové skupiny: CH?=CHX, kde X = CN, SOCHs SCC.2H5, · CCCH3 redukční alkylační činidla: R.COOR-BH^ nebo BHaCN“, kde R a R‘ ·=' = H, CH3, C2H5, C6H5.

Metoda redukční alkylace proteinů aromatickými aldehydy a natriumkyanborhydI ridem je popsána· Friedmanem M. a· spol. v časopisu Int. J. Peptide Protein Res., 6, 1974, str. 183—185, . alkylace . akrylonitrilem pak Meansem a Feeneyem v knize „Chemical Modifitacion of Proteins“, kapitola 6, 114— —117, Fletcherem J. C., v časopisu Biochem. J. 98 34C (1966), Friedmanem M. a spol. v časopisu J. Amer. Chem. Soc. 87, str. 3672 (1965) a Friedmanem M. a spol. v časopisu J. Org. Chem., 31, str. 2888 (1966).

Příklady vhodných karbamoylačních činidel zahrnují kyanáty alkalických kovů, například NaNCO, KNCO, alkylisokynáty a alkylisothiokyanáty, například RNCO a RNCS, kde R = CH3, C2H5, n-CíHr, n-CdH9, n-CaHiz, a arylisokyanáty a isokyanáty, například fenylisokyanát a fenylisothiokyanát.

Ačkoliv kyanáty kovu reagují s mnoha druhy postranního řetězce, skýtá stabilní produkt . pouze jejich reakce s aminosikupinami, kterou se přemění ve skupiny močoviny.

Reakce alkylisothiokyanátů a alkylisokyanátů s orgoteinem je zcela obdobná reakci kynátů s orgoteinem, pouze mnohem rychlejší. Isokynáty s dlouhým řetězcem jsou méně reaktivní než isokyanáty s krátkým řetězcem.

Reakci orgoteinů s isokyanáty a isothiokyanáty je obvykle možno sledovat použitím činidla, které vnáší do· molekuly fluorescenční skupinu, jakým je například isothiokyanát fluoresceinu. Toto činidlo je podobné alkylisokyanátům a reaguje s aminoskupinami orgoteinů za vzniku substituovaných thiomočovin. Avšak i nízký .stupeň substttuce snižuje· ve značné míře aktivitu superoxidové dismutázy orgoteinů vzhledem k množství fluoresceinu.Monosubstituované a disubstituované orgoteiny nejsou v roztoku stálé a pozvolna se stávají více heterogenními následkem výměny mezi podjednotkami a následkem hydroýzy.

Poněvadž na tom, o jaký alkylový zbytek v molekule .orgoteinů jde, nezáleží, pokud jen není fyziologicky toxický a může být vytvořen na · lysinových e-aminoskupinách, jsou případnými ekvivalenty výhodných výše popsaných uhlovodíkových alkylových skupin, pokud jen mohou být vytvořeny, cyklopentylová, cyklohexylová, . methylová a podobná cykloalkylová, cyklohexylmethylová, /J-cyklopentylpropyiová a podobná cykloalkylal203992 kýlová, dále benzylová, p-xylylová a fene'thylová a podobná aralkylová skupina.

Rovněž možnými ekvivalenty jsou alkylové skupiny s 1 až 8, s výhodou 1 až 4 atomy uhlíku, a zejména methylový nebo ethylový zbytek nejméně s jedním, výhodně s jedním jednoduchým substituentem, jako je karboxylová skupina, kyanoskupina, karbalkoxylová skupina a amidoskupina, například karboxymethylová, kyanomethyíová, karbethoxymethylová, karbmethoxymethylová skupina, a podobně karb-nižší alkoxymethylová, karbamoylmethylová skupina, jakož i příslušně substituované ethylové skupiny, například skupiny -CH2CH2COOH, -CH2CH21CS N, -CH2CH2CONH2 a -CH2CH2COOR, kde R znamená · například methylový ' nebo ethylový zbytek, skupinu -CH2CH2SOCH3, -CH2CH2SOC2H5 .. a -CH2CH2COCH3.

Jsou tedy alkylovanými orgoteiny podle vynálezu analogy orgoteinu z hovězího· Skotu, ovcí, koní, vepřů, psů, králíků, morčat, kuřat a lidí, · jejichž nejméně jedna, například 1, 2, 3, 4, 5 a až všechny (asi 18 až 26] titrovatelné aminoskupiny jsou alkylovány, to jest, mají nesubstituovanou nebo substituovanou alkylovou skupinu.

S výhodou jsou alkylovanými aminoskupinami skupiny vzorce —NH—CHz—R , kde R znamená vodík, skupinu CH3, C2H5, n-C3H7 nebo jinou alkylovou skupinu až se 7 atomy uhlíku, skupinu -COOH, -COO-LA, -CONH-LA, -CON-(LA)2, -CN, -CH2-CN, -Ph, -COPh, -CH2OH nebo -СН(СНз) OH, kde LA znamená alkylový zbytek s 1 až 4 atomy a Ph znamená nesubstituovaný fenylový zbytek nebo fenylový zbytek s 1 až 3 jednoduchými substituenty, například methylem, chlorem, bromem, nitroskupinou, amidoskupihou a methoxyskupinou, karboxyskupinou nebo karboethoxyskupinou, jako je např. p-tolylový, sym-xylylový, p-amidofenylový, m-chlorfenylový a p-methoxyfenylový zbytek.

Takové orgoteiny mají obecný vzorec (H2N)_m-org-(NHCH2R)n , kde n- znamená c-elé číslo od 1 do přibližně 26, s výhodou ' nejméně 10, zejména 10 až 18, a součet m + n znamená celkový počet titrovatelných volných ' aminoskupin v nemodifikovaném analogu, a R má výše uvedený význam, s výhodou znamená vodík nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, například methylovou skupinu, a org znamená zbytek molekuly orgoteinu.

Některá z alkylačních . činidel používaná při způsobu podle vynálezu budou současně alikylovat některé ze skupin volné kyseliny molekuly orgoteinu. Tyto alkylované orgoteiny je možno znázornit obecným vzorcem (HOOC)_X (COOCHžRJy \ / (org) / \ (H2N)m (NHCH2R)n kde org, R m a n mají výše uvedené významy, y znamená počet alkylovaných skupin volné karboxylové kyseliny, například 1 až 8, s výhodou 2 až 6, a x znamená zbytek skupin volné karboxylové kyseliny v .molekule orgoteinu.

Činidly vhodnými pro zavádění karboxymethylové a karbamoylmethylové skupiny jsou kyselina jodoctová a jodacetamid.

Kyselina jodoctová může tvořit stabilní produkty s cysteinovými (sulfhydryl), lysinovými (amino), histidinovými (imidazolové dusíky] a methioninovými (.s^lfidická síra) zbytky v proteinech. *

Poněvadž karboxymethylací kterékoliv z těchto skupin, s výjimkou methioninu, se zvyšuje účinný záporný náboj v orgoteinovém proteinu při pH 8,4, je možno celkovou reakci kvantitativně vyhodnotit elektroforeticky (vyjma karboxymethylace methioninu a karboxymethylace druhého imidazolového dusíku').

U. přírodního orgoteinu reagují kyselina jodoctová a jodacetamid převážně, ne-li výhradně, s lysinovými aminoskupinami. Ačkoliv volné thioly reagují s kyselinou jodoctovou řádově několikrát než aminy, nereaguje · prvních několik skupin v orgoteinu, které jsou karboxymethylovány, nijak . znatelně rychleji než reaguje dalších 10 až 20 skupin. Toto je v souhlasu s reakcí p-merkuribenzoátu se sulfhydryly · orgoteinu: nedochází k žádné reakci s holoproteinem. I u apoproteinu, který skýtá p-merkuribezoátsulfhydrylovou reakci (třebaže pomalou za nedenaturujících podmínek), nedochází při použití kyseliny . jodoctové v desetinásobném moiárním nadbytku při pH 7 k žádnému poklesu po několika týdnech při teplotě 4°C v obsahu sulfhydrylu (stanoveno· spektrofotometricky titrací pjmerkuribenzoátem. Závislost karboxymethylační reakce na pH, jak vyplývá z elektroforézy, je v souhlasu s reakcí lysinu (pk > &) a nikoliv histidinu (pK < 6), poněvadž rozsah reakce při stejných počátečních koncentracích se neustále zvyšuje v té míře, jak se hodnota pH blíží 9, přičemž nedochází k žádné znatelné reakci při neutrální hodnotě nebo pod ní, kdy hlstidin . by stále měl být neprotonovaný a reaktivní. Na druhé straně titrace ethylchlorformiátem na histidin ukázala pouze 5 histidinů v karboxymethylovaném orgoteinu za podmínek, při nichž ce jich v přírodním orgoteinu ukazuje 16.

Důkaz, že u přírodního orgoteinu z hovězího skotu nedochází k reakci ani u methio203992 ninu ani u histidinu, vyplynul z pokusu, při němž byl orgotein inkubován po 48 hodin s 0,2 M roztokem jodacetamidu v 0,5 M fosforečnanovém pufru o pH 6,5. Alkylací methioninu nebo dvojitou alkylací histidinu by byl měl vzniknout více pozitivně nabitý protein při pH 8,4, avšak při elektroforéze se neprojevila žádná změna aktivity superoxidové dismutázy ani změna v soustavě pásů.

Avšak lysinové aminoskupiny v orgoteinu rozhodně reagují s jodacetátem. Extenzívně karboxymethylovaný orgotein se při elektroforéze pohybuje podobně jako acetylovaný orgotein, má však nižší aktivitu superoxidové dismutázy (přibližně 20 % nemodifikovaného· orgoteinového proteinu).

Kromě N-rnethylorgoteinů z hovězího skotu a orgoteinů z · dále uvedených · příkladů jsou dalšími příklady N-alkylorgoteinů z hovězího skotu podle vynálezu N-ethylorgotein, N-propylorgotein a N-benzylorgotein, kde v každém případě je 9 takových alkylových skupin v každé z obou podjednotek molekuly orgoteinu, popřípadě příslušné orgoteiny, u nichž je v průměru 1, 6 nebo 10 takových alkylových skupin v každé této podjednotce, a příslušné analogy těchto orgoteinů z lidí, ovcí, koní, vepřů, psů, králíků, morčat a kuřat.

Karbamoylovanými orgoteiny podle vynálezu jsou analogy orgoteinu z hovězího skotu, ovcí, koní, vepřů, krys, psů, králíků, morčat, kuřat a lidí, u nichž alespoň jedna, například 1, 2, 3, 4, 5 až všechny (přibližně 18 až 26) titrovatelné aminoskupiny jsou karbamoylovány, to jest mají nesubstituovanou nebo substituovanou skupinu —CONH— nebo —CSNH—.

Výhodně jsou karbamoylovanými aminoskupinami aminoskupiny obecného vzorce

X

II —NHCNHR, kde

X znamená kyslík nebo síru a

R znamená skupinu CH3, · C2H5, n-CsHť, n-CsHi.7 nebo jinou alkylovou skupinu s až 12 atomy uhlíku, Ph nebo, když X znamená kyslík, rovněž atom vodíku, a Ph znamená nesubstituovanou fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu mající 1 až 3 jednoduché substituenty, jakými jsou například methylový zbytek, chlor, brom, nitroskupina, amidoskupina a methoxyskupina, karbomethoxyskupina nebo karboethoxyskupina, například p-tolylový, s-xylylový, p-amidofenylový, m-chlorfenylový a p-methoxyfenylový zbytek. Takovéto· orgoteiny mají vzorec

X

II (H2N)_m-org-(NHCNH-R)_n, kde n znamená celé číslo· od 1 asi do 26, s výhodou nejméně 2, zejména pak 6 až 10, a součet n + m znamená celkový počet tltrovatelných volných aminoskupin v nemodifikovaném analogu,

X znamená kyslík nebo síru,

R má výše uvedený význam, ·s výhodou vodík nebo alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku, a org znamená zbytek molekuly orgoteinu.

Obzvlášť výhodnými karbamoylovanými orgoteiny jsou alkylkarbamoylorgotein a alkylthiokarbamoylorgotein u nichž alkylovou skupinou je nesubstituovaný alkylový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku, například methylový, ethylový, propylový, isopropylový, butylový nebo oktylový zbytek.

Poněvadž na tom, o jakou karbamoylovou skupinu v molekule orgoteinu jde, nezáleží, pokud jen není fyziologicky toxická a může být vytvořena na lysinových ε-aminoskupinách, jsou případnými ekvivalenty výhodných výše popsaných alkylkarbamoylorgoteinů, pokud jen mohou být vytvořeny, ty, které jinak odpovídají výše uvedenému vzorci, kde R znamená · cyklopentylový, cyklohexylový, methylový a podobný cýkloalkylový, dále cyklohexylmethylový, /-cyklopentylpropylový a podobný · cykloalkylový, benzylový, pcχklklový a fenethylový a podobný aralkylový zbytek.

Rovněž možnými ekvivalenty jsou ty orgoteiny výše uvedeného vzorce, kde R znamená alkylový zbytek s 1 až 8, s výhodou 1 až 4 atomy uhlíku, · zejména pak methylový nebo · ethylový zbytek případně substituovaný nejméně jedním, výhodně jedním jiným· substituentem, například fluoresceinylovým zbytkem.

Kromě N-karbamoylovaného orgoteinu z hovězího skotu z následujících příkladů jsou dalšími příklady N-karbamoylorgoteinu z hovězího skotu podle vynálezu příslušný N-karbamoylorgotein, Ncpropylkarbamoylorgotein, NcεthklkaгbamΌylorgotem a N-methylthiokarbamoylorgotein, u nichž je vždy 9 takovýchto karbamoylových skupin v každé z obou podjednotek molekuly orgoteinu, a příslušné orgoteiny, u nichž je průměrně 1, 6 · nebo 10 takovýchto karbamoylových skupin v každé z obou podjednotek, a dále příslušné lidské, ovčí, koňské, vepřové, psí, králičí, morčí, kuřecí a krysí analogy každé z uvedených sloučenin.

Jak již bylo výše uvedeno, obsahují analogy orgoteinu asi 50 až 68 zbytků kyseliny glutamové a asparágové, avšak pouze asi 20 až 27 z těchto zbytků má skupiny volné kyseliny. Poněvadž molekula orgoteinu sestává ze dvou shodných nebo téměř shodných peptidových řetězců (podjednotek), je polovina z těchto zbytků aminokyselin v každém z obou řetězců, které se k sobě za mírných podmínek teploty a pH pevně, avšak nikoliv kovalentně váží. Esterifikací se změní náboj molekuly orgoteinu a obvykle pouze jen · až 10, s výhodou jen až asi 6 až 8 z těchto skupin volné kyseliny může být esterifikováno, přičemž si stále zachovávají onu strukturu přírodní molekuly, na níž závisí stabilita a použitelnost této látky.

Esterifikace skupin karboxylové kyseliny může být kvantitativně sledována podle změny náboje při elektroforéze. Je-li to žádoucí, může být esterifikovaný orgotein hybridován přírodním orgoteinem, jak je v dalším popsáno, čímž se o polovinu sníží počet skupin esterifikované karboxylové kyseliny v molekule.

Protože molekula . orgoteinu se skládá ze dvou shodných peptidových řetězců, jsou esterové skupiny pravděpodobně více nebo méně rovnoměrně rozděleny mezi oba řetězce. Poněvadž se obvykle používá jediného esterifikačního činidla, budou všechny esterové skupiny shodné. Avšak je možné připravit esterifikované orgoteiny, které mají dvě nebo ' i více různých esterových skupin v molekule a dokonce i v každém svém řetězci.

Jedním způsobem, jak připravit smíšený ester orgoteinu, je postupná esterifikace různými esterifikačními činidly. Tak například je možno část skupin volné kyseliny esterifikovat jedním esterifikačním činidlem o nízké koncentraci, například diethylsulfátem, a další část skupin volné kyseliny esterifikovat jiným esterifikačním činidlem o vysoké koncentraci, například diazomethanem. Co se rozumí nízkou, popřípadě vysokou koncentrací esterifikačního činidla, bude záviset na jeho poměrných rychlostech reakce s kyselými skupinami proteinu a s rozpouštědlem, a tím bude záviset na pH reakčního prostředí a na esterifikačním činidle a v menší míře na pufru a teplotě.

Jinou metodou, jak získat smíšený ester orgoteinu, je hybridizace. Pojem hybridizace orgoteinu vyjadřuje tvorbu smíšeného orgoteinu z podjednotkových řetězců dvou různých molekul orgoteinu, například . Až a Bž, kde A a B znamenají jejich příslušné peptidové řetězce (Α2 + Β22ΎΑΒ). Při etektroforéze by náboj heterodimeru AB měl být průměrem nábojů homodimerů Až a B2, za předpokladu, že ve všech případech se spojení účastní táž .část každé z obou podjednotek.

Jak methylorgotein, tak ethylorgotein mohou být hýbridovány přírodním orgoteinem nebo spolu navzájem zahříváním s malým nadbytkem přírodního orgoteinu při teplotě 50 ^;°C po dobu 4 hodin. Výsledné heterodimery se při elektroforéze projeví jako směs pásů, ležících mezi pásem přírodního orgoteinu a pásy esterifikovaného orgoteinu před hybridizací.

Jak je zřejmé, mohou · být tyto hybridní molekuly semiesterifikovaného orgoteinu dále esterifikovány jiným esterifikačním činidlem .za vzniku hybridního. esterifikovaného orgoteinu, u něhož se esterové skupiny v jednom peptidovém řetězci liší od esterových skupin v druhém řetězci.

Esterifikované orgoteiny podle vynálezu se zdají mít prakticky tutéž prostorovou strukturu jako molekula přírodního orgoteinu. Obsahy chelatovaných Cu++ a Zn+⁺ iontů (počet gramatomů na 1 mol) jsou přibližně stejné jako u orgoteinu. Podobně jako orgotein jsou vysoce odolné vůči pronáze a degradaci jinými proteolytickými enzymy. Enzymatická aktivita superoxidové dismutázy se znatelně nesníží, dokud není esterifikováno více než asi 6 až 8 skupin karboxylové kyseliny.

Povaha esterifikujících skupin podobně jako počet esterifikovaných skupin není rozhodující, pokud jen je esterifikující skupina fyziologicky vhodná. Vzhledem k vyšší molekulové hmotnosti molekuly orgoteinu, i když je molekula orgoteinu esterifikována esterifikujícími skupinami nízké molekulové hmotnosti, například ál60, je vliv na celkové chemické složení poměrně malý, to jest menší než 5 %. Esterifikace skupin volné karboxylové kyseliny má samozřejmě velký vliv na isoelektrický bod a na výslednou elektroforetickou pohyblivost, avšak — jak již bylo výše uvedeno — pokud je esterifikace omezena asi na 10 nebo· méně skupin kyseliny glutamové a asparágové, nemá žádný výrazný vliv na prostorové uspořádání molekuly a na výslednou stabilitu, · například vůči zahřívání při . teplotě 60 °C po 1 hodinu a vůči napadení proteolytickými enzymy.

Jak bude dále zřejmé, esterifikující skupiny musí též pocházet z esterifikačního· činidla schopného esterifikovat skupinu karboxylové kyseliny ve vodném roztoku nebo v roztoku pufru, poněvadž se reakce obvykle provádí v těchto prostředích. Takováto esterifikační činidla zahrnují dimethylsulfát a diethylsulfát, diazomethan a jiné diazosloučeniny, například vzorce

N2CH2COX, kde

X znamená například skupiny OCH3, OC2H5, NH2 nebo NHCH2CONH2, a jiné estery a amidy diazooctové kyseliny, které nemají reaktivní skupiny, jako je karboxylová skupina nebo iminoskupina.

Metody přípravy takovýchto esterů jsou popsány v příručce „Methods in Enzymology,“ sv. XI, str. 612 (1967), a dále v Biochem. Biohys, Ress. Comm., 30, str. 489 (196’8) K. T. Fryem a spol., a v PNAS, 56, str. ’ 1817 (1966), G. R. Delpierrem a J. S. Frutonem.

Dále se vynález týká orgoteinu s esterifikovanou COOH skupinou, u něhož esterová skupina má výhodně až 4 atomy uhlíku, například od jednomocného alkanolu, jako· je methylová nebo ethylová, s výhodou methylová skupina.

Poněvadž na tom, 0 jaký esterový zbytek jde, nezáleží, pokud jen není fyziologicky toxický · a může být vytvořen na skupinách volné kyseliny v orgoteinu, jsou případnými ekvivalenty výhodných alkylových esterifikujících výše popsaných skupin, pokud jen mohou být vytvořeny, ty, které mají jeden, dva nebo více · jednoduchých substituentů, například halogen, alkoxyskupinu, karbal17 koxyskupinu, karbaminoskupinu atd., zejména pak ty, u nichž je esterovou skupinou nesoucí substituent nebo substituenty methylová skupina. Tak například, kromě esterifikováného orgoteinů, u něhož jsou skupinami esterifikované kyseliny skupiny —СООСНз, jsou případnými ekvivalenty ty sloučeniny, u nichž jsou esterovými skupinami skupiny —COOR, kde R znamená skupinu —GHzCOX, v níž X znamená skupinu ОСНз, OCžils, N112, NHCH2CONH2 nebo CHžCHz-fenyl, nebo kde R znamená skupinu СИ (fenyl )2.

Esterifikace skupin —COOH může být následována stanovením změny náboje zjištěné elektroforeticky srovnáním s přírodními orgoteiny.

Jak je známo, elektroforetická pohyblivost iontu je funkcí intenzity elektrického pole, účinného náboje iontu (včetně vázaných 0pačných iontů) a součinitele tření, viz například příručku C. Tanforda „Physical. Chemistry of Macromolecules“, nakladatelství Wilsy, New York (1966). Poněvadž součinitel tření závisí na velikosti a tvaru molekuly a 11a složení roztoku, nejsou srovnání různých proteinů příliš informativní. Avšak srovnávají-Ii se proteiny podobné velikosti a tvaru, v tomto případě molekuly orgoteinů chemicky modifikované poměrně malými skupinami, za identických elektroforetických podmínek, je jedinou proměnnou veličinou ovlivňující tuto elektroforetickou pohyblivost účinný náboj.

S tímto závěrem je v souhlasu elektroforetické chování řady chemicky modifikovaných molekul orgoteinů. Přírodní orgotein z hovězího skotu skýtá při eiektroforéze převážně jedno rozhraní (pás 1) s menším množstvím rychleji se pohybujících rozhraní (pásy 2, 3 atd.) rovnoměrně vzdálených před hlavním rozhraním, představujících molekuly orgoteinů s vyšším poměrem počtu skupin —COOH к — NH?, než jaký mají molekuly tvořící rozhraní 1. Esterifikace postupně vyšších počtu volných skupin —COOH přírodního orgoteinů z hovězího skotu vede к vytvoření řady postupně více katodických (pohybujících se к záporné elektrodě) elektroforetických pásů, jak se postupně stále více skupin volné karboxylové kyseliny molekuly orgoteinů esterifikuje.

Grafické znázornění závislosti vzdálenosti, kterou rozhraní proběhlo od startu, na čísle pásu je poměrně lineární u nízkých rozsahů přeměny skupin —COOH, avšak postupně se zakřivuje při vyšších stupních přeměny, protože existuje mez, jak rychle se i nejvíc?, nabité složky mohou roztokem pohybovat. Rychleji se pohybující složky jsou též citlivětší na koncentraci soli a jsou podstatně zpomaleny při eiektroforéze iontů obsahujících sůl. Z tohoto důvodu — protože extrapolace poloh více než asi 2 pásů není vždy přesná -..... je pro přesné stanovení ná boje třeba, aby neznámá látka byla podrobena společné eiektroforéze s roztokem, který obsahuje všechny pásy od 1 až po příslušnou polohu (například částečně acetylovaný orgotein).

Všechny běžné reakce pro modifikování proteinů, které byly až dosud aplikovány na molekulu orgoteinů, souhlasí s touto interpretací, to jest polohy pásů odpovídají celkovým změnám náboje oproti molekule přírodního orgoteinů. Esterifikace dimethylsulfátem nebo ethyldiazoacetátem skýtá pásy -1, -2, -3, -4 atd., což naznačuje, že 1, 2, 3, popřípadě 4 skupiny volné karboxylové kyseliny byly chemicky modifikovány.

Obecně řečeno, nejvýše jen asi osm z volných skupin —COOH může být esterifikováno bez škodlivých účinků. Pokusy esteriflkovat více než 6 až 8 skupin —COOH, to jest esterifikovat více než tři skupiny —COOH každé z obou peptidových podjednotek orgoteinu, obvykle vedou к denaturaci a ztrátě aktivity superoxidové dismutázy.

Jak lze očekávat, rozložení esterifikujících alkoxylových skupin na molekule orgoteinu je pravděpodobně náhodné, poněvadž žádná z titrovatelných volných karboxylových skupin se nezdá mimořádně snadno esterifikovatelná. Protože molekula orgoteinu sestává ze dvou shodných peptidových řetězců, budou esterové skupiny částečně esterifikovaného orgoteinů rozloženy více nebo méně náhodně podél každé peptidové podjednotky, avšak více nebo méně stejně mezi oba tyto řetězce. Poněvadž se obvykle používá jediného esterifikačního činidla, budou všechny esterové skupiny shodné. Je však též možné připravit esterifikované orgoteiny, mající dvě nebo více různých esterových skupin v molekule a dokonce v každém z obou řetězců.

Jedním ze způsobů, jak připravit smíšený esterifikovaný orgotein, je provést esterifikací postupně za použití různých esterifikačních činidel. Tak například je možno část volných skupin —COOH esterifikovat jedním esterifikačním činidlem, například dimethylsulfátem, a zbytek reaktivních skupin —COOH esterifikovat jiným esterifikačním činidlem, například ethyldiazoacetátem.

Jinou metodou, jak připravit smíšený esterifbkovaný orgotein, je hybridizace, Pojmem hybridizace orgoteinů se rozumí vytvoření smíšeného orgoteinů z podjednotkových řetězců dvou různých molekul orgoteinů, například Аг а B2, přičemž А а В představují jejich příslušné peptidové řetězce (Аг + Вз* -2AB). Náboj heterodimeru AB pře elektroforéze by měl být průměrem náboje homodimerů A? а B2, za předpokladu, že ve všech případech se spojení účastní táž část každé z obou podjednotek.

Jak methylovou skupinou esterifikovaný orgotein, připravený esterifikaci asi 6 volných kyselinových skupin molekuly orgoteinu dimethylsulfátem, tak karboxymethylovou skupinou esterifikovaný orgotein, připravený esterifikováním molekuly přírodního orgoteinů ethyldiazoacetátem, se může hyb203992 řádovat přírodním orgoteinem nebo spolu navzájem společným zahříváním při teplotě 50· °C po dobu 4 hodin. Kromě derivátů orgoteinu z hovězího skotu, uvedených v následujících příkladech, jsou dalšími příklady derivátů orgoteinu podle vynálezu příslušné deriváty jiných analogů orgoteinu.

Jinými příklady esterifikovaných orgoteinů z hovězího skatu jsou karbomethoxymethylorgotein a karbamoyimethylorgotein, u nichž jsou v každé z obou podjednotek molekuly orgoteinu vždy 3 až 4 takovéto esterifikované skupiny, a příslušné esterifikované orgoteiny, u nichž jsou v každé takovéto podjednotce 1 až 2 takovéto esterové skupiny, a dále příslušné lidské, ovčí, koňské, vepřové, psí, králičí, morčí a· kuřecí analogy každé z těchto sloučenin.

Deriváty orgoteinu se mohou izolovat z reakčního roztoku, s výhodou po dialýze k odstranění cizích iontů, běžnou lyofilizací, například postupem popsaným v patentovém spisu US 3 658 682. Je-li· to žádoucí, může· se derivát orgoteinu nejprve přečistit chromatograficky výměnou iontů na pryskyřici, -elektroforeticky a/nebo filtrací přes gel za použití polymeru, který se chová jako molekulární síto.

Filtrací mikropórovitým filtrem o velikosti pórů v rozmezí od 0,01 až 0,22 μ/m za aseptických podmínek do sterilních lékovek, popřípadě po úpravě iontové síly chloridem sodným a/nebo fosforečnanem sodným, například až na isotonicitu, se získá bakteriálně a virově nebo bakteriálně sterilní roztok, vhodný pro injekční aplikaci. Filtrací přes filtr o velikosti pórů 0,1 «m se rovněž sníží počet · pyrogenů nebo se odstraní z roztoku.

Způsob · výroby injikovatelných derivátů orgoteinu majících protizánětlivou účinnost se · vyznačuje tím, · že se vodný roztok přírodního orgoteinu, zejména z hovězího· dobytka, nechá · reagovat v zásaditém prostředí s alkylačním · a/nebo · karbamoylačním - činidlem, jako je · -dialkylsulfát se 3 až 8 atomy uhlíku v · · alkylové části, aktivovaný alkylhalogenid s 2 až 8 atomy uhlíku, alkylační činidlo mající aktivovanou vinylovou · skupinu, redukční alkylační činidlo, - anebo s kyanátem alkalického kovu, · alkylisokyanátem se 3 až 8 atomy uhlíku · v alkylové části, arylisokyanátem, -isothiokyanátem, · v množství postačujícím · k ···přeměně alespoň jedné z titrovatelných ε-aminoskupin orgoteinu v N-alkylovou · nebo N-karbamoylovou skupinu, anebo v kyselém · prostředí s esterifikačním činidlem, ·jako · je dialkylsulfát, diazomethan, v množství postačujícím k přeměně až 10 z volných karboxylových skupin v molekule orgoteinu na esterifikovanou karboxylovou skupinu., -při teplotě v rozmezí od teploty mrznutí reakční směsi do 80 °C.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu zahrnují ester orgoteinu podle vynálezu a farmaceuticky vhodný nosič. Forma a cha20 rakter tohoto nosiče jsou dány způsobem aplikace.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je s výhodou v podobě sterilního injikovatelného přípravku, například v podobě sterilního injikovatelného vodného roztoku. Roztok může být formulován známým způsobem za použití výše uvedených nosičů. Sterilním injikovatelným prostředkem rovněž může být sterilní injikovatelný roztok nebo suspenze v jakémkoliv netoxickém parenterálně vhodném ředidle nebo rozpouštědle, nebo to může být iyofilizovaný prášek, rekonstituovatelný · takovýmto rozpouštědlem.

Prostředky -podle vynálezu obsahují účinné množství dávkovači jednotky derivátu orgoteinu podle vynálezu, to jest derivát orgoteinu je přítomen v koncentraci účinné pro vyvolání požadované odezvy, aplikuje-li se jednotková látka prostředku způsobem vhodným pro použitý -farmaceutický nosič. Například kapalné prostředky jak topické, tak injikovatelný obvykle obsahují asi 0,5 až 20 mg derivátu orgoteinu v 0,25 až 10 ml, s výhodou v -0,5 až 5 ml, kromě intravenózních infúzních roztoků, které mohou též být zředěnější a mohou obsahovat například 0,5 až 20 mg derivátu orgoteinu na 50 až 1000 ml, s výhodou 100 až 500 ml infúzního roztoku. Tablety, tobolky a čípky obvykle obsahují 0,1 až 25 mg, s výhodou 1 až 10 mg derivátu orgoteinu v jednotce.

Derivát orgoteinu se obvykle aplikuje nakapáním nebo injekcí, například intramuskulárně, subkutánně, intravenózně nebo intradermálně. Výhodná je intramuskulární aplikace, s výjimkou v případě šoku, kde se někdy dává přednost intravenózní aplikaci vzhledem k rychlejšímu účinku, a v případě některých lokalizovaných poruch, například při ozáření a některých cystitidách, kdy · často · bývá účinnější lokální injekce, infúze a/nebo nakapání. - Individuální dávky obvykle bývají v rozmezí 0,5 až 20- mg. Výhodným rozmezím u člověka je asi 0,5 až 8 mg; u koní asi 5,0 až 10,0 mg. Přesná dávka není rozhodujícím činitelem a závisí na druhu choroby a vážnosti případu.

Deriváty orgoteinu podle vynálezu jsou podobně jako orgotein účinné pro léčení širokého spektra zánětlivých procesů, včetně těch, u nichž syntetická protizánětlivá činidla mají omezenou použitelnost, například pro toxické vedlejší účinky při déle trvajícím používání.

Zejména jsou tyto deriváty orgoteinu účinné pro zlepšení zánětlivých procesů a pro- zmírnění jejich účinků, například v těch případech, kdy jsou postiženy močové cesty a klouby u savců. Jsou vhodné pro zmírnění symptomů spojených -s reumatickou artritidou, osteoartritidau a -posttraumatickou - artritidou, jakož i bursitidou, tendonitidou atd.

Protizánětlivá účinnost injikovatelných derivátů -orgoteinu vyrobených způsobem- podle vynálezu byla zkoumána testy $ karage21 ninovým ©démem, provedenými na samičkách myší Swiss Webster o hmotnosti v rozmezí od 20 do 23 g, v · porovnání s účinností samotného orgoteinu. Skupinám po 10 pokusných zvířatech byly do zadní pravé tlapky subkutánně vstříknu-ty 0,03 ml fyziog^ého roztoku, obsahujícího 1,0 % karageninu. Roztoky toji-kovat-elného derivátu orgoteinu vyrobeného způsobem podle vyná lezu jakož i srovnávacího ergot©^ byly subkutánně vystříknuty vždy 3 hodiny před a 2 hodiny po aplikaci roztoku karageninu, · a to v dávce 0,1 ml. Po uplynutí 24 hodin po aplikaci karageninu byla zvířata usmrcena chloroformem, jejich zadní tlapky amputovány v kloubu a zváženy. Výsledky inhibice otoků vyvolaných karageninem jsou uvedeny v následující tabulce:

počet zvířat	průměrné zvětšení otoku --S.D. za 24 h	aplikace
10	57,1+ 8,6	fyziologický roztok
10	44,0+10,5	' 0,1 mg/ml ORG
10	43,7+ 5,6	0,1 mg/ml DMS-ORG
10	29,6-+ 5,7	1,0 mg/ml ORG
10	35,0-+11,-8	1,0 mg/ml DMS-ORG

inhibice	t	2p<
22,9 %	3,057	0,01
23,5 %	4,122	0,001
48,2 %	8,423	0,001
38,7 %	4,786	0,001

ORG + orgotein 740706/740705 DMS-ORG = N-methylorgotein, mající 18 Nmethylem substituovaných lysinových skupin

Z výsledků uvedených v tabulce vyplývá, žs N-methylorgotein (DMS-ORG) má přibližně stejný stupeň účinnosti jako orgotein (ORG). Pro zjištění toxicity byla jedné skupině 10 myší subkutánně dvakrát aplikována dávka 4,5 mg/kg, jiné skupině myší subkutánně dvakrát dávka 0,45 mg/kg. Během 24 hodin po aplikaci nebyly pozorovány žádné známky toxicity ^jiRovaného prostředku. Toto je v souladu s naprostou netoxicitou orgoteinu, i při vysokých dávkách po delší časové období.

Další podrobnosti, týkající se isolování výchozích analogů orgoteinu a použití derivátů orgoteinu vyrobeného způsobem podle vynálezu, včetně způsobů aplikace, dávkovačích forem, dávkovacího režimu a zánětových a jiných procesů, které je možno léčit сsterifikrvaným orgoteinem, jsou uvedeny v patentovém spisu US 3 758 682.

Na základě předchozího popisu bude odborník bez jakéhokoliv dalšího podrobnějšího výkladu jistě schopen využít vynálezu v maximální míře. Dále uvedené příklady provedení slouží proto pouze k bližšímu objasnění a vynález na ně není nikterak omezen.

Příklad IA

K roztoku 5 mg orgoteinu z hovězího· Skotu ve 4 ml 0,04 M uhličitaného pufru se přidá. 20 dimethyl-sulfátu a pH reakční směsi se udržuje na 10,0 přidáváním 0,5 M roztoku hydroxidu sodného. Polovina zásady je spotřebována asi za 37 minut. Při elektroforéze se Objeví pásy 1 až —5, vyznačující se aktivitou superoxidové dismutázy. Po dialýze, lyonii-zací a opětném rozpuštění 1 ml vody jsou aktivita superoxidové dismutázy proteinu a jeho obsah Cu⁺⁺ a Zn++ iontů stále nezměněny ve srovnání s nezpracovaným orgoteinem. Acetylací roztoku mocdiikovaného proteinu o koncentraci 85 ^g/ml celkem 3 μ\ anhydridu octového· v 0,4 ml brгitanovéhr pufru při pH 9 se dosáhne průměrné elektrrfrretické změny náboje pouze asi —2, ve srovnání s —20 u přírodního orgoteinu v tomtéž roztoku. Orgotein, zpracovaný dimethylsulfátem při pH 10, · je proto extenzívně N-methylován, to jest obsahuje asi 18 methylových skupin v 1 molekule.

Příklad 2 A

Postupuje se .podle příkladu IA, avšak použije se, postupně, příslušných lidských, ovčích, koňských, vepřových, psích, králičích, morcích a kuřecích analogů orgoteinu jako výchozí látky. V každém z uvedených případů se alkylují všechny až asi na jeden lysin každé z podjednotek orgoteinové molekuly.

Příklad 3 A

Postupem podle příkladu IA, avšak za použití diethylsulfátu místo dimethytsulfátu se získá ε-N-ethylovaný orgotein, jehož vlastnosti jsou v podstatě tytéž jako vlastnosti ε-N-methylovaného orgoteinu.

Příklad 4 A ε-aminoskupiny lysinových zbytků orgoteinu z hovězího skotu se kaгOrxymethylují 0,2 M roztokem natriumjodačetátu při teplotě okolí za níže uvedených podmínek a s níže uvedenými výsledky. *

Reakční pufr změna náboje při elektroforéze, průměr 4- rozsah orgotein (1,4 mg/ml)+JCH2COONa⁺ (0,2 M)

a) 0,3 M acetát, pH 3,8 (jediné změny jsou ty, způsobené nízkou hodnotou pH)

b) 0,4 m acetát, pH 5,0 žádná změna do hodin

c) 0,23 M uhličitan, 0 (15 minut), pH 9,2 3+2 (2,5 hod.),

5+3 (6,5 hod.) >18 (72 hod.).

Z těchto elektroforetických. obrazů je zřejmé, že při pH 3;8 a 5,0 nedochází к žádné N-alkylaci a že při pH 9,2 se za 2,5 hod. vnesou průměrně asi 3 skupiny — CH2COO; asi 5 takových skupin se vnese za 6,5 hod. a asi 18 takových skupin se vnese za 72 hod. na atomy dusíku ε-aminoskupin.

orgotein (2,8 mg/ml) + JCH2COO'Na⁺ (0,43 M)

d) pH 6,0

e) pH 7,0

f) pH 10

0,4 po 5 dnech při teplotě místnosti,

0,6 (1 den), 1,0 (2 dny), 1,5 (5 dnů), 0 (10 minut, > 3 (2,5 hod.), >10 (6,5 hod.)

Doba (dny): 0,75

Počet lysinu, které zreagovaly: 0

Z elektroforetických obrazců takto zpracovaného orgoteinu vyplývá, že při pH 6 se zalkyluje méně než polovina molekul orgoteinu, při pH 7 měly molekuly orgoteinu za 2 dny průměrně jednu ε-aminoskupinu alkylovanou skupinou — CH2COO a za 5 dní byly průměrně vneseny dvě takovéto skupiny do 1 molekuly. PřrpH 10 bylo vneseno za

2,5 hod. průměrně více než 3 takovéto skupiny a za 6,5 hod. průměrně více než 10 takovýchto skupin na 1 molekulu.

Produkty při všech výše popsaných alkylacích, při nichž se vnášejí skupiny —CH2COO, jsou směsi ε-aminoalkylovaných orgoteinů, obsahujících různý počet takovýchto skupin, jak je patrné ze vzniku většího počtu pásů s různými elektroforetickými pohyblivostmi.

Příklad 1 В

Nesubsítituovainý kaťbamoylovaný orgoitein

Roztek 3,7 mg orgoteinu (analog z hovězího skotu) a 14 mg KNCO ve 2 ml 0,025 M roztoku fosforečnanu sodného o pH 7,5 se ponechá při teplotě 4 °C. Při elektroforéze alikvotních vzorků po dobu 54 dnů se objeví řada pásů š aktivitou superoxid-ové dismutázy, které jsou více anodické než přírodní orgotein. Níže je uvedena průměrná změna náboje spolu s rozsahem aktivních pásů po obou stranách průměrné hodnoty u

vzorků:	54
3,8	27
0,8	5+2	8,5+3,5

Přiklad 2B

Alkylkarbamoylované orgoteiny μΐ podíly orgoteinu (analog z hovězího skotu) v 0,1 M roztoku tris nebo fosforečnánového pufru o pH 7,6 a s koncentrací 10 miligramů/ml se nechají reagovat při teplotě min2 h.

Reakční činidlo isopropylkyanát/tris 88 propylisokyanát/fosforeičnan 88 oktylisokyanát/tris 0,21,0 oktylisokyanát/fosforečnan 00,2 °C s 1 μΐ buď propylisokyanátu, nebo oktylisokyanátu po různou dobu. Ve dvou případech se po 2 dnech přidají další 2 μΐ propylisokyanátu. Počet vnesených propylkarbamoyiových a oktylkarbamoylovýoh skupin se stanoví z průměrné změny náboje určené elektroforeticky, jak je níže uvedeno.

Průměrná změna náboje den 2 dny 4- 2 μϊ isokyanátu .

nestanoveno10 nestanoveno>15

2,53 kyanátu nebo oktylisokyanátu. Roztoky se udržují při teplotě 25 °C po 4 hodiny a podrobí se elektroforéze. Pak se ke každému z nich přidá další 1 ml isokyanátu. Po ponechání přes noc při teplotě 4°C se roztoky znovu elektroforeticky zkoumají a dialyzují.

Karbamoylované proteiny jsou méně roz-

P г í к 1 a cl 3 В

Alkylkarbamoylované orgoteiny

Opakuje se postup z příkladu 2B za použití 10 mg orgoteinu v 1 ml 0,1 M fosforečnanového pufru o pH 7,6 a 1 ml propylisoobsah kovu g-at/mol

Cu⁺⁺ Zn++ % původní aktivity superoxidové dismutázy pustne v deionízované vodě a po dialýze se částečně vylučují, avšak jsou rozpustné v

0,15 M solném roztoku. Počet karbamoylovaných lysinových skupin je uveden níže:

Isokyanát počet zreagovavších lysinů po 4 hod. přes noc propyloktyl10+4 > 15 2,2

3+3 6+5 2,1

1,5

1,8 přibližně 50 přibližně 25

Příklad 4B

N-im^t^^^^Rhiokarbamoyl orgotein

K roztoku 5 mg orgoteinu ve 4 ml 0,075 M roztoku tetraboritanu sodného o pH 9 se přidá 10^/íl CHsNCS a .směs se minutu třepe, dokud se CHsNCS nerozpustí. V intervalech se odeberou 50/,d vzorky a přidá se vždy 0,4 ml 0,1 M roztoku octanu sodného o pH 5,3 jakožto pufr. Po uplynutí 6 až 22 hodin se objeví bílá sraženina síry [jak se zjistí podle zápachu při spálení a podle rozpustnosti v sírouhlíku). Po 22 hodinách při teplotě míst nosti se ke zbytku reakční směsi přidá 0,5 mililitru 1 M roztoku octanového pufru o pH

5,3 a směs se dialyzuje po 2 dny za častých výměn vody. Dialyzovaný roztok se krátce odstředí k odstranění bílého . zákalu roztoku.

Při eiektroforéze vzorků odebíraných z roztoku vznikne řada stále anodičtějších pásů se super^o^x^i^d^c^ivou d·iem.utazovou aktivitou.

Z analýzy vzorků cy-tochromovou zkouškou při pH 7,0 [McCord a Fridovich, J. Biol. Chem. str. 6049 až 6055 (1969]] vyplývá pokles superoxidové dismutázové aktivity při exintenzívnější .modifikaci. .

Doba (hodiny)	průměrná doba náboje	superoxidové dismutázová aktivita (%)
0	(0)	(100·%)
0,08	0,5	111
0,25	1	118
0,75	2	91
1,9	4	86
6	9,5	43
22	16	20

Dialyzovaný reakční produkt se po 22 hod. při eiektroforéze projeví jako rychle se pohybující anodický pás; zachovává si 18 % superoxidové dismutázové aktivity přírodního orgoteinového proteinu a obsahuje 2,06 g-at/ /mol Zn++ iontů a 1,76 g-at/mol Cu++ iontů (ve srovnání s 2,26 g-at/mol Zn + + iontů a 2,08 g-at/mol Cu + + iontů u nemodifikovaného orgoteinu). Všechny tyto produkty jsou rozpustné, podržují si chelatované Cu⁺⁺ a Zn++ ionty a nejméně část superoxidové dismutázové aktivity nemodifikovaného proteinu.

Příklad 5 B

NIfluoretcemylkarbamoyl orgotein

Roztok 100 mg orgoteinu (analog z hovězího skotu) a 6 mg flouretce.шitothiokyanátu v 10 ml 0,14 M fosfoi^ečnanového roztoku o pH 8,5 se udržuje při teplotě 4 °C po 18 hodin. Reakční směs se pak vnese na chromatografickou .kolonu obsahující mikropórovitý zssítěný dextran (Sephadex G-50), a eluuje se 0,15 M solným roztokem pufrovaným boritanem na pH 8. Eluované frakce žlutého proteinu se dialyzují proti vodě. Dialyzovaný protein, který se vykáží (20 miligramů), je intenzívně žlutý a fluorescenční a snadno se rozpouští v solném roztoku pufrovaném boritanem na pH 8.

Při eiektroforéze se zjistí, že z 96 mg rozpustného proteinu je asi polovina monokarbamoýlovaným orgoteinem (změna náboje —3), spolu s menším množstvím dvojnásobně a trojnásobně karbamoylovaného orgotenu (změny náboje —6 a —9) a . nezreagovaného orgoteinu. Znovu rozpuštěná sraženina .se zdá být extenzivněji modifikovaným. proteinem, poněvadž při eiektroforéze skýtá rychlou anodickou skvrnu.

Rozpustný protein se chromatografuje na slabě zásadité iontoměničové koloně při pH 6 fosforečnanovým půfrem s lineárně stoupající koncentrací od 0,01 do 0,2 M. Monkarbamoylované a dikarbamoylované orgoterny se izolují, dialyzují .a .lyofylizují.

Monokafrbamoylovaný orgotein se při elektroforéze vyznačuje superox·idcvou ditmutázovou aktivitou a aktivitou při riboflavinové zkoušce. Podle cytochromové zkoušce při pH 7,5 má 4’8' % superoxidové ditmutάzové aktivity přírodního orgoteinu. Podle Ungarovy bio-zkoušky se tento protein vyznačuje přibližně 50% aktivitou přírodního orgoteinu.

Roztok monokarbamoylovaného orgoteinu,

203882 uchovávaný při teplotě 4 °C po dva týdny, se změní ve směs orgoteinu, monokarbamoylovaného orgoteinu a dikarbamoylovaného orgoteinu [zřejmě výsledek hybridizace) a neprotein.Qvé fluorescenční sloučeniny [zřejmě výsledek hydrolýzy thiomočovinové skupiny karbainoylovauého orgoteinu za vzniku volného arainofluoresceinu).

Postupem podle výše uvedených příkladů, avšak za použití příslušných lidských, ovčích, koňských, psích, králičích, morčích, krysích a kuřecích analogů orgoteinu jakožto výchozích látek se získají příslušné karbamoylované deriváty těchto analogů.

Příklad 1C

Methylová esterifikace

Roztok [1'25 (Ug/ml) 0,5 mg orgoteinu z hovězího skotu a 0,5% obj./obj. roztok dimethylsulfátu ve 4 ml 0,05 M acetátového pufru se udržuje při pH 5 po 100 minut. Při elektroforetické analýze reakčního produktu vzniknou pásy superoxidové dismutázové aktivity od +1 po —6 (průměr —4). Produktem je orgotein, s průměrným obsahem 4 skupin —СООСНз.

Příklad 2C

Methylová esterifikace

Roztok 0,5 mg .orgoteinu z hovězího skotu a 10 μϊ dimethylsulfátu ve 4 ml vody se udržuje na konstantní hodnotě pH přidáváním 0,1 M roztoku hydroxidu sodného. Rychlost, s jakou zásada reaguje v rozmezí pH 7 až 10, je značně nezávislá na hodnotě pH a na přidávání 0,25 molu fosforečnanu sodného jakožto pufru. Při elektroforetické analýze vzniká více katodových pásů se superoxidpvou dismutázovou aktivitou počáteční rychlostí přibližně —0,5 náboje/hod. Po 21 hodinách, převážně při pH 7 až 8, se roztok analyzuje ke zjštění N-methylace a esterifikaee, jak je v dalším popsáno. Při této analýze nelze zjistit žádnou N-methyluci.

a] Acetylací 0,5 ml alikvotního dílu esterifikovaného orgoteinu použitím 1 ^ul anhydridu octQvého + 3 μΐ 6 M roztoku hydroxidu sodného při teplotě 4 °C se získá roztok, při jehož elektroforetické analýze se objeví rychle se pohybující anodický pás, podobně jako je tomu při elektroforéze acetylovaného přírodního orgoteinu, což dokazuje, že volné aminoskupiny jsou esterifikaci nedotčeny.

b) 1 ml roztoku esterifikovaného orgotelnu se upraví na pH 10,5 a vloží do eksikátoru se zrněním hydroxidem sodným. Ačkoliv obrazec katodických pásů 1 až —4 je stálý při pH 7 až 9, při pH 10,5 katodické pásy postupně mizí během 4 dnů, přičemž se znovu objeví elektroforetické obrazce pří rodníhO orgoteinu. Methylestery proteinu obvykle snadno hydrolyzují při alkalických hodnotách pH, což dokazuje, že vícekatodické pásy objevující se po esterifikaci jsou estery orgoteinu.

Z předchozího je zřejmé, že po dvou hodinách še při pH 7 až 10 dimethylsulfátem esterifikuje průměrně jedna skupina —COOH v 1 molekule; po 4 hodinách asi dvě skupiny v 1 molekule; další esterifikaci se zvýší počet esterifikovaných skupin —COOH· maximálně asi na 6 v 1 molekule.

Postupem podle příkladů 1C, 2 C a za použití příslušných lidských, ovčích, koňských, vepřových, psích, králičích, morčích a kuřecích analogů orgoteinu jakožto výchozích látek se pokaždé přemění průměrně asi 4 skupiny karboxylové kyseliny molekuly orgoteinu na methylesterové skupiny.

Postupem podle příkladů 1 C, 2 C za použití diethylsulfátu místo dimethylsulfátu se získají estery orgoteinu, mající od 1 do 6 skupin volné karboxylové kyseliny, přeměněných v ethylesterové skupiny. Vlastnosti výsledných esterifikovaných orgoteinů jsou prakticky tytéž jako vlastnosti methylově esteriifikovaných orgoteinů.

Esterifikované orgoteiny je popřípadě možno dále čistit iontoměnioovou chromatografií, aby se od sebe oddělily druhy s rozdílným účinným nábojem a tudíž esterifikované v různém stupni. Tak například se při eluci 200 mg v iontoměničové koloně o rozměrech 2,5 X 40 cm (SEPHADEX) za použití 4 litrů roztoku tris o pH 8,5 s lineárně se zvyšující koncentrací o 0,01 M do 0,2 M od sebe oddělí pásy orgoteinu, přičemž elektroforeticky více katodické pásy eluují první. Takovýmto postupem se směs orgoteinů esterifikovaných methylovými skupinami, vyrobená postupem podle příkladu 1C, může rozdělit ve frakce, obsahující převážně 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6 methylesterových skupin v 1 molekule orgoteinu.

Takováto frakcionace částečně modifikovaného orgoteinu iontoměničovou chromatografií je použitelná u jakéhokoliv modifikovaného orgoteinu, jehož molekulární náboj závisí na rozsahu modifikace, například methylovými nebo karboethoxymethylovými skupinami esterifikovainý orgotein a N-acetyilofvaný orgotein.

Příklad 3C

Karbethoxymethylová esterifikace

Ethyldiazoacetát se připraví reakcí ethylesteru glycinu kyselinou dusitou, jak je uvedeno v příručce „Orgnic Synthesis“ Coli. sv. IV, str. 424, avšak za použití chloridu uhličitého místo dichlormethanu pro extrakci ethyldiazoacetátu z vodného roztoku.

ml přibližně 1 molárního roztoku ethyldla^oacetátu v chloridu uhličitém se vnesou do baňky o objemu 25 ml a většina chloridu uhličitého se odpaří za sníženého tlaku, dosaženého vodní vývěvou. Přidá se roztok 9 miligramů orgoteinu z hovězího Skotu ve 3 mililitrech vody a organická fáze se rozptýlí kroužením. Roztok se ponechá při teplotě 4 °C a každých několik dní se protřepe. Po celou dobu zůstává reakční směs heterogenní. Eléktroforetickou analýzou se zjistí postupná tvorba více katodických proteinových pásů —1 až —6 se superoxidovou dismutázovou aktivitou. Průměrná změna náboje je 1,2 po 5 dnech a 3 po 12 dnech. Produkt je směsí karbethoxymethylových ešterů orgoteinu, majících po 5 dnech bud^r jednu, nebo dvě takovéto esterové skupiny v 1 molekule a po 12 dnech od 1 do 6 takovýchto esterových skupin.

Vodná fáze se pak zfiltruje a zbaví soli chromatografickou frakcionací v koloně tvořené 10 ml Sephadexu G-25. Proteinové frak ce se lyofylizují a znovu rozpustí ve 2 ml vody a pH se zvýší z 3,7 na 5,6 přidáním 2 μΐ 1M roztoku hydroxidu sodného. Podle elektroforetické analýzy nedochází к žádné změně ve srovnání se stavem před odstraněním soli a lyofylizací.

Po další reakci tohoto roztoku po dobu 1 měsíce za stejných podmínek, jak výše uvedeno, se při elektroforetické analýze objeví skvrna proteinu s nižší superoxidovou dismutázovou aktivitou a žádný materiál více katodický než pás —6.

Příklad 4 C

Methylová esterifikace

Postupem podle příkladů 1 a 2 se orgotein z hovězího skotu alkyluje za podmínek uvedených v následující tabulce:

pH	pufr	orgotein	dimethylsulfát obj. %	poločas při hydrolýze +	pásy s superoxidovou dismutázovou aktivitou při e lektroforéze
(a) 5,0	0,05 M acetát	3.25 ,ug/ml	0,25	54 min.	+ 1 až —4 (průměr —2)
(b) 5,0	0,05 M acetát	125 ,ug/m!	0,5	54 min.	—1 až —6 (průměr —4)
(c) 7,0	0,016 M fosforečnan	80 ^g/ml	0,65	1 hod.	—2 až —6
(d) 7,0	0,016 M fosforečnan	80 /.ig/ml	1,3	1 hod.	slabá skvrna SOD od +4 do —6, vrcholící při poloze —6
(e) 11,7-	-9,3 0,05 M uhličitan	125 ^g/ml	0,5	¥2 hod. (při pH 10)	+2 až —‘3

⁺ Poločas pro pohlcování NaOH potřebného к udržení konstantního pH.

Produkt z příkladu [a] má průměrně 2 esterifikované skupiny —COOH v 1 molekule a produkt z příkladu (b) průměrně 4 takovéto skupiny. Přítomnost většího počtu katodických pásů dokazuje, že se esterifikované produkty skládají z většího množství esterifikovaných orgoteinů, obsahujících 1 až asi 6 esterových skupin v 1 molekule.

Příklad 5C

Hybrid obsahující methylésterove a N-acetylové skupiny

К roztoku (125 ^g/ml) 0,5 mg methylovými skupinami esterifikovaného orgoteinu, vyrobeného postupem podle příkladu 1, se přidá 0,5 mg zcela N-acetylovaného orgoteinu. Při elektroforetické analýze směsi se objeví pouze pásy odpovídající orgoteinu esterifikovanému methylovými skupinami a anodický pás odpovídající N-acetylorogoteinu.

Když se však směs zahřívá po 4 hodiny při teplotě 50 °C, ukáže se při elektroforéze vytvoření několika nových složek (v polohách pásů -1-7 až +11) a více než 50% zmenšení původních pásů, odpovídajících N-acetylorgoteinu a methylesteru orgoteinu.

Novými složkami, vzniklými zahříváním směsi modifikovaných orgoteinů, jsou hybridy (heterodímery), obsahující každý podjednotku z N-acetylorgoteinu (s 10 N-acetyl-lysiny v 1 podjednotce) a podjednotku z orgoteinu esterifikovaného esterovými skupinami (s 0 až 3 skupinami —-СООСНз v 1 podjednotce).

Hybridy se mohou Izolovat ze své rovnovážné směsi s N-acetylorgoteinem a orgoteinem obsahujícím skupiny —СООСНз (homodlimery) iontoměničovou chriomatografií při nízké teplotě, jak je popsáno v příkladu C 2. Při stání izolovaných heterodimerů může rehybridizace pokračovat za opětného vytvoření směsi obsahující rovněž oba homodimery. Rychlost rehybridizace závisí na teplotě a je nízká při nízkých teplotách.

Předchozí příklady se mohou opakovat s podobným výsledkem, nahradí-li se reakční složky a podmínky v nich použité genericky a specificky popsanými reakčními složkami a/nebo reakčními podmínkami podle vynálezu.

Z předchozího popisu může odborník snadno stanovit charakteristické význaky vynálezu a může provést aniž přestoupí rámec a

Claims (3)

1. Způsob výroby injikovatelných derivátů orgoteinu, majících protizánětlivou účinnost, vyznačující · se tím, že se vodný roztok přírodního· orgoteinu, zejména z hovězího· dobytka, nechá reagovat v zásaditém prostředí s alkylačním a/nebo karbamoylačním činidlem·, jako· je dialkylsulfát s 3 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, aktivovaný alkylhalogenid s 2 až 8 atomy uhlíku, alkylační činidlo mající aktivovanou vinylovou skupinu, redukční alkylační činidlo, anebo· s kyanátem alkalického kovu, alkylisokyanátem se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, arylisokyanátem, isothiokyanátem, v množství postačujícím k přeměně alespoň jedné z titrovatelných ε-ammoskupin orgoteinu v N-alkylovou nebo N-karbamoylovou skupinu, anebo v kyselém prostředí s esterifikačním činidlem, jako je · dialkylsulfát, diazomethan, v množství postačujícím k přeměně až 10 z volných karboxylovýoh skupin v molekule orgoteinu na esterifikovanou karboxylovou skupinu, při teplotě v rozmezí od teploty mrznutí reakční směsi do 80 °C.

2. Způsob podle bodu 1 k výrobě injikovatelných derivátů orgoteinu, majících protizánětlivou účinnost, vyznačující se tím, že k získání N-alkylovaných, popřípadě N-karbamoylovaných orgoteinů se nechá vodný rozsah vynálezu, různé změny a úpravy vynálezu, aby jej přizpůsobil pro různé použití a různým podmínkám.

VYNÁLEZU roztok přírodního orgoteinu, zejména z hovězího dobytka, reagovat v zásaditém prostředí s alkylačním a/nebo- karbamoylačním činidlem, jako · je dialkylsulfát se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, aktivovaný alkylhalogenid s 2 až 8 atomy uhlíku, alkylační činidlo mající aktivovanou vinylovou skupinu, redukční alkylační činidlo, anebo s kyanátem alkalického kovu, alkylisokyanátem se 3 až 8 atomy uhlíku v alkylové části, arylisokyanátem,· isothiokyanátem, v množství postačujícím k přeměně alespoň jedné z titrovatelných ε-aminoskupin orgoteinu v N-alkylovou nebo N-karbamoylovou skupinu, při teplotě v rozmezí od teploty mrznutí reakční směsi do 80 °C.

3. z^j^iasibb podle 'bidlu 1 к výrobě injioovatelných · derivátů orgoteinu majících protizánětliosu účinnost,· vyznačující se tím, že k získání esterových derivátů orgoteinu se nechá vodný roztok přírodního orgoteinu, zejména z hovězího dobytka, reagovat v kyselém prostředí s esterifikačním činidlem, jako je dialkylsulfát se 3 až 8 atomy uhlíku, diazomethan, v množství postačujícím k přeměně až 10 z volných karboxylových skupin v molekule orgoteinu na esterifikooansu karboxylovou skupinu, při teplotě v rozmezí od teploty mrznutí reakční směsi do 80 °C.