CS203992B2 - Method of making the injectable derivates of the ergothein with antiinflammation effect - Google Patents
Method of making the injectable derivates of the ergothein with antiinflammation effect Download PDFInfo
- Publication number
- CS203992B2 CS203992B2 CS765859A CS585976A CS203992B2 CS 203992 B2 CS203992 B2 CS 203992B2 CS 765859 A CS765859 A CS 765859A CS 585976 A CS585976 A CS 585976A CS 203992 B2 CS203992 B2 CS 203992B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- orgotein
- groups
- alkyl
- molecule
- agent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
Vynález se týká způsobu výroby injikovatelných derivátů orgoteinu, majících protizánětlivou účinnost.The invention relates to a process for the production of injectable orgotein derivatives having anti-inflammatory activity.
Jako orgoiein se označují členy skupiny vodorozpustných analogů bílkovin v prakticky čisté, ínjikovatelné podobě, tj. prakticky neobsahují jiné bílkoviny, které je doprovázejí nebo jsou s nimi sdruženy ve zdrojích jejich výskytu. V patentovém spisu USAORGOININ refers to members of the family of water-soluble analogues of proteins in practically pure, injectable form, i.e., virtually free of other proteins that accompany or are associated with them in the sources of their occurrence. U.S. Pat
758 682 se popisují farmaceutické prostředky obsahující orgotein.758,682 describes pharmaceutical compositions comprising an orgotein.
Orgoteinové rnethanoproteiny jsou členy skupiny analogů bílkovin vyznačujících se charakteristickým souhrnem fyzikálních, chemických, biologických -a - farmakodynamickýoh vlastností. Každý z těchto- analogů je fyzikálně charakterizován tím, že je isolovanou, prakticky čistou formou globulární, ve vodě a v pufru rozpustné bílkoviny, mající vysoce kompaktní přirozenou stavbu, která — ačkoliv je citlivá vůči teplu — je stálá při zahřívání při teplotě 65 °C při pH až 10 po- několik - minut. Po chemické stránce sa každý z -těchto· analogů vyznačuje tím, že obsahuje v molekule všechny bílkovinové aminokyseliny až na 0 až 2, malé procento uhlohydrátů, žádné tuky, - 0,1 až 1,0 % kovu následkem obsahu. 1 až 5 gramatomů/mol nejméně jednoho chelátovaného dvojmocné- ho kovu, majícího průměr iontů v rozmezí od 0,60 do 1,00 X'10 m, a prakticky žádné chelátované jednomooné kovy nebo ty 'kovy, které jsou buněčnými jedy.Orgotein methanoproteins are members of a family of protein analogs characterized by a characteristic sum of physical, chemical, biological, and pharmacodynamic properties. Each of these analogs is physically characterized in that it is an isolated, practically pure form of globular, water-soluble and buffer-soluble proteins having a highly compact natural structure which, although heat-sensitive, is stable when heated at 65 ° C. at pH up to 10 for several minutes. Chemically, each of these analogs is characterized in that it contains all protein amino acids in the molecule up to 0 to 2, a small percentage of carbohydrates, no fats, 0.1 to 1.0% of the metal due to the content. 1 to 5 gram-moles / mol of at least one chelated divalent metal having an ion diameter in the range of 0.60 to 1.00 X 10 m, and virtually no chelated mono-metals or those which are cellular poisons.
Složení -orgoteinových analogů, pokud jde o aminokyseliny, je značně neměnné bez o.hledu na zdroj, z něhož jsou izolovány.The composition of the -orgotein analogs with respect to amino acids is largely unchanged regardless of the source from which they are isolated.
V tabulce I je uvedeno rozdělení zbytků aminokyselin u několika orgoteinových analogů, uvažováno pro molekulovou hmotnost 32 500.Table I shows the amino acid residue distribution for several orgotein analogues, considered for a molecular weight of 32,500.
Z - tabulky I je zřejmé, že orgoteinové analogy -mají 18 až 26, obvykle 20 a 23 lysinových skupin, z nichž všechny až na 1 až 3 mají titrovatelné (kyselinou - trinitrobenzensulfonovou) ε-aminoskupiny. Vynález se proto týká způsobu výroby derivátů orgoteinu, u nichž alespoň část lysinových -skupin orgoteinu je alkylována, -a dále derivátů - orgoteinu, u nichž alespoň část lysinových skupin orgoteinů je karbamoylována.It can be seen from Table I that the orgotein analogs have 18 to 26, usually 20 and 23 lysine groups, all of which except for 1 to 3 have titratable (trinitrobenzenesulfonic acid) ε-amino groups. The invention therefore relates to a process for the production of orgotein derivatives in which at least a portion of the lysine groups of the orgotein is alkylated, and further to derivatives of orgotein in which at least a portion of the lysine groups of the orgoteins are carbamoylated.
Z tabulky I je dále patrné, že -orgoteinové analogy mají 29 až 37 skupin kyseliny -asparágové a 21 až 38 skupin -kyseliny- glutamové. Vynález se proto dále týká způsobu výroby derivátů orgoteinu, u nichž alespoň část zbytků těchto aminokyselin ve formě volné kyseliny je esterifikována.It is further evident from Table I that the -orgotein analogs have 29-37 aspartic acid groups and 21-38 glutamic acid groups. The invention therefore further relates to a process for the production of orgotein derivatives in which at least a portion of these free acid residues are esterified.
Tabulka ITable I
Aminokyselinové složení několika orgoteinových analogů (Počet zbytků v 1 molu, molekulová hmotnost =32 500)Amino acid composition of several orgotein analogues (Number of residues in 1 mole, molecular weight = 32,500)
Aminokyseliny červené krvinkyAmino acids of red blood cells
1 kolorimetrické stanovení 2 průměr analýzy aminokyselin a spektrofotometrického stanovení 1 colorimetric determination 2 average of amino acid analysis and spectrophotometric determination
Jak je odborníkům zřejmé, některá eisterifikační činidla a podmínky jsou schopny současně alkylovat volné aminoskupiny v molekule orgoteinu a esterifikovat skupiny karboxylové kyseliny. Výroba taikovýchto N-alkylových a esterifikovaných orgoteinů je rovněž částí vynálezu.As will be appreciated by those skilled in the art, some eisterification agents and conditions are capable of simultaneously alkylating the free amino groups in the orgotein molecule and esterifying the carboxylic acid groups. The production of such N-alkyl and esterified orgoteins is also part of the invention.
Přírodní orgoteinový protein se mezi jiným vyznačuje protizánětli-vou účinností, jak je uvedeno v patentovém spisu US 3 758 682. Má rovněž jedinečně vysokou aktivitu sufperoxidové dismutázy, jak je popsáno McCordem a Fridovicihem v časopisu J. Biol. Chem., 244, 6,176, (1970) a 246, 2,875, (1971).Among other things, the natural orgotein protein has anti-inflammatory activity as disclosed in U.S. Pat. No. 3,758,682. It also has a uniquely high activity of sulphoperoxide dismutase as described by McCord and Fridovich in J. Biol. Chem., 244, 6, 176, (1970) and 246, 2,875, (1971).
Překvapivě se protizánětlivá účinnost přírodního proteinu esterifikací, N-alkylací nebo karbaimylací prakticky nemění. Proto jsou deriváty orgoteinu podle vynálezu použitelné týmž způsobem jako přírodní orgotein, například pro léčení zánetlivých stavů u savců a jiných zvířat, jak je popsáno v patentovém spisu US 3 758 682.Surprisingly, the anti-inflammatory activity of the natural protein is virtually unchanged by esterification, N-alkylation or carbaimylation. Accordingly, the orgotein derivatives of the invention are useful in the same manner as the natural orgotein, for example, for treating inflammatory conditions in mammals and other animals, as described in U.S. Patent 3,758,682.
Podstatná část aktivity superoxidové dismutázy přírodního proteinu je rovněž zachována u derivátů orgoteinu podle vnálezu, například 20 až 100 % aktivity přírodního proteinu.A substantial portion of the natural protein superoxide dismutase activity is also retained in the orgotein derivatives of the invention, for example, 20-100% of the activity of the natural protein.
jak bylo výše uvedeno, obsahují _ analogy orgoteinu 1'8 až 26 lysinových skupin. Poněvadž molekula orgoteinu sestává ze dvou shodných peptidových řetězců (podjednotek), je polovina těchto· lysinových skupin v každém z těchto řetězců, které se spolu pevně, nikoliv však kovalentně spojí za mírných podmínek teploty a pH. Vzhledem k prostorové stavbě molekuly orgoteinu nejsou obvykle ε-aminoskupiny několika málo lysinů v každém z uvedených řetězců titrovatelné kyselinou ti^.niitool^t^i^2^e^n^su]^l^o^r^ovou a proto nejsou snadno· dostupné pro alkylaci nebo· karbamoylaci. Avšak jak alkylace, tak karbamoylace netitrovatelných lysinových ε-aminoskupin se zdá být též možná za použití vysoce aktivního alkylačního nebo· karOamoylačního činidla, například dimethylsulfátu při pH v alkalické oblasti.as mentioned above, the orgotein analogs contain 1-8 to 26 lysine groups. Since the orgotein molecule consists of two identical peptide chains (subunits), there are half of these lysine groups in each of these chains, which join together firmly but not covalently under mild temperature and pH conditions. Due to the spatial structure of the orgotein molecule, the ε-amino groups of a few lysines in each of these chains are usually not titratable with thiolitolic acid and are therefore not readily available. Available for alkylation or carbamoylation. However, both alkylation and carbamoylation of non-titratable ε-amino lysine groups also appear to be possible using a highly active alkylating or caramoylating agent, for example dimethyl sulfate, at an alkaline pH.
Rozsah alkylace nebo karbamoylace může být určen podle snížení počtu aminoskupin reagujících s kyselinou tгinitrobenzensulfrnovou, s přihlédnutím k . okolnosti, že 1 až 3 lysiny přírodního orgOteinového proteinu jsou netitrovatelné kyselinou trinítrobenzensulfonovou. Například u orgoteinu z hovězího skotu se takto zjistí pouze 18 z jeho· 20 až 22 lysinů. Je třeba mít rovněž na mysli, že mrnralikylrvané lysiny jsou stále ještě acylovatelné, takže pouze do značné míry alkylované orgoteiny se vyznačují snížením počtu acylovatelných lysinových skupin.The extent of alkylation or carbamoylation may be determined by reducing the number of amino groups reacting with tinnitrobenzenesulphonic acid, taking into account. the fact that 1 to 3 lysines of the native orgatinine protein are non-titratable with trinitrobenzenesulfonic acid. For example, only 18 of its 20 to 22 lysines are detected in bovine orgotein. It should also be remembered that mylled and lysine-containing lysines are still acylated, so that only the largely alkylated orgoteins are characterized by a reduction in the number of acylated lysine groups.
Dialkylace a ítialkylace nebo kaг0amrylace lysinových skupin se může sledovat podle změny náboje při elektroforéze N-alikylovaného nebo N-kat0amoylrvanéhr produktu. Ták například u orgoteinu alkylovaného dimethylsulfátem při pH 10 dojde ke změně náboje —2 po acylaci anhydridem octovým ve srovnání s —20 u nealkylovanéhr orgoteinu. Podobně u orgoteinu N-karbamoylovaného methylisothiokyanátem při pH 9 dojde ke změně náboje —2 po 45 minutách.The dialkylation and thialkylation or cation-amylation of the lysine groups can be monitored by the change in charge in electrophoresis of the N-alkylated or N-catoyl-broken product. Also, for example, for an dimethyl sulphate-alkylated orgotein at pH 10, there will be a charge change of -2 upon acylation with acetic anhydride as compared to -20 for unalkylated orgotein. Similarly, the methyl-isothiocyanate N-carbamoylated orgotein at pH 9 exhibits a charge change of -2 after 45 minutes.
Jak je známo, elektroforetícká · pohyblivost iontu je funkcí intenzity elektrického pole, účinného náboje iontu (včetně vázaných opačných iontů) a součinitele tření, viz například C. Tanford „Physical Chenistry of Maoromolecules“, nakladatelství Wiley, New York (1969). Poněvadž souí^ii^itel tření závisí na velikosti a tvaru molekuly a na složení roztoku, nejsou srovnání různých proteinů příliš informativní. Avšak při porovnávání proteinů podobné velikosti a tvaru, v tomto případě molekul orgoteinu, chemicky modifikovaných poměrně malými skupinami, za identických elektroforetických podmínek je jedinou proměnnou veličinou ovlivňující tuto elektroforetidkou · pohyblivost účinný náboj.As is known, electrophoretic ion mobility is a function of electric field strength, effective ion charge (including coupled counter ions) and friction coefficient, see, for example, C. Tanford, "Physical Chenistry of Maoromolecules," published by Wiley, New York (1969). Since friction coefficients depend on the size and shape of the molecule and the composition of the solution, comparisons of different proteins are not very informative. However, when comparing proteins of similar size and shape, in this case orgotein molecules, chemically modified by relatively small groups, under identical electrophoretic conditions, the only variable affecting this electrophoresis is mobility.
S touto úvahou je v souhlasu elektroíerotické chování řady chemicky modifikovaných molekul orgoteinu. Přírodní orgotein hovězího skotu skýtá při elektroforéze převážně jedno rozhraní (pás 1), s menším množstvím rychleji se pohybujících rozhraní (pás 2,3 atd.), rovnoměrně vzdálených před hlavním rozhraním, představujících molekuly orgoteinu s větším poměrem počtu skupin -COOH k -NHž, než jaký mají molekuly tvořící rozhraní 1.With this in mind, the electroerotic behavior of many chemically modified orgotein molecules is in agreement. The natural bovine orgotein provides predominantly one interface (lane 1) in electrophoresis, with fewer, faster moving interfaces (lane 2,3, etc.), evenly spaced from the main interface, representing orgotein molecules with a larger ratio of -COOH to -NH 2 groups than interface molecules 1.
Zpracováním přírodního orgoteinu z hovězího skotu, například postupně vyššími koncentracemi anhydridu octového při pH 7 nebo· methylisothiokyanátem -při pH 9 vznikne řada postupně více anodických (pohybujících se ke kladné elektrodě) elektroforetických pásů, jak se postupně stále více volných aminoskupin molekul orgoteinu acetyluje nebo kar0amoyluje. Naopak zpracováním dimethylsulfátem se získá řada pásů postupně více katodických (vzdálených od pásu 1 směrem k záporné elektrodě), jak se postupně stále více volných skupin karboxylových kyselin molekuly orgoteinu esterinkuje.Treatment of the natural bovine orgotein, for example gradually with higher concentrations of acetic anhydride at pH 7 or with methylisothiocyanate at pH 9, results in a series of progressively more anodic (moving towards the positive electrode) electrophoretic bands as more and more free amino groups of orgotein molecules . Conversely, treatment with dimethyl sulfate yields a series of bands progressively more cathodic (distant from band 1 towards the negative electrode) as more and more free carboxylic acid groups of the orgotein molecule are gradually esterified.
Grafické znázornění závislosti vzdálenosti, kterou proběhlo rozhraní od startu, na čísle pásu je poměrně lineární u nízkých rozsahů přeměny skupin -COOH nebo -NH2, avšak postupně se zákřivuje při vyšších stupních přeměny, poněvadž existuje mez, jak rychle se i nejvíce nabité složky _ mohou roztokem pohybovat. Rychleji se pohybující složky jsou též citli^vější na koncentraci soli a jsou podstatně zpomaleny při elektroforéze· vzorků obsahujících sůl.Graphical representation of the distance traveled by the interface from the start on the belt number is relatively linear for the low conversion ranges of the -COOH or -NH2 groups, but gradually becomes curved at higher conversion rates because there is a limit to how fast even the most charged components can solution to move. The faster moving components are also more sensitive to salt concentration and are substantially retarded by electrophoresis of salt-containing samples.
Z tohoto důvodu — protože extrapolace poloh více než asi dvou pásů není vždy přesná — je pro přesné stanovení náboje třeba, aby neznámá látka byla podrobena společné elektroforéze s roztokem, který obsahuje všechny pásy od 1 až po příslušnou polohu (například -částečně acetylovaný nebo částečně kaг0omrylrvaný orgotein).For this reason - because the extrapolation of the positions of more than about two bands is not always accurate - for accurate charge determination, the unknown substance needs to be subjected to electrophoresis with a solution containing all bands from 1 to the appropriate position (for example - partially acetylated or partially (an orgyme).
Všechny běžné reakce pro modifikaci proteinů, které byly až · dosud aplikovány na molekulu orgoteinu, souhlasí s touto interpretací, to jest polohy pásů odpovídají celkovým. změnám náboje oproti molekule přírodního orgoteinu. Jak acetylace, tak karbamoylace a N-methythiOka·rba·mrylace skýtají pásy 2, 3, 4, 5 atd., což naznačuje, že 1, 2, 3, popřípadě 4 volné aminoskupiny byly chemicky modifikovány. Podobně sukcinylace, kterou se skupiny ~NH3+ mění na · skupinyAll conventional protein modification reactions that have been applied to an orgotein molecule to date agree with this interpretation, i.e. the position of the bands corresponds to the overall. charge changes over the natural orgotein molecule. Both acetylation and carbamoylation and N-methythiocarbamylation provide bands of 2, 3, 4, 5, etc., indicating that the 1, 2, 3 and 4 free amino groups have been chemically modified. Similarly, the succinylation by which the ~ NH3 + groups are converted into groups
-NHOCHCHaCOO—,-NHOCHCHaCOO—,
II oII o
skýtá pásy 3, 5, 7, 9 atd., a extenzivnější karbamoylace nebo thiokarbamoylace, které mění ještě další skupiny na skupinyprovides bands 3, 5, 7, 9, etc., and more extensive carbamoylation or thiocarbamoylation, which converts yet other groups into groups
-NHCNH—R a-NHCNH — R a
II .II.
O ~NHCNH—R,O ~ NHCNH — R,
II sII p
skýtá ' pásy 6, 7, 8, 9 atd. Esterifikací dimethylsulfátem nebo ethyldiazoacetátem se získají pásy —1, —2, —3, —4 atd,, což naznačuje, že 1, 2, 3, popřípadě 4 skupiny karboxylové kyseliny byly chemicky modifikovány.provides bands of 6, 7, 8, 9, etc. Esterification with dimethyl sulfate or ethyldiazoacetate affords bands of -1, 2, 3, 4, 4, etc., indicating that 1, 2, 3, or 4 carboxylic acid groups were chemically modified.
Obecně řečeno, většina, například všechny lysiny až na 2 a 4, mohou být alkylovány, dokonce i mírnějšími alkylačními činidly, nebo karbamoylovány. Všechny až asi na jednu z dostupných (tj. titrovatelných kyselinou trinitro'brnzrnsulf onovou) lysinových skupin v každé z paptidových podjednotek orgoteinu mohou být polyaikylovány použitím silnějších alkylačních podmínek, například - - nadbytkem dimethylsulfátu, 0,04 M uhličitanového pufru při pH 10.Generally speaking, most, for example, all lysines except 2 and 4, can be alkylated, even with milder alkylating agents, or carbamoylated. All but about one of the available (i.e., titratable trinitro-bromosulfonic acid) lysine groups in each of the orgotein peptide subunits may be polyalated using stronger alkylation conditions, for example - excess dimethyl sulfate, 0.04 M carbonate buffer at pH 10.
Jak lze očekávat , když méně než všechny z titrovatelných lysinových aminoskupin jsou alkylovány nebo karbamoylovány, je rozložení alkylových nebo karbamoylových skupin na molekule orgoteinu pravděpodobně náhodné, poněvadž žádná z titrovatelných lysinových' aminoskupin se nezdá abnormálně snadno alkylovatelná nebo přeměnitelná na karbamoylované aminoskupiny. Protože molekula orgoteinu se skládá ze dvou shodných peptidových řetězců, budou alkylové skupiny částečně alkylovaného orgoteinu a N-kar.bamoylované aminoskupiny částečně karbamoylovaného orgoteinu rozloženy více nebo méně náhodně po každé z obou peptidových podjednotek, avšak více nebo méně stejně u obou těchto řetězců. Poněvadž se obvykle používá jediného alkylačního nebo karbamoylačního činidla, budou všechny alkylové skupiny popřípadě karbamoylované aminoskupiny ' shodné. Je však též možné připravit alkylované orgoteiny a karbamoylované orgoteiny, které mají dvě nebo více rozdílných alkylových 'skupin v molekule, a dokonce v každém z obou řetězců.As can be expected, when less than all of the titratable lysine amino groups are alkylated or carbamoylated, the distribution of the alkyl or carbamoyl groups on the orgotein molecule is likely to be random, since none of the titratable lysine amino groups appears abnormally readily alkylated or convertible to carbamoylated amino groups. Because the orgotein molecule is composed of two identical peptide chains, the alkyl groups of the partially alkylated orgotein and the N-carbamoylated amino group of the partially carbamoylated orgotein will be distributed more or less randomly over each of the two peptide subunits, but more or less equally for both. Since a single alkylating or carbamoylating reagent is usually used, all alkyl or carbamoylated amino groups will be identical. However, it is also possible to prepare alkylated orgoteins and carbamoylated orgoteins having two or more different alkyl groups in the molecule, and even in each of the two chains.
Jednou cestou, jak připravit orgotein se smíšenými alkylovými skupinami, je alkylace ve stupních za použití různých alkylačních činidel. Tak například je možno část titrovatelných lysinových ε-aminoskupin alkylovat ' za použití mírné koncetrace jednoho- alkylačního činidla, například jodacetamídu, a zbytek reaktivních aminoskupin alkylovat použitím vyšší koncentrace jiného alkylačního činidla, například -dimethylsulfátu. Co se rozumí nízkou nebo- vysokou koncentrací alkylačního činidla, bude záviset na poměrných - reakčních rychlostech s proteinovými aminoiskupinami a -s rozpouštědlem ' a tak bude záviset na pH reakčního prostředí a na alkylačním činidle a v menší míře i nla pufru a teplotě.One way to prepare a mixed alkyl orgotein is by step alkylation using various alkylating agents. For example, a portion of the titratable ε-amino lysine groups can be alkylated using a slight concentration of one alkylating agent, for example iodoacetamide, and the remainder of the reactive amino groups can be alkylated using a higher concentration of another alkylating agent, for example dimethylsulfate. What is meant by a low or high concentration of alkylating agent will depend on the relative reaction rates with the protein amino groups and the solvent and thus will depend on the pH of the reaction medium and the alkylating agent and to a lesser extent in 1 and buffer and temperature.
Jedním ze způsobů, jak připravit orgotein se -smíšenými N-karbamoylovanými skupinami, je karbamoylovat ve stupních za použití různých karbamoylačních činidel. Tak například -část titrovatelných lysinových ε-aimÍnos.kupin může být karbamoylována mírně reaktivním karbamoylačním činidlem, například KNCO, a zbytek reaktivních aminoskupin může být karbamoylován reaktivnějším karbamoylačním činidlem, například methylisokyanátem. Reaktivita karbamoylačního činidla závisí na -poměrných rychlostech reakce -s proteinovými aminoskupinami a s reakčním rozpouštědlem a tím i na pH reakčního prostředí a na karbamoylačním činidle a v menší míře i na pufru a teplotě.One way to prepare an orgotein with mixed N-carbamoylated groups is to carbamoylate in stages using various carbamoylating agents. For example, part of the titratable lysine ε-amines may be carbamoylated with a slightly reactive carbamoylating agent, for example KNCO, and the rest of the reactive amino groups may be carbamoylated with a more reactive carbamoylating agent, for example methyl isocyanate. The reactivity of the carbamoylating agent depends on the proportional reaction rates with the protein amino groups and the reaction solvent, and thus on the pH of the reaction medium and the carbamoylating agent, and to a lesser extent buffer and temperature.
Jinou metodou, jak připravit smíšený alkylovaný nebo - smíšený N-karbamoylovaný orgotein, je hybridizace. Pojmem hybridizace orgoteinu -se rozumí tvorba smíšeného orgoteinu z peptidových řetězců dvou různých molekul orgoteinu, například Az a Bž, přičemž A a B představují jejich příslušné peptidové řetězce (A2 + Bž^2 AB). Náboj heterodimeru, AB, při elektroforéze by měl být průměrem náboje homodimerů A2 a B2, za předpokladu, že ve všech případech se spojení účastní táž -část každé z obou podjednotek.Another method to prepare a mixed alkylated or - mixed N-carbamoylated orgotein is by hybridization. The term "orgotein hybridization" refers to the formation of a mixed orgotein from the peptide chains of two different orgotein molecules, for example, A 2 and B 2, wherein A and B represent their respective peptide chains (A 2 + B 2 → 2 AB). The charge of the heterodimer, AB, in electrophoresis should be the average of the charges of the homodimers A2 and B2, provided that in all cases the same part of each of the two subunits is involved.
Jak ε-N-methylorgotein, vyrobený alkylací molekuly přírodního orgoteinu nadbytkem dimethylsulfátu v 0,04 M uhličitanovém pufru o pH - 10, tak ε-N-ethylorgotein, připravený alkylací orgoteinu týmž způsobem diethylsulíátem, tak i ε-N-propylkarbamoylorgotein, připravený karbamoylací molekuly přírodního orgoteinu nadbytkem -propylisokyanátu v 0,1 M roztoku tris nebo fosforečnanového pufru o pH 7,6, nebo konečně ε-N-^f^n^^^lthiokarbamoylorgotein, vyrobený karbamoylací orgoteinu methylisokyanátem v 0,075 M - roztoku tetraborit^anu sodného, všecny mohou být hydridovány s přírodním orgoteinem nebo spolu navzájem společným zahříváním při teplotě - 50 °C po dobu 4 hodin.Both ε-N-methylorgotein, produced by alkylation of a natural orgotein molecule with excess dimethyl sulfate in 0.04 M carbonate buffer at pH-10, and ε-N-ethyllorgotein, prepared by alkylating orgotein in the same manner with diethyl sulfate, and ε-N-propylcarbamoylorgotein, prepared by carbamoylation natural orgotein molecules with an excess of -propylisocyanate in 0.1 M tris or phosphate buffer pH 7.6, or finally ε-N- (1-thiocarbamoylorgotein) produced by carbamoylation of the orgotein with methyl isocyanate in 0.075 M sodium tetraborate solution , they may all be hydrated with natural orgotein or heated together at -50 ° C for 4 hours.
Jak je zřejmé, mohou být tyto hybridní semialkylované a semikarbamoylované molekuly orgoteinu dále alkylovány nebo karbamoylovány odlišným alkylačním nebo karbamoylačním činidlem -za -vzniku hybridního alkylovaného nebo karbamoylovaného orgoteinu, u něhož -alkylové skupiny a popřípadě karbamoylované - aminoskupiny v jednom· -peptidovém řetězci se liší od těchto skupin v druhém řetězci.As can be seen, these hybrid semi-alkylated and semi-carbamoylated orgotein molecules may be further alkylated or carbamoylated with a different alkylating or carbamoylating agent to form a hybrid alkylated or carbamoylated orgotein in which the -alkyl groups and optionally carbamoylated -amino groups in a single -peptide chain from these groups in the second chain.
ε-N-alkylorgoteiny a ε-N-karbamoylorgoteiny podle vynálezu se zdají mít prakticky tutéž prostorovou strukturu jako -molekula přírodního orgoteinu. Obsah chelatovaných Cu++ a Zn++ iontů (počet gramatomů na 1 mol] je přibližně -týž jako u orgoteinu. Podobně jako orgotein jsou - vysoce odolné vůči pronáze a degradaci jinými proteolytickými enzymy. Enzymatická aktivita superoxidové dismutázy je zachována, ačkoliv v případě karbamoylovaných orgoteinů je snížena v závislosti na stupni 'karbamoylace.The ε-N-alkyl chloro-proteins and ε-N-carbamoylor-proteins of the invention appear to have virtually the same spatial structure as the natural orgotein molecule. The content of chelated Cu ++ and Zn ++ ions (grammatoms per mole) is approximately the same as that of an orgotein. Like an orgotein, they are highly resistant to pronase and degradation by other proteolytic enzymes. is reduced depending on the degree of carbamoylation.
Ačkoliv převažující strukturní modifikací molekuly přírodního orgoteinů, k níž dochází při jeho .alkylaci nebo karbamoylaci při pH v alkalické oblasti, je v případě alkylace monoalkylace, dialkylace a v menším rozsahu trialkylace ε-N-aminoskupin jeho lysinových zbytků, a v případě karbamoylace pak karbamoylace těchto ε-aminoskupin, mohou. být volné aminoskupiny jeho argininových zbytků a volné skupiny karboxylových kyselin zbytků kyseliny esparágové a kyseliny glutamové, jakož i jiné alkylovatelné skupiny přítomné v molekule, zejména skupiny -OH, a imidazolový dusík a popřípadě též guanidinový dusík, skupiny -SH, -SCH3 atd. rovněž současně alkylovány nebo karbamoylovány podle použitých podmínek a reaktivity alkylacního nebo karba'moylačního činidla. Tak například zatímco při pH 10 se alkylace jodacetamidem zdá být pouhou ε-N-alkylací, je alkylace dimethylsulfátem při pH 10 méně selektivní a současně se jí zavádějí methylové skupiny jinam do molekuly. Rovněž takovéto průvodně alkylované orgoteiny, mající ε-N-alkylové skupiny, jsou zahrnuty .mezi nové sloučeniny podle vynálezu. Avšak v případě karbamoylace jsou takovéto· souběžně modifikované skupiny labilní a snadno hydrolyzovatelné ve vodných roztocích během jednoho dne nebo i během kratší doby, což závisí na hodnotě pH.Although the predominant structural modification of the natural orgotein molecule that occurs during its alkylation or carbamoylation at alkaline pH, in the case of alkylation, monoalkylation, dialkylation and, to a lesser extent, trialkylation of the ε-N-amino groups of its lysine residues, and carbamoylation in carbamoylation of these ε-amino groups can. be free amino groups of its arginine residues and free carboxylic acid groups of aspartic acid and glutamic acid residues, as well as other alkylable groups present in the molecule, in particular -OH, and imidazole nitrogen and optionally also guanidine nitrogen, -SH, -SCH3 etc. simultaneously alkylated or carbamoylated according to the conditions employed and the reactivity of the alkylating or carboylating agent. For example, while at pH 10 alkylation with iodoacetamide appears to be merely ε-N-alkylation, alkylation with dimethyl sulfate at pH 10 is less selective, while introducing methyl groups elsewhere into the molecule. Also such concomitantly alkylated orgoteins having ε-N-alkyl groups are included among the novel compounds of the invention. However, in the case of carbamoylation, such concomitantly modified groups are labile and readily hydrolyzable in aqueous solutions within a day or even shorter, depending on the pH.
Průběh alkylace, pokud zahrnuje alkylaci -COOH-skupin, a průběh karbamoylace je možno sledovat přímo podle změny celkového elektroforetického náboje a podle vzniku nových pásů při elektrolOi^é^zz\ Podobně může být N-alkylace, poněvadž přeměňuje jinak acylovatelnou skupinu -N--I2 na skupinu odolnou vůči acylaci, sledována podle snížení počtu acylovatelných aminoskupin ve srovnání s molekulou přírodního orgoteinů.The course of the alkylation, if it involves the alkylation of -COOH groups, and the course of carbamoylation can be monitored directly by the change in total electrophoretic charge and by the formation of new bands in the electrolyte. Similarly, N-alkylation can be performed because it converts the otherwise acylated -N- -12 per acylation-resistant group, monitored by a reduction in the number of acylated amino groups compared to the natural orgotein molecule.
Přesná povoha N-alkylových a N-karbamoylových skupin, jakož i jejich počet není rozhodujícím činitelem, pokud jen je alkylový nebo karbamoylový zbytek fyziologicky vhodný. Vzhledem k vyšší molekulové hmotnosti molekuly orgoteinů, i když je molekula orgoteinů plně alkylována nebo karbamoylována alkylovými nebo karbamoylovými skupinami nižší molekulové hmotnosti, například g 100, je vliv na celkové chemické složení poměrně malý, to jest menší než . 100 procent. Alkylace a karbamoylace rovněž nemá žádný výrazný účinek na prostorové uspořádání molekuly a na výslednou stabilitu, například vůči zahřívání při teplotě 60 stupňů Celsia po dobu 1 hodiny a vůči napadení proteolytickými enzymy.The exact nature of the N-alkyl and N-carbamoyl groups, as well as their number, is not critical as long as the alkyl or carbamoyl residue is physiologically suitable. Due to the higher molecular weight of the orgotein molecule, although the orgotein molecule is fully alkylated or carbamoylated with lower molecular weight alkyl or carbamoyl groups, e.g. g 100, the effect on the overall chemical composition is relatively small, i.e. less than. 100 percent. Alkylation and carbamoylation also have no significant effect on the spatial arrangement of the molecule and on the resulting stability, for example, against heating at 60 degrees Celsius for 1 hour and against attack by proteolytic enzymes.
Jak bude dále zřejmé, musí alkylová nebo karbamoylová skupina rovněž pocházet z alkylačního nebo karbamoylačního činidla, schopného· alkylovat, popřípadě karbamoylovat aminOskupinu ve vodě nebo v roztoku pufru, poněvadž se · reakce obvykle · provádí v tomto prostředí.As will be further understood, the alkyl or carbamoyl group must also be derived from an alkylating or carbamoylating agent capable of alkylating or carbamoylating the amino group in water or buffer solution, since the reaction is usually carried out in this medium.
Takováto alkylační činidla zahrnují primární dialkylsírany: (ROžSOž kde R=CH3, C2H5, n-CsHz, n-Ci-lH, aktivované alkylhalogenidy: JCH2COX, kde X = 0H, NH2, benzylbromid a allylbromid, aktivované vinylové skupiny: CH?=CHX, kde X = CN, SOCHs SCC.2H5, · CCCH3 redukční alkylační činidla: R.COOR-BH^ nebo BHaCN“, kde R a R‘ ·=' = H, CH3, C2H5, C6H5.Such alkylating agents include primary dialkyl sulfates: (R 6 SO 2 wherein R = CH 3, C 2 H 5, n-C 5 H 2, n-C 1 -1 H, activated alkyl halides: JCH 2 COX, where X = OH, NH 2, benzyl bromide and allyl bromide activated vinyl groups: CH 2 = CHX) wherein X = CN, SOCH 3 SCC 2 H 5, · CCCH 3 reducing alkylating agents: R.COOR-BH 4 or BHaCN ", wherein R and R '= H = CH, CH 3, C 2 H 5, C 6 H 5.
Metoda redukční alkylace proteinů aromatickými aldehydy a natriumkyanborhydI ridem je popsána· Friedmanem M. a· spol. v časopisu Int. J. Peptide Protein Res., 6, 1974, str. 183—185, . alkylace . akrylonitrilem pak Meansem a Feeneyem v knize „Chemical Modifitacion of Proteins“, kapitola 6, 114— —117, Fletcherem J. C., v časopisu Biochem. J. 98 34C (1966), Friedmanem M. a spol. v časopisu J. Amer. Chem. Soc. 87, str. 3672 (1965) a Friedmanem M. a spol. v časopisu J. Org. Chem., 31, str. 2888 (1966).The method of reductive alkylation of proteins with aromatic aldehydes and sodium cyanoborohydride is described by Friedman M. et al. in Int. J. Peptide Protein Res., 6, 1974, pp. 183-185. alkylation. acrylonitrile then Means and Feeney in the book "Chemical Modifitacion of Proteins", chapter 6, 114-117, by Fletcher J. C., in Biochem. J. 98 34C (1966), Friedman M. et al. in J. Amer. Chem. Soc. 87, p. 3672 (1965) and Friedman M. et al. in J. Org. Chem., 31, 2888 (1966).
Příklady vhodných karbamoylačních činidel zahrnují kyanáty alkalických kovů, například NaNCO, KNCO, alkylisokynáty a alkylisothiokyanáty, například RNCO a RNCS, kde R = CH3, C2H5, n-CíHr, n-CdH9, n-CaHiz, a arylisokyanáty a isokyanáty, například fenylisokyanát a fenylisothiokyanát.Examples of suitable carbamoylating agents include alkali metal cyanates such as NaNCO, KNCO, alkyl isocyanates and alkyl isothiocyanates such as RNCO and RNCS where R = CH3, C2H5, n-C1Hr, n-CdH9, n-CaHiz, and aryl isocyanates and isocyanates such as phenylisocyanate and phenylisothiocyanate.
Ačkoliv kyanáty kovu reagují s mnoha druhy postranního řetězce, skýtá stabilní produkt . pouze jejich reakce s aminosikupinami, kterou se přemění ve skupiny močoviny.Although metal cyanates react with many types of side chain, it provides a stable product. only their reaction with amino groups to convert them into the urea group.
Reakce alkylisothiokyanátů a alkylisokyanátů s orgoteinem je zcela obdobná reakci kynátů s orgoteinem, pouze mnohem rychlejší. Isokynáty s dlouhým řetězcem jsou méně reaktivní než isokyanáty s krátkým řetězcem.The reaction of alkylisothiocyanates and alkylisocyanates with orgotein is quite similar to the reaction of cyanates with orgotein, only much faster. Long chain isocyanates are less reactive than short chain isocyanates.
Reakci orgoteinů s isokyanáty a isothiokyanáty je obvykle možno sledovat použitím činidla, které vnáší do· molekuly fluorescenční skupinu, jakým je například isothiokyanát fluoresceinu. Toto činidlo je podobné alkylisokyanátům a reaguje s aminoskupinami orgoteinů za vzniku substituovaných thiomočovin. Avšak i nízký .stupeň substttuce snižuje· ve značné míře aktivitu superoxidové dismutázy orgoteinů vzhledem k množství fluoresceinu.Monosubstituované a disubstituované orgoteiny nejsou v roztoku stálé a pozvolna se stávají více heterogenními následkem výměny mezi podjednotkami a následkem hydroýzy.The reaction of orgoteins with isocyanates and isothiocyanates can usually be monitored using a reagent that introduces a fluorescent moiety such as fluorescein isothiocyanate into the molecule. This reagent is similar to alkyl isocyanates and reacts with amino groups of orgoteins to form substituted thioureas. However, even a low degree of substitution greatly reduces the activity of superoxide orgotein dismutase relative to the amount of fluorescein. Monosubstituted and disubstituted orgoteins are not stable in solution and gradually become more heterogeneous as a result of exchange between subunits and the consequence of hydrolysis.
Poněvadž na tom, o jaký alkylový zbytek v molekule .orgoteinů jde, nezáleží, pokud jen není fyziologicky toxický a může být vytvořen na · lysinových e-aminoskupinách, jsou případnými ekvivalenty výhodných výše popsaných uhlovodíkových alkylových skupin, pokud jen mohou být vytvořeny, cyklopentylová, cyklohexylová, . methylová a podobná cykloalkylová, cyklohexylmethylová, /J-cyklopentylpropyiová a podobná cykloalkylal203992 kýlová, dále benzylová, p-xylylová a fene'thylová a podobná aralkylová skupina.Since the alkyl moiety in the molecule is not important, unless it is physiologically toxic and can be formed on lysine ε-amino groups, the optional equivalents of the above-described hydrocarbon alkyl groups, if any, can be formed, cyclopentyl, cyclohexyl,. methyl and the like cycloalkyl, cyclohexylmethyl, N-cyclopentylpropyl, and the like cycloalkylalkyl, benzyl, p-xylyl and phenethyl and the like aralkyl groups.
Rovněž možnými ekvivalenty jsou alkylové skupiny s 1 až 8, s výhodou 1 až 4 atomy uhlíku, a zejména methylový nebo ethylový zbytek nejméně s jedním, výhodně s jedním jednoduchým substituentem, jako je karboxylová skupina, kyanoskupina, karbalkoxylová skupina a amidoskupina, například karboxymethylová, kyanomethyíová, karbethoxymethylová, karbmethoxymethylová skupina, a podobně karb-nižší alkoxymethylová, karbamoylmethylová skupina, jakož i příslušně substituované ethylové skupiny, například skupiny -CH2CH2COOH, -CH2CH21CS N, -CH2CH2CONH2 a -CH2CH2COOR, kde R znamená · například methylový ' nebo ethylový zbytek, skupinu -CH2CH2SOCH3, -CH2CH2SOC2H5 .. a -CH2CH2COCH3.Possible equivalents are alkyl groups of 1 to 8, preferably 1 to 4 carbon atoms, and in particular a methyl or ethyl radical with at least one, preferably one, single substituent such as carboxyl, cyano, carbalkoxy and amido, for example carboxymethyl, cyanomethyl, carbethoxymethyl, carbmethoxymethyl, and the like carb-lower alkoxymethyl, carbamoylmethyl, as well as appropriately substituted ethyl groups, for example -CH2CH2COOH, -CH2CH21CS N, -CH2CH2CONH2 and -CH2CH2COOR, where R is, for example, methyl or ethyl; -CH 2 CH 2 SOCH 3, -CH 2 CH 2 SOC 2 H 5, and -CH 2 CH 2 COCH 3.
Jsou tedy alkylovanými orgoteiny podle vynálezu analogy orgoteinu z hovězího· Skotu, ovcí, koní, vepřů, psů, králíků, morčat, kuřat a lidí, · jejichž nejméně jedna, například 1, 2, 3, 4, 5 a až všechny (asi 18 až 26] titrovatelné aminoskupiny jsou alkylovány, to jest, mají nesubstituovanou nebo substituovanou alkylovou skupinu.Thus, the alkylated orgoteins of the invention are bovine, ovine, equine, swine, canine, rabbit, guinea pig, chicken and human analogues of the bovine, of which at least one, for example 1, 2, 3, 4, 5 and up to all (about 18 to 26] titratable amino groups are alkylated, i.e., have an unsubstituted or substituted alkyl group.
S výhodou jsou alkylovanými aminoskupinami skupiny vzorce —NH—CHz—R , kde R znamená vodík, skupinu CH3, C2H5, n-C3H7 nebo jinou alkylovou skupinu až se 7 atomy uhlíku, skupinu -COOH, -COO-LA, -CONH-LA, -CON-(LA)2, -CN, -CH2-CN, -Ph, -COPh, -CH2OH nebo -СН(СНз) OH, kde LA znamená alkylový zbytek s 1 až 4 atomy a Ph znamená nesubstituovaný fenylový zbytek nebo fenylový zbytek s 1 až 3 jednoduchými substituenty, například methylem, chlorem, bromem, nitroskupinou, amidoskupihou a methoxyskupinou, karboxyskupinou nebo karboethoxyskupinou, jako je např. p-tolylový, sym-xylylový, p-amidofenylový, m-chlorfenylový a p-methoxyfenylový zbytek.Preferably, alkylated amino groups are —NH — CH2 —R, wherein R is hydrogen, CH3, C2 H5, n -C3 H7, or another alkyl group of up to 7 carbon atoms, -COOH, -COO-LA, -CONH-LA , -CON- (LA) 2, -CN, -CH 2 -CN, -Ph, -COPh, -CH 2 OH or -СН (СНз) OH, where LA is an alkyl radical of 1 to 4 atoms and Ph is an unsubstituted phenyl radical, or a phenyl radical having 1 to 3 simple substituents, for example methyl, chlorine, bromine, nitro, amido and methoxy, carboxy or carboethoxy, such as p-tolyl, symylyl, p-amidophenyl, m-chlorophenyl and p-methoxyphenyl .
Takové orgoteiny mají obecný vzorec (H2N)m-org-(NHCH2R)n , kde n- znamená c-elé číslo od 1 do přibližně 26, s výhodou ' nejméně 10, zejména 10 až 18, a součet m + n znamená celkový počet titrovatelných volných ' aminoskupin v nemodifikovaném analogu, a R má výše uvedený význam, s výhodou znamená vodík nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, například methylovou skupinu, a org znamená zbytek molekuly orgoteinu.Such orgoteins have the general formula (H2N) m -org- (NHCH2R) n, wherein n- is an integer from 1 to about 26, preferably at least 10, especially 10 to 18, and the sum of m + n represents the total number and R is as defined above, preferably is hydrogen or C1-C4 alkyl, for example methyl, and org is the remainder of the orgotein molecule.
Některá z alkylačních . činidel používaná při způsobu podle vynálezu budou současně alikylovat některé ze skupin volné kyseliny molekuly orgoteinu. Tyto alkylované orgoteiny je možno znázornit obecným vzorcem (HOOC)X (COOCHžRJy \ / (org) / \ (H2N)m (NHCH2R)n kde org, R m a n mají výše uvedené významy, y znamená počet alkylovaných skupin volné karboxylové kyseliny, například 1 až 8, s výhodou 2 až 6, a x znamená zbytek skupin volné karboxylové kyseliny v .molekule orgoteinu.Some of the alkylation. The agents used in the method of the invention will simultaneously alkylate some of the free acid groups of the orgotein molecule. These alkylated orgoteins can be represented by the general formula (HOOC) X (COOCH2R @ y) / (org) / \ (H2N) m (NHCH2R) n wherein org, R and m are as defined above, y is the number of alkylated free carboxylic acid groups, e.g. to 8, preferably 2 to 6, and x is the remainder of the free carboxylic acid groups in the orgotein molecule.
Činidly vhodnými pro zavádění karboxymethylové a karbamoylmethylové skupiny jsou kyselina jodoctová a jodacetamid.Suitable reagents for introducing the carboxymethyl and carbamoylmethyl groups are iodoacetic acid and iodoacetamide.
Kyselina jodoctová může tvořit stabilní produkty s cysteinovými (sulfhydryl), lysinovými (amino), histidinovými (imidazolové dusíky] a methioninovými (.s^lfidická síra) zbytky v proteinech. *Iodoacetic acid can form stable products with cysteine (sulfhydryl), lysine (amino), histidine (imidazole nitrogen) and methionine (sulfuric) sulfur residues in proteins. *
Poněvadž karboxymethylací kterékoliv z těchto skupin, s výjimkou methioninu, se zvyšuje účinný záporný náboj v orgoteinovém proteinu při pH 8,4, je možno celkovou reakci kvantitativně vyhodnotit elektroforeticky (vyjma karboxymethylace methioninu a karboxymethylace druhého imidazolového dusíku').Since carboxymethylation of any of these groups, with the exception of methionine, increases the effective negative charge in the orgotein protein at pH 8.4, the overall reaction can be quantitated electrophoretically (except for carboxymethylation of methionine and carboxymethylation of the second imidazole nitrogen ').
U. přírodního orgoteinu reagují kyselina jodoctová a jodacetamid převážně, ne-li výhradně, s lysinovými aminoskupinami. Ačkoliv volné thioly reagují s kyselinou jodoctovou řádově několikrát než aminy, nereaguje · prvních několik skupin v orgoteinu, které jsou karboxymethylovány, nijak . znatelně rychleji než reaguje dalších 10 až 20 skupin. Toto je v souhlasu s reakcí p-merkuribenzoátu se sulfhydryly · orgoteinu: nedochází k žádné reakci s holoproteinem. I u apoproteinu, který skýtá p-merkuribezoátsulfhydrylovou reakci (třebaže pomalou za nedenaturujících podmínek), nedochází při použití kyseliny . jodoctové v desetinásobném moiárním nadbytku při pH 7 k žádnému poklesu po několika týdnech při teplotě 4°C v obsahu sulfhydrylu (stanoveno· spektrofotometricky titrací pjmerkuribenzoátem. Závislost karboxymethylační reakce na pH, jak vyplývá z elektroforézy, je v souhlasu s reakcí lysinu (pk > &) a nikoliv histidinu (pK < 6), poněvadž rozsah reakce při stejných počátečních koncentracích se neustále zvyšuje v té míře, jak se hodnota pH blíží 9, přičemž nedochází k žádné znatelné reakci při neutrální hodnotě nebo pod ní, kdy hlstidin . by stále měl být neprotonovaný a reaktivní. Na druhé straně titrace ethylchlorformiátem na histidin ukázala pouze 5 histidinů v karboxymethylovaném orgoteinu za podmínek, při nichž ce jich v přírodním orgoteinu ukazuje 16.In natural orgotein, iodoacetic acid and iodoacetamide react predominantly, if not exclusively, with lysine amino groups. Although the free thiols react with iodoacetic acid several times than amines, the first few groups in the carboxymethylated orgotein do not react in any way. noticeably faster than the next 10 to 20 groups react. This is in agreement with the reaction of p-mercuribenzoate with sulfhydryls of orgotein: there is no reaction with holoprotein. Even apoprotein, which provides a p-mercuribezoate sulfhydryl reaction (albeit slow under non-denaturing conditions), does not occur with acid. iodoacetic acid in 10-fold molar excess at pH 7 to no decrease after a few weeks at 4 ° C in the sulfhydryl content (determined spectrophotometrically by titration with p-mercuribenzoate. The pH dependence of the carboxymethylation reaction as determined by electrophoresis is consistent with lysine reaction. ) and not histidine (pK <6), since the extent of reaction at the same initial concentrations is constantly increasing as the pH approaches 9, with no appreciable reaction at or below neutral, where On the other hand, titration with ethyl chloroformate to histidine showed only 5 histidines in the carboxymethylated orgotein under conditions where they showed 16 in the natural orgotein.
Důkaz, že u přírodního orgoteinu z hovězího skotu nedochází k reakci ani u methio203992 ninu ani u histidinu, vyplynul z pokusu, při němž byl orgotein inkubován po 48 hodin s 0,2 M roztokem jodacetamidu v 0,5 M fosforečnanovém pufru o pH 6,5. Alkylací methioninu nebo dvojitou alkylací histidinu by byl měl vzniknout více pozitivně nabitý protein při pH 8,4, avšak při elektroforéze se neprojevila žádná změna aktivity superoxidové dismutázy ani změna v soustavě pásů.Evidence that the natural bovine orgotein did not respond to either methio203992 nin or histidine was the result of an experiment in which the orgotein was incubated for 48 hours with a 0.2 M solution of iodoacetamide in 0.5 M phosphate buffer at pH 6, 5. Alkylation of methionine or double alkylation of histidine should result in a more positively charged protein at pH 8.4, but there was no change in superoxide dismutase activity or change in band system during electrophoresis.
Avšak lysinové aminoskupiny v orgoteinu rozhodně reagují s jodacetátem. Extenzívně karboxymethylovaný orgotein se při elektroforéze pohybuje podobně jako acetylovaný orgotein, má však nižší aktivitu superoxidové dismutázy (přibližně 20 % nemodifikovaného· orgoteinového proteinu).However, the lysine amino groups in the orgotein definitely react with iodoacetate. Extensively carboxymethylated orgotein moves similarly to acetylated orgotein in electrophoresis but has a lower superoxide dismutase activity (approximately 20% of the unmodified orgotein protein).
Kromě N-rnethylorgoteinů z hovězího skotu a orgoteinů z · dále uvedených · příkladů jsou dalšími příklady N-alkylorgoteinů z hovězího skotu podle vynálezu N-ethylorgotein, N-propylorgotein a N-benzylorgotein, kde v každém případě je 9 takových alkylových skupin v každé z obou podjednotek molekuly orgoteinu, popřípadě příslušné orgoteiny, u nichž je v průměru 1, 6 nebo 10 takových alkylových skupin v každé této podjednotce, a příslušné analogy těchto orgoteinů z lidí, ovcí, koní, vepřů, psů, králíků, morčat a kuřat.In addition to the bovine N-methyl-organogoteins and the orgoteins of the examples below, other examples of the bovine N-alkyl chlorgoteins of the invention are N-ethylorgotein, N-propylorgotein and N-benzylorgotein, wherein in each case there are 9 such alkyl groups in each both subunits of the orgotein molecule, or the respective orgoteins, on average 1, 6 or 10 such alkyl groups in each subunit, and the respective analogues of these orgoteins from humans, sheep, horses, pigs, dogs, rabbits, guinea pigs and chickens.
Karbamoylovanými orgoteiny podle vynálezu jsou analogy orgoteinu z hovězího skotu, ovcí, koní, vepřů, krys, psů, králíků, morčat, kuřat a lidí, u nichž alespoň jedna, například 1, 2, 3, 4, 5 až všechny (přibližně 18 až 26) titrovatelné aminoskupiny jsou karbamoylovány, to jest mají nesubstituovanou nebo substituovanou skupinu —CONH— nebo —CSNH—.The carbamoylated orgoteins of the invention are bovine, ovine, equine, pig, rat, dog, rabbit, guinea pig, chicken and human orgotein analogues in which at least one, for example, 1, 2, 3, 4, 5 to all (about 18 to 18). 26) titratable amino groups are carbamoylated, i.e., have an unsubstituted or substituted "CONH" or "CSNH" group.
Výhodně jsou karbamoylovanými aminoskupinami aminoskupiny obecného vzorcePreferably, the carbamoylated amino groups are amino groups of the general formula
XX
II —NHCNHR, kdeII — NHCNHR where
X znamená kyslík nebo síru aX is oxygen or sulfur; and
R znamená skupinu CH3, · C2H5, n-CsHť, n-CsHi.7 nebo jinou alkylovou skupinu s až 12 atomy uhlíku, Ph nebo, když X znamená kyslík, rovněž atom vodíku, a Ph znamená nesubstituovanou fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu mající 1 až 3 jednoduché substituenty, jakými jsou například methylový zbytek, chlor, brom, nitroskupina, amidoskupina a methoxyskupina, karbomethoxyskupina nebo karboethoxyskupina, například p-tolylový, s-xylylový, p-amidofenylový, m-chlorfenylový a p-methoxyfenylový zbytek. Takovéto· orgoteiny mají vzorecR is CH 3, C 2 H 5, n-C 5 H 6, n-C 5 H 17 or another alkyl group of up to 12 carbon atoms, Ph or, when X is oxygen, also hydrogen, and Ph is unsubstituted phenyl or phenyl having 1 up to 3 simple substituents such as methyl, chloro, bromo, nitro, amido and methoxy, carbomethoxy or carboethoxy, for example p-tolyl, s-xylyl, p-amidophenyl, m-chlorophenyl and p-methoxyphenyl. Such orgoteins have the formula
XX
II (H2N)m-org-(NHCNH-R)n, kde n znamená celé číslo· od 1 asi do 26, s výhodou nejméně 2, zejména pak 6 až 10, a součet n + m znamená celkový počet tltrovatelných volných aminoskupin v nemodifikovaném analogu,II (H2N) m -org- (NHCNH-R) n , wherein n is an integer from 1 to about 26, preferably at least 2, in particular 6 to 10, and the sum of n + m represents the total number of washable free amino groups in an unmodified analog,
X znamená kyslík nebo síru,X is oxygen or sulfur,
R má výše uvedený význam, ·s výhodou vodík nebo alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku, a org znamená zbytek molekuly orgoteinu.R is as defined above, preferably hydrogen or alkyl of 1 to 8 carbon atoms, and org is the remainder of the orgotein molecule.
Obzvlášť výhodnými karbamoylovanými orgoteiny jsou alkylkarbamoylorgotein a alkylthiokarbamoylorgotein u nichž alkylovou skupinou je nesubstituovaný alkylový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku, například methylový, ethylový, propylový, isopropylový, butylový nebo oktylový zbytek.Particularly preferred carbamoylated orgoteins are alkylcarbamoylorgotein and alkylthiocarbamoylorgotein wherein the alkyl group is an unsubstituted C 1 -C 8 alkyl radical, for example a methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl or octyl radical.
Poněvadž na tom, o jakou karbamoylovou skupinu v molekule orgoteinu jde, nezáleží, pokud jen není fyziologicky toxická a může být vytvořena na lysinových ε-aminoskupinách, jsou případnými ekvivalenty výhodných výše popsaných alkylkarbamoylorgoteinů, pokud jen mohou být vytvořeny, ty, které jinak odpovídají výše uvedenému vzorci, kde R znamená · cyklopentylový, cyklohexylový, methylový a podobný cýkloalkylový, dále cyklohexylmethylový, /-cyklopentylpropylový a podobný · cykloalkylový, benzylový, pcχklklový a fenethylový a podobný aralkylový zbytek.Since the carbamoyl group in the orgotein molecule does not matter if it is not only physiologically toxic and can be formed on the lysine ε-amino groups, the possible equivalents of the preferred alkylcarbamoylorogoteins described above, if they can be formed, are those which otherwise correspond to the above of the above formula wherein R represents a cyclopentyl, cyclohexyl, methyl and the like cycloalkyl, cyclohexylmethyl, n-cyclopentylpropyl and the like cycloalkyl, benzyl, cycloalkyl and phenethyl and the like aralkyl radical.
Rovněž možnými ekvivalenty jsou ty orgoteiny výše uvedeného vzorce, kde R znamená alkylový zbytek s 1 až 8, s výhodou 1 až 4 atomy uhlíku, · zejména pak methylový nebo · ethylový zbytek případně substituovaný nejméně jedním, výhodně jedním jiným· substituentem, například fluoresceinylovým zbytkem.Possible equivalents are those orgoteins of the above formula wherein R is an alkyl radical of 1 to 8, preferably 1 to 4 carbon atoms, especially a methyl or ethyl radical optionally substituted by at least one, preferably one other, substituent, for example a fluoresceinyl radical .
Kromě N-karbamoylovaného orgoteinu z hovězího skotu z následujících příkladů jsou dalšími příklady N-karbamoylorgoteinu z hovězího skotu podle vynálezu příslušný N-karbamoylorgotein, Ncpropylkarbamoylorgotein, NcεthklkaгbamΌylorgotem a N-methylthiokarbamoylorgotein, u nichž je vždy 9 takovýchto karbamoylových skupin v každé z obou podjednotek molekuly orgoteinu, a příslušné orgoteiny, u nichž je průměrně 1, 6 · nebo 10 takovýchto karbamoylových skupin v každé z obou podjednotek, a dále příslušné lidské, ovčí, koňské, vepřové, psí, králičí, morčí, kuřecí a krysí analogy každé z uvedených sloučenin.In addition to the N-carbamoylated bovine orgotein of the following examples, other examples of the bovine N-carbamoylorgotein of the present invention are the corresponding N-carbamoylorgotein, N-propylcarbamoylorgotein, N-thecoccarbamoylglorine and N-methylthiocarbamoylgotein groups, both of which are both carbamoylgotein groups. , and the respective orgoteins having an average of 1, 6, or 10 such carbamoyl groups in each of the two subunits, and the respective human, sheep, horse, pork, canine, rabbit, guinea pig, chicken and rat analogs of each compound.
Jak již bylo výše uvedeno, obsahují analogy orgoteinu asi 50 až 68 zbytků kyseliny glutamové a asparágové, avšak pouze asi 20 až 27 z těchto zbytků má skupiny volné kyseliny. Poněvadž molekula orgoteinu sestává ze dvou shodných nebo téměř shodných peptidových řetězců (podjednotek), je polovina z těchto zbytků aminokyselin v každém z obou řetězců, které se k sobě za mírných podmínek teploty a pH pevně, avšak nikoliv kovalentně váží. Esterifikací se změní náboj molekuly orgoteinu a obvykle pouze jen · až 10, s výhodou jen až asi 6 až 8 z těchto skupin volné kyseliny může být esterifikováno, přičemž si stále zachovávají onu strukturu přírodní molekuly, na níž závisí stabilita a použitelnost této látky.As mentioned above, the orgotein analogs contain about 50-68 glutamic and aspartic acid residues, but only about 20-27 of these residues have free acid groups. Since the orgotein molecule consists of two identical or nearly identical peptide chains (subunits), half of these amino acid residues in each of the two chains are rigid but not covalently bound to each other under mild temperature and pH conditions. Esterification changes the charge of the orgotein molecule and usually only about 10 to 10, preferably only about 6 to 8 of these free acid groups can be esterified while still retaining the structure of the natural molecule upon which the stability and usefulness of the substance depend.
Esterifikace skupin karboxylové kyseliny může být kvantitativně sledována podle změny náboje při elektroforéze. Je-li to žádoucí, může být esterifikovaný orgotein hybridován přírodním orgoteinem, jak je v dalším popsáno, čímž se o polovinu sníží počet skupin esterifikované karboxylové kyseliny v molekule.The esterification of carboxylic acid groups can be quantitatively monitored by a change in charge during electrophoresis. If desired, the esterified orgotein can be hybridized with a natural orgotein, as described below, thereby reducing by half the number of esterified carboxylic acid groups per molecule.
Protože molekula . orgoteinu se skládá ze dvou shodných peptidových řetězců, jsou esterové skupiny pravděpodobně více nebo méně rovnoměrně rozděleny mezi oba řetězce. Poněvadž se obvykle používá jediného esterifikačního činidla, budou všechny esterové skupiny shodné. Avšak je možné připravit esterifikované orgoteiny, které mají dvě nebo ' i více různých esterových skupin v molekule a dokonce i v každém svém řetězci.Because the molecule. The orgotein consists of two identical peptide chains, the ester groups are probably more or less evenly distributed between the two chains. Since a single esterifying agent is usually used, all ester groups will be identical. However, it is possible to prepare esterified orgoteins having two or more different ester groups per molecule and even in each of its chains.
Jedním způsobem, jak připravit smíšený ester orgoteinu, je postupná esterifikace různými esterifikačními činidly. Tak například je možno část skupin volné kyseliny esterifikovat jedním esterifikačním činidlem o nízké koncentraci, například diethylsulfátem, a další část skupin volné kyseliny esterifikovat jiným esterifikačním činidlem o vysoké koncentraci, například diazomethanem. Co se rozumí nízkou, popřípadě vysokou koncentrací esterifikačního činidla, bude záviset na jeho poměrných rychlostech reakce s kyselými skupinami proteinu a s rozpouštědlem, a tím bude záviset na pH reakčního prostředí a na esterifikačním činidle a v menší míře na pufru a teplotě.One way to prepare a mixed orgotein ester is to sequentially esterify with different esterifying agents. For example, a portion of the free acid groups can be esterified with one low concentration esterifying agent, such as diethyl sulfate, and another portion of the free acid groups can be esterified with another high concentration esterifying agent, such as diazomethane. What is meant by a low or high concentration of esterifying agent will depend on its relative rates of reaction with the acid groups of the protein and the solvent, and thus will depend on the pH of the reaction medium and the esterifying agent, and to a lesser extent buffer and temperature.
Jinou metodou, jak získat smíšený ester orgoteinu, je hybridizace. Pojem hybridizace orgoteinu vyjadřuje tvorbu smíšeného orgoteinu z podjednotkových řetězců dvou různých molekul orgoteinu, například . Až a Bž, kde A a B znamenají jejich příslušné peptidové řetězce (Α2 + Β22ΎΑΒ). Při etektroforéze by náboj heterodimeru AB měl být průměrem nábojů homodimerů Až a B2, za předpokladu, že ve všech případech se spojení účastní táž .část každé z obou podjednotek.Another method of obtaining a mixed orgotein ester is by hybridization. The term hybridization of orgotein expresses the formation of a mixed orgotein from the subunit chains of two different orgotein molecules, for example. Up to and Bž, where A and B are their respective peptide chains (Α2 + Β22ΎΑΒ). In electrophoresis, the charge of the heterodimer AB should be the average of the charges of the homodimers A 1 and B 2, provided that in all cases the same portion of each of the two subunits is involved.
Jak methylorgotein, tak ethylorgotein mohou být hýbridovány přírodním orgoteinem nebo spolu navzájem zahříváním s malým nadbytkem přírodního orgoteinu při teplotě 50 ;°C po dobu 4 hodin. Výsledné heterodimery se při elektroforéze projeví jako směs pásů, ležících mezi pásem přírodního orgoteinu a pásy esterifikovaného orgoteinu před hybridizací.Both the methyl chloro-protein and the ethyl chloro-protein can be hybridized with natural orgotein or by heating with each other with a small excess of natural orgotein at 50 ; ° C for 4 hours. The resulting heterodimers appear in electrophoresis as a mixture of bands lying between the natural orgotein band and the esterified orgotein band prior to hybridization.
Jak je zřejmé, mohou · být tyto hybridní molekuly semiesterifikovaného orgoteinu dále esterifikovány jiným esterifikačním činidlem .za vzniku hybridního. esterifikovaného orgoteinu, u něhož se esterové skupiny v jednom peptidovém řetězci liší od esterových skupin v druhém řetězci.As can be seen, these hybrid molecules of the semi-esterified orgotein can be further esterified with another esterifying agent to form a hybrid. an esterified orgotein in which the ester groups in one peptide chain differ from the ester groups in the other chain.
Esterifikované orgoteiny podle vynálezu se zdají mít prakticky tutéž prostorovou strukturu jako molekula přírodního orgoteinu. Obsahy chelatovaných Cu++ a Zn++ iontů (počet gramatomů na 1 mol) jsou přibližně stejné jako u orgoteinu. Podobně jako orgotein jsou vysoce odolné vůči pronáze a degradaci jinými proteolytickými enzymy. Enzymatická aktivita superoxidové dismutázy se znatelně nesníží, dokud není esterifikováno více než asi 6 až 8 skupin karboxylové kyseliny.The esterified orgoteins of the invention appear to have virtually the same spatial structure as the natural orgotein molecule. The contents of chelated Cu ++ and Zn + + ions (number of grammatomes per mole) are approximately the same as those of an orgotein. Like orgotein, they are highly resistant to pronase and degradation by other proteolytic enzymes. The enzymatic activity of the superoxide dismutase is not appreciably reduced until more than about 6-8 carboxylic acid groups are esterified.
Povaha esterifikujících skupin podobně jako počet esterifikovaných skupin není rozhodující, pokud jen je esterifikující skupina fyziologicky vhodná. Vzhledem k vyšší molekulové hmotnosti molekuly orgoteinu, i když je molekula orgoteinu esterifikována esterifikujícími skupinami nízké molekulové hmotnosti, například ál60, je vliv na celkové chemické složení poměrně malý, to jest menší než 5 %. Esterifikace skupin volné karboxylové kyseliny má samozřejmě velký vliv na isoelektrický bod a na výslednou elektroforetickou pohyblivost, avšak — jak již bylo výše uvedeno — pokud je esterifikace omezena asi na 10 nebo· méně skupin kyseliny glutamové a asparágové, nemá žádný výrazný vliv na prostorové uspořádání molekuly a na výslednou stabilitu, · například vůči zahřívání při . teplotě 60 °C po 1 hodinu a vůči napadení proteolytickými enzymy.The nature of the esterifying groups, like the number of esterified groups, is not critical as long as the esterifying group is physiologically appropriate. Due to the higher molecular weight of the orgotein molecule, although the orgotein molecule is esterified by low molecular weight esterifying groups, such as 60, the effect on the overall chemical composition is relatively small, i.e. less than 5%. The esterification of the free carboxylic acid groups has, of course, a large effect on the isoelectric point and the resulting electrophoretic mobility, but - as mentioned above - if esterification is limited to about 10 or less glutamic and aspartic acid groups, it has no significant effect on the spatial arrangement of the molecule and the resulting stability, for example against heating at. at 60 ° C for 1 hour and against proteolytic enzyme attack.
Jak bude dále zřejmé, esterifikující skupiny musí též pocházet z esterifikačního· činidla schopného esterifikovat skupinu karboxylové kyseliny ve vodném roztoku nebo v roztoku pufru, poněvadž se reakce obvykle provádí v těchto prostředích. Takováto esterifikační činidla zahrnují dimethylsulfát a diethylsulfát, diazomethan a jiné diazosloučeniny, například vzorceAs will be further appreciated, the esterifying groups must also be derived from an esterifying agent capable of esterifying the carboxylic acid group in an aqueous solution or a buffer solution, since the reaction is usually carried out in these environments. Such esterifying agents include dimethyl sulfate and diethyl sulfate, diazomethane and other diazo compounds, for example
N2CH2COX, kdeN2CH2COX, where
X znamená například skupiny OCH3, OC2H5, NH2 nebo NHCH2CONH2, a jiné estery a amidy diazooctové kyseliny, které nemají reaktivní skupiny, jako je karboxylová skupina nebo iminoskupina.X is, for example, OCH 3, OC 2 H 5, NH 2 or NHCH 2 CONH 2, and other diazoacetic acid esters and amides that do not have reactive groups such as a carboxyl group or an imino group.
Metody přípravy takovýchto esterů jsou popsány v příručce „Methods in Enzymology,“ sv. XI, str. 612 (1967), a dále v Biochem. Biohys, Ress. Comm., 30, str. 489 (196’8) K. T. Fryem a spol., a v PNAS, 56, str. ’ 1817 (1966), G. R. Delpierrem a J. S. Frutonem.Methods for preparing such esters are described in "Methods in Enzymology," Vol. XI, p. 612 (1967), and further in Biochem. Biohys, Ress. Comm., 30, p. 489 (196'8) by K. T. Fry et al., And in PNAS, 56, p. 1817 (1966), G. R. Delpierr and J. S. Fruton.
Dále se vynález týká orgoteinu s esterifikovanou COOH skupinou, u něhož esterová skupina má výhodně až 4 atomy uhlíku, například od jednomocného alkanolu, jako· je methylová nebo ethylová, s výhodou methylová skupina.The invention further relates to an COOH esterified orgotein in which the ester group preferably has up to 4 carbon atoms, for example from a monovalent alkanol such as methyl or ethyl, preferably methyl.
Poněvadž na tom, 0 jaký esterový zbytek jde, nezáleží, pokud jen není fyziologicky toxický · a může být vytvořen na skupinách volné kyseliny v orgoteinu, jsou případnými ekvivalenty výhodných alkylových esterifikujících výše popsaných skupin, pokud jen mohou být vytvořeny, ty, které mají jeden, dva nebo více · jednoduchých substituentů, například halogen, alkoxyskupinu, karbal17 koxyskupinu, karbaminoskupinu atd., zejména pak ty, u nichž je esterovou skupinou nesoucí substituent nebo substituenty methylová skupina. Tak například, kromě esterifikováného orgoteinů, u něhož jsou skupinami esterifikované kyseliny skupiny —СООСНз, jsou případnými ekvivalenty ty sloučeniny, u nichž jsou esterovými skupinami skupiny —COOR, kde R znamená skupinu —GHzCOX, v níž X znamená skupinu ОСНз, OCžils, N112, NHCH2CONH2 nebo CHžCHz-fenyl, nebo kde R znamená skupinu СИ (fenyl )2.Since the ester moiety does not matter if it is not only physiologically toxic and can be formed on the free acid groups in the orgotein, the possible equivalents of the preferred alkyl esterifying groups described above, if they can be formed, are those having one two or more simple substituents, for example halogen, alkoxy, carbal17, alkoxy, carbamino, etc., especially those in which the ester group bearing the substituent or substituents is a methyl group. For example, except for esterified orgoteins in which the esterified acid groups are —СООСНз, the possible equivalents are those in which the ester groups are —COOR, where R is —GHzCOX, where X is ОСНз, OCžils, N112, NHCH 2 CONH 2 or CH 2 CH 2 -phenyl, or wherein R represents C 1 (phenyl) 2.
Esterifikace skupin —COOH může být následována stanovením změny náboje zjištěné elektroforeticky srovnáním s přírodními orgoteiny.Esterification of the COOH groups can be followed by determining the charge change detected electrophoretically by comparison with natural orgoteins.
Jak je známo, elektroforetická pohyblivost iontu je funkcí intenzity elektrického pole, účinného náboje iontu (včetně vázaných 0pačných iontů) a součinitele tření, viz například příručku C. Tanforda „Physical. Chemistry of Macromolecules“, nakladatelství Wilsy, New York (1966). Poněvadž součinitel tření závisí na velikosti a tvaru molekuly a 11a složení roztoku, nejsou srovnání různých proteinů příliš informativní. Avšak srovnávají-Ii se proteiny podobné velikosti a tvaru, v tomto případě molekuly orgoteinů chemicky modifikované poměrně malými skupinami, za identických elektroforetických podmínek, je jedinou proměnnou veličinou ovlivňující tuto elektroforetickou pohyblivost účinný náboj.As is known, the electrophoretic mobility of an ion is a function of the electric field strength, the effective charge of the ion (including bonded ions) and the coefficient of friction, see, for example, C. Tanford's "Physical. Chemistry of Macromolecules', Wilsy Publishing House, New York (1966). Since the coefficient of friction depends on the size and shape of the molecule and the composition of the solution, comparisons of the different proteins are not very informative. However, when compared to proteins of similar size and shape, in this case the orgotein molecules chemically modified by relatively small groups, under identical electrophoretic conditions, the only variable affecting this electrophoretic mobility is the effective charge.
S tímto závěrem je v souhlasu elektroforetické chování řady chemicky modifikovaných molekul orgoteinů. Přírodní orgotein z hovězího skotu skýtá při eiektroforéze převážně jedno rozhraní (pás 1) s menším množstvím rychleji se pohybujících rozhraní (pásy 2, 3 atd.) rovnoměrně vzdálených před hlavním rozhraním, představujících molekuly orgoteinů s vyšším poměrem počtu skupin —COOH к — NH?, než jaký mají molekuly tvořící rozhraní 1. Esterifikace postupně vyšších počtu volných skupin —COOH přírodního orgoteinů z hovězího skotu vede к vytvoření řady postupně více katodických (pohybujících se к záporné elektrodě) elektroforetických pásů, jak se postupně stále více skupin volné karboxylové kyseliny molekuly orgoteinů esterifikuje.The electrophoretic behavior of many chemically modified orgotein molecules is in agreement with this conclusion. The natural bovine orgotein in ecotrophoresis provides predominantly one interface (lane 1) with fewer, faster moving interfaces (lanes 2, 3, etc.) evenly spaced from the main interface, representing orgotein molecules with a higher group ratio —COOH к - NH? 1. Esterification of progressively higher numbers of free groups — COOH of natural bovine orgoteins leads to the formation of a series of progressively more cathodic (moving towards the negative electrode) electrophoretic bands as more and more free carboxylic acid groups of the orgotein molecule progressively esterifuje.
Grafické znázornění závislosti vzdálenosti, kterou rozhraní proběhlo od startu, na čísle pásu je poměrně lineární u nízkých rozsahů přeměny skupin —COOH, avšak postupně se zakřivuje při vyšších stupních přeměny, protože existuje mez, jak rychle se i nejvíc?, nabité složky mohou roztokem pohybovat. Rychleji se pohybující složky jsou též citlivětší na koncentraci soli a jsou podstatně zpomaleny při eiektroforéze iontů obsahujících sůl. Z tohoto důvodu — protože extrapolace poloh více než asi 2 pásů není vždy přesná -..... je pro přesné stanovení ná boje třeba, aby neznámá látka byla podrobena společné eiektroforéze s roztokem, který obsahuje všechny pásy od 1 až po příslušnou polohu (například částečně acetylovaný orgotein).Graphical representation of the distance traveled by the interface from start to belt number is relatively linear at low conversion ranges —COOH, but gradually curves at higher conversion rates as there is a limit to how fast even the most charged components can move through the solution . The faster moving components are also more sensitive to salt concentration and are substantially retarded by the salt-containing ions electrophoresis. For this reason - because the extrapolation of positions of more than about 2 bands is not always accurate -..... it is necessary to accurately determine the charge of an unknown substance to be subjected to common eciekophoresis with a solution containing all bands from 1 to the appropriate position ( for example partially acetylated orgotein).
Všechny běžné reakce pro modifikování proteinů, které byly až dosud aplikovány na molekulu orgoteinů, souhlasí s touto interpretací, to jest polohy pásů odpovídají celkovým změnám náboje oproti molekule přírodního orgoteinů. Esterifikace dimethylsulfátem nebo ethyldiazoacetátem skýtá pásy -1, -2, -3, -4 atd., což naznačuje, že 1, 2, 3, popřípadě 4 skupiny volné karboxylové kyseliny byly chemicky modifikovány.All conventional protein modification reactions previously applied to an orgotein molecule agree with this interpretation, i.e., the position of the bands corresponds to the overall charge changes compared to the natural orgotein molecule. Esterification with dimethyl sulfate or ethyldiazoacetate affords bands of -1, -2, -3, -4, etc., indicating that 1, 2, 3 and 4 free carboxylic acid groups have been chemically modified.
Obecně řečeno, nejvýše jen asi osm z volných skupin —COOH může být esterifikováno bez škodlivých účinků. Pokusy esteriflkovat více než 6 až 8 skupin —COOH, to jest esterifikovat více než tři skupiny —COOH každé z obou peptidových podjednotek orgoteinu, obvykle vedou к denaturaci a ztrátě aktivity superoxidové dismutázy.Generally speaking, at most only about eight of the free COOH groups can be esterified without deleterious effects. Attempts to esterify more than 6-8 COOH groups, i.e., esterify more than three COOH groups of each of the two orgotein peptide subunits, usually lead to denaturation and loss of superoxide dismutase activity.
Jak lze očekávat, rozložení esterifikujících alkoxylových skupin na molekule orgoteinu je pravděpodobně náhodné, poněvadž žádná z titrovatelných volných karboxylových skupin se nezdá mimořádně snadno esterifikovatelná. Protože molekula orgoteinu sestává ze dvou shodných peptidových řetězců, budou esterové skupiny částečně esterifikovaného orgoteinů rozloženy více nebo méně náhodně podél každé peptidové podjednotky, avšak více nebo méně stejně mezi oba tyto řetězce. Poněvadž se obvykle používá jediného esterifikačního činidla, budou všechny esterové skupiny shodné. Je však též možné připravit esterifikované orgoteiny, mající dvě nebo více různých esterových skupin v molekule a dokonce v každém z obou řetězců.As expected, the distribution of the esterifying alkoxy groups on the orgotein molecule is likely to be random, since none of the titratable free carboxyl groups appears to be extremely easily esterifiable. Because the orgotein molecule consists of two identical peptide chains, the ester groups of the partially esterified orgotein will be distributed more or less randomly along each peptide subunit, but more or less equally between the two. Since a single esterifying agent is usually used, all ester groups will be identical. However, it is also possible to prepare esterified orgoteins having two or more different ester groups per molecule and even in each of the two chains.
Jedním ze způsobů, jak připravit smíšený esterifikovaný orgotein, je provést esterifikací postupně za použití různých esterifikačních činidel. Tak například je možno část volných skupin —COOH esterifikovat jedním esterifikačním činidlem, například dimethylsulfátem, a zbytek reaktivních skupin —COOH esterifikovat jiným esterifikačním činidlem, například ethyldiazoacetátem.One way to prepare a mixed esterified orgotein is to carry out the esterification stepwise using various esterifying agents. For example, a portion of the -COOH free groups can be esterified with one esterifying agent, for example dimethyl sulfate, and the rest of the COOH reactive groups can be esterified with another esterifying agent, for example ethyldiazoacetate.
Jinou metodou, jak připravit smíšený esterifbkovaný orgotein, je hybridizace, Pojmem hybridizace orgoteinů se rozumí vytvoření smíšeného orgoteinů z podjednotkových řetězců dvou různých molekul orgoteinů, například Аг а B2, přičemž А а В představují jejich příslušné peptidové řetězce (Аг + Вз* -2AB). Náboj heterodimeru AB pře elektroforéze by měl být průměrem náboje homodimerů A? а B2, za předpokladu, že ve všech případech se spojení účastní táž část každé z obou podjednotek.Another method to prepare a mixed esterified orgotein is by hybridization. The term "hybridization of orgoteins" refers to the formation of mixed orgoteins from the subunit chains of two different orgotein molecules, for example Аг а B2, where А а В represent their respective peptide chains (Аг + Вз * -2AB) . The charge of heterodimer AB before electrophoresis should be the diameter of the charge of homodimers A? and B2, provided that in all cases the same portion of each of the two subunits participates in the concentration.
Jak methylovou skupinou esterifikovaný orgotein, připravený esterifikaci asi 6 volných kyselinových skupin molekuly orgoteinu dimethylsulfátem, tak karboxymethylovou skupinou esterifikovaný orgotein, připravený esterifikováním molekuly přírodního orgoteinů ethyldiazoacetátem, se může hyb203992 řádovat přírodním orgoteinem nebo spolu navzájem společným zahříváním při teplotě 50· °C po dobu 4 hodin. Kromě derivátů orgoteinu z hovězího skotu, uvedených v následujících příkladech, jsou dalšími příklady derivátů orgoteinu podle vynálezu příslušné deriváty jiných analogů orgoteinu.Both the methyl esterified orgotein, prepared by esterifying about 6 free acid groups of the orgotein molecule with dimethyl sulfate, and the carboxymethyl esterified orgotein, prepared by esterifying the natural orgotein molecule with ethyldiazoacetate, can hybridize to natural orgotein or together with each other at 50 ° C for 4 ° C. hours. In addition to the bovine orgotein derivatives shown in the following examples, other examples of the orgotein derivatives of the invention are the corresponding derivatives of other orgotein analogues.
Jinými příklady esterifikovaných orgoteinů z hovězího skatu jsou karbomethoxymethylorgotein a karbamoyimethylorgotein, u nichž jsou v každé z obou podjednotek molekuly orgoteinu vždy 3 až 4 takovéto esterifikované skupiny, a příslušné esterifikované orgoteiny, u nichž jsou v každé takovéto podjednotce 1 až 2 takovéto esterové skupiny, a dále příslušné lidské, ovčí, koňské, vepřové, psí, králičí, morčí a· kuřecí analogy každé z těchto sloučenin.Other examples of esterified bovine orgoteins are carbomethoxymethylorgotein and carbamoyimethylorgotein, each of which contains 3 to 4 such esterified groups in each of the two subunits of the orgotein molecule, and the corresponding esterified orgoteins in which there are 1 to 2 such ester groups in each such subunit, and furthermore, the respective human, sheep, equine, pork, canine, rabbit, guinea pig and chicken analogues of each of these compounds.
Deriváty orgoteinu se mohou izolovat z reakčního roztoku, s výhodou po dialýze k odstranění cizích iontů, běžnou lyofilizací, například postupem popsaným v patentovém spisu US 3 658 682. Je-li· to žádoucí, může· se derivát orgoteinu nejprve přečistit chromatograficky výměnou iontů na pryskyřici, -elektroforeticky a/nebo filtrací přes gel za použití polymeru, který se chová jako molekulární síto.The orgotein derivatives can be isolated from the reaction solution, preferably after dialysis to remove foreign ions, by conventional lyophilization, for example as described in U.S. Pat. No. 3,658,682. If desired, the orgotein derivative can first be purified by ion exchange chromatography. resin, electrophoretically, and / or gel filtration using a polymer that acts as a molecular sieve.
Filtrací mikropórovitým filtrem o velikosti pórů v rozmezí od 0,01 až 0,22 μ/m za aseptických podmínek do sterilních lékovek, popřípadě po úpravě iontové síly chloridem sodným a/nebo fosforečnanem sodným, například až na isotonicitu, se získá bakteriálně a virově nebo bakteriálně sterilní roztok, vhodný pro injekční aplikaci. Filtrací přes filtr o velikosti pórů 0,1 «m se rovněž sníží počet · pyrogenů nebo se odstraní z roztoku.Filtration with a microporous filter having a pore size of from 0.01 to 0.22 μ / m under aseptic conditions into sterile vials, optionally after adjusting the ionic strength with sodium chloride and / or sodium phosphate, for example up to isotonicity, is obtained bacterially and virally, or bacterial sterile solution suitable for injection. Filtration through a 0.1 µm filter also reduces the number of pyrogens or removes them from the solution.
Způsob · výroby injikovatelných derivátů orgoteinu majících protizánětlivou účinnost se · vyznačuje tím, · že se vodný roztok přírodního orgoteinu, zejména z hovězího· dobytka, nechá · reagovat v zásaditém prostředí s alkylačním · a/nebo · karbamoylačním - činidlem, jako je · -dialkylsulfát se 3 až 8 atomy uhlíku v · · alkylové části, aktivovaný alkylhalogenid s 2 až 8 atomy uhlíku, alkylační činidlo mající aktivovanou vinylovou · skupinu, redukční alkylační činidlo, - anebo s kyanátem alkalického kovu, · alkylisokyanátem se 3 až 8 atomy uhlíku · v alkylové části, arylisokyanátem, -isothiokyanátem, · v množství postačujícím · k ···přeměně alespoň jedné z titrovatelných ε-aminoskupin orgoteinu v N-alkylovou · nebo N-karbamoylovou skupinu, anebo v kyselém · prostředí s esterifikačním činidlem, ·jako · je dialkylsulfát, diazomethan, v množství postačujícím k přeměně až 10 z volných karboxylových skupin v molekule orgoteinu na esterifikovanou karboxylovou skupinu., -při teplotě v rozmezí od teploty mrznutí reakční směsi do 80 °C.The method for producing injectable orgotein derivatives having anti-inflammatory activity is characterized in that the aqueous solution of the natural orgotein, in particular from bovine, is reacted in an alkaline medium with an alkylating and / or carbamoylating agent, such as dialkyl sulfate C 3 -C 8 alkyl moiety, C 2 -C 8 activated alkyl halide, vinyl-activated alkylating agent, reducing alkylating agent, - or alkali metal cyanate, C 3 -C 8 alkyl isocyanate an alkyl moiety, an aryl isocyanate, an isothiocyanate, in an amount sufficient to convert at least one of the titratable ε-amino groups of the orgotein into an N-alkyl or N-carbamoyl group, or in an acidic environment with an esterifying agent, such as dialkyl sulfate, diazomethane, in an amount sufficient to convert up to 10 of the free % of the carboxyl groups in the orgotein molecule to the esterified carboxyl group at a temperature ranging from the freezing point of the reaction mixture to 80 ° C.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu zahrnují ester orgoteinu podle vynálezu a farmaceuticky vhodný nosič. Forma a cha20 rakter tohoto nosiče jsou dány způsobem aplikace.The pharmaceutical compositions of the invention include an orgotein ester of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The form and character of this carrier are determined by the method of application.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu je s výhodou v podobě sterilního injikovatelného přípravku, například v podobě sterilního injikovatelného vodného roztoku. Roztok může být formulován známým způsobem za použití výše uvedených nosičů. Sterilním injikovatelným prostředkem rovněž může být sterilní injikovatelný roztok nebo suspenze v jakémkoliv netoxickém parenterálně vhodném ředidle nebo rozpouštědle, nebo to může být iyofilizovaný prášek, rekonstituovatelný · takovýmto rozpouštědlem.The pharmaceutical composition of the invention is preferably in the form of a sterile injectable preparation, for example a sterile injectable aqueous solution. The solution may be formulated in a known manner using the above carriers. The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in any non-toxic parenterally-acceptable diluent or solvent, or may be an lyophilized powder reconstitutable with such a solvent.
Prostředky -podle vynálezu obsahují účinné množství dávkovači jednotky derivátu orgoteinu podle vynálezu, to jest derivát orgoteinu je přítomen v koncentraci účinné pro vyvolání požadované odezvy, aplikuje-li se jednotková látka prostředku způsobem vhodným pro použitý -farmaceutický nosič. Například kapalné prostředky jak topické, tak injikovatelný obvykle obsahují asi 0,5 až 20 mg derivátu orgoteinu v 0,25 až 10 ml, s výhodou v -0,5 až 5 ml, kromě intravenózních infúzních roztoků, které mohou též být zředěnější a mohou obsahovat například 0,5 až 20 mg derivátu orgoteinu na 50 až 1000 ml, s výhodou 100 až 500 ml infúzního roztoku. Tablety, tobolky a čípky obvykle obsahují 0,1 až 25 mg, s výhodou 1 až 10 mg derivátu orgoteinu v jednotce.The compositions of the invention contain an effective amount of a dosage unit of an orgotein derivative according to the invention, i.e. the orgotein derivative is present in a concentration effective to elicit the desired response when the unitary agent of the composition is administered in a manner suitable for the pharmaceutical carrier used. For example, liquid preparations, both topical and injectable, usually contain about 0.5 to 20 mg of the orgotein derivative in 0.25 to 10 ml, preferably -0.5 to 5 ml, in addition to intravenous infusion solutions, which may also be more dilute and may contain, for example, 0.5 to 20 mg of the orgotein derivative per 50 to 1000 ml, preferably 100 to 500 ml of infusion solution. Tablets, capsules and suppositories generally contain 0.1 to 25 mg, preferably 1 to 10 mg, of an orgotein derivative per unit.
Derivát orgoteinu se obvykle aplikuje nakapáním nebo injekcí, například intramuskulárně, subkutánně, intravenózně nebo intradermálně. Výhodná je intramuskulární aplikace, s výjimkou v případě šoku, kde se někdy dává přednost intravenózní aplikaci vzhledem k rychlejšímu účinku, a v případě některých lokalizovaných poruch, například při ozáření a některých cystitidách, kdy · často · bývá účinnější lokální injekce, infúze a/nebo nakapání. - Individuální dávky obvykle bývají v rozmezí 0,5 až 20- mg. Výhodným rozmezím u člověka je asi 0,5 až 8 mg; u koní asi 5,0 až 10,0 mg. Přesná dávka není rozhodujícím činitelem a závisí na druhu choroby a vážnosti případu.The orgotein derivative is usually administered by instillation or injection, for example, intramuscularly, subcutaneously, intravenously or intradermally. Intramuscular administration is preferred, except in the case of shock, where intravenous administration is sometimes preferred due to the more rapid effect, and in some localized disorders such as radiation and some cystitis where local injections, infusions and / or dripping. - Individual doses usually range from 0.5 to 20 mg. A preferred range in humans is about 0.5 to 8 mg; in horses, about 5.0 to 10.0 mg. The exact dose is not a determining factor and depends on the type of disease and the severity of the case.
Deriváty orgoteinu podle vynálezu jsou podobně jako orgotein účinné pro léčení širokého spektra zánětlivých procesů, včetně těch, u nichž syntetická protizánětlivá činidla mají omezenou použitelnost, například pro toxické vedlejší účinky při déle trvajícím používání.The orgotein derivatives of the invention, like the orgotein, are effective for treating a wide variety of inflammatory processes, including those in which synthetic anti-inflammatory agents have limited utility, for example, to toxic side effects with prolonged use.
Zejména jsou tyto deriváty orgoteinu účinné pro zlepšení zánětlivých procesů a pro- zmírnění jejich účinků, například v těch případech, kdy jsou postiženy močové cesty a klouby u savců. Jsou vhodné pro zmírnění symptomů spojených -s reumatickou artritidou, osteoartritidau a -posttraumatickou - artritidou, jakož i bursitidou, tendonitidou atd.In particular, these orgotein derivatives are effective for improving inflammatory processes and mitigating their effects, for example in those cases where the urinary tract and joints in mammals are affected. They are useful in alleviating the symptoms associated with rheumatoid arthritis, osteoarthritis and post-traumatic arthritis as well as bursitis, tendonitis, etc.
Protizánětlivá účinnost injikovatelných derivátů -orgoteinu vyrobených způsobem- podle vynálezu byla zkoumána testy $ karage21 ninovým ©démem, provedenými na samičkách myší Swiss Webster o hmotnosti v rozmezí od 20 do 23 g, v · porovnání s účinností samotného orgoteinu. Skupinám po 10 pokusných zvířatech byly do zadní pravé tlapky subkutánně vstříknu-ty 0,03 ml fyziog^ého roztoku, obsahujícího 1,0 % karageninu. Roztoky toji-kovat-elného derivátu orgoteinu vyrobeného způsobem podle vyná lezu jakož i srovnávacího ergot©^ byly subkutánně vystříknuty vždy 3 hodiny před a 2 hodiny po aplikaci roztoku karageninu, · a to v dávce 0,1 ml. Po uplynutí 24 hodin po aplikaci karageninu byla zvířata usmrcena chloroformem, jejich zadní tlapky amputovány v kloubu a zváženy. Výsledky inhibice otoků vyvolaných karageninem jsou uvedeny v následující tabulce:The anti-inflammatory activity of the injectable ororgotein derivatives produced by the method of the invention was investigated with n-karage21 ninema cream tests performed on female Swiss Webster mice weighing between 20 and 23 g, compared to that of orgotein alone. Groups of 10 test animals were injected subcutaneously into the hind paw with 0.03 ml of saline containing 1.0% carrageenan. The solutions of the tocotable orgotein derivative produced by the process of the invention and the comparative ergot were sprayed subcutaneously every 3 hours before and 2 hours after application of the carrageenin solution, at a dose of 0.1 ml. 24 hours after carrageenin administration, the animals were sacrificed with chloroform, their hind paws amputated in the joint and weighed. The results of inhibition of carrageenin-induced edema are shown in the following table:
ORG + orgotein 740706/740705 DMS-ORG = N-methylorgotein, mající 18 Nmethylem substituovaných lysinových skupinORG + orgotein 740706/740705 DMS-ORG = N-methylorgotein having 18 N-methyl-substituted lysine groups
Z výsledků uvedených v tabulce vyplývá, žs N-methylorgotein (DMS-ORG) má přibližně stejný stupeň účinnosti jako orgotein (ORG). Pro zjištění toxicity byla jedné skupině 10 myší subkutánně dvakrát aplikována dávka 4,5 mg/kg, jiné skupině myší subkutánně dvakrát dávka 0,45 mg/kg. Během 24 hodin po aplikaci nebyly pozorovány žádné známky toxicity ^jiRovaného prostředku. Toto je v souladu s naprostou netoxicitou orgoteinu, i při vysokých dávkách po delší časové období.The results in the table show that N-methylorgotein (DMS-ORG) has approximately the same degree of efficacy as orgotein (ORG). To determine toxicity, one group of 10 mice received a subcutaneous dose of 4.5 mg / kg twice, and another group of mice received a subcutaneous dose of 0.45 mg / kg twice. No signs of toxicity were observed within 24 hours after administration. This is consistent with the total non-toxicity of the orgotein, even at high doses for extended periods of time.
Další podrobnosti, týkající se isolování výchozích analogů orgoteinu a použití derivátů orgoteinu vyrobeného způsobem podle vynálezu, včetně způsobů aplikace, dávkovačích forem, dávkovacího režimu a zánětových a jiných procesů, které je možno léčit сsterifikrvaným orgoteinem, jsou uvedeny v patentovém spisu US 3 758 682.Further details regarding the isolation of parent orgotein analogs and the use of orgotein derivatives made by the method of the invention, including administration methods, dosage forms, dosing regimen and inflammatory and other processes that can be treated with sterified orgotein, are disclosed in U.S. Patent 3,758,682.
Na základě předchozího popisu bude odborník bez jakéhokoliv dalšího podrobnějšího výkladu jistě schopen využít vynálezu v maximální míře. Dále uvedené příklady provedení slouží proto pouze k bližšímu objasnění a vynález na ně není nikterak omezen.Based on the foregoing description, one of ordinary skill in the art will be able to utilize the invention to the fullest extent without further elaboration. The following examples are intended to illustrate the invention and are not to be construed as being limited thereto.
Příklad IAExample IA
K roztoku 5 mg orgoteinu z hovězího· Skotu ve 4 ml 0,04 M uhličitaného pufru se přidá. 20 dimethyl-sulfátu a pH reakční směsi se udržuje na 10,0 přidáváním 0,5 M roztoku hydroxidu sodného. Polovina zásady je spotřebována asi za 37 minut. Při elektroforéze se Objeví pásy 1 až —5, vyznačující se aktivitou superoxidové dismutázy. Po dialýze, lyonii-zací a opětném rozpuštění 1 ml vody jsou aktivita superoxidové dismutázy proteinu a jeho obsah Cu++ a Zn++ iontů stále nezměněny ve srovnání s nezpracovaným orgoteinem. Acetylací roztoku mocdiikovaného proteinu o koncentraci 85 ^g/ml celkem 3 μ\ anhydridu octového· v 0,4 ml brгitanovéhr pufru při pH 9 se dosáhne průměrné elektrrfrretické změny náboje pouze asi —2, ve srovnání s —20 u přírodního orgoteinu v tomtéž roztoku. Orgotein, zpracovaný dimethylsulfátem při pH 10, · je proto extenzívně N-methylován, to jest obsahuje asi 18 methylových skupin v 1 molekule.To a solution of 5 mg of bovine orgotein in 4 ml of 0.04 M carbonate buffer is added. The reaction mixture was maintained at 10.0 by addition of 0.5 M sodium hydroxide solution. Half of the base is consumed in about 37 minutes. During electrophoresis, bands 1-5 appear, characterized by superoxide dismutase activity. After dialysis, lyonization and redissolution of 1 ml of water, the superoxide dismutase activity of the protein and its content of Cu ++ and Zn ++ ions are still unchanged compared to the untreated orgotein. Acetylation of a 85 µg / ml solution of a 3 µl acetic anhydride solution in a medium of 0.4 µg of a britanite buffer at pH 9 achieves an average electrrfretic charge change of only about -2 compared to -20 for a natural orgotein in the same solution. . The dimethyl sulfate-treated orgotein at pH 10 is therefore extensively N-methylated, i.e. it contains about 18 methyl groups per molecule.
Příklad 2 AExample 2
Postupuje se .podle příkladu IA, avšak použije se, postupně, příslušných lidských, ovčích, koňských, vepřových, psích, králičích, morcích a kuřecích analogů orgoteinu jako výchozí látky. V každém z uvedených případů se alkylují všechny až asi na jeden lysin každé z podjednotek orgoteinové molekuly.The procedure of Example IA is followed, but using, respectively, the respective human, sheep, horse, pig, dog, rabbit, turkey and chicken orgotein analogs as starting material. In each case, all of the up to about one lysine of each of the subunits of the orgotein molecule are alkylated.
Příklad 3 AExample 3 A
Postupem podle příkladu IA, avšak za použití diethylsulfátu místo dimethytsulfátu se získá ε-N-ethylovaný orgotein, jehož vlastnosti jsou v podstatě tytéž jako vlastnosti ε-N-methylovaného orgoteinu.The procedure of Example IA, but using diethyl sulfate instead of dimethyl sulfate, yields ε-N-ethylated orgotein, the properties of which are substantially the same as those of ε-N-methylated orgotein.
Příklad 4 A ε-aminoskupiny lysinových zbytků orgoteinu z hovězího skotu se kaгOrxymethylují 0,2 M roztokem natriumjodačetátu při teplotě okolí za níže uvedených podmínek a s níže uvedenými výsledky. *EXAMPLE 4 The ε-amino groups of bovine orgotein lysine residues are cationized with a 0.2 M sodium iodoate solution at ambient temperature under the conditions given below and with the results given below. *
Reakční pufr změna náboje při elektroforéze, průměr 4- rozsah orgotein (1,4 mg/ml)+JCH2COONa+ (0,2 M)Reaction buffer charge change during electrophoresis, mean 4- range orgotein (1.4 mg / ml) + JCH2COONa + (0.2 M)
a) 0,3 M acetát, pH 3,8 (jediné změny jsou ty, způsobené nízkou hodnotou pH)a) 0.3 M acetate, pH 3.8 (the only changes are those due to low pH)
b) 0,4 m acetát, pH 5,0 žádná změna do hodinb) 0.4 m acetate, pH 5.0 no change in hours
c) 0,23 M uhličitan, 0 (15 minut), pH 9,2 3+2 (2,5 hod.),c) 0.23 M carbonate, 0 (15 min), pH 9.2 3 + 2 (2.5 h),
5+3 (6,5 hod.) >18 (72 hod.).5 + 3 (6.5 hours)> 18 (72 hours).
Z těchto elektroforetických. obrazů je zřejmé, že při pH 3;8 a 5,0 nedochází к žádné N-alkylaci a že při pH 9,2 se za 2,5 hod. vnesou průměrně asi 3 skupiny — CH2COO; asi 5 takových skupin se vnese za 6,5 hod. a asi 18 takových skupin se vnese za 72 hod. na atomy dusíku ε-aminoskupin.From these electrophoretic. the images show that at pH 3, 8 and 5.0, there is no N-alkylation and that at pH 9.2 on average about 3 groups - CH 2 COO - are introduced in 2.5 hours; about 5 such groups are introduced in 6.5 hours and about 18 such groups are introduced in 72 hours on the nitrogen atoms of the ε-amino groups.
orgotein (2,8 mg/ml) + JCH2COO'Na+ (0,43 M)orgotein (2.8 mg / ml) + JCH 2 COO'Na + (0.43 M)
d) pH 6,0d) pH 6.0
e) pH 7,0e) pH 7.0
f) pH 10f) pH 10
0,4 po 5 dnech při teplotě místnosti,0.4 after 5 days at room temperature,
0,6 (1 den), 1,0 (2 dny), 1,5 (5 dnů), 0 (10 minut, > 3 (2,5 hod.), >10 (6,5 hod.)0.6 (1 day), 1.0 (2 days), 1.5 (5 days), 0 (10 minutes,> 3 (2.5 hours),> 10 (6.5 hours)
Doba (dny): 0,75Time (days): 0.75
Počet lysinu, které zreagovaly: 0Number of lysine reacted: 0
Z elektroforetických obrazců takto zpracovaného orgoteinu vyplývá, že při pH 6 se zalkyluje méně než polovina molekul orgoteinu, při pH 7 měly molekuly orgoteinu za 2 dny průměrně jednu ε-aminoskupinu alkylovanou skupinou — CH2COO a za 5 dní byly průměrně vneseny dvě takovéto skupiny do 1 molekuly. PřrpH 10 bylo vneseno zaThe electrophoretic patterns of the thus processed orgotein show that at pH 6 less than half of the orgotein molecules are alkylated, at pH 7 the orgotein molecules had on average one ε-amino group in the alkylated group - CH2COO in 2 days and two such groups in 1 day. molecules. Example 10 was introduced
2,5 hod. průměrně více než 3 takovéto skupiny a za 6,5 hod. průměrně více než 10 takovýchto skupin na 1 molekulu.2.5 hours an average of more than 3 such groups and 6.5 hours an average of more than 10 such groups per molecule.
Produkty při všech výše popsaných alkylacích, při nichž se vnášejí skupiny —CH2COO, jsou směsi ε-aminoalkylovaných orgoteinů, obsahujících různý počet takovýchto skupin, jak je patrné ze vzniku většího počtu pásů s různými elektroforetickými pohyblivostmi.The products in all of the above-described alkylations wherein the -CH 2 COO groups are introduced are mixtures of ε-aminoalkylated orgoteins containing a different number of such groups, as evidenced by the formation of multiple bands with different electrophoretic motions.
Příklad 1 ВExample 1 В
Nesubsítituovainý kaťbamoylovaný orgoiteinUnsubstituted catamoylated orgoitein
Roztek 3,7 mg orgoteinu (analog z hovězího skotu) a 14 mg KNCO ve 2 ml 0,025 M roztoku fosforečnanu sodného o pH 7,5 se ponechá při teplotě 4 °C. Při elektroforéze alikvotních vzorků po dobu 54 dnů se objeví řada pásů š aktivitou superoxid-ové dismutázy, které jsou více anodické než přírodní orgotein. Níže je uvedena průměrná změna náboje spolu s rozsahem aktivních pásů po obou stranách průměrné hodnoty uA solution of 3.7 mg of orgotein (bovine analog) and 14 mg of KNCO in 2 ml of 0.025 M sodium phosphate pH 7.5 is left at 4 ° C. Upon electrophoresis of aliquots for 54 days, a number of bands with superoxide dismutase activity appear more anodic than natural orgotein. Below is the average charge change along with the range of active bands on either side of the average u
Přiklad 2BExample 2B
Alkylkarbamoylované orgoteiny μΐ podíly orgoteinu (analog z hovězího skotu) v 0,1 M roztoku tris nebo fosforečnánového pufru o pH 7,6 a s koncentrací 10 miligramů/ml se nechají reagovat při teplotě min2 h.Alkylcarbamoylated orgoteins μΐ aliquots of orgotein (bovine analogue) in 0,1 M tris solution or phosphate buffer pH 7,6 and a concentration of 10 milligrams / ml are allowed to react at min2 h.
Reakční činidlo isopropylkyanát/tris 88 propylisokyanát/fosforeičnan 88 oktylisokyanát/tris 0,21,0 oktylisokyanát/fosforečnan 00,2 °C s 1 μΐ buď propylisokyanátu, nebo oktylisokyanátu po různou dobu. Ve dvou případech se po 2 dnech přidají další 2 μΐ propylisokyanátu. Počet vnesených propylkarbamoyiových a oktylkarbamoylovýoh skupin se stanoví z průměrné změny náboje určené elektroforeticky, jak je níže uvedeno.Isopropyl cyanate / tris 88 reagent propyl isocyanate / phosphate 88 octyl isocyanate / tris 0.21.0 octyl isocyanate / phosphate 00.2 ° C with 1 μΐ of either propyl isocyanate or octyl isocyanate for various times. In two cases, an additional 2 μΐ of propyl isocyanate is added after 2 days. The number of propylcarbamoyl and octylcarbamoyl groups introduced is determined from the average charge change determined electrophoretically as shown below.
Průměrná změna náboje den 2 dny 4- 2 μϊ isokyanátu .Average charge change day 2 days 4- 2 μϊ isocyanate.
nestanoveno10 nestanoveno>15not determined10 not determined> 15
2,53 kyanátu nebo oktylisokyanátu. Roztoky se udržují při teplotě 25 °C po 4 hodiny a podrobí se elektroforéze. Pak se ke každému z nich přidá další 1 ml isokyanátu. Po ponechání přes noc při teplotě 4°C se roztoky znovu elektroforeticky zkoumají a dialyzují.2.53 cyanate or octyl isocyanate. The solutions were kept at 25 ° C for 4 hours and electrophoresed. Then an additional 1 ml of isocyanate is added to each of them. After leaving overnight at 4 ° C, the solutions are again electrophoretically examined and dialyzed.
Karbamoylované proteiny jsou méně roz-Carbamoylated proteins are less resolved
P г í к 1 a cl 3 ВP г í к 1 and cl 3 В
Alkylkarbamoylované orgoteinyAlkylcarbamoylated orgoteins
Opakuje se postup z příkladu 2B za použití 10 mg orgoteinu v 1 ml 0,1 M fosforečnanového pufru o pH 7,6 a 1 ml propylisoobsah kovu g-at/molThe procedure of Example 2B was repeated using 10 mg of orgotein in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.6 and 1 ml of g-at / mol propyl isolate.
Cu++ Zn++ % původní aktivity superoxidové dismutázy pustne v deionízované vodě a po dialýze se částečně vylučují, avšak jsou rozpustné vCu ++ Zn ++% of the original superoxide dismutase activity is released in deionized water and is partially excreted after dialysis but is soluble in
0,15 M solném roztoku. Počet karbamoylovaných lysinových skupin je uveden níže:0.15 M saline. The number of carbamoylated lysine groups is given below:
Isokyanát počet zreagovavších lysinů po 4 hod. přes noc propyloktyl10+4 > 15 2,2Isocyanate number of reacting lysines after 4 hours overnight propyloctyl10 + 4> 15 2.2
3+3 6+5 2,13 + 3 6 + 5 2.1
1,51.5
1,8 přibližně 50 přibližně 251.8 about 50 about 25
Příklad 4BExample 4B
N-im^t^^^^Rhiokarbamoyl orgoteinN-im (R) -ocrine-rhocarbamoyl orgotein
K roztoku 5 mg orgoteinu ve 4 ml 0,075 M roztoku tetraboritanu sodného o pH 9 se přidá 10^/íl CHsNCS a .směs se minutu třepe, dokud se CHsNCS nerozpustí. V intervalech se odeberou 50/,d vzorky a přidá se vždy 0,4 ml 0,1 M roztoku octanu sodného o pH 5,3 jakožto pufr. Po uplynutí 6 až 22 hodin se objeví bílá sraženina síry [jak se zjistí podle zápachu při spálení a podle rozpustnosti v sírouhlíku). Po 22 hodinách při teplotě míst nosti se ke zbytku reakční směsi přidá 0,5 mililitru 1 M roztoku octanového pufru o pHTo a solution of 5 mg of orgotein in 4 ml of a 0.075 M sodium tetraborate solution, pH 9, was added 10 µl of CH 3 NCS, and the mixture was shaken for one minute until the CH 3 NCS dissolved. 50 µl samples were taken at intervals and 0.4 ml of 0.1 M sodium acetate pH 5.3 was added as a buffer. After 6 to 22 hours, a white sulfur precipitate appears (as determined by the burning odor and the carbon disulfide solubility). After 22 hours at room temperature, 0.5 ml of 1 M pH acetate buffer solution is added to the rest of the reaction mixture.
5,3 a směs se dialyzuje po 2 dny za častých výměn vody. Dialyzovaný roztok se krátce odstředí k odstranění bílého . zákalu roztoku.5.3 and the mixture was dialyzed for 2 days with frequent water changes. The dialyzed solution is briefly centrifuged to remove white. turbidity of the solution.
Při eiektroforéze vzorků odebíraných z roztoku vznikne řada stále anodičtějších pásů se super^o^x^i^d^c^ivou d·iem.utazovou aktivitou.The electrophoresis of the samples taken from the solution gives rise to a series of increasingly anodic bands with superfluous diatomic activity.
Z analýzy vzorků cy-tochromovou zkouškou při pH 7,0 [McCord a Fridovich, J. Biol. Chem. str. 6049 až 6055 (1969]] vyplývá pokles superoxidové dismutázové aktivity při exintenzívnější .modifikaci. .From the analysis of samples by the cychochrome assay at pH 7.0 [McCord and Fridovich, J. Biol. Chem. pp. 6049-6055 (1969)] shows a decrease in superoxide dismutase activity with more intensive modification.
Dialyzovaný reakční produkt se po 22 hod. při eiektroforéze projeví jako rychle se pohybující anodický pás; zachovává si 18 % superoxidové dismutázové aktivity přírodního orgoteinového proteinu a obsahuje 2,06 g-at/ /mol Zn++ iontů a 1,76 g-at/mol Cu++ iontů (ve srovnání s 2,26 g-at/mol Zn + + iontů a 2,08 g-at/mol Cu + + iontů u nemodifikovaného orgoteinu). Všechny tyto produkty jsou rozpustné, podržují si chelatované Cu++ a Zn++ ionty a nejméně část superoxidové dismutázové aktivity nemodifikovaného proteinu.The dialyzed reaction product becomes apparent as a fast moving anodic band after 22 hours in ecophoresis; retains 18% of the superoxide dismutase activity of the natural orgotein protein and contains 2.06 g-at / mol Zn ++ ions and 1.76 g-at / mol Cu ++ ions (compared to 2.26 g-at / mol Zn + + ions and 2.08 g-at / mol Cu + + ions for unmodified orgotein). All of these products are soluble, retaining chelated Cu ++ and Zn ++ ions and at least a portion of the superoxide dismutase activity of the unmodified protein.
Příklad 5 BExample 5 B
NIfluoretcemylkarbamoyl orgoteinNIfluoretcemylcarbamoyl orgotein
Roztok 100 mg orgoteinu (analog z hovězího skotu) a 6 mg flouretce.шitothiokyanátu v 10 ml 0,14 M fosfoi^ečnanového roztoku o pH 8,5 se udržuje při teplotě 4 °C po 18 hodin. Reakční směs se pak vnese na chromatografickou .kolonu obsahující mikropórovitý zssítěný dextran (Sephadex G-50), a eluuje se 0,15 M solným roztokem pufrovaným boritanem na pH 8. Eluované frakce žlutého proteinu se dialyzují proti vodě. Dialyzovaný protein, který se vykáží (20 miligramů), je intenzívně žlutý a fluorescenční a snadno se rozpouští v solném roztoku pufrovaném boritanem na pH 8.A solution of 100 mg of orgotein (bovine analog) and 6 mg of flouretecithiothiocyanate in 10 ml of a 0.14 M phosphate solution at pH 8.5 is kept at 4 ° C for 18 hours. The reaction mixture was then loaded onto a chromatographic column containing microporous crosslinked dextran (Sephadex G-50) and eluted with 0.15 M borate buffered saline to pH 8. The eluted yellow protein fractions were dialyzed against water. The dialyzed protein that is reported (20 milligrams) is intensely yellow and fluorescent and readily dissolves in borate buffered saline to pH 8.
Při eiektroforéze se zjistí, že z 96 mg rozpustného proteinu je asi polovina monokarbamoýlovaným orgoteinem (změna náboje —3), spolu s menším množstvím dvojnásobně a trojnásobně karbamoylovaného orgotenu (změny náboje —6 a —9) a . nezreagovaného orgoteinu. Znovu rozpuštěná sraženina .se zdá být extenzivněji modifikovaným. proteinem, poněvadž při eiektroforéze skýtá rychlou anodickou skvrnu.Ecotoxophoresis reveals that about 96 mg of soluble protein is about half of the monocarbamylated orgotein (charge change of -3), along with a smaller amount of double and triple carbamoylated orgotene (charge changes of -6 and -9) and. unreacted orgotein. The redissolved precipitate appears to be more extensively modified. protein, since it provides a rapid anodic spot in ecotrophoresis.
Rozpustný protein se chromatografuje na slabě zásadité iontoměničové koloně při pH 6 fosforečnanovým půfrem s lineárně stoupající koncentrací od 0,01 do 0,2 M. Monkarbamoylované a dikarbamoylované orgoterny se izolují, dialyzují .a .lyofylizují.The soluble protein is chromatographed on a weakly basic ion exchange column at pH 6 with a phosphate buffer having a linearly increasing concentration from 0.01 to 0.2 M. The monocarbamoylated and dicarbamoylated orgoterins are isolated, dialyzed and lyophilized.
Monokafrbamoylovaný orgotein se při elektroforéze vyznačuje superox·idcvou ditmutázovou aktivitou a aktivitou při riboflavinové zkoušce. Podle cytochromové zkoušce při pH 7,5 má 4’8' % superoxidové ditmutάzové aktivity přírodního orgoteinu. Podle Ungarovy bio-zkoušky se tento protein vyznačuje přibližně 50% aktivitou přírodního orgoteinu.The monocaprbamoylated orgotein is characterized by superoxide dimitutase activity and riboflavin assay activity in electrophoresis. According to the cytochrome assay at pH 7.5, 4'8 '% has superoxide ditmutasse activity of natural orgotein. According to Ungar's bioassay, this protein is characterized by approximately 50% natural orgotein activity.
Roztok monokarbamoylovaného orgoteinu,Monocarbamoylated orgotein solution,
203882 uchovávaný při teplotě 4 °C po dva týdny, se změní ve směs orgoteinu, monokarbamoylovaného orgoteinu a dikarbamoylovaného orgoteinu [zřejmě výsledek hybridizace) a neprotein.Qvé fluorescenční sloučeniny [zřejmě výsledek hydrolýzy thiomočovinové skupiny karbainoylovauého orgoteinu za vzniku volného arainofluoresceinu).203882, stored at 4 ° C for two weeks, turns into a mixture of orgotein, monocarbamoylated orgotein and dicarbamoylated orgotein [apparently the result of hybridization] and non-protein fluorescent compounds [apparently the result of hydrolysis of the thiourea group of the carbainoyl orgotein to give free arainofluorescein).
Postupem podle výše uvedených příkladů, avšak za použití příslušných lidských, ovčích, koňských, psích, králičích, morčích, krysích a kuřecích analogů orgoteinu jakožto výchozích látek se získají příslušné karbamoylované deriváty těchto analogů.Using the procedure of the above examples, but using the appropriate human, sheep, equine, canine, rabbit, guinea pig, rat and chicken orgotein analogs as starting materials, the corresponding carbamoylated derivatives of these analogs are obtained.
Příklad 1CExample 1C
Methylová esterifikaceMethyl esterification
Roztok [1'25 (Ug/ml) 0,5 mg orgoteinu z hovězího skotu a 0,5% obj./obj. roztok dimethylsulfátu ve 4 ml 0,05 M acetátového pufru se udržuje při pH 5 po 100 minut. Při elektroforetické analýze reakčního produktu vzniknou pásy superoxidové dismutázové aktivity od +1 po —6 (průměr —4). Produktem je orgotein, s průměrným obsahem 4 skupin —СООСНз.Solution [125 (Ug / ml) 0.5 mg of bovine orgotein and 0.5% v / v a solution of dimethyl sulfate in 4 ml of 0.05 M acetate buffer was maintained at pH 5 for 100 minutes. Electrophoretic analysis of the reaction product yields bands of superoxide dismutase activity from +1 to -6 (mean -4). The product is orgotein, with an average content of 4 groups —СООСНз.
Příklad 2CExample 2C
Methylová esterifikaceMethyl esterification
Roztok 0,5 mg .orgoteinu z hovězího skotu a 10 μϊ dimethylsulfátu ve 4 ml vody se udržuje na konstantní hodnotě pH přidáváním 0,1 M roztoku hydroxidu sodného. Rychlost, s jakou zásada reaguje v rozmezí pH 7 až 10, je značně nezávislá na hodnotě pH a na přidávání 0,25 molu fosforečnanu sodného jakožto pufru. Při elektroforetické analýze vzniká více katodových pásů se superoxidpvou dismutázovou aktivitou počáteční rychlostí přibližně —0,5 náboje/hod. Po 21 hodinách, převážně při pH 7 až 8, se roztok analyzuje ke zjštění N-methylace a esterifikaee, jak je v dalším popsáno. Při této analýze nelze zjistit žádnou N-methyluci.A solution of 0.5 mg. Of beef cattle and 10 μϊ of dimethyl sulfate in 4 ml of water is kept constant by the addition of 0.1 M sodium hydroxide solution. The rate at which the base reacts in the pH range of 7 to 10 is largely independent of pH and the addition of 0.25 moles of sodium phosphate buffer. In electrophoretic analysis, multiple cathode bands with superoxide dismutase activity are formed at an initial rate of approximately 00.5 charges / h. After 21 hours, predominantly at pH 7-8, the solution is analyzed for N-methylation and esterification as described below. No N-methylation can be detected in this analysis.
a] Acetylací 0,5 ml alikvotního dílu esterifikovaného orgoteinu použitím 1 ^ul anhydridu octQvého + 3 μΐ 6 M roztoku hydroxidu sodného při teplotě 4 °C se získá roztok, při jehož elektroforetické analýze se objeví rychle se pohybující anodický pás, podobně jako je tomu při elektroforéze acetylovaného přírodního orgoteinu, což dokazuje, že volné aminoskupiny jsou esterifikaci nedotčeny.a] Acetylation of a 0.5 ml aliquot of esterified orgotein using 1 µl of acetic anhydride + 3 µΐ of 6 M sodium hydroxide solution at 4 ° C gives a solution whose electrophoretic analysis reveals a fast moving anodic strip, similar to the one electrophoresis of the acetylated natural orgotein, demonstrating that the free amino groups are unaffected by esterification.
b) 1 ml roztoku esterifikovaného orgotelnu se upraví na pH 10,5 a vloží do eksikátoru se zrněním hydroxidem sodným. Ačkoliv obrazec katodických pásů 1 až —4 je stálý při pH 7 až 9, při pH 10,5 katodické pásy postupně mizí během 4 dnů, přičemž se znovu objeví elektroforetické obrazce pří rodníhO orgoteinu. Methylestery proteinu obvykle snadno hydrolyzují při alkalických hodnotách pH, což dokazuje, že vícekatodické pásy objevující se po esterifikaci jsou estery orgoteinu.b) Adjust 1 ml of the esterified orgoteln solution to pH 10.5 and place in a sodium hydroxide grain desiccator. Although the pattern of cathodic bands 1 to 4 is stable at pH 7 to 9, at pH 10.5 the cathodic bands gradually disappear within 4 days, and electrophoretic patterns of the natural orgotein reappear. Protein methyl esters usually readily hydrolyze at alkaline pH, demonstrating that the multicode bands occurring after esterification are orgotein esters.
Z předchozího je zřejmé, že po dvou hodinách še při pH 7 až 10 dimethylsulfátem esterifikuje průměrně jedna skupina —COOH v 1 molekule; po 4 hodinách asi dvě skupiny v 1 molekule; další esterifikaci se zvýší počet esterifikovaných skupin —COOH· maximálně asi na 6 v 1 molekule.It is apparent from the foregoing that, after two hours, an average of one -COOH group per molecule is esterified with dimethyl sulfate at pH 7-10; after 4 hours about two groups in 1 molecule; further esterification increases the number of esterified groups —COOH · to a maximum of about 6 in 1 molecule.
Postupem podle příkladů 1C, 2 C a za použití příslušných lidských, ovčích, koňských, vepřových, psích, králičích, morčích a kuřecích analogů orgoteinu jakožto výchozích látek se pokaždé přemění průměrně asi 4 skupiny karboxylové kyseliny molekuly orgoteinu na methylesterové skupiny.Using the procedures of Examples 1C, 2C and using the appropriate human, sheep, equine, pig, canine, rabbit, guinea pig and chicken analogues of orgotein as starting materials, an average of about 4 carboxylic acid groups of the orgotein molecule are each converted to methyl ester groups.
Postupem podle příkladů 1 C, 2 C za použití diethylsulfátu místo dimethylsulfátu se získají estery orgoteinu, mající od 1 do 6 skupin volné karboxylové kyseliny, přeměněných v ethylesterové skupiny. Vlastnosti výsledných esterifikovaných orgoteinů jsou prakticky tytéž jako vlastnosti methylově esteriifikovaných orgoteinů.Following the procedure of Examples 1C, 2C using diethyl sulfate instead of dimethyl sulfate, orgotein esters having from 1 to 6 free carboxylic acid groups converted to ethyl ester groups were obtained. The properties of the resulting esterified orgoteins are practically the same as those of the methyl esterified orgoteins.
Esterifikované orgoteiny je popřípadě možno dále čistit iontoměnioovou chromatografií, aby se od sebe oddělily druhy s rozdílným účinným nábojem a tudíž esterifikované v různém stupni. Tak například se při eluci 200 mg v iontoměničové koloně o rozměrech 2,5 X 40 cm (SEPHADEX) za použití 4 litrů roztoku tris o pH 8,5 s lineárně se zvyšující koncentrací o 0,01 M do 0,2 M od sebe oddělí pásy orgoteinu, přičemž elektroforeticky více katodické pásy eluují první. Takovýmto postupem se směs orgoteinů esterifikovaných methylovými skupinami, vyrobená postupem podle příkladu 1C, může rozdělit ve frakce, obsahující převážně 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6 methylesterových skupin v 1 molekule orgoteinu.Alternatively, the esterified orgoteins may be further purified by ion exchange chromatography to separate species with different effective charges and thus esterified to a different degree. For example, when eluting with 200 mg in a 2.5 X 40 cm ion exchange column (SEPHADEX) using 4 liters of a tris pH 8.5 solution with a linear increasing concentration of 0.01 M to 0.2 M, they were separated orgotein bands, wherein the electrophoretically more cathodic bands elute first. In this way, the mixture of methyl esterified orgoteins produced by Example 1C can be separated into fractions containing predominantly 1, 2, 3, 4, 5 or 6 methyl ester groups per 1 orgotein molecule.
Takováto frakcionace částečně modifikovaného orgoteinu iontoměničovou chromatografií je použitelná u jakéhokoliv modifikovaného orgoteinu, jehož molekulární náboj závisí na rozsahu modifikace, například methylovými nebo karboethoxymethylovými skupinami esterifikovainý orgotein a N-acetyilofvaný orgotein.Such fractionation of a partially modified orgotein by ion exchange chromatography is applicable to any modified orgotein whose molecular charge depends on the extent of the modification, for example, the esterified orgotein and the N-acetyilofused orgotein by methyl or carboethoxymethyl groups.
Příklad 3CExample 3C
Karbethoxymethylová esterifikaceCarbethoxymethyl esterification
Ethyldiazoacetát se připraví reakcí ethylesteru glycinu kyselinou dusitou, jak je uvedeno v příručce „Orgnic Synthesis“ Coli. sv. IV, str. 424, avšak za použití chloridu uhličitého místo dichlormethanu pro extrakci ethyldiazoacetátu z vodného roztoku.Ethyldiazoacetate is prepared by reacting glycine ethyl ester with nitrous acid as described in "Orgnic Synthesis" Coli. St. IV, p. 424, but using carbon tetrachloride instead of dichloromethane to extract ethyldiazoacetate from the aqueous solution.
ml přibližně 1 molárního roztoku ethyldla^oacetátu v chloridu uhličitém se vnesou do baňky o objemu 25 ml a většina chloridu uhličitého se odpaří za sníženého tlaku, dosaženého vodní vývěvou. Přidá se roztok 9 miligramů orgoteinu z hovězího Skotu ve 3 mililitrech vody a organická fáze se rozptýlí kroužením. Roztok se ponechá při teplotě 4 °C a každých několik dní se protřepe. Po celou dobu zůstává reakční směs heterogenní. Eléktroforetickou analýzou se zjistí postupná tvorba více katodických proteinových pásů —1 až —6 se superoxidovou dismutázovou aktivitou. Průměrná změna náboje je 1,2 po 5 dnech a 3 po 12 dnech. Produkt je směsí karbethoxymethylových ešterů orgoteinu, majících po 5 dnech budr jednu, nebo dvě takovéto esterové skupiny v 1 molekule a po 12 dnech od 1 do 6 takovýchto esterových skupin.ml of an approximately 1 molar solution of ethyl dichloroacetate in carbon tetrachloride was introduced into a 25 ml flask and most of the carbon tetrachloride was evaporated under reduced pressure by a water pump. A solution of 9 milligrams of bovine orgotein in 3 milliliters of water is added and the organic phase is dispersed by swirling. The solution is left at 4 ° C and shaken every few days. The reaction mixture remains heterogeneous at all times. Electrophoretic analysis revealed the gradual formation of multiple cathodic protein bands -1 through 6 with superoxide dismutase activity. The average charge change is 1.2 after 5 days and 3 after 12 days. The product is a mixture of esters karbethoxymethylových orgoteins having after 5 days either r one or two of such ester groups in one molecule, and after 12 days 1 to 6 such ester groups.
Vodná fáze se pak zfiltruje a zbaví soli chromatografickou frakcionací v koloně tvořené 10 ml Sephadexu G-25. Proteinové frak ce se lyofylizují a znovu rozpustí ve 2 ml vody a pH se zvýší z 3,7 na 5,6 přidáním 2 μΐ 1M roztoku hydroxidu sodného. Podle elektroforetické analýzy nedochází к žádné změně ve srovnání se stavem před odstraněním soli a lyofylizací.The aqueous phase is then filtered and freed by chromatographic fractionation in a column consisting of 10 ml of Sephadex G-25. Protein fractions are lyophilized and redissolved in 2 ml of water and the pH is raised from 3.7 to 5.6 by adding 2 μΐ of 1 M sodium hydroxide solution. According to electrophoretic analysis, there was no change compared to the state prior to salt removal and lyophilization.
Po další reakci tohoto roztoku po dobu 1 měsíce za stejných podmínek, jak výše uvedeno, se při elektroforetické analýze objeví skvrna proteinu s nižší superoxidovou dismutázovou aktivitou a žádný materiál více katodický než pás —6.After a further reaction of this solution for 1 month under the same conditions as above, an electrophoretic analysis stained a protein with a lower superoxide dismutase activity and no material more cathodic than band-6.
Příklad 4 CExample 4 C
Methylová esterifikaceMethyl esterification
Postupem podle příkladů 1 a 2 se orgotein z hovězího skotu alkyluje za podmínek uvedených v následující tabulce:Following the procedure of Examples 1 and 2, the bovine orgotein is alkylated under the conditions in the following table:
+ Poločas pro pohlcování NaOH potřebného к udržení konstantního pH. + Half - life for NaOH uptake required to maintain a constant pH.
Produkt z příkladu [a] má průměrně 2 esterifikované skupiny —COOH v 1 molekule a produkt z příkladu (b) průměrně 4 takovéto skupiny. Přítomnost většího počtu katodických pásů dokazuje, že se esterifikované produkty skládají z většího množství esterifikovaných orgoteinů, obsahujících 1 až asi 6 esterových skupin v 1 molekule.The product of Example [a] has an average of 2 esterified —COOH groups per molecule and the product of Example (b) has an average of 4 such groups. The presence of multiple cathodic bands demonstrates that the esterified products consist of a plurality of esterified orgoteins containing 1 to about 6 ester groups per molecule.
Příklad 5CExample 5C
Hybrid obsahující methylésterove a N-acetylové skupinyHybrid containing methyl ether and N-acetyl groups
К roztoku (125 ^g/ml) 0,5 mg methylovými skupinami esterifikovaného orgoteinu, vyrobeného postupem podle příkladu 1, se přidá 0,5 mg zcela N-acetylovaného orgoteinu. Při elektroforetické analýze směsi se objeví pouze pásy odpovídající orgoteinu esterifikovanému methylovými skupinami a anodický pás odpovídající N-acetylorogoteinu.0.5 mg of totally N-acetylated orgotein was added to the solution (125 µg / ml) of 0.5 mg methyl esterified orgotein produced according to Example 1. In the electrophoretic analysis of the mixture, only bands corresponding to methyl esterified orgotein and an anodic band corresponding to N-acetylorogotein appear.
Když se však směs zahřívá po 4 hodiny při teplotě 50 °C, ukáže se při elektroforéze vytvoření několika nových složek (v polohách pásů -1-7 až +11) a více než 50% zmenšení původních pásů, odpovídajících N-acetylorgoteinu a methylesteru orgoteinu.However, when the mixture is heated at 50 ° C for 4 hours, electrophoresis reveals the formation of several new constituents (at band positions -1-7 to +11) and a reduction of more than 50% of the original band corresponding to N-acetylorgotein and orgotein methyl ester .
Novými složkami, vzniklými zahříváním směsi modifikovaných orgoteinů, jsou hybridy (heterodímery), obsahující každý podjednotku z N-acetylorgoteinu (s 10 N-acetyl-lysiny v 1 podjednotce) a podjednotku z orgoteinu esterifikovaného esterovými skupinami (s 0 až 3 skupinami —-СООСНз v 1 podjednotce).The new components resulting from the heating of a mixture of modified orgoteins are hybrids (heterodimers) containing each subunit of N-acetylorgotein (with 10 N-acetyl-lysines in 1 subunit) and a subunit of esterified esterified orgotein (with 0 to 3 groups) ——СООСНз in 1 subunit).
Hybridy se mohou Izolovat ze své rovnovážné směsi s N-acetylorgoteinem a orgoteinem obsahujícím skupiny —СООСНз (homodlimery) iontoměničovou chriomatografií při nízké teplotě, jak je popsáno v příkladu C 2. Při stání izolovaných heterodimerů může rehybridizace pokračovat za opětného vytvoření směsi obsahující rovněž oba homodimery. Rychlost rehybridizace závisí na teplotě a je nízká při nízkých teplotách.The hybrids can be isolated from their equilibrium mixture with N-acetylorgotein and an orgotein containing groups of —СООСНз (homodlimers) by low-temperature ion exchange chriomatography as described in Example C 2. On standing of isolated heterodimers, rehybridization can continue to form a mixture containing both homodimers . The rate of rehybridization is temperature dependent and is low at low temperatures.
Předchozí příklady se mohou opakovat s podobným výsledkem, nahradí-li se reakční složky a podmínky v nich použité genericky a specificky popsanými reakčními složkami a/nebo reakčními podmínkami podle vynálezu.The foregoing examples may be repeated with a similar result by replacing the reagents and conditions used therein with the generic and specifically described reagents and / or reaction conditions of the invention.
Z předchozího popisu může odborník snadno stanovit charakteristické význaky vynálezu a může provést aniž přestoupí rámec aFrom the foregoing description, one of ordinary skill in the art can readily determine the features of the invention and can do so without departing from the scope of
Claims (3)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US05/611,659 US4022888A (en) | 1975-09-09 | 1975-09-09 | Esterified orgotein |
US05/611,657 US4042689A (en) | 1975-09-09 | 1975-09-09 | Alkylated orgotein |
US05/639,076 US4070459A (en) | 1975-12-09 | 1975-12-09 | N-carbamylated orgotein |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CS203992B2 true CS203992B2 (en) | 1981-03-31 |
Family
ID=27417063
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS765859A CS203992B2 (en) | 1975-09-09 | 1976-09-09 | Method of making the injectable derivates of the ergothein with antiinflammation effect |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
CA (1) | CA1090782A (en) |
CS (1) | CS203992B2 (en) |
DD (1) | DD128695A5 (en) |
DE (1) | DE2637778A1 (en) |
DK (1) | DK396376A (en) |
FI (1) | FI57112C (en) |
FR (2) | FR2323395A1 (en) |
GB (1) | GB1561295A (en) |
IE (1) | IE43701B1 (en) |
IL (1) | IL50287A (en) |
IT (1) | IT1068221B (en) |
NL (1) | NL7610003A (en) |
NO (1) | NO763075L (en) |
SE (3) | SE7609978L (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE202009017709U1 (en) | 2009-12-31 | 2011-09-02 | Heinz-Dieter Matuschak | Rotary valve and conveyor for conveying bulk material |
-
1976
- 1976-08-17 IL IL50287A patent/IL50287A/en unknown
- 1976-08-20 FR FR7625354A patent/FR2323395A1/en active Granted
- 1976-08-21 DE DE19762637778 patent/DE2637778A1/en not_active Withdrawn
- 1976-09-02 DK DK396376A patent/DK396376A/en not_active Application Discontinuation
- 1976-09-07 FI FI762566A patent/FI57112C/en not_active IP Right Cessation
- 1976-09-07 CA CA260,685A patent/CA1090782A/en not_active Expired
- 1976-09-07 DD DD7600194658A patent/DD128695A5/en unknown
- 1976-09-07 IT IT51154/76A patent/IT1068221B/en active
- 1976-09-08 NO NO763075A patent/NO763075L/no unknown
- 1976-09-08 IE IE2001/76A patent/IE43701B1/en unknown
- 1976-09-09 NL NL7610003A patent/NL7610003A/en not_active Application Discontinuation
- 1976-09-09 GB GB37431/76A patent/GB1561295A/en not_active Expired
- 1976-09-09 CS CS765859A patent/CS203992B2/en unknown
- 1976-09-09 SE SE7609978A patent/SE7609978L/en not_active Application Discontinuation
-
1977
- 1977-10-28 FR FR7732803A patent/FR2362864A1/en active Granted
-
1980
- 1980-08-25 SE SE8005934A patent/SE8005934L/en unknown
- 1980-08-25 SE SE8005933A patent/SE8005933L/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK396376A (en) | 1977-03-10 |
NL7610003A (en) | 1977-03-11 |
FI57112C (en) | 1980-06-10 |
FR2323395A1 (en) | 1977-04-08 |
FR2323395B1 (en) | 1979-06-22 |
SE8005934L (en) | 1980-08-25 |
DE2637778A1 (en) | 1977-03-17 |
DD128695A5 (en) | 1977-12-07 |
SE7609978L (en) | 1977-03-10 |
FR2362864B1 (en) | 1981-01-16 |
CA1090782A (en) | 1980-12-02 |
NO763075L (en) | 1977-03-10 |
FR2362864A1 (en) | 1978-03-24 |
FI762566A (en) | 1977-03-10 |
IE43701L (en) | 1977-03-09 |
IE43701B1 (en) | 1981-05-06 |
SE8005933L (en) | 1980-08-25 |
FI57112B (en) | 1980-02-29 |
IT1068221B (en) | 1985-03-21 |
IL50287A (en) | 1979-11-30 |
GB1561295A (en) | 1980-02-20 |
IL50287A0 (en) | 1976-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Brinkley | A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens and crosslinking reagents | |
Martin et al. | The reaction cycle of GroEL and GroES in chaperonin-assisted protein folding | |
Bayley et al. | [8] Photoaffinity labeling | |
FI66751B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV ETT STABILT INSULINPREPARATMED LAONGTIDSVERKAN | |
Bodlaender et al. | Use of isoxazolium salts for carboxyl group modification in proteins. Trypsin | |
EP2542572B1 (en) | Multimeric forms of therapeutic proteins and uses thereof | |
Olomucki et al. | Octopine Dehydrogenase: Evidence for a Single‐Chain Structure | |
EP0210761A1 (en) | Modified enzymes, production and use thereof | |
RU2159775C2 (en) | Pseudopeptide product containing imidazole group and utilization thereof | |
JPH02131594A (en) | Method for producing db30-insulin and db30-insulin derivative | |
US4277465A (en) | Adjuvant for promoting absorption of therapeutically active substances through the digestive tract | |
JPH04500519A (en) | Stable and bioactive growth hormone | |
KOTAKI et al. | Reaction between sulfhydryl compounds and 2, 4, 6-trinitrobenzene-l-sulfonic acid | |
JP2008517033A (en) | Method for producing an analog of growth hormone linked by oxime, thiazolidine, dithiane, dithiolane or hydrazone | |
CS203992B2 (en) | Method of making the injectable derivates of the ergothein with antiinflammation effect | |
Offord | The possible use of cyanogen bromide fragments in the semisynthesis of proteins and polypeptides. | |
US4070459A (en) | N-carbamylated orgotein | |
NL8302935A (en) | NEW POLYPEPTIDES, METHODS FOR THEIR PREPARATION, PHARMACEUTICAL PREPARATIONS CONTAINING THESE POLYPEPTIDES AND THEIR USE. | |
US4042689A (en) | Alkylated orgotein | |
Ozawa | Bridging Reagent for Protein: II. The Reaction of N, N’-Polymethylene-bis (iodoacetamide) with Cysteine and Rabbit Muscle Aldolase | |
US4009267A (en) | Cross-linked orgotein | |
JP2766303B2 (en) | Superoxide dismutase modified with glycosaminoglycan and method for producing the same | |
CA1059504A (en) | Acylated orgotein | |
US4701458A (en) | Inhibition of diarrhea induced by escherichia coli heat-stable enterotoxin | |
Cohen et al. | Amides and peptides derived from 6-trichloromethylpurine and amino acids |