DE2637778A1 - N-alkylierte, n-carbamylierte und veresterte orgoteine - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Orgotein-Derivate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Orgotein ist der offizielle Name, den das United States Adopted Name Council Mitgliedern einer Familie von artgleichen wasserlöslichen Proteinen in weitgehend reiner, injizierbarer Form, d.h. im wesentlichen frei von anderen Proteinen, die mit ihnen in den Quellen vermischt oder verbunden sind, verliehen hat. In der US-PS 3,758,682 sind Orgotein enthaltend·, pharmazeutische Präparate beschrieben.

Die Orgotein-Metallproteine sind Mitglieder einer Familie von Protein-Artgenossen mit einer charakteristischen Kombination von physikalischen, chemischen, biologischen und pharmakodynamischen Eigenschaften. Jeder dieser Artgenossen ist physikalisch die isolierte, im wesentlichen reine Form eines globularen, in Pufferlösung und Wasser löslichen

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Proteins mit einer sehr kompakten nativen Konformation, die zwar hitzeempfindlich, aber gegen ein mehrminütiges Erhitzen bei 65° C bei einem pH-Wert von 4 - 10 stabil ist. In chemischer Hinsicht ist jedes dieser Proteine dadurch gekennzeichnet, daß es alle bis auf 0-2 Protein-Aminosäuren, einen geringen Prozentsatz Kohlehydrate, keine Lipide, 0,1 - 1,0 % Metallgehalt, der aus 1 bis 5 Grammatomen je

Molekül eines oder mehrerer chelatgebundener, 2-wertiger

ο Metalle mit einem Ionenradius von 0,6 bis 1,0 A herrührt,

und im wesentlich nicht ehelatgebundene 1-wertige Metalle oder solche die Zellgifte darstellen, im Molekül aufweist.

Die Aminosäuren-Zusammensetzung der Orgotein-Artgenossen ist, unabhängig von der Quelle, aus der sie isoliert wurden, bemerkenswert gleichbleibend.

Tabelle I zeigt die Verteilung der Aminosäure-Reste, berechnet für ein Molekulargewicht von 32.500 von mehreren Orgotein-Artgenossen.

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Tabelle

Aminosäuren-Zusammensetzung verschiedener Orgotein-Artgenossen (Reste pro Mol; MQ = 32 5OO)

Aminosäuren Leber, Hote Blutzellen

■<! O CD OO

O OO O

	Rind	Rind	Schaf	Pferd	Schwein	Hund	Kaninchen	, Ratte	Meerschw.	Huhn	Mensch	Bereich
Alanin	19	%9	18	18 .	18	16: ■.	19	22	22	23	22 ·	16-23
Arginin	^8	•8	10	6	8	8	8 ■*	7	8	8	8	6-10
Asparagin. säure	37·	36	35	35	31 ■"	29	31	30	31	36	37	29-37
Cystin-1/2	6 .	6	.6	6	6	6'	6	6	1	10	8	1-10
Glutaminsäure	21	23	22	30	28	30 ■'■	25	38	29	26	28	21-38
Glycin'	53	52	52	51	52	53	51	51	53	56	51	51-56
Histidin	16	16	11	20	16	15	17	20	15	17	11	11-20
Isoleucin	18	18	18	IH	16	18	16	16	18	15	17	IH-I8
Leucin	17	17	17	18	16	16	19	12	17	15	20	12-20
Lysin	22	21	23	26	23	20	21	18	20	21	23	18-26
Methionin	2	2	2	2	2	6	3	ή	2	3	1	1-6
Phenylalanin	8	8	7	9	B	B	9 ."■■	6	8	8	8	6-9
Prolin	12	13	15	10	10	10	13	10	12	13	12	10-15
Serin	17	17	i1	11	13	20	18 '	18 ·	18	15	19	13-20
Threonin	26	25	20	16	27	20	21	17·	17	18	18	16-27
Tryptophan*	Nil	JJiI	Nil	Nil	Nil	Nil	Nil "	Nil	Nil	1.	2 .	0- 2
Tyrosin	2	2	2	Nil	H	2	Nil	2	Nil	2	"Nil	0- 4
Valin	33	32	31	29	29	31	31	35	32	30	30	2-9-35
Gesamtzahl	317	315	306	30H	307	311	315	315	309	317	318	30I1-318

Colorimetrische Bestimmung

Mittelwert aus Arairiosäurenanalyse und spektrophotometrischer Bestimmung

■■·<!■ CO

Wie Tabelle I zeigt, besitzen Orgotein-Artgenossen 18 bis 26 und gewöhnlich 20 bis 23 Lysin-Gruppen, von denen alle bis auf 1 bis 3 (mit Trinitrobenzolsulfonsäure) titrierbare
£-Aminogruppen aufweisen. In einer Hinsicht betrifft die
Erfindung.Orgotein-Derivate, in denen mindestens ein Teil
der Orgotein-Lysingruppen alkyliert ist , und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. In anderer Hinsicht betrifft die Erfindung Orgotein-Derivate, in denen mindestens ein Teil der
Orgotein-Lysin-Gruppen earbamyliert ist , und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Aus Tabelle I ist ebenso ersichtlich, daß Orgotein-Artgenossen 29 - 37 Asparaginsäuregruppen und 21 - 38 Glutaminsäuregruppen besitzen. Die Erfindung betrifft somit auch Orgotein-Derivate, in denen mindestens ein Teil dieser Aminosäure-Reste in
freier Säureform verestert ist -, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Für den Fachmann offensichtlich können einige Veresterungsmittel und -bedingungen gleichzeitig freie Aminogruppen im Orgotein-Molekül alkylieren und Carboxylgruppen verestern.
Derartige N-alkylierte und veresterte Orgoteine und ihre Herstellung sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Das native Orgotein-Protein besitzt unter anderem eine entzündungshemmende Aktivität; vgl. US-PS 3*758,682. Es besitzt ebenso eine einzigartig hohe Superoxid-Dismutase-Aktivität;

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vgl. Mc.Cord & Fridovich, J. Biol. Chem., Bd. 244, 6, S 176, (1970); ibid, Bd. 246, 2, S. 875 (1971). Überraschenderweise bleibt die entzündungshemmende Aktivität des nativen Proteins von der Veresterung, N-Alkylierung oder Carbamylierung weitgehend unbeeinflußt. Dementsprechend sind Orgotein-Derivate der Erfindung in gleicher Weise wie das native Protein beispielsweise zur Behandlung von Entzündungen bei Säugetieren und anderen Tieren, wie in US-PS 3»758,682 beschrieben, geeignet. Ein wesentlicher Teil der Superoxid-Dismutase-Aktivität des nativen Proteins bleibt ebenso in den Orgotein-Derivaten der Erfindung, beispielsweise 20 bis 100 % des nativen Proteins,erhalten.

N-ALKYLIERTES UND N-CARBAMYLIERTES ORGOTEIN

Wie vorstehend festgestellt, besitzen Orgdte in- Art genoss en 18 bis 26 Lys.ingruppen. Da das Orgotein-Mdlekül aus zwei identischen Peptidketten (Untereinheiten) aufgebaut ist, liegt die Hälfte dieser Lysingruppen in jeder Gruppe vor. Sie sind fest, aber nicht kovalent untarmäßigen Temperatur- und pH-Bedingungen miteinander verbunden. Wegen der räumlichen Konformation des Orgotein-Moleküls sind gewöhnlich die £-Aminogruppen einiger weniger Lysingruppen in jeder Kette mit Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) nicht titrierbar und

nicht

daher für die Alkylierung oder Carbamylierung/leicht zugänglich. Jedoch scheint sowohl die Alkylierung als auch die

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Carbamylierung von nicht titrierbaren Lysin- £-Aminogruppen unter Verwendung eines hochaktiv alkylierenden oder carbamylierenden Mittels, beispielsweise Dimethylsulfat bei einem alkalischen pH-Wert, möglich. Der Alkylierungs- oder Carbamylierungsgrad kann durch die Abnahme der TNBS-reagierenden Aminogruppen bestimmt werden,wenn man berücksichtigt, daß 1 bis 3 Lysingruppen des nativen Orgotein-Moleküls mit TNBS nicht titrierbar sind. Beispielsweise mißt man bei Rinder-Orgotein nur 18 seiner 20 bis 22 Lysingruppen. Dabei ist zu berücksichtigen, daß monoalkylierte Lysingruppen noch acylierbar sind, sodaß nur umfassend alkylierte Orgoteine eine Verminderung der acylierbaren Lysingruppen zeigen.

Die Di- und Trialkylierung oder Carbamylierung von Lysingruppen kann durch Zählen des Ladungswechsels bei der Elektrophoryse des N-alkylierten oder N-carbamylierten Produkts verfolgt werden. Beispielsweise zeigt ein mit Dimethylsulfat bei pH alkyliertes Orgotein einen Ladungswechsel von -2 nach dem Acylieren mit Essigsäure-Anhydrid, verglichen mit einem Ladungswechsel von -20 beim nichtalkylierten Orgotein. In ähnlicher Weise zeigt ein mit Methyl^sothiocyanat bei pH 9 N-carbamyliertes Orgotein einen Ladungswechsel von -2 nach 15 Minuten.

Bekanntlich ist die elektrophoretische Beweglichkeit eines Ions eine Funktion der. elektrischen Feldstärke, der Nettoladung des Ions (einschließlich gebundener Gegenionen) und des Reibungskoeffizienten; vgl. C. Tanford "Physical
Chemistry of Macromolecules" Wiley, New York (1966).

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Da der Reibungskoeffizient von der Molekülgröße und -form und der Zusammensetzung der Lösung abhängig ist; besitzen Vergleiche verschiedener Proteine keinen allzu hohen Informationswert. Jedoch ist beim Vergleich von Proteinen mit ähnlicher Größe und Form, in diesem Fall von Orgotein-Molekülen, die chemisch mit relativ kleinen Gruppen modifiziert sind,

bedingungen unter identischen Elektrophorese' die einzige Variable, die diese elektrophoretisch^ Beweglichkeit beeinflußt, die Nettoladung.

Der Vergleich der elektrophoretischen Muster einer Anzahl chemisch modifizierter Orgotein-Moleküle ist mit diesem Schluß im Einklang. Das native Rinderorgotein ergibt in der Elektrophorese hauptsächlich eine Bande (Bande 1) mit kleineren Anteilen schneller bewegender Banden (Banden 2, 3» etc.), die gleichmäßig an der Front der Hauptbande getrennt sind und Orgotein-Moleküle mit einem größeren Verhältnis von COOH- zu NHp-Gruppen darstellen als diejenigen Moleküle, die die Bande 1 bilden. Die Behandlung von nativen Rinder-Orgoteinen mit beispielsweise aufeinander folgenden höheren Konzentrationen von Essigsäure-Anhydrid bei einem pH-Wert von f, oder mit Methyl^j-sothiocyanat bei einem pH-Wert von 9 führt zur Bildung einer Reihe nacheinander stärker anodischer (Wanderung zur + - Elektrode) elektrophoretischer Banden , da nacheinander mehr freie Aminogruppen der Orgotein-Moleküle acetyliert oder carbamyliert wurden. Im Gegensatz dazu ergibt die Behandlung mit DimethyU₅^uIfat eine Reihe von nacheinander stärker

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kathodischen (versetzt von der Bande 1 zur Minus-Elektrode) Banden, da nacheinander mehr freie Carboxylgruppen des Orgotein-Moleküls verestert wurden.

Eine grafische Darstellung des durch Elektrophorese erhaltenen Abstandes gegen die Bandenzahl ist bei niedrigem COOH- oder NH₂-MOdifizierunggraden relativ linear, nimmt jedoch bei höherer Modifizierung allmählich Kurvenform an, da es eine Begrenzung der Geschwindigkeit gibt, mit der sich sogar die am höchsten geladene Spezies durch eine Lösung bewegen kann. Die schneller wandernden Spezies sind auch empfindlicher gegenüber der Salzkonzentration und werden bemerkenswert verlangsamt, wenn salzenthaltende Proben elektrophoretisch behandelt werden. Da die Extrapolation von mehr als etwa 2 Bandengenaue lagen nicht immer genau ist, benötigt deshalb das/Zählen einer Ladung die Co-Elektrophorese der unbekannten Ladung mit einer Lösung,die sämtliche Banden von 1 bis zu der interessierenden Lage enthält (beispielsweise teilweise acetyliertes oder teilweise fearbamyliertes Orgotein).

Sämtliche übliche Proteinmodifizierungsreaktionen, die auf das Orgotein-Molekül soweit angewandt wurden, sind mit dieser Interpretative im Einklang, nämlich daß die Bandlagen den integralen Ladungswechseln vom nativen Orgotein-Molekül entsprechen. Die Acetylierung, Carbamylierung und N-Metylthiocarbamylierung ergeben insgesamt die Banden 2, 3, 4, 5 etc. unter dem Hinweis, daß 1, 2, 3 bzw. 4 freie Aminogruppen che-

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misch modifiziert wurden. In ähnlicher Weise ergibt die Succinylierung, die die^NH,+ - Gruppen in die

NHCCH₂CH₂CO₂ - Gruppen umwandelt, die Banden 3, 5» 7» 9 etc.

und umfassendere CarbamyIierungeη oder ThiοcarbamyIierungeη,

0 §

die noch mehr ^NHCNH-R - und r^NHCNH-R - Gruppen verändern, die Banden 6, 7, 8, 9 etc. Die Veresterung mit Dimethylsulfat oder mit Diazoessigsäureäthylester gibt Banden -1, -2, -3, -4, usw. unter dem Hinweis, daß 1, 2, 3 bzw. 4 freie Carboxylgruppen chemisch modifiziert wurden.

Insgesamt können also die meisten, beispielsweise alle mit Ausnahme von 2-4 Lysingruppen alkyliert (sogar mit den milderen Alkylierungsmitteln) oder carbamyliert werden. Alle bis auf etwa eine der zugänglichen (mit TNBS titrierbaren) Lysingruppen in jeder der Orgotein-Pepdiduntereinheiten kann unter stärker alkylierenden Bedingungen, beispielsweise mit Überschuß Dimethylsulfat in einem 0,04 m Carbonatpuffer vom pH-Wert 10, polyalkyliert werden. Wie aus der Tatsache, daß nicht alle titrierbaren Lysinamino-Gruppen alkyliert oder carbamyliert werden, zu erwarten ist, ist die Verteilung der Alkyl-oder Carbamylgruppen an dem Orgotein-Molekül offensichtlich willkürlich, da keine der titriöbaren Lysin-Aminogruppen ungewöhnlich leicht alkylierbar oder zu den carbamylierten Aminogruppen umwandelbar zu sein scheint. Da das Orgotein-Molekül aus zwei identischen Peptidketten besteht, sind die Alkylgruppen eines teilweise alkylierten Orgoteins

N-
und dieXcarbamylierten Aminogruppen eines teilweise carbamylier-

ten Orgoteins mehr oder weniger willkürlich entlang jeder

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Peptid-Untereinheit, jedoch mehr oder weniger gleichmäßig zwischen den beiden Ketten verteilt. Da gewöhnlich ein einzelnes Alkylierungs- oder Carbamylierungsmittel verwendet wird, sind alle Alkylgruppen bzw.alle carbamylierten Aminogruppen identisch. Es ist jedoch auch möglich, alkylierte Orgoteine und carbamylierte Orgoteine herzustellen, die zwei oder mehr verschiedene Alkylgruppen im Molekül und sogar innerhalb jeder der beiden Ketten haben.

Eine Möglichkeit, ein gemischtes Alkylorgotein zu gewinnen, besteht darin, stufenweise mit unterschiedlichen Alkylierungsmitteln zu alkylieren. So kann z.B. ein Teil der titrierbaren Lysin- 6-Aminogruppen mit einem in mäßiger Konzentration vorliegenden ersten Alkylierungsmittel, wie Iodoacetamid, und der Rest der umsetzbaren Aminogruppen mit einem in hoher Konzentration vorliegenden weiteren Alkylierungsmittel, wie Dimethylsulfat,alkyliert werden.Was dabei unter geringer oder hoher Konzentration an Alkylierungsmitteln zu verstehen ist, hängt von den jeweiligen Reaktionsgeschwindigkeiten mit Proteinaminogruppen μηα dem Lösungsmittel sowie gleichermaßen vom Reaktions-pH-We,rt und dem Alkylierungsmittel sowie, in geringerem MaßjVom Puffer und der Temperatur ab.

Eine Möglichkeit zur Herstellung eines gemischten N-carbamylierten Orgoteins besteht in der stufenweisen Carbamylierung mit unterschiedlichen Carbamylierungsmitteln. So kann z.B. ein Teil der titrierbaren Lysin- £-Aminogruppen mit einem mäßig

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reaktionsfreudigen Carbamylierungsmittel, wie KNCO, und der Rest der umsetzbaren Aminogruppen mit einem stärker reaktionsfreudigen Carbamylierungsmittel, wie Methylisocyanat, carbamyliert werden. Die Reaktivität eines CarbamylierungsmitteIs hängt von den jeweiligen Reaktionsgeschwindigkeiten mit den Proteinaminogruppen und dem Reaktionslösungsmittel und somit gleichermaßen vom Reaktions-pH-Wert und dem Carbamylierungsmittel sowie, in geringerem Maße,vom Puffer und der Temperatur ab.

Eine andere Möglichkeit zur Gewinnung eines gemischt alkylierten oder gemischt N-carbamylierten Orgoteins besteht in der ^; Hybridisierung. Der Ausdruck "Hybridisierung eines Orgoteins" bezeichnet die Bildung eines gemischten Orgoteins aus den Peptidketten von zwei unterschiedlichen Orgoteinmolekülen, z.B. 'Ap und B₂, wobei A und B deren jeweilige Peptidketten sind (Ap + B₂^=^ 2AB). Die Ladung des Heterodimeren AB bei der Elektrophorese sollte der Mittelwert derjenigen der Homodimeren A₂ und B₂ sein, wenn man annimmt, daß der gleiche Anteil jeder Untereinheit in allen Fällen an der Bindung teilhat.

ε-N-Methylorgotein, das durch Alkylierung des nativen Orgotein-Moleküls in 0,04 m Carbonatpuffer vom pH-Wert 10 mit Überschuß Dimethylsulfat hergestellt wurde, £ -N-Äthyl-Orgotein, das durch Alkylieren des Orgoteins in gleicher Weise mit Diäthylsulfat hergestellt wurde, €-N-Propylcarbamyl-Orgotein, das durch Carbamylieren des nativen Orgotein-

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Moleküls in 0,1 m Tris- oder Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 mit Überschuß Propyl-Isocyanat hergestellt wurde, und £ -N-Methylthiocarbamyl-Orgotein, das durch Carbamylieren des Orgoteins in 0,075 m Natriumtetraborat mit Methyl-Isothiocyanat hergestellt wurde, können jedes mit nativem Orgotein oder untereinander hybridisiert werden, wobei sie zusammen ¹I Stunden auf 50 C erwärmt werden.

Wie leicht einzusehen ist, können diese hybridischen halbalkylierten und halbcarbamylierten Orgotein-Moleküle mit einem anderen Alkylierungsmittel oder Carbamylierungsmitte1 weiter alkyliert oder carbamyliert werden zu einem hybridischen alkylierten oder carbamylierten Orgotein,in dem sich die Alkylgruppen bzw. die carbamylierten Aminogruppen in einer Peptidkette von denen der anderen unterscheiden.

Die erfindüngsgemäßen €-N-Carbamylorgoteine und i-N-Alkylorgoteine scheinen im wesentlichen die gleiche räumliche Konformation wie das native Orgotein-Molekül zu besitzen. Die Gehalte an chelatgebundenem Cu ⁺ und Zn (Grammatome pro Mol) sind etwa die gleichen wie die beim Orgotein. Wie Orgotein sind auch sie höchst beständig gegenüber Pronase und gegen Abbaureaktionen durch andere proteolytische Enzyme. Die enzymatische Superoxiddismutase (SODase-) Aktivität ist jedoch bei den carbamylierten Orgoteinen im Verhältnis zum Carbamylierungsgrad reduziert.

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Obwohl die überwiegende strukturelle Modifizierung des nativen Orgotein-Moleküls, die beim Alkylieren oder Carbamylieren bei alkalischem pH-Wert abläuft, beim Alkylieren die Mono-, Di- und zu einem geringeren Ausmaß die Tri-Alkylierung der £-Aminogruppen der Lysinreste und beim Carbamylieren die Carbamylierung dieser t -Aminogruppen ist, können die freien Aminogruppen der Argininreste und die freien Carboxylgruppen der Asparginsäure- und Glutaminsäuregruppen sowie weitere alkylierbare, im Molekül vorliegende Gruppen, insbesondere die Hydroxylgruppe und der Imidazoletickstoff sowie möglicherweise auch der Guanidinstickstoff,

-SH, -SCH., usw. j in gleicher Weise in Abhängigkeit von den angewandten Bedingungen und der Reaktivität des Alkylierungs- öder Carbamylierungsmittels alkyliert oder carbamyliert werden. Während beispielsweise die Alkylierung bei einem pH-Wert von 10 mit Jodacetamid alleinig eine 6 -N-Alkylierung zu sein scheint, ist die Alkylierung mit Dimethylsulfat bei einem pH-Wert von 10 weniger selektiv und führt gleichzeitig Methylgruppen irgendwo im Molekül ein. Derartige zusammen auftretende alkylierte Orgoteine mit £-N-Alkylgruppen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Jedoch sind bei der CarbamyÜerung derartige gleichzeitig modifizierte Gruppen labil und in wässrigen Lösungen innerhalb eines Tages oder weniger und abhängig vom pH-Wert leicht hydrolysierbar.

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Der Ablauf der Alkylierung, soweit er die COOH-Alkylierung erfaßt, und der Carbamylierung kann direkt durch einen Wechsel der elektrophoretischen Gesamtladung und einen Wechsel im Auftauchen, neuer Banden bei der Elektrophorese verfolgt werden. In ähnlicher Weise kann die N-Alkylierung, soweit sie eine ansonsten acylierbare -NH_?-Gruppe gegen die Acylierung widerstandsfähig macht, durch eine Verminderung der Anzahl der acylierbaren Aminogruppen^verglichen mit dem nativen Orgotein-Moleküljverfolgt werden. Die genaue Natur der N-Alkyl- und N-Carbamylgruppen ist_fähnlich wie ihre Anzahl* nicht kritisch, soweit der Alkyl- oder Carbamylrest physiologisch verträglich ist. Wegen des höheren Molekulargewichts des Orgotein-Moleküls ist, sogar wenn das Orgotein-Molekül mit Alkyl- oder Carbamylgruppen eines mäßigen Molekulargewichts, beispielsweise ^ 100, vollständig alkyliert oder carbamyliert ist, der Einfluß auf die

chemische Gesamtzusammensetzung relativ gering, d.h. weniger als 10 %. Die Alkylierung und die Carbamylierung haben auch keine offensichtlich signifikante Wirkung auf die dichte räumliche Konformation des Moleküls und die resultierende Stabilität, beispielsweise bei einstündigem Erhitzen bei 60 C und beim Angriff durch proteolytische Enzyme.

Es ist einleuchtend, daß die Alkyl- oder Carbamylgruppe ein

es
.Derivat ein/ Alkylierungs- oder Carbamylierungsmittels sein

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muß, das eine Aminogruppe im Wasser einer Pufferlösung alkylieren bzw. earbamylieren kann, da die Reaktion üblicherweise darin durchgeführt wird.

Zu derartigen Alkylierungsmittein gehören primäre Dialkylsulfate der Formel (RO)₂SO₂ (R = CH,, C₃H₅,^-C₃H₇, n-C^Hg), aktivierte Alkylhalogenide der Formel ICH₂COX (X = OH, NH₂), Benzyl- und Allylbromide, aktivierte Vinylgruppen der Formel CH₂ = CHX (X = CN, SOCH,, SOC₂H₅, COCH₃) sowie reduktive Alkylierungs-'mittel, wie RCOR¹ +BH₁₁" oder BH₃CN" (R, R¹ = H, CH₃, C₃H₅, CgH₁₅). Ein Verfahren zur reduktiven Alkylierung von Proteinen mit aromatischen Aldehyden und Natriumcyanoborhydrid ist in Friedman, M. et al, Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 6, 197¹», S. 183-185 beschrieben. Die Alkylierung mit Acrylonitril ist in Means & Feeney, "Chemical Modifications of Proteins" Kap. 6, S. 114-117; Fletcher, J.C., Bioehern J., Bd. 98, 1966, S. 34C; Friedman, M. et al., J. Amer. Chem. Soc, Bd. 87, 1965, S. 3672; Friedman, M. et al., J. Org. Chem., Bd. 31/1966, S. 2888 beschrieben.

Zum Beispiel geeigneter Carbamylierungsmittel gehören Alkalimetallcyanate,wie NaNCO, KNCO; Alkylisocyanate und Alky1-isothiocyanate,wie RNCO und RNCS, wobei R= CH₃, C₃H₅, ri-C,H„, n-C^Hq und n-CgH.- ist und Arylisocyanate und -isothiocyanate, wie Phenylisocyanat und Phenylisothiocyanat.

Obwohl Metallcyanate mit vielen Typen einer Seitenkette reagieren, stellt nur die Reaktion mit Aminogruppen unter ihrer Umwandlung zu Harnstoffgruppen ein stabiles Produkt her.,

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.- 16 -

Die Reaktion von Alky!isocyanaten und -isothiocyanaten
mit Orgotein ist vollständig analog mit der Reaktion der Cyanate, nur viel schneller. Die langkettigen Isocyanate sind dabei weniger reaktionsfreudig als die kurzkettigen.

Die Reaktion von Orgotein mit Isocyanaten und Isothiocyanaten kann überlicherweise dadurch bestätigt werden, daß man ein Reagenz verwendet, das eine fluoreszierende Gruppe in das Molekül, beispielsweise Fluoresceinxsothiocyanat, einführt. Dieses Reagenz ist ähnlich den Alkylisocyanaten und reagiert mit den Aminogruppen des Orgoteins unter Bildung von substituierten Thioharnstoffen. Jedoch vermindert sogar ein niedriger Substitutionsgrad die SOD-Aktivität des Orgoteins beträchtlich wegen der Größe des Fluoresceins. Die mono- und disubstituierten Orgoteine sind in Lösung nicht stabil und werden langsam durch Austausch der Untereinheiten und Hydrolyse immer mehr heterogen.

N-alkylierte Orgoteine

Da die genaue chemische Natur des Alkylrestes nicht kritisch ist, sofern er nicht im Orgotein-Molekül physiologisch toxisch ist und an den Lysin- £ -Aminogruppen gebildet werden kann,, kommen a,ls in Betracht zu ziehende Äquivalente der bevorzugten, vorstehend beschriebenen Kohlenwasserstoff-Alkylgruppen, soweit sie gebildet werden können, die Cyclopentyl-, Cyclohexyl-jMenthylgruppe und ähnliche Cycloalkylgruppen, die Cyclohexylmethyl-, jö-Cyclopentylpropyl-

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und ähnliche Cycloalkylalkylgruppen, Benzyl-, p-Xylyl- und die Phenethylgruppe und ähnliche Aralkylgruppen infrage. Ebenso als Äquivalente in Betracht zu ziehen sind die Alkylreste mit 1-8,vorzugsweise 1—4 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methyl- oder Äthylgruppe mit 1 oder mehreren, vorzugsweise einem einfachen Substituent,beispielsweise Carboxyl, Cyan-; Carbalkoxy-und die Amid-Gruppe,wie

Cyanometh^l-,
die Carboxymethyl-j/Carbathoxymethyl-, Carbomethoxymethyl-Gruppe und ähnliche Carbo-nieder-Alkoxymethyl-, Carbamylmethy!gruppen und die entsprechend substituierten Äthylgruppen, wie -CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CsN, -CH₂CH₂CONH₃ und -CH₂CH₂COOR, wobei R z.B. Methyl oder Äthyl, -CH₂CH₂SOCH₃, -CH CH₂SOC₂H und -CHgCHgCOCH, bedeutet. Die erfindungsgemäß alkylierten Orgoteine sind also Orgotein-Artgenossen einschließlich Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen,, Huhn und Mensch, wobei mindestens eine, beispielsweise 1,2,3»4»5 bis sämtliche (etwa 18-26) der titrierbaren Aminogruppen alkyliert sind, d. h. eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe besitzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die alkylierten Aminogruppen die Formel .

-NH-CH₂-R

in der R die Reste H, CH₅, C₃H₅, η-Ο,Η-, iso-C,H_ oder

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weitere Alkylgruppen bis zu 7 Kohlenstoffatomen, -COOH, -COO-LA, -CONH-LA, -CON(LA)₅, -C=N, -CH₅-C

-Ph, -COPh, -CH₂OH oder -CH(CH₃)OH bedeutet, in denen

LA einen nieder-Alkylrest mit 1-^ Kohlenstoffatomen bedeutet und Ph den Phenylrest bedeutet, der gegebenenfalls 1-3 einfache Substituenten, wie die Methylgruppe, das Chloratom, Bromatom, Nitrogruppe,Amidgruppe und die Methoxygruppe, die Carbomethoxy-oder Corboäthoxygruppe, beispielsweise die p-Tolyl-, sym.-Xylyl-, p-Amidophenyl-, m-Chlorphenyl- und die p-Methoxyphenylgruppe, besitzt.

Derartige Orgoteine besitzen die Formel

(H₂M)_m-0rg-

in der η eine ganze Zahl von 1 bis etwa 26, vorzugweise mindestens lo, insbesondere etwa 10-18,darstellt und die Summe von m und η die Gesamtzahl der titrierbaren freien Aminogruppen in dem nicht modifizierten Artgenossen darstellt und R die vorstehend angegebenen Gruppen darstellt, vorzugsweise H oder LA, beispielsweise die Methyl- oder Äthylgruppe, und "Org" der Rest Orgotein-Molekül ist.

Einige der im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Alkylierungsmittel alkylieren gleichzeitig einige der freien Säuregruppen des Orgetein-Moleküls. Diese alkylierten Orgoteine können durch folgende Formel dargestellt werden :

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(HOOC)_x (COOCH₂R)_y

(0rg)

in der "Org", R, m, η vorstehende Bedeutung besitzen, y die Anzahl der alkylierten freien Carboxylgruppen, beispielsweise 1 bis etwa 8, vorzugsweise 2-6, bedeutet und χ der Rest der freien Carboxylgruppen im Orgotein-Molekül ist.

Reagenzien, die für die Einführung von Carboxymethyl- bzw. Carbamylmethylgruppen einsetzbar sind,sind Jodessigsäure und Jodacetamid. Die Jodessigsäure kann stabile Produkte mit Cystein-Resten (Sulfhydryl), Lysinresten (Amino), Histidinresten (Imidazolstickstoffe) und Methioninresten (Sulfidschwefel) in den Proteinen bilden. Da die Carboxymethylierung jeder dieser Gruppen mit Ausnahme von Methionin die negative Netto-Ladung im Orgotein-Protein bei einem pH-Wert von 8,4 anhebt, kann die Elektrophorese die Gesamtreaktion quantitativ erfassen (mit Ausnahme der Garboxymethylierung von Methionin und des zweiten Imidazolstickstoffs).

Im nativen Orgotein reagieren die Jodessigsäure und Jodacedamid vorwiegend, jedoch nicht ausschließlich mit den Lysin-Aminogruppen. Obwohl die freien Thiole mit Jodessigsäure

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um mehrere Größenordnungen schneller als die Amine reagieren, reagieren die ersten wenigen Gruppen im Orgotein, die carboxymethyliert werden,nicht bemerkenswert schneller als die nächsten 10 bis 20 Gruppen. Dies ist mit der Reaktion von p-Mercuribenzoat mit den Orgotein-Sulfhydryl-Gruppen im Einklang. Es gibt also keine Reaktion mit dem

Holo-Protein. Sogar mit dem Apo-Pro.tein, das eine

ergibt

p-Mercuribenzoat-Sulfhydryl-Reaktion (obwohl langsam unter

ergibt Jodessigsäure

nicht-denaturierenden Bedingungen),/ im zehnfachen molaren Überschuß bei einem pH-Wert von 7 nach mehreren Wochen bei 4° C keine Abnahme des Sulfhydryl-Gehaltes (photometrisch durch p-Mercuribenzoat-Titration bestimmt). Die pH-Abhängigkeit der Carboxymethylierungsreaktion ist, wie

mit durch die Elektrophorese gezeigt,'der Reaktion von Lysin

(pK>8) und nicht mit der von Histidin (pK<6) in Übereinstimmung, da das Ausmaß der Reaktion bei identischen Anfangskonzentrationen stetig mit dem Anstieg des pH-Wertes auf 9 ansteigt, wobei keine nennenswerte Reaktion bei oder unterhalb des Neutralitätspunktes stattfindet, wo Histidin noch unprotoniert und reaktionsfähig ist. Andererseits zeigt die Titration des Histidins mit Chlorameisensäure-Äthylester nur 5 Histidingruppen im carboxymethylierten. Orgotein unter Bedingungen, die im nativen Orgotein 16 Histidingruppen zeigte.

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Der Nachweis, daß weder Methionin noch Histidin im nativen Rinderorgotein reaktionsfähig sind, wurde mit einem Experiment erbracht, in dem Orgotein mit 0,2 m Jodacetamid in 0,5 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 48 Stunden incubiert wurde. Die Alkylierung von Methionin oder die doppelte Alkylierung von Histidin sollte dabei ein stärker positiv geladenes Protein bei einem pH-Wert von 8,4 ergeben. Die Elektrophorese zeigte■ jedoch keinen Wechsel der SOD-Aktivität oder des Bandenmusters.

Die Lysin-Aminogruppen im Orgotein reagieren jedoch definitiv mit Jodacetat.Das umfassend carboxymethylierte Orgotein wandert bei der Elektrophorese in ähnlicher Weise wie das acetylierte Orgotein, hat jedoch eine niedrigere SOöAktivität (etwas 20 % des nicht modifizierten Orogtein-Proteins).

Zusätzlich zu den N-Methyl-"Rinder"-Orgoteinen und den Orgoteinen der nachstehend angeführten Beispiele sind weitere Beispiele der erfindungsgemäßen .N-Alkyl-Rinder-Orgoteine das N-Äthyl-Orgotein, N-Propyl-Orgotein und N-Benzyl-Orgotein, in denen in jedem Fall 9 derartige Alkylgruppen in jeder der zwei Untereinheiten des Orgotein-Moleküls vorliegen, bzw. die entsprechenden Orgotedne, wobei ein Mittelwert von 1,6 oder 10 derartiger Alkylgruppen in jeder derartigen Untereinheit vorliegt, sowie jeweils von.ihnen die entsprechenden Artgenossen von Mensch, Schaf

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Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn.

N-CARBAMYLIERTE ORGOTEINE

Die erfindungsgemäßen carbamylierten Orgoteine sind Orgotein-Artgenossen einschließlich Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Ratte, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen, Huhn und Mensch, wobei mindestens eine, beispielsweise 1,2,3,4,5 bis sämtliche (etwa 18-26)der titrierbaren Aminogruppen carbamyliert sind, d. h. eine gegebenenfalls substituierte -CONH- oder -CSNH-Gruppe enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die carbamylierten Aminogruppen folgende Formel:

Il

-NHCNHR

in der X das Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeutet und R die Reste CH_,C₂H , n-C,H_, ISO-C₅H₇,n-CgH^ oder weitere Alky!gruppen bis zu 12 Kohlenstoffatome, einen gegebenenfalls mit 1-3 einfachen Substituenten substituierten Phenylrest oder, wenn X Sauerstoffatom bedeutet, auch ein Wasserstoffatom

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darstellt, wobei als Substituenten des Phenylrests beispielsweise die Methylgruppe, das Chlor-Bromatom, die Nitro-,Amid- und die Methoxy-, die Carbomethoxy- oder Carboäthoxy-Gruppe,beispielsweise dieJp-Tolyl-, symrXylyl-, p-Amidophenyl-, m-Chlorphenyl- und die p-Methoxyphenylgruppe infrage kommen. Derartige Orgoteine besitzen die Formel

X Il (H₂N)_m-Org-(NHCNH-R)_n

mindestens in der η eine ganze Zahl von 1 bis etwa 26,vorzugsweise'2, insbesondere etwa 6 - 10 bedeutet und die Summe von m und η die Gesamtzahl der titrierbaren freien Aminogruppen in dem nicht modifizierten Artgenossen ist, X das Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeutet, R die vorstehend angegebene Bedeutung hat, vorzugsweise das Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit Ibis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet,und "Org" der Rest des Orgotein-Moleküls ist.

Besonders bevorzugte carbamylierte Orgoteine sind Alkylcarbamyl- und Alkylthiocarbamyl- Orgoteine, in denen die Älkylgruppe eine nicht substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, beispielsweise die

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Methyl-, Äthyl-?, Propyl-, Isopropyl-, Butyl- und die Octylgruppe.

Da die genaue chemische Natur der Carbamylgruppe nicht kritisch ist, soweit sie im Orgotein-Molekül nicht physiologisch toxisch ist und an den Lysin- ε -Aminogruppen gebildet werden kann, kommen als in Betracht zu ziehende Äquivalente der bevorzugten,-vorstehend beschriebenen Alkylcarbamyl-Orgoteine, soweit sie gebildet werden können, die andererseits der vorstehenden Formel entsprechenden Orgoteine infrage,in denen R die Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Menthyl- und ähnliche Cycloalkylgruppen, die Cyclohexylmethyl-, yö-Cyclopentylpropyl-und ähnliche Cycloalkylalkylgruppen, die Benzyl-, p-Xylyl- und Phenäthyl- und ähnliche Aralkylgruppen bedeutet. Ebenso in Betracht

zu ziehende Äquivalente sind diejenigen, in denen R eine

C-Atomen Alkylgruppe von 1-8, vorzugsweise 1-4 / insbesondere

en die Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet, die ein' oder

en

mehrere, vorzugsweise ein^ , weiterenSubstituenten, beispielsweise die Fluoresceinylgruppe besitzen.

Zusätzlich zu dem N-carbamylierten "Rinder"-Orgotein der nachstehend angeführten Beispiele gehören zu weiteren Beispielen der erfindungsgemäßen N-Carbamyl-Rinder-Orgoteine das entsprechende N-Carbamyl-Orgotein, N-PropytCarbamyl-Orgqtein, N-Äthylcarbamyl-Orgotein und das N-Methylthiocarbamyl-Orgotein, in denen in jedem Fall 9 derartige Carbamylgruppen in jeder der zwei Untereinheiten des

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vorliege^
Orgotein-Moleküls/bzw. dxe entsprechenden Orgoteine»

wobei ein Mittelwert von 1,6 oder 10 derartige!· Carbamylgruppen in jeder derartigen Untereinheit vorliegt, sowie jeweils von ihnen die entsprechenden Artgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen, Huhn und Ratte.

VERESTERTES ORGOTEIN

Wie vorstehend festgestellt,enthalten die Orgotein-Artgenossen etwa 50-68 Glutamin- und Asparaginreste. Jedoch nur etwa 20-27 von ihnen besitzen freie Säuregruppen. Da das Orgotein-Molekül aus zwei identischen oder nahezu identischen Peptidketten (Untereinheiten) aufgebaut ist, befindet sich die Hälfte dieser Aminosäurereste in jeder Kette, die fest, aber nicht kovalent unter mäßigen Temperatur- und pH-Bedingungen zusammengebunden sind. Die Veresterung ändert die Lad/ <fes Orgotein-Moleküls. Gewöhnlich können nur bis zu etwa 10, vorzugsweise bis zu etwa 6-8, dieser freien Säuregruppen verestert werden und bewahren noch diejenige Konformation des nativen Moleküls, von der die Stabilität und die Verwendung als Arzneistoff abhängig ist.

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Die Veresterung der Carboxylgruppe kann durch Zählen des Ladungswechsels, die bei der Elektrophorese gezeigt wird, quantitativ erfaßt werden. Gegebenenfalls kann das veresterte Orgotein mit dem nativen Orgotein, wie nachstehend beschrieben, hybridisiert werden, wobei die Zahl der veresterten Carboxylgruppen im Molekül um die Hälfte verringert wird.

Da das Orgotein-Molekül aus zwei identischen Peptidketten aufgebaut ist,sind die Estergruppen wahrscheinlich mehr oder weniger gleichmäßig zwischen den beiden Ketten verteilt. Da normalerweise ein einziges Veresterungsmittel verwendet wird, sind die Estergruppen insgesamt identisch. Es ist jedoch möglich ,veresterte Orgoteine zu produzieren, die zwei oder noch mehr verschiedene Estergruppen im Molekül und sogar innerhalb jeder der beiden Ketten haben.

Eine Möglichkeit, einen gemischten Ester des Orgoteins zu gewinnen, besteht darin, stufenweise mit unterschiedlichen Veresterungsmitteln zu verestern. So kann z.B. ein Teil der freien Säuregruppen mit einem in geringer Konzentration vorliegenden ersten Veresterungsmittel, beispielsweise Diäthylsulfat, und ein anderer Teil der Säuregruppen mit einem anderen in höherer Konzentration

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vorliegenden Veresterungsmittel, beispielsweise Diazomethan, verestert werden. Was hierbei unter geringer oder hoher Konzentration an Veresterungsmittel zu verstehen ist, hängt von den jeweiligen Reaktionsgeschwindigkeiten mit den Protein-Säuregruppen und dem Lösungsmittel und somit gleichermaßen vom Reaktions-pH-Wert und dem Veresterungsmittel sowie, im geringeren Maße, vom Puffer und der Temperatur ab.

Eine andere Möglichkeit zur Gewinnung eines gemischten Orgotein-Esters besteht in der Hybridisierung. Der Ausdruck "Hybridisierung von Orgotein" bezeichnet die Bildung eines gemischten Orgoteins aus den Untereinheit-Ketten von zwei

unterschiedlichen Orgotein-Molekülen, _wie A und B , wobei A und B ihre speziellen Peptidketten bedeuten ( A_p + B ?= Die Ladung des Heterodimeren AB bei der Elektrophorese sollte der Mittelwert derjenigen der Homodimeren A„ und Bp sein, wenn man annimmt, daß der gleiche Anteil jeder Untereinheit in allen Fällen an der Bindung teilhat.

Methyl-Orgotein und Äthyl-Orgotein können jeweils mit dem nativen Orgotein oder miteinander hybridisiert werden, wobei mit einem geringen Überschuß an nativem Orgotein 4 Stunden auf 50° C erwärmt wird. Die entstandenen Heterodimeren wandern in der Elektrophorese als ein Gemisch von Banden zwischen dem nativen Orgotein und den Banden des

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veresterten Orgoteins vor der Hybridisierung.

Wie leicht einzusehen ist, können diese hybridischen halbveresterten Orgotein-Moleküle mit einem anderen Veresterungsmittel weiter zu einem hybridischen"veresterte« Orgotein verestert werden, in dem die Estergruppen in der einen Peptidkette sich von denjenigen in der anderen Kette unterscheiden*

Die erfindungsgemäß veresterten Orgoteine scheinen im wesentlichen die gleiche räumliche Konformation wie das native Orgotein-Mölekül zu besitzen. Die Gehalte an chelatgebundenem Cu⁺⁺ und Zn ⁺ (Grammatome pro Mol) sind etwa die gleichen wie die beim Orgotein. Wie Orgotein sind sie höchst beständig gegenüber Pronase und gegen Abbaureaktionen durch andere proteolytische Enzyme. Die enzymatische Superoxiddismutase (SODase)-Aktivität ist nicht bemerkenswert reduziert,soweit nicht mehr als etwa 6-8 Carboxylgruppen verestert sind.

Die genaue Natur der Veresterungsgruppen ist; ähnlich wie die genaue Zahl der veresterten Gruppen,nicht kritisch, soweit die Veresterungsgruppe physiologisch verträglich ist. Wegen des hohen Molekulargewichts des Orgotein-Moleküls

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ist, selbst wenn das Orgotein-Mölekül mit Veresterungsgruppen eines mäßigen Molekulargewichts, wie < 160., verestert wird, der Einfluß auf "die chemische Gesamtzusammensetzung relativ klein, nämlich weniger als 5 %. Natürlich hat die Veresterung der freien Carboxylgruppen einen nachhaltigen Einfluß auf den isoelektr.ischen Punkt und die damit verbundene elektrophoretisch^ Beweglichkeit^ doch hat sie,wie vorstehend erläutert, sofern die Ver-

etwa
esterung auf/10 oder weniger Glutamin- und Asparagin-Säuregruppen beschränkt ist, keinen offensichtlich signifikanten Einfluß auf die kompakte räumliche !Conformation des Moleküls und deren Beständigkeit, beispielsweise gegen lstündiges Erwärmen auf 60° C und gegen den Angriff von proteolytischen Enzymen. ■

Verständlicherweise muß die Veresterungsgruppe von einem Veresterungsmittel stammen, das in der Lage ist, eine Carboxylgruppe in Wasser- oder Puffer-Lösung zu verestern, ' da die Umsetzung gewöhnlich in einem solchen Medium durchgeführt wird. Zu derartigen Veresterungsmitteln gehören Dir methyl- und Diäthylsulfat, . Diazomethan und weitere Diazoverbindungen, beispielsweise der Formel NpCHLCOX, in der X beispielsweise die Gruppen OCH,,OC₂ H₅, NH₂ oder NHCH₂CONH₂ bedeutet,und weitere Ester und Amide der Diazoessigsäure, denen reaktionsfähige Gruppen, wie die Carboxyl- oder Iminogruppe, fehlen.

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Verfahren zur Herstellung derartiger Ester sind beispielsweise in Methods in Enzymology, Bd. XI, .1967» S. 612; K.T. Fry et al, Biochem. Biophys. Res. Comra. Bd. 30, 1968, S. 489 und G.R. Delpierre and J.S. Pruton, PNAS, Bd. 56, 1966, S. I817 beschrieben.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein -COOH-verestertes Orgotein, in dem die Estergruppe vorzugsweise bis zu

von

4 Kohlenstoffatome enthält, beispielsweise/einem einwertigen Alkanol , wie die Methyl- und die Äthylgruppe, insbesondere die Methylgruppe.

Da die genaue chemische Natur der Estergruppe nicht kritisch ist, sofern sie nicht physiologisch toxisch ist und an den freien Säuregruppen des Orgoteins gebildet werden kann, kommen als in Betracht zu ziehende Äquivalente der bevorzugten,vorstehend beschriebenen Alkylveresterungsgruppen, soweit sie gebildet werden können, diejenigen infrage, die 1,2 oder mehrere einfache Substituenten besitzen, beispielsweise Halogenatome, Alkoxy-, Carbalkoxy-, Carbamidogruppen usw., insbesondere diejenigen, in denen die Substituent (en) enthaltende Estergruppe die Methylgruppe ist. Dabei kommen zusätzlich zum veresterten Orgotein, in dem die veresterten Säuregruppen -COOCH-sind,

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als in Betracht ziehenden Äquivalente diejenigen infrage, in denen die Säuregruppen -COOR darstellen, wobei R die Gruppen -CH₀COX, in der X die Reste OCH,, OC₀H₁., NH₀, NHCH₂CONH₂ oder CH^Hg-Phenyl bedeutet, oder CH(Phenyl)₂ bedeutet.

Die Veresterung der -COOH-Gruppen kann durch Zählen des Ladungswechsels bei der Elektrophorese^verglichen mit den nativen Orgoteinenyverfolgt werden.

Bekanntlich ist die elektroporetische Beweglichkeit eines Ions eine Punktion der Feldstärke, der Nettoladung des Ions (einschließlich der gebundenen Gegenionen) und des Reibungskoeffizienten; vgl. beispielsweise C. Tanford "Physical Chemistry of Macromolecules" Wiley, New York (1966), Da der Reibungskoeffizient von der molekularen Größe und Form sowie von der Zusammensetzung der Lösung abhängt, besitzen Vergleiche verschiedener Proteine keinen Informationswert. Jedoch ist beim Vergleich von Proteinen ähnlicher Größe und Form, in diesem Fall von Orgotein-MolekÜlen, die mit relativ kleinen Gruppen chemisch modifiziert wurden, unter identischen Elektrophoresebedingungen die einzige Variable,die diese elektrophoretische Beweglichkeit beeinflußt,die Nettoladung.

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Der Vergleich von elektrophoretischen Mustern einer Anzahl chemisch modifizierter Orgotein- Moleküle ist mit diesem Schluß in Einklang. Das native Rinder-Orgotein bewegt sich in der Elektrophorese hauptsächlich als eine Bande (Bande 1) mit geringeren Anteilen schneller bewegender Banden (Banden 2,3 usw.))die gleichmäßig von der Front der Hauptbande getrennt sind und Orgotein-Moleküle mit einem größeren Verhältnis von -COOH- zu -NHp-Gruppen darstellen als diejenigen Moleküle, die die Bande 1 bilden. Die Veresterung nacheinander höherer Zahlen von freien -COOH-Gruppen des nativen Rinder-Orgoteins führt zur Bildung einer Reihe nacheinander stärkerer kathodischer (Wanderung zur negativen Elektrode) elektrophoretischer Banden, da nacheinander mehr freie Carboxylgruppen des Orgotein-Moleküls verestert wurden.

Eine grafische Darstellung des durch Elektrophorese erhaltenen Abstandes gegen die Bandenzahl ist bei niedrigem COOH-

-Modifizierunggraden relativ linear, nimmt jedoch bei höherer Modifizierung allmählich Kurvenform an, da es eine Begrenzung der Geschwindigkeit gibt, mit der sich sogar die am höchsten geladene Spezies durch eine Lösung bewegen kann. Die schneller wandernden Spezies sind auch empfindlicher gegenüber der Salzkonzentration und werden bemerkenswert verlangsamt, wenn salzenthaltende Proben elektrophoretisch behandelt werden. Da die Extrapolation von mehr als etwa 2 Bandengenaue lagen nicht immer genau ist, benötigt deshalb das/Zählen einer Ladung die Co-Elektrophorese der unbekannten I^adung mit einer Lösung,die sämtliche Banden von 1 bis zu der interessierenden Lage enthält (beispielsweise teilweise acyteliertes Orgotein).

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Sämtliche übliche Proteinmodifzierungsreaktionen, die am Protein-Molekül insoweit angewandt wurden, sind mit dieser Interpretation im Einklang, nämlich daß die Bandenlagen den integralen Ladungsveränderungen vom nativen Orgotein-Molekül entsprechen. Die Veresterung mit Dimethylsulfat

äthyl
oder mit Diazoessigsäure-tester ergibt die Banden -1, -2, -3, -4 usw. unter dem Hinweis, daß 1,-2,. 3 bzw. k freie Carboxylgruppen chemisch modifiziert wurden.

Allgemein ausgedrückt.können höchstens nur etwa 8 der freien Carboxy1-Gruppen ohne nachteilige Effekte verestert werden. Versuche_/mehr als 6-8 Carboxyl-Gruppen zu verestern, d. h. mehr als 3 Carboxylgruppen jedes der beiden Orgotein-Peptid-Untereinheiten zu verestern, führCflgewöhnlich zur Denaturierung und zum Verlust der Superoxiddismutase-Aktivität.

Wie zu erwarten ist die Verteilung der veresternden Alkylgruppen am Orgotein-Molekül wahrscheinlich willkürlich, da keine der titrierbaren freien Carboxylgruppen ungewöhnlich leicht veresterbar scheint. Da das Orgotein-Molekül aus zwei identischen Peptidketten zusammengesetzt ist, sind die Estergruppen eines teilweise veresterte*!·" Orgoteins mehr oder weniger willkürlich entlang jeder Peptid-Üntereinheit, jedoch mehr oder weniger gleichmäßig zwischen den

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beiden Ketten verteilt. Da gewöhnlich ein einzelnes Veresterungsmittel verwendet wird, sind alle Ester-Gruppen ■identisch. Es ist jedoch auch möglich, veresterte Orgoteine zu produzieren,die zwei oder noch mehr verschiedene Estergruppen im Molekül und sogar innerhalb jeder der beiden Ketten haben.

Eine Möglichkeit, ein gemischtes verestertes Orgotein zu gewinnen, besteht darin, stufenweise mit unterschiedlichen Veresterungsmitteln zu verestern. So kann zum Beispiel ein Teil der freien Carboxylgruppen mit einem ersten Veresterungsmittel, beispielsweise Dimethylsulfat, und der Rest der reaktionsfähigen Carboxylgruppen mit einem anderen Veresterungsmittel, beispielsweise

. äthyl
Diazq^ssigsäure-'ester verestert werden. Eine andere

Möglichkeit zur Gewinnung eines gemisiohten veresterten Orgoteins besteht in der Hybridisierung. Die Bezeichnung "Hybridisierung von Orgotein" bezeichnet die Bildung eines gemischten Orgoteins aus den Untereinheit-Ketten von zwei unterschiedlichen Orgotein-Molekülen, wie A₂U.B , wobei A und B deren jeweilige Peptid-Ketten sind (A» + B ==±2AB). Die Ladung des Heterodimeren AB bei der Elektrophorese sollte der Mittelwert derjenigen der Homodimeren Ap u. B_ sein, wenn man annimmt, daß der gleiche Anteil jeder Untereinheit in allen Fällen an der Bindung teilhat. Methylverestertes Orgotein, das durch Veresterung von etwa 6 freien Säuregruppen des Orgotein-

Moleküls mit Dimethylsulfat hergestellt wird, und

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.carboxymethylverestertes Orgotein, das durch Verestern des nativen Orgotein-Moleküls mit Diazoessigsaure-tester hergestellt wird, können jeweils mit dem nativen Orgotein oder miteinander hybridisiert werden, indem sie zusammen 4 Stunden bei 50 C erwärmt werden.

Zusätzlich zum Rinder-Orgotein-Derivat der nachstehend beschriebenen Beispiele gehören zu weiteren Beispielen von erfindungsgemäßen Orgotein-Derivaten die entsprechenden Derivate weiterer Orgotein-Artgenossen.

Weitere Beispiele von veresterten Rinder-Orgoteinen sind

Carbomethoxymethyl-Orgotein und Carbamylmethyl-Orgotein,

in in denen jeweils 3 - 4 derart veresterte Gruppen/jeder

der zwei Untereinheiten des Orgotein-Moleküls vorliegen, bzw. die entsprechend veresterten Orgoteine, in denen eine oder zwei derartige Ester-Gruppen in jeder derartigen Untereinheit vorliegen, sowie jeweils von diesen die entsprechenden Artgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn.

Die Orgotein-Derivate können aus der Reaktionslösung, vorzugsweise nach der Dialyse zur Entfernung von Fremdionen, durch herkömmliche Lyophilisierung, beispielsweise gemäß US-PS- 3,658,682,isoliert werden. Gegebenenfalls kann das, Orgotein-Derivat durch Ionenauatausciharzchromatographie, Elektrophorese und/öder Gelfiltration

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unter Verwendung eines Polymers, das als Molekularsieb wirkt, gereinigt werden.

Die Filtration durch ein Mikroporenfilter der Porengröße o,öl - o,22 Micron in aseptischer Weise in sterile Flaschen, gegebenenfalls nach Einstellung der Ionenstärke mit NaCl und/oder Natriumphosphat auf beispielsweise isotonischen Zustand liefert eine bakteriell und viral oder bakteriell sterile Lösung, die für Injektionen geeignet ist. Die Filtration durch ein 0,1 Micron-Porenfilter vermindert oder eliminiert auch pyrogene Stoffe in der Lösung.

Die pharmazeutischen Präparate gemäß der Erfindung bestehen aus einem erfindungsgemäßen Orgotein-Ester und einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Form und die Natur dieses Trägers werden natürlich vom Verabreichungsmodus bestimmt.

Die bevorzugten pharmazeutischen Produkte sind sterile injizierbare Präparate, beispielsweise eine sterile injizierbare wässrige Lösung. Die Lösung kann in bekannter Weise unter Verwendung üblicher Träger zubereitet werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine Lösung oder eine Suspension in einem nicht toxischen, parenteral akzeptablen Verdünnungs- oder Lösungsmittel

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sein oder es kann ein lyophilisiertes Pulver für einen erneuten Einsatz mit einem derartigen Lösungsmittel sein.

Die erfindungsgemäßen Präparate enthalten eine wirksame Einheitsdosis-Menge eines erfindungsgemäßen Orgotein-Derivats, d. h. das Orgotein-Derivat liegt in einer Konzentration vor, die die gewünschte Wirkung zeigt, wenn eine Einheitsdosis des Produkts auf dem gewünschten Wege verabreicht wird. Flüssige Produkte zum Beispiel, gleich ob für Injektionen oder lokale Anwendungen enthalten gewöhnlich 0,5 bis 2o mg Orgotein-Derivat auf o,25 bis 10 ml, vorzugsweise von 0,5 - 5 ml , außer den IV-Infusions-Lösunger^ die stärker verdünnt sein können, beispielsweise 0,5 - 20 mg Orgotein-Derivat auf 50 - 1000 ml ,vorzugsweise 10Ö - 5OO ml, Infusionslösung. Tabletten, Kapseln und Suppositorien enthalten gewöhnlich 0,1 - 25 mg , vorzugsweise 1 bis 10 mg Orgotein-Derivat je Einheit.

Das Orgotein-Derivat wird gewöhnlich durch Einträufeln oder Injektionen verabreicht, zum Beispiel intramuskulär

subkutan, intravenös oder intradermal, wobei der intramuskuläre Weg bevorzugt ist außer in Fällen von Schock,,in welchen manchmal die intravenöse Verabreichung eine schnellere Wirkung erbringt, und bei bestimmten lokalen Schäden, wie Strahlungsschäden

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und weitere Zystitis,bei welchen eine lokale Injektion, Infusion und /oder Einträufelung häufig wirksamer ist. Die individuelle Dosis liegt gewöhnlich zwischen 0,5 - 20 mg und die bevorzugte Dosis für den Menschen beträgt etwa 0,5 - 8 mg , für das Pferd 5,0 - 10,0 mg Die exakte Dosis ist nicht kritisch und richtet sich nach der Art und Schwere der Krankheit.

Die erfindungsgemäßeη Orgotein-Derivate sind ebenso wie Orgotein ein wirksames Mittel zur Behandlung einer Vielzahl von Entzündungszuständen einschließlich solcher, bei denen synthetische entzündungshemmende Produkte nur beschränkt verwendet werden können, beispielsweise wegen toxischer Nebeneffekte bei längerem Gebrauch.

Insbesondere heilen diese Orgotein-Derivate Entzündungen und schwächen deren Polgen, beispielsweise im Harntrakt und in den Gelenken von verschiedenen Säugetieren. Es mildert die Symptome, die bei r.heumatoiden Erkrankungen, Osteoarthritis und posttraumatischer Arthritis sowie bei Bursitis, Tendonitis usw., auftreten.

Verfahren zur Gewinnung der als Ausgangsmaterial verwendeten Orgotein-Artgenossen und Angaben über die Verwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Orgotein- Derivate einschließlich Vorschlägen über die

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Verabreichung, Dosierungsformen,Dosierungseinheit und Ent zÜndungszust aride Und weitere Zustände, die für die Behandlung mit dem veresterten Orgotein empfänglich sind, finden sich in der US-PSJy.758^682'.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne jedoch ihren Rahmen einzuengen.

Beispiel IA

Eine Lösung von 5 mg Rinder-Orgotein in 4 ml 0,O¹I m C.jarbonatpuffer wird mit 20*yul Dimethylsulfat behandelt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 0,5 rn^iaOH bei 10,0 gehalten wird. Die Aufnahme der Base hat eine .:·'·*.·..·· Halbwertzeit von etwa 37 Minuten.Die Elektrophorese - -_ : zeigt SOD-aktive Banden1 bis -5 (Mittelwert -3)·-. Nach der Dialyse, dem Lyophilisieren und dem Wieder* lösen in 1 ml Wasser besitzt das Protein noch seine SOD-Aktivität und einen Cu⁴⁺ und Zn⁺⁺—Gehalt, der sich gegenüber dem nicht behandelten Orgotein nicht verändert hat. Die Acetylierung einer Lösung von 85 /ug/ml des modifizierten Proteins mit insgesamt 3yul Essigsäureanhydrid in 0,M ml Boratpuffer vom pH-Wert 9 gibt einen mittleren elektrophoretischen Ladungswechsel von nur etwa -2, verglichen mit -20 für das native Orgotein in der gleichen Lösung. Das mit Dimethylsulfat bei einem pH-Wert von 10 behandelte Orgotein ist deshalb

umfassendJN-methyliert, d. h. etwa 18 Methylgruppen je

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Molekül.

- 1*0 -

Beispiel 2A

Gemäß dem Verfahren von Beispiel IA werden die entsprechenden Orgotein-Artgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn als Ausgangsstoffe verwendet. In jedem Fall werden sämtliche mit Ausnahme einer Lysingruppe einer jeden Untereinheit des Orgotein-Moleküls alkyliert.

Beispiel J>A

Gemäß dem Verfahren von Beispiel IA wird Diäthylsulfat anstatt Dimethylsulfat verwendet. Die Eigenschaften des erhalten £-N-äthylierten Orgoteins sind im wesentlichen denen des 6 -N- methylierten Orgoteins gleich.

Beispiel 4A

Die ε-Amino-Gruppen der Lysinreste des Rinder-Orgoteins werden mit 0,2 m Natriumjodacetat bei Raumtemperatur unter den nachstehenden Bedingungen und mit den nachstehenden Ergebnissen carboxymethyliert.

70981 1 /1 OBO

Reaktionspuffer Ladungsveränderung bei der

Elektrophorese Mittelwert - Bereich

Orgotein (1.4 mg./ml) + ICH₂CO^Na⁺ (0.2 m)

(a) 0.3 m (pH 3.8) Acetatpuffer ( nur Veränderungen

infolge des niedrigen pH-Wertes)

(b) 0.4 m (pH 5.0) Acetatpuffer (keine Veränderung bis

72 Stunden)

(c) 0.23 m (pH 9.2)Carbonatpuffer 0 (15 Min), 3^±2

(2 1/2 Std.),

5+3 (6 1/2 Std.),>l8

(72 StdO

Aus diesen elektrophoretischen Mustern scheint es, daß keine N-Alkylierung bei pH-Werten von 3,8 und 5,0 stattfindet und daß bei einem pH-Wert von 9»2 im Mittel etwa 3 -CHpCOO'-Gruppen in 2,5 Stunden, etwa 5 derartige Gruppen in 6,5 und etwa 18 derartige Gruppen in 72 Std. an den E-Aminostickstoff-Atomen eingeführt werden.

Orgotein (2,8 mg/ml) + ICH₂CO₂Na (0.43 m)

(d) pH 6.0 . 0.4 nach 5 Tagen bei Raumtemperatur

(e) pH 7.0 0.6 (1 Tag), 1.0(2 Tage), 1,5 (5 Tage)

(f) pH 10 0 (10 Minuten), >3 (2,5 Stdn.),

>10 (6,5 Stdn.)

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Aus den elektrophoretischen Mustern eines derart behandelten Orgoteins scheint, daß bei einem pH-Wert von 6 weniger/die Hälfte der Orgotein-Moleküle alkyliert wird ,bei einem pH-Wert von 7 in 2 Tagen die Orgotein-Moleküle im Mittel eine mit einer -CHpCOO -Gruppe alkylierte £-Aminogruppe besitzen und in 5 Tagen im Mittel 2 derartige Gruppen je Molekül eingeführt werden. Bei einem pH- Wert von 10 werden im Mittel mehr als 3 derartige Gruppen in 2,5 Stunden und in 6,5 Stunden im Mittel mehr als 10 derartige Gruppen je Molekül eingeführt.

Die Produkte sämtlicher vorstehender Alkylierungen, in denen -CH COO -Gruppen eingeführt werden, sind ein Gemisch von S -amxnoalkylierten Orgoteinen mit einer verschiedenen Zahl derartiger Gruppen, was durch das Auftauchen einer Vielzahl von Banden mit verschiedenen elektrophoretischen Beweglichkeiten nachgewiesen wird.

Beispiel IB

Nicht substituiertes carbamyliertes Orgotein

Eine Lösung von 3»7 mg Orgotein (Rind-Artgenosse) und ll» mg KNCO in 2 ml 0,025 m Natriumphosphat-Puffer vom pH-Wert 7,5 wird bei 4° C incubiert. Die Elektrophorese gleicher Probenteile über 5^ Tage zeigte das Auftauchen

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einer Reihe von SOD-aktiven Banden, die stärker anodisch als das native Orgotein sind. Die mittlere Ladungsänderung entlang des Bereichs der aktiven Banden auf jeder Seite des Mittelwerts für die Proben ist nachstehend angegeben.

Zeit Cd)' : 0,75 3,8 27 54

umgesetzte Lysingruppen: O 0,8 5 + 2 8,5+3*5

Beispiel 2B

Alkyl-carbämylierte Orgöteine

50/ul.Anteile von Orgotein (Rinder-Artgenosse) in 0,1 m Tris- oder Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»6 bei einer Konzentration von 10 mg/ml werden bei 4 C mit 1yul entweder Propylisocyanat oder OGtylisocyanat in verschiedenen Zeiten umgesetzt. In 2 Fällen werden zusätzlich 2/ul Propylisocyanat zugesetzt. Die Zahl der eingeführten Propyl-Carbamyl- und Octyl-Carbamyl-Gruppen wird durch die mittlere Ladungsveränderung in der ElektrophoresejWie nachstehend gezeigt, bestimmt.

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- hh -

Mittlere Ladungsveränderung

-REAGENZ

Propylisocyanat/Tris-

puffer

Propylisocyanat/ Phosphatpuffer

Octylisocyanat/ Trispuffer

Octylisocyanat/ Phosphatpuffer

2 Min 2 Std. 1 Tag

0,2

1,0

0,2

+ 2/ul Isocy-2 T. anat

8 10

keine zus. _ft Veränderung

2,5

Beispiel 3B

Alkyl-carbamylierte-Orgoteine

Das Verfahren gemäß Beispiel 2B wird unter Verwendung von 10 mg Orgotein in 1 ml 0,1 m Phosphatpuffer von pH 7,6 und 1 ml Propyl- oder Octylisocyanat wiederholt. Die Lösungen werden H Stunden bei 25 C gehalten und anschließend elektrophoretisch geprüft. Danach wird jeweils zusätzlich 1 ml Isocyanat zugesetzt. Nach der Incubation bei H° C über Nacht werden die Lösungen wiederum elektrophoretisch geprüft und dialysiert. Die carbamylierten Proteine sind in entionisiertem Wasser weniger löslich und fallen bei der Dialyse teilweise aus.Sie sind jedoch in 0,15 m Kochsalzlösung löslich. Die Zahl der carbamylierten

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Lysingruppen ist nachstehend angegeben.

GAPM Isocyanat umgesetzte Lysingr. Metallgeh. % der ursprüngl.

4 Std. ü. Nacht

Cu⁺⁺ Zn^{++ S0D}~^Aktivität

Propyl

10+ 4

>15 2,2 1,5

etwa 50 %

Octyl

3 + 3

6+ 5 2,1 1,8

etwa 25 %

Beispiel 4B

N-Methyl-Thiocarbamyl-Orgotein

Eine Lösung von 5 mg Orgotein in 4 ml 0,075 Na₃B^O₇ vom pH-Wert 9 wird mit 10 axI CH NCS versetzt,und das Gemisch wird eine Minute bis zum Lösen des CH-NCS geschüttelt. In bestimmten Zeitabständen werden 50 ^ul-Proben entnommen^ und mit 0,4 ml 0,1 m Natriumacetat-Puffer vom pH-Wert 5,3 wird die Reaktion unterbrochen. Ein weißer Schwefelniederschlag (nachgewiesen durch seinen Verbrennungsgeruch und seine Löslichkeit in CS ) tritt zwischen 6 und 22 Stunden auf. Nach 22 Stunden bei Raumtemperatur wird das restliche Reaktionsgemisch mit 0,5 ml Im Acetatpuffer vom pH-Wert 5,3 abgeschreckt und unter häufigem Wechseln von Wasser 2 Tage dialysiert. Die dialysierte Lösung wird kurz zur Entfernung der weißen wolkigen Trübung in der Lösung zentrifugiert. *

7 0 9 8 11/10 6 0

Die Elektrolyse von aus der Lösung entnommenen Proben zeigt die Herstellung einer Reihe von anwachsend anodisch stärkeren SOD-aktiven Banden. Die Analyse der Proben nach dem Cytochrom C-Test bei einem pH-Wert von 7»8 (vgl. McCord & Fridovich, J. Biol. Chem.S.6O49-6O55 (I969)) zeigt einen Abfall der SOD-Aktivität bei etwas mehr umfassender Modifizierung.

Zeit (Stunden) Mittlere Ladungs- SOD-Aktivität

Veränderung

0 (0) (100 %)

0,08 0,5 111

0,25 1 118

0,75 2 91

1,9 4 86

6 9,5 43

22 16 20

Das 22 Stunden dialysierte Reaktionsprodukt bewegt sich auf der Elektrophorese als eine schnell bewegende anodische Bande, enthält 18* der SOD-Aktivität des nativen Orgotein-Proteins und 2,06 gapm Zn ⁺ und 1,76 gapm Cu⁺⁺ (verglichen mit 2,26 gapm Zn⁺⁺ und 2,08 gapm Cu⁺⁺ im nicht modifizierten Orgotein). Sämtliche Produkte sind löslich, enthalten ehelatgebundenes Cu und Zn und mindestens einen Teil der Superoxiddismutase-Aktivität des nicht modifizierten Proteins.

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■I !-.-■' -

Beispiel 5Β
N-Fluoresceinylcarbamyl-Orgotein

Eine Lösung von 100 mg Orgotein (Rinder-Artgenosse) und 6 mg Pluoresceinisothiocyanat in 10 ml 0,14 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5 wird 18 Stunden bei 4° C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird auf eine chromatographische Säule von mikroporösem vernetzten! Dextran (Sephadex G-50, Pharmacia, Upsala, Schweden) gegeben und mit 0,15 m Kochsalzlösung, die mit Boratpuffer vom pH-WÖrt 8 gepuffert ist, eluiert. Die eluierten gelben Proteinfraktionen werden

gegen Wasser dialysiert. Das ausgefällte dialysierte

or Protein (20 mg) ist intensiv gelb, flufesziert und ist

in Kochsalzlösung, die mit Boratpuffer vom pH-Wert 8 gepuffert ist, leicht löslich. Die Elektrophorese zeigt, daß

96 mg lösliches Protein etwa zur Hälfte monocarbamyliertes Orgotein (Ladungsveränderung -3) in Verbindung mit etwas zweifach und dreifach carbamyliertem Orgotein (Ladungsveränderung -6und -9) sowie nicht umgesetztes Orgotein sind* Der wieder gelöste Niederschlag scheint umfassender modifiziertes Protein zu sein, da die Elektrophorese einen schnellen anodischen Fleck zeigt.

Das lösliche Protein wird auf einer schwachbasischen Ionenaustauschsäule (DEAE-Cellulose) bei einem pH-Wert von 6 mit einem linearen 0,01 - 0,2 m Phosphatpuffergradienten chro_matographiert. Die mono-carbamylierten- und die di-carbamylierten Orgoteine werden isoliert, dialysiert

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lyophilisiert.

Das mono-carbamylierte Orgotein ist bei der Elektrophorese und der NBT-Riboflavin-Färbung SOD-aktiv. Nach dem Cytochrom C-Test beim pH-Wert von 7,5 besitzt es 48 £ der SOD-Aktivität des nativen Orgoteins. Im Ungar^Biotest zeigt das Protein etwa 50 % der Aktivität des nativen Orgoteins.

Eine Lösung des mono-carbamylierten Orgoteins, das 2 Wochen bei 4 C aufbewahrt wurde, verändert sich zu einem Gemisch von Orgotein, mono-carbamyliertera Orgotein und di-carba-

myliertem Orgotein (offensichtlich das Ergebnis der

nicht Hybridisierung) und etwas flueszierender^proteinartiger Verbindung (offensichtlich das Ergebnis der Hydrolyse der Thioharnstoffgruppe des carbamylierten Orgoteins unter Bildung von freiem Aminofluorescein).

Gemäß dem Verfahren der vorstehenden Beispiele,jedoch unter

Verwendung der entsprechenden Orgotein-Artgenossen von

Hund ₃
Mensch,Schaf, Pferd, Schwein ,'Kaninchen, Meerschweinchen,

Ratte und Huhn als Ausgangsprodukte werden die entsprechenden carbamylierten Derivate dieser Artgenossen hergestellt.

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Beispiel IC

Methylveresterung

Eine Lösung (125/U/ml) von 0,5 mg Rinder-Orgotein und 0,5 VoI % Dimethylsulfat in 4 ml 0,05 m Acetatpuffer wird 100 Minuten bei einem pH-Wert von 5 gehalten. Die elektrophoretische Analyse des Reaktionsprodukts zeigte SOD-aktive Banden von +1 bis -6 (Mittelwert -4). Das Produkt ist ein Orgotein mit im Mittel 4 -COOCKL-Gruppen.

Beispiel 2C Methylveresterung

Eine Lösung von 0,5 mg Rinder-Orgotein und 10/ul Dimethylsulfat in 4 ml Wasser wird unter Zugabe von 0,1 m NaOH bei einem konstanten pH-Wert gehalten. Die Geschwindigkeit der Basenaufnahme im pH-Bereich von 7-10 ist ziemlich unabhängig vom pH-Wert und der Zugabe von 0,25 m Natriumphosphatpuffer. Die Elektrophorese zeigt die Bildung von kathodisch stärkeren SOD-aktiven Banden bei einer Anfangsgeschwindigkeit von etwa -0,5 Ladung/Stunde. Nach 21 Stunden überwiegend bei einem pH-Wert von 7-8 wird die Lösung hinsichtlich der N-Methylierung und der Veresterung, wie nachstehend beschrieben,analysiert. Es kann keine N-Methylierung festgestellt werden.

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(a) Die Acetylierung eines 0,5 ml Anteils des verestertenr Orgoteins mit 1yul Essigsäureanhydrid und 3 ^l 6 m NaOH bei h° C gibt eine Lösung, deren Elektrophoresemuster eine schnell bewegende anodische Bande ist, die der von acetyliertem nativen Orgotein ähnlich ist, wobei festgestellt wird, daß die freien Aminogruppen während der Veresterung unbeeinflußt bleiben.

(b) Ein 1 ml Anteil der veresterten Orgotein-Lösung wird auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und in einem Exikator über NaOH-Plätzchen aufbewahrt. Obwohl das kathodische Bandenmuster der Banden ijbis -l| bei pH-Werten von 7-9 stabil ist, verschwinden die kathodischen Banden bei einem pH-Wert von 10,5 allmählich innerhalb 4 Tagen, wobei das elektrophoretische Muster des nativen Orgoteins wieder erscheint. Die Proteinmethylester hydrolysieren üblicherweise leicht bei alkalischen pH-Werten, wobei bestätigt wird, daß die kathodisch stärkeren Banden, die nach dem Verestern erscheinen, Orgotein-Ester sind.

Aus dem Vorstehenden ist offensichtlich, daß nach 2 Stunden Dimethylsulfat bei einem pH-Wert von 7 - 10 im Mittel eine -COOH-Gruppe je Molekül, nach 4 Stunden etwa 2 je Molekül verestert und anschließend die Zahl der veresterten -COOH-Gruppen auf einen Maximalwert von etwa 6 je Molekül dauernd ansteigt.

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Gemäß dem Verfahren der Beispiele IC und 2C, jedoch unter ·». Verwendung der entsprechenden Orgotein-Artgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn als Ausgangsprodukte werden jeweils im Mittel etwa M Carboxylgruppen des Orgotein-Moleküls zu ihren Methylestern umgewandelt.

Gemäß dem Verfahren von Beispiel IC und Beispiel 2C unter Verwendung von Diäthylsulfat anstelle von Dimethylsulfat werden Orgoteinester mit 1-6 freien Carboxylgruppen, die zu Äthylestern umgewandelt werden, hergestellt. Die Eigenschaften der erhaltenen veresterten Orgoteine sind im wesentlichen gleich denen des methylveresterten Orgoteins.

Die veresterten Orgoteine können weiterhin gegebenenfalls durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden, um die Produkte verschiedener Nettoladung und deshalb verschiedener Veresterungsgrade voneinander zu trennen. Beispielsweise trennt die Elution von 200 mg Orgotein über eine DEAE-Sephadexsäule der Abmessung 2,5 x ^O cm mit h 1 eines linearen 0,01 m bis 0,2 m Trispuffergradienten vom pH-Wert 8,5 die Orgotein-Banden voneinander, wobei die elektrophoretisch stärkeren kathodischen Banden zuerst eluiert werden. Durch ein derartiges Verfahren kann das

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Gemisch von methylveresterten Orgoteinen, die nach dem Verfahren von Beispiel IC hergestellt wurden, . in Fraktionen getrennt werden, die überwiegend 1, 2, 3, 4, oder 6 Methylestergruppen je Orgotein-Molekül enthalten.

Eine derartige Fraktionierung eines teilweisen modifizierten Orgoteins durch Ionenaustausch-Chromatographie ist auf jedes modifizierte Orgotein anwendbar, dessen molekulare Ladung vom Modifizierungsgrad abhängt,beispielsweise methylverestertes Orgotein, carbäthoxymethylverestertes· Orgotein und N-acetyliertes Orgotein.

Beispiel 3C
Carbäthoxymethy!veresterung

Diazoessigsäureäthylester wird durch Umsetzung von Glycinäthylester mit salpetriger Säure (vgl. "Organic Synthesis" Coll. Bd. IV, S. iJ24) hergestellt. Zur Extraktion des Diazoessigsäureesters aus der wässrigen Lösung wird Chloroform anstelle von Methylenchlorid verwendet.

2 ml einer etwa 1 m Diazoessigsäureester/Chloroformlösung wird in einem 25 ml-Kolben vorgelegt. Der größte Teil des Chloroforms wird am Wasserstrahl_yakuum eingedampft. Eine Lösung von 9 mg Rinder-Orgotein in 3 ml Wasser wird zugefügt und zur Dispersion der organischen Phase verrührt. Die Lösung wird bei *J° C aufbewahrt und jeweils nach einigen

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Tagen aufgerührt. Währenddessen bleibt das Reaktionsgemisch heterogen. Die Elektrophorese zeigt die allmähliche Bildung von stärker kathodischen SOD-aktiven Proteinbanden -1 bis -6. Die mittlere Ladungsveränderung beträgt 1,2 nach 5 Tagen und 3 nach 12 Tagen. Das Produkt ist ein Gemisch von Carbäthoxymethyl-Orgoteinestern,wobei sie nach 5 Tagen entweder eineoder zwei derartiger Estergruppen je Molekül und nach 12 Tagen 1 bis 6 derartiger Estergruppen besitzen.

Die wässrige Phase wird anschließend filtriert und durch chromatographische Fraktionierung unter Verwendung einer 10 ecm fassenden Sephadex G-25-Säule entsalzt. Die Proteinfraktionen werden lyophilisiert und erneut in 2 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird von 3,7 auf 5,6 mit 2 yul 1 mNaOH angehoben. Die Elektrophorese zeigt keine Abweichung von dem Zustand vor dem Entsalzen und Lyophilisieren. Eine Rückreaktion dieser Lösung innerhalb eines Monats unter den gleichen, vorstehend beschriebenen Bedingungen ergibt einen Proteinflecken auf der Elektrophorese mit geringerer SOD-Aktivität und kein Produkt, das stärker kathodisch als die Bande -6 ist.

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Beispiel

Methylveresterung

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 und 2 wird Rinder-Orgotein unter den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Bedingungen alkyliert.

Puffer Orgotein

SOD-aktive

Dimethyl- Hydro- Banden sulfat lyse- auf der Vol.-* Halbwert- Elektro-

(e) 11,2 - 0,05 9,3

	125	/ug/ml	0,25	zeit*	phorese
0,05 m	125		0,5	54 Min	+1 bis -4 (Mittelw. -2)
Acetat	80	/ig/ml	0,65	54 Min	-1 bis -6 (Mittelw. -4)
0,016 m	80	/ug/ml	1,3	1 Std.	-2 bis -6
Phosphat	125	/ug/ml	0,5	1 Std.	Schwache Spur SOD von +4 bis -6 mit Max. bei -6
0,05 m Carbonat			1/2 Std bei pH= 10	+2 bis -3

⁺ Halbwertszeit der NaOH-Aufnähme, die zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Werts benötigt wird.

Das Produkt von Beispiel (a) hat im Mittel 2 veresterte -COOH-Gruppen je Molekül, während Beispiel (b) im Mittel 4 derartige Gruppen besitzt, Die Anwesenheit einer Vielzahl von kathodischen Banden beweist₉ daß die veresterten Produkte aus einer Vielzahl von veresterten Orgoteinen bestehen, die 1 bis etwa 6 Estergruppen je Molekül enthalten. 709811/1080

Beispiel 5C

Methylester-VN-Acetyl-Hybrid

Eine Lösung ( 125/ug/ml) von 0,5 rag methylverestertem Orgotein, das nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt wurde, wird mit 0,5 mg vollständig N-aeetyliertem Orgotein versetzt. Die Elektrophorese des Gemische zeigt nur die den methylveresterten Orgoteinen entsprechenden Banden und die dem N-Acetylorgotein entsprechende anodische Bande. Nach fJstündigem Erwärmen des Gemischs auf 50 C zeigt die Elektrophorese die Bildung mehrerer neuer Produkte (bei den Bandenlagen +7 - +11) und eine über 50 %ige Verminderung der ursprünglichen N-Acetyl- und Methylester-Örgoteinbanden.

Die durch das Erhitzen des Gemischs von modifizierten Orgoteinen gebildete neue Spezies sind Hybride

(Heterodimere), die jeweils eine Untereinheit des N-Acetyl-Orgoteins (mit einem Gehalt von 10 N-Acetyl-Lysingruppen

je Untereinheit) und von methylverestertem Orgotein

(mit einem Gehalt von 0 - j -COOMe-Gruppen je Untereinheit)

enthalten.

Die Hybriden können aus ihrem Gleichgewichtsgemisch mit den N-Acetyl- und -COOMe-Orgoteinen (Homodimere) durch Ionenaustausch-Chromatographie bei niedriger Temperatur, wie in Beispiel 2C beschrieben, getrennt werden. Die getrennten Heterodimerenkönnen bei Lagerung fortfahren,

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sich zu rehybridisieren unter Wiederherstellung eines
Gemischs, das ebenso .gut beide Homodimeren enthält.
Die Geschwindigkeit der Rehybridisierung hängt von der Temperatur ab und ist bei tiefen Temperaturen niedrig.

Die vorstehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werden, wenn man die allgemein oder spezifisch beschriebenen Reaktanten und/oder Behandlungsbedingungen der Erfindung anstelle derjenigen einsetzt, die in den vorstehenden Beispielen verwendet wurden.

Aus der vorstehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wichtigen Eigenschaften der Erfindung entnehmen undι ohne vom Gegenstand der Erfindung abzuweichen, zahlreiche Veränderungen und Modifizierungen der Erfindung durchführen, um,sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   (a) mit einem Alkylierungs- oder Carbamylierungsmittel zum entsprechenden N-alkylierten oder N-carbamylierten Orgotein mit einer Alkyl- bzw. Carbamylgruppe an
   mindestens einer der Lysin- £ -Amino-Gruppen^oder

   (b) mit einem Veresterungsmittel zu einem veresterten
   Orgotein umsetzt, in dem bis zu 10 freie Carboxylgruppen des Orgotein-Proteinmoleküls verestert sind.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Orgotein Rinder-Orgotein umsetzt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Orgotein mit einem Alkylierungsmittel unter
   alkylierenden Bedingungen umsetzt, bei denen ein
   alkyliertes Orgotein mit mindestens 10 alkylierten

   £,-Aminogruppen je Molekül hergestellt wird.

   4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,
   daß man Alkylierungsbedingungen verwendet, bei denen
   ein alkyliertes Orgotein mit mindestens 18 alkylierten

   C- Aminogruppen je Molekül hergestellt wird.

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   5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,

   daß man als Alkylierungsmittel ein primäres Dialkylsulfat, ein aktiviertes Alkylhalogenid, eine aktivierte Vinylverbindung oder ein reduzierendes Alkylierungsmittel verwendet .

   6. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,

   daß man als Alkylierungsmittel Dialkylsulfat verwendet, in dem der Alkylrest jeweils 1-4 Kohlenstoffatome besitzt.

   7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

   daß man als Alkylierungsmittel Dimethylsulfat verwendet.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Orgotein mit einem Carbamylierungsmittel unter Reaktionsbedingungen umsetzt, bei denen ein carbamyliertes Orgotein mit mindestens 2 carbamylierten £ -Amino-Gruppen je Molekül hergestellt wird.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Reaktionsbedingungen verwendet,bei denen ein carbamyliertes Orgotein mit etwa 5-10 carbamylierten £ -Amino-Gruppen je Molekül hergestellt wird.

   10. Verfahren nach Anspruch 8,dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbamylierungsmittel ein Alkalimetallcyanat,

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   Alkylisocyanat, Alkylisothiocyanat, Arylisocyanat oder ein Arylisothiocyanat verwendet.

   11. Verfahren nach Anspruch 10,dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbamylierungsmittel ein Alkalimetallcyanat,

   Alkylisocyanat oder ein Alkylisothiocyanat einsetzt,

   bis zu wobei der Alkylrest/12 Kohlenstoffatome enthält.

   12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbamylierungsmittel ein Alkylisocyanat, in dem der Alkylrest 1-8 Kohlenstoffatome enthält, oder ein Alkalimetallcyanat einsetzt.

   13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carbamylierungsmittel ein Alkylisothiocyanat mit einem Alkylrest von 1-8 Kohlenstoffatomen einsetzt.

   14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Orgotein in einer wässrigen Lösung mit einem Veresterungsmittel umsetzt, das Carbonsäuregruppen in wässriger oder Puffer-Lösung verestert.

   15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Veresterungsmittel Dimethyl- oder Diäthylsulfat, ein Azid der Formel NgCHgCOX, in der X eine OCH,-, OC₂H-, NH₂- oder eine NHCH₂ CONHg-Gruppe bedeutet, oder einen weiteren Ester oder ein weiteres Amid der Diazoessigsäure, denen eine Reaktionsfähige Gruppe fehlt _s einsetzt.

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   16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Veresterungsmittel ein Mittel einsetzt, das Alkylester mit 1-4 Kohlenstoffatomen bildet.

   17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,

   daß man als Veresterungsmittel ein Mittel einsetzt, das Methylester bildet.

   18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Veresterungsmittel Dimethylsulfat einsetzt.

   il9j. Orgotein-Derivat, und zwar ein alkyliertes Orgotein,

   in welchem sich ein Alkylrest mit 1-8 Kohlenstoffatomen an mindestens einer Lysin- £ -Amino-Gruppe befindet, ein N-carbamyliertes Orgotein, in welchem sich eine Carbamylgruppe an mindestens einer Lysin- £ -Amino-Gruppe befindet, oder ein verestertes Orgotein, in welchem bis zu 10 freie Carboxylgruppen des Orgotein-Proteinmoleküls verestert sind.

   20. Orgotein-Derivat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Orgotein ein Rinder-Orgotein ist.

   21. Alkyliertes Orgotein nach Anspruch 19 oder 20^ dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 10 alkylierte £-Amino-Gruppen je Molekül besitzt.

   22. Alkyliertes Orgotein nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 18 alkylierte

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   €-Ämino-Gruppen je Molekül besitzt.

   23. Alkyliertes Orgotein nach einem der Ansprüche 19-22, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest 1-4 Kohlenstoffatome enthält.

   24. Alkyliertes Orgotein nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest die Methylgruppe bedeutet.

   25. Carbamyliertes Orgotein nach Anspruch I9, dadurch ge-

   e *■

   kennzeichnet, daß es mindestensizwei carbamylierte £-Amino-Gruppen je Molekül enthält.

   26. Carbamyliertes Orgotein nach Anspruch 19 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 6 bis 10 carbamylierte

   8-Amino-Gruppen je Molekül enthält.

   27. Carbamyliertes Orgotein nach Anspruch 19, 25 oder 26,

   dadurch gekennzeichnet, daß die carbamylierte Amino-Gruppe

   X das

   die Formel -NHCNHR besitzt, in der X/Sauerstoff- oder

   Schwefelatom bedeutet und R einen Alkylrest mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen oder, falls X das Sauerstoffatom bedeutet, auch ein Wasserstoffatom darstellt.

   28. Carbamyliertes Orgotein nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet, daß X das Sauerstoffatom und R einen Alkylrest mit 1-8 Kohlenstoffatomen oder das Wasserstoffatom darstellt.

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   29. Carbamyliertes Orgotein nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet, daß X das Schwefelatom und R einen Alkylrest mit 1-8 Kohlenstoffatomen darstellt.

   30. Verestertes Orgotein nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß es bis zu 8 veresterte Carboxylgruppen je Molekül enthält.

   31. Verestertes Orgotein nach Anspruch 19 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Estergruppen Alkylester mit 1-4 Kohlenstoffatomen bedeuten.

   32. Verestertes Orgotein nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Estergruppen Methylester bedeuten.

   33· Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet,

   daß es im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger eine wirksame Menge eines Orgotein-Derivats nach Anspruch 19 enthält.

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