NO753291L

NO753291L -

Info

Publication number: NO753291L
Application number: NO753291A
Authority: NO
Inventors: C Keller-Juslen; M Kuhn; W Pache
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1974-10-07
Filing date: 1975-09-29
Publication date: 1976-04-08
Also published as: DK438475A; IL48248A0; AU8552375A; FR2287235A1; IE43592B1; FI752696A; GB1527494A; BE834289A; IE43592L; FR2287235B1; SE7510899L; AU508075B2; NL7511649A; JPS5195189A

Abstract

Fremgangsmåte for fremstilling av nye_antibiotika.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av nye antibiotika, som i det følgende betegnes med SL 7810/F,

SL 7810/F-II og SL 7810/F-III, samt deres tetrahydroderivater.

Det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av de nye antibiotika og deres tetrahydroderivater,

er at

a) en stamme av skekten aspergillus rugulosus Thorn & Raper dyrkes i nærvær av et næringsmedium, eller b) for fremstilling av tetrahydroderivatene av disse antibiotika underkastes de en hydrogenering.

De nye antibiotika og deres tetrahydroderivater har følgende karakteristika: SL 7810/ F

Fargeløst amorft pulver med smeltepunkt 160 - 163°C (spalting);

/"o7p° 48,3° '(c = 0,806 i;;metanol).

Analyse: Funnet C 57,3 H 7,9 N 9,2 0 25,2 %

Molvekt (bestemt osmometrisk i etanol): 1190

UV^spektrum i metanol : Amaks= 194 nm, log £' = 1,98

(se fig. 1) 276 nm, log = 0,14

IR-spektrum i nujol (se fig. 2)

<->1H-NMR i DMSO (100 MHz, tetrametylsilan som intern standard)

/"se fig. 3/.

Hydrolysen av SL 7810/F med 6 N saltsyre (4 timer ved 110°C under N^-atmosfære) gir som hydrolyseprodukt blant annet linolsyre.

(Løselighet, stabilitet, ty-nnskik tkromatogram og MIC-verdier se nedenfor).

SL 7810/ F- II

Fargeløst amorft pulver med smeltepunkt 158 - 160°C (spalting);

/a7p° =^7,9° (c = 0,81 i metanol).

Analyse: Funnet C 58,5 H 8,0 N 9,3 0 23,8 %

Mol vekt (bestemt osmometrisk i metanol): 1018

UV-spektrum i metanol: Å-maks 193 nm, log = 1,95

(se fig. 4) 278 nm, log^<*>0,18

TR-spektrum i nujol (se fig. 5).

<\>H-NMR-spektrum i DMSO (100 MHz, tetrametylsilan som intern standard) /se fig. 6/.

(Løselighet, stabilitet, tynnskiktkromatogram og MIC-verdier se nedenfor.)

SL 7810/F-IIX

Fargeløst amorft.pulver med smeltepunkt 164 - 168°C (spalting);

/a7p° b -53,0° (c = 1,00 i metanol).

Analyse: Funnet C 61,1 H 8,0 N 9,0 0 22,0 %

UV-spektrum i metanol: /^maks 193 nm, log £' = 1,98 (se fig. 7) 278 nm, log = 0,24

IR-spektrum i nujol (se fig. 8).

H-NMR-spektrum'i DMSO (100 MH&, tetrametyl sil an som intern standard) /se fig. 9/.

(Løselighet, stabilitet, tynnskiktkromatogram og MIC-verdier se nedenfor).

Tetrahydro- SL 7810/ F

Fargeløst amorft pulver med smeltepunkt 173 - 178°C (spalting); etter krystal1isering fra etanol-vann (95 : 5) smeltepunkt 190 - 205°C / 210 - 212°C (spalting);

A7d° = -47>8° (c = 0,984 i metanol).

Analyse: Funnet C 56,8 H 8,0 N 9,0 0 25,5 %

UV-spektrum i metanol: ^ ma)<;s 194 nm, log £' = 1,85

(se fig. 10) 277 nm, log =0,09

227 (skulder)

log =1,00

IR-spektrum i nujol (se fig. 11)

H-NMR-spektrum i DMSO (100 MHz, tetrametylsilah som intern standard ) £se fig. 127.

<13>C-NMR-spektrum i CD^OD med tetrametylsil an. som intern standard (se tabell 1)

(Løselighet, stabilitét, tynnskiktkromatogram og MIC-verdier se nedenfor).

Hydrolysen av tetrahydro-SL 7810/F med 6 N saltsyre (4 timer ved 110°C under N^-atmosfære) gir som hydrolyseprodukt blandt annet stearinsyré.

Tetrahydro- SL 7810/ F- II

Fargeløst amorft pulver med smeltepunkt 160 - 163°C ( spalting); /o7d° = -41,4° (c « 0,823 i metanol).

Analyse: Funnet C 58,7 H 8,1 N 9,6 0 23,7 %

UV-spektrum i metanol ^ maks<1>94 nm, log £, ' = 1,90

(se fig. 13) 278 nm, log £, ' = 0,25

227 (skulder)

log £' = 1,07

IR-spektrum i nujol (se fig. 14)

\H^NMR-spektrum i DMSO (90 MHz, tetrametylsil.an -som intern standard) /se fig. 15.7.

13

C-NMR-spektrum i CD^OD med tetrametyls.ilan som intern standard (se tabell 2).

(Løselighet, stabilitet, tynnskiktkromatogram og MIC-verdier se nedenfor).

Tetrahydro- SL 7810/ F- III Fargeløst amorft pulver med smeltepunkt 175 - 180°C (spalting); /bc7p°= -41,5° (c = 1,094 i metanol).

Analyse: Funnet C 60,5 H8,5 N9,2 0 21,9 %-

UV-spektrum i metanol: A maks 193 nm, log £11,93

(se fig. 16) 278 nm, log = 0,19

224 nm, log 1,01 (skulder)

IR-spektrum i nujol (se fig. 17)..

H-NMR-spektrum i DMSO (100 MHz, tetrametylsilan som intern standard) /se fig. 18J7.

(Løselighet, stabilitet, tynnskiktkromatogram og MIC-verdier se nedenfor).

Løselighet

Antibiotikan SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III såvel som deres tetrahydroderivater er ved romtemperatur lett løselige i metanol og etanol , tungt løselige i kloroform, eter, petroleter, heksan og praktisk uoppløselig i vann.

Stabilitet

De nye antibiotika SL 78.10/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III er i nærvær av.lys og spesielt i luften lite stabile og spaltes. Spaltingen merkes også ved oppvarming over 50°C. Hydrogeneringen til tetrahydroderivatene eliminerer i stor utstrekning ustabiliteten.

Karakteristisk for allé tre antibiotika og deres tetrahydroderivater er ustabiliteten under basiske betingelser. Ved en pH over 8 opptrer omdannelse til spaltingsprodukter som biologisk bare er svakt aktive henhv. ikke lenger er aktive.

Tynnskik tkromatogram

Analyse skjer på kiselgel merk 60-plater (0,25 mm skikttykkelse). Med de etterfølgende elueringsmidler kan følgende R^-verdier konstateres:

Antibiotikan SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III viser ved denne bestemmelser de samme R^-verdier som deres tetrahydroderivater.

Ved fremkalling med en 0,2% Ce( SO^)2~løsning i 50% svovelsyre som dusjreagens kan følgende flekker (etter oppvarming ved, 130°C) påvises:

For deteksjon av antibiotikan SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III kan også joddamp anvendes.

Skjelningen mellom de tre antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III fra deres tetrahydroderivater kan også skje tynnskikt-kromatografisk på kiselgel -GF 254-plater (0,3 mm skikttykkelse), idet kiselgelen er blandet med 3% AgNO^. Med kloroform-metanol-vann (70 : 25 : 5) som elueringsmiddel kan det med 40ifsubstans konstateres følgende R^-verdier:

For påvisning av substansene dusjes med vanillin-svovelsyre.

Ved oppvarming til 120 - 130°C opptrer gulbrune fargeflekker for tetrahydroforbindelsene. De ikke-hydrogenerte forbindelser viser en rødaktig farging.

Fremgangsmåten a) lar seg gjennomføre på for fermenterende fremstilling av antibiotika kjente måter. En kultur derav ble deponert i United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Diviåon), Peoria, 111., USA og står til disposisjon for offentligheten under betegnelsen NRRL 8039. Foretrukket anvendes stammen NRRL 8039.

Imidlertid kan også stammer anvendes som er utvunnet fra utgangsstammen aspergillus rugulosus Thorn & Raper ved behandling med mutagene substanser eller stråler eller ved seleksjon.

Karakteristikum for stammen NRRL 8039

Den nye stamme NRRL 8039 av aspergillus rugulosus Thorn & Raper ble isolert fra en jordprøve isolert på Jaum-passet i Sveits og lar seg på grunn av sine morftologiske trekk ved hjelp av aspergillus-monografien av K.B. Raper & D.I. Fennell (THE GENUS ASPERGILLUS: The Williams & Wilkings Company Baltimore, 1965, side 686) inordne

.under Aspergillus rugulosus Thom_':& Raper.

Stammen NRRL 8039 vokser på Agarnæringssubstrat mellom- 15 og 50°C, idet vekstoptimum ligger mellom 35 og 42°C. På Czapek-Dox-Agar vokser stammen NRRL 8039 heller langsomt, kulturene tilsvarer habituelt tilnærmet artsbeskrivel sen (Raper & Fennell, 1965). : 20 dager gamle kolonier er sterkt rynket og det grå, fløyel saktige luftmycel er grått, pigmentert lysebrunt til brunfiolett. Koloni-kanten blir ved lavere inkubasjonstemperaturer(£eks. 18 - 27°C) hvi t, ved ./høyere temperaturer (f.eks. 33 - 45°C) synes denne gulbrun. Baksiden av kolonien blir ved lavere inkubasjons temper aturer gulaktig, ved høyere temperaturer dannes et fiolett pigment og utskilles i agaren. Også etter 20-dagers inkubasjon på Czapek-Dox-Agar dannes ingen Cleistothecier og bare ved høyere inkubasjonstemperaturer enkle men forkrøblede konidiebærere.

Betydelig hurtigere og bedre utvikles, stammen NRRL 8039 på 2% malt-dextrose-agar, hvor allerede etter 20-dagers inkubasjon ved 27°C hoved- og bifruktformene dannes i betraktelige mengder og modnes. Koloniene er høyst ganske svakt, men oftest overhode: ikke rynket.og det fLøyelsaktige luftmycel er ensartet gulaktig farget. Baksiden av kolonien er ved lavere inkubasjonstemperaturer gul og ved høyere temperaturer lysebrun.

Den på 2% mali-dextrose-agar voksende stamme NRRL 8039 viser små mørkegrønne konidiehoder, som oftest opptrer i mindre grupper i og på kanten av kolonien.

Morftologien og dimensjonen av alle strukturer av bifruktformene stemmer godt overens med den nevnte artsbeskrivelse av aspergillus rugulosus. Med hensyn til hovedfruktformen består derimot noen forskjeller i forhold til artsbeskrivel sen.: således blir de kuleaktige Cleistothecier som utvikler seg i Slere lag av det fløyelsaktige luftmycel i stort antall betydelig mindre enn det er angitt for arten (50.- 80 ju i diameter i forhold til 225 - 350 /u) . Omhyllingscellene er også glassaktige, mens de.ved denne art skulle være mørkebrune. En god overensstemmelse med artsbeskrivelsen består derimot i det ar tka-rak ter is tiske trekk med de. f iolettorangerøde, linseformede 4,1 - 5,0 x 3,4 - 3,8 p store ascos<p>orer, hvis overflate-er mer eller mindre tydelig rynket og furet og hvis to parallelt anordnede ekvatorsummer er 0,4 - 0,7|U brede. ).

Den nye stamme NRRL 8039 lar seg dyrke på forskjellige nærings- ' substrater med de vanlige næringsstoffer, f.eks. som beskrevet i det følgende 'eksempel.

De nye antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III kan man fremstille på den måte at et flytende medium podes med en spore-eller mycel suspensjon av iammen NRRL 8039 og kulturen innkuberes i 2 - 4 dager, foretrukket 3 dager, ved 27°C. Dyrkingen skjer under aerobe betingelser, enten i overflate- eller submerskul tur. Så snart<-'en maksimal mengde av antibiotika er produsert (kan konstateres ved påvisningen av aktiviteten overfor Candida albicans) isoleres disse fra dyrkingsbuliongen etter i og for seg kjente metoder, f.eks. som beskrevet i det følgende eksempel, idet det som løsningsmiddeldestédet for etyl acetat også anvendes andre organiske løsningsmidler, som f.eks. butylacetat eller butanol.

For separasjon fra fettaktige følgestoffer fra den rå ekstrakt kan det som første operasjon gjennomføres en filtrering over en kiselgel-kolonne, idet omtrent den 4 - 5-dobbelte vek.tmengde kiselgel, regnet på ekstraktmengden, anvendes. Elueringen skjer med kloroform-metanolblandinger (se det etterfølgende eksempel).

En annen fremgangsmåte kan f .eks. gjennomføres på følgende måte: Fettaktige følgestoffer og andre biprodukter fraskilles ved passende ' fel1ingsreaksjoner. For dette utgnis etylacetatekstrakten med petroleter, idet de overfor kandidå/albikans aktive antibiotika forblir i den uløselige del. Denne rest oppslemmes imetanol og etter frafil trering av uoppløselige inaktive andeler inndampes filtratet i vakuum. Dette material løses i metanol og den klare løsning til.dryppes til den^.lO-dobbel te mengde etylacetat. Fellingen inneholder SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III ved siden av inaktive følgestoffer. Den ytterligere rensing og oppdeling av komponentene fra blandingen skjer nå ved hjelp av i;.og for seg kj~ente kromatografiske metoder, hvorved gelkromatografering på . "Séphadex LH 20" og kromatografering pa kiselgel egner seg meget godt. Disse metoder anvendes i kombinasjon og for rensing av de enkelte komponenter. Således kromatograferes f.eks. et av de ovenfor beskrevne råprodukter først på "Séphadex LH 20" med metanol, idet de tre antibiotika ved elueringen opptrer i de samme fraksjoner.

De forenede aktive fraksjoner kromatograferes deretter på kiselgel, kornstørrelsen 0,06 - 0,2 mm, For eluéring kan anvendes enten kloroform, som tilsettes stigende mengder metanol, men også'en kloroform-metanol-vannblanding (80 : 17,5 : 2) kan anvendes gjennomgående. Tilsvarende R^-verdiene i tynnskiktkromatogrammet erholdes

ved elueringen fra kiselgelkolonnene først SL 7810/F-III,

deretter SL 7810/F-II og til sist SL 7810/F. For oppdeling av blandingsfraksjoner, spesielt SL 7810/F-II og SL 7810/F-III kromatograferes eventuelt lere ganger på den 250- til 400- .i dobbelte mengde kiselgel. De overfor kandida albikans aktive og i tynnskiktkromatogram rene fraksjoner tilsvarer R^-verdiene for angjeldende antibiotika.

Fremgangsmåten b) lar seg også gjennomføre etter i og for seg

kjente metoder, f . eks . \ved_ Katalytisk hydrogenering .

Som løsningsmiddel kommer foretrukket lavere alifatiske alkoholer, som f.eks. metanol el ler.</>etanol, på tale. Hydrogeneringen skjer, hensiktsmessig i .nøytralt eller svakt surt område, f.eks. i nærvær av svake'organiske syrer som eddiksyre. Hydrogeneringen skjer ved ■ temperaturer mellom 10 og 40°C, foretrukket mellom 20 og 25°C. Hydrogeneringen skjer hensiktsmessig under atmosfæretrykk eller" svakt forhøyet trykk, i.; nær vær av en platinakatalysator, som f.eks. PtC^, som forhydrogeneres til Pt, eller foretrukket en paladium-katal<c>ysator, som f.eks. palladium på kull eller bariumsul f at. Hydrogeneringen skjer til fullstendig hydrogenopptagning. For dette gås det ut fra at hydrogenopptagningen tilsvarer 2 mol pr. mol antibiotikum SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III med molvekt fra ca. 1000 til 1200. Ved hydrogenerte derivater av de nevnte antibiotika^kunne det i NMR-spektrum ikke påvises noen protoner som tyder på linolsyre.

De erholdte hydrogenerte derivater av antibiotikaene SL 7810/F,

SL 7810/F-II og SL 7810/F-III renses om nødvendig på i og for seg kjent måte. Foretrukket egner seg for dette kromatogragering på "Séphadex LH 20" (eluering med metanol) og/eller kromatografering på finkornet kiselgel, idet det hensiktsmessig elueres med kloroform metanolblandinger (9:1) til (3:1) eller med kloroform-metanolblandinger under tilsetning av en liten mengde vann.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også gjæringsløsninger, som erholdes ved dyrking av en stamme av slekten aspergillus rugulosus Thorn & Raper som produserer et av antibiotikaene-; SL 7810/F, SL 7810/F II og/eller SL 7810/F-III.

De nye antibiotika og deres tetrahydroderivater'viser interessante farmakologiske egenskaper.

For biologisk karakterisering av antibiotikaene > SL 7810/F, SL 7810/F-II, SL 7810/F-III og deres tetrahydroderivater tjener deres virkningsspektrum. Mens samtlige forbindelser ved de vanlige testbetingelser er uvirksomme mot grampositive og gram-negative bakterier som f.eks. staphylokokkus aureus og escherichia koli, viser de utpregende virkninger mot gjær- og sopp-arter.

I den etterfølgende tabell er de minste hemmende konsentrasjoner

mot forskjellige gjær- og sopp-arter oppført.. Den for dette anvendte .rekke-f ortynningsprøve ble gjennomført på kjent måte med de angitte teststammer. Inkubasjonen ved rekke-fortynningstesten skjedde i et mal tekstrakt-medium (2%) med pH-4,4 - 4,7 ved 27 til 37°C alt etter temperaturoptimum for den angjeldende teststamme. Bedømmelsen skjedde etter 72 timers inkubasjonstid. Teststammene

er deponert i mykoteket i firma Sandoz og står der til disposisjon.

Som det fremgår av de ovenstående resultater (MIC-verdier) viser

de nevnte forbindelser en virksomhet mot bestemte sopparter,

spesielt mot candida albicans. Virkningen mot candida albicans kan også bestemmes in vivo ved følgende forsøk:.

1. Eksperimentell tarminfeksjon med candida albikans

A 124 i hunrimus

.--.Ved denne metode forstyrres likevekten i den'normale tarmflora til beste for peroralt tilført candida albicans^124. Ved den bredspektrum-antibiotiske behandling opptrer undertrykkelse av den bakterielle flora og dermed til selektiv formering av candida-s-.opp. ar tene i tarmen i hunnmusene. De i tarmen dyrkede candida-organismer utskilles med avføringen (, kimtall 10 4 /g avføring). regelmessig i løpet av minst tre uker.

Material og metode

Forsøksdyr:

Det anvendes hunn-NMRI-mus som var foret ad libitum med musepellets og som hadde en vekt på 18 - 24 g. I drikkevannet var det tilsatt

1 mg/ml streptomycin.

5l22!syl££i!22_22_in^'e'<:s jon •

Tarminfeksjonen av hunnmusene med candida albicans ble gjennomført

på følgende.måte:

Fra en i flytende nitrogen oppbevart og opptint ampulle ble det fremstilt en fortynning som inneholdt 5 x 10 7 kimer i 0,25 ml.

Det ble så ° i det. enkelte tilfelle tilført .5 x 10 7 kim pr. mus peroralt Etter infeksjonen ble dyrene fordelt enkeltvis i bur (6 eller 10

dyr som holdes enkeltvis utgjør et kollektiv).

!5i!I!;!:^Iikestemmelse_i avfØ ri n9 (KZ/g avføring) :

Forsøksdyrene ble den 6. dag - henhv. på det tidspunkt hvor kimtallet i avføringen skal bestemmes,vsatt i sterile makrolonbur og avføring i 4 timer ble samlet og.veid. Deretter ble det i en NaCl-løsning fremstilt en suspensjon på 10 — 1 og fortynnet til 10 —7. Deretter ble kimene telt i platemetoden med saboraud-agar, idet det pr. ml SAB-agar ble tilsatt 50 yug streptomycin. Ved streptomycin-tilsetningen i agaren ble veksten av de øvrige tarmkimer utskjaltet og det ble på agarplaten erholdt en renkultur av sopparten candida albicans.

Dosering_og behandlingsmåte:

Den høyeste tilførte dose av enttestsubstans retter seg generelt etter dosen tolerata maksima. Den utgjør høyst 300 mg/kg kroppsvekt for mus. En ytterligere dosering utgjør 100 mg/kg kroppsvekt.

Disse daglige tilførselsdoser, tilføres, begynnende med dagen for infeksjonen, peroralt i 5 dager. Dagsdosene fordeles på hver tre enkeltdoser og tilføres peroralt i et volum på 0,25 ml (ved vann-uoppløselige substanser tjener 0,2% KMC + 0,2% "Tween 80" som suspensjonsformidlere) til 20 g mus.

Hvert infeksjonsforsøk ble komplettert ved medføring av 10 kontrolldyr, som erholdt en standardsubstans. Som standardsubstans ble i dette infeksjonsforsøk tilført "Nystatin" i dagsdoser på 300 og 100 mg/kg kroppsvekt peroralt. Tilførselen av disse doser skjedde som ved testsubstansen. Ved en p.o. tilført dose på 300 mg/kg kroppsvekt "Nystatin" er det en dag etter avsluttet behandling ikke mulig å påvise noen kimer av Candida albicans i avføringen, mens 100 mg/kg kroppsvekt "Nystatin" bevirker en kimreduksjon på å minst to tierpotenser, i noen tilfeller også allerede en fullstendig eliminering av disse kim.

For hver dosering foreligger en gruppe på 6 dyr hver, som holdes enkeltvis i bur. 6 ytterligere dyr erholder som alle andre også streptomycin i drikkevannet og løsningsmidlet uten substans som kontroll. Dyrene holdes likeledes enkeltvis.

Bestemmelse og bedømmelse:

Ved bestemmelsen av.et slikt forsøk ble kimtallreduksjoner henhv. kim-elimineringer bestemt og sammenliknet med de ubehandlede kontrolldyr henhv. sammenliknet' med standardsubstansenes kontrolldyr

og beregnet i prosent.

2. Vaginal Candida albicans- infeksjon i rotter

(stamme Al24)

Den vaginale mykose i hunnrotter utgjør en slimhud-infeksjon. Ved ovariektomi og etterfølgende hormon til setning indusert' varig brunst i den kjønnsmodne rotte kan det frembringes en eksperimentell vaginal mykose. Denne lokale infeksjon omfatter omtrent bare de ytterste overf1ateskikt av vaginal slimhuden. Véd avstrykninger kan dens forløp kontrolleres nøye. Den gode reproduserbarhet og det ensartede forløp av infeksjonene oppfyller alle de krav som er forutsetningen for letingen etter et nytt virkestoff.

Forsøksdyr^

Det ble anvendt wistar-ftunnrotter med en vekt på ca. 200 g. Dyrene fikk mat og vann ad libitum. For hver forsø.ksgruppe ble

det anvendt 10 dyr.

Forberedelse og gjennomføring av infeksjonen:

Under "N.embutal-"-narkose ble dyrene ovari ek tome. I'; En dag etter ovariektomien ble 100^ug østradiol tilført i /en_ mengde på 0,5 ml sesamolje subkutantpr. rotte. En uke etter hormontilsetningen befannt dyrene seg i østrustil stand idet dette lett lot seg påvise ved hjelp av avstrykninger og metylenblåttfarging i mikroskop..

I denne tilstand av varigc:bruns t kan det i vaginal innholdet knapt finnes leu.coeyter, idet dette er en fordel for manifestas jon' av en infeksjon, da f renimedkimer som trenger inn i vagina ikke -med en gapg fagocyteres av leucocytene. 7 dager etter ovariektomien skjer infeksjonen. Med en tuberkulin-sprøyte og slundsonde tilføres candida albicanskimer i en mengde på 0,05 ml eller 10^ kimer pr. rotte intravaginal.

Fremstillingen av inokulum skjer etter vanlige metoder og oppbevares

1 flytende nitrogen. Kimene anvendes direkte fra etter hurtig opptining for infeksjonen. Forløpet av den lokale vaginalmykose kontrolleres 3., 7., 10., 15. og 20. dag etter infeksjonen. Vaginal innhold strykes ut med en platinaring på str eptomycinholdig '" sabouraud-agar plate (20 ^ug/ml) . Parallelt fremstilles med vaginal-innhold avstrykninger som farges for grampåvisning og undersøkes under mikroskopet for tilstedeværelse av seudomycel. Etter 2 dagers dyrking av SAB-platene (rør) ved 30°C bedømmes disse semi-kvantitativt. Alt etter veksten av candida albicanskolonier. kan man tale om en høygradig (hurtigvekst), måtelig (tellbare kolonier) og lavgradig (enkelt-vekst av kolonier av candida albicans) infeksjon.

Beihandl ing_og_doseri ng_:

Den lokale behandling av den eksperimentelle vagina-kadidasis begynner 24 timer etter infeksjonen. Det gis intravaginal-terapi 2 ganger daglig (formiddag og ettermiddag) 5 etterfølgende dager.

Som enkeltdose av en testsubstans tilføres i det enkelte tilfelle

0,5 ml av en 1,5% og en 5% salve pr. rotte.

Substansene forarbeides i en blanding av 2 deler•polyetylenglykol

300 og 1 del polyetylenglykol 1500 "salvebasis" og tilføres intravaginalt.

Hvert infeksjonsforsøk ble komplettert ved medføring av en gruppe

på 10 dyr som kontrolldyr, som fikk en kjent standardsubstans. Som standardsubstans ble anvendt"Nystatin" som'1,5% salve henhv. alternativt "Clotrimazol" som 1,5% salve. 10 ytterligere dyr fikk salvebasis uten substans og en gruppe på 10 dyr tjener som infeksjons-kontrol1.

De nye antibiotika og deres tetrahydroderivater egner seg derfor for behandling av de ved Candida albicans fremkalte sykdommer.

Vanlig oppnås tilfredsstillende resultater,.med en daglig dose på omtrent 100 til 1500 mg. Denne dose kan om nødvendig tilføres i

2 til 3 porsjoner på 30 til 750 mg.

Som legemiddel kan de nye antibiotika og deres tetrahydroderivater tilføres alene eller i passende preparatform sammen med uorganiske eller organiske, farmakologisk indifferente hjelpestoffer. F.eks. anvendes de som b'estanddel av en salve, idet konsentrasjonen i salven kan utgjøre ca. 5 til 130 mg virkestoff pr. gram salve. Andre preparatformer er tablettei; kapsler og løsninger.

I de etterfølgende eksempeler som skal illustrere oppfinnelsen,

er alle temperaturangivelser i grader celcius. Alle angitte forhold er på volumbasis.

Eksempel 1:

En sporesuspensjon som tjener for poding av næringsløsningen, fremstilles av en kultur av stammen NRRL 8039. For dette podes 200 ml næringsagar med følgende sammensetning:

Etter 10 'dagers inkubasjon ved- 2.7°C suspenderes de dannede sporer

i 200 ml sterilt vann og et ståi-gjæringskar som inneholder 50'liter av følgende næringsløsning, podes dermed:

B så vel som 10% polypropylenglykol 2020 (Chem. Werke Huls, Mari

BRD)

1 liter av-ionisert vann.

Denne gjæringsbeholder ble inkubert under omrøring i 42 timer ved 27°C, idet luftingen utgjorde 1 liter luft/min/liter medium, ved en omrøringsfasthet på 250 omdr./min..

Denne kultur tjener som forkultur for 500 liter.^gjæringskaret -med

den samme næringsløsning som ble inkubert dermed i 66 timer ved 27°C. Beluftningen utgjorde på nytt 1 liter luft/min./liter medium, men omrøringshastigheten utgjorde bare 150 omdr./min. Etter 66 timers inkubasjonstid ble dyrkingsbuliongen høstet og opparbeidet på 'følgende måte: 450 liter dyrkingsbuliong ble innstilt til pH 7,0 med.2 N saltsyre, tilsatt 500 liter etylacetat og homogenisert med en "Dispax"-reaktor. Deretter ble den organiske fase skilt fra buliongen.med"separator og vasket med 50 liter vann. Dette ekstråksjonsskritt

ble gjentatt to ganger. De erholdte 3 ekstrakter ble forenet og inndampet til tørrhet under vakuum (vannringpumpe)' ved 20 til 4\0°C.

Dette material fraksjoneres på den 4-dobbelte mengde kiselgel'"Merk 60" (kornstørrelse 0,063 - 0,20 mm)..Eluatene.med kloroform + 10% metanol .og kloroform + 20% metanol inneholdt inaktive følge-substanser. Kromatografikolonnen ble deretter eluert med kloroform-metanol (1 : 1) og fraksjonene med aktivitet overfor Candida albicans''ble forenet og inndampet til .tørrhet. Ved kromatograf er ing av 16,4 g aktivt material på;1 kg kiselgel "Merk 60" (kornstørrel se 0,063 - 0,20 mm) og eluering med kloroform + 20% metanol ble det først ebholdt blandingsfraksjoner av SL 7810/F-II og SL 7810/F-III. Den^^etterfølgende eluering med klorofor m + 30% metanol gav fraksjoner

-med SL 7810/F som hovedkomponent. Etter gel filtrering av SL 7810/F fraksjoner (8,1 g) på 1,2 kg "Séphadex LH 20" med metanol ble SL 7810/F utvunnet i tilnærmet ren form. Dette preparat ble åsøst i aceton under oppvarming og den klare løsning inndampes til é/4 av volumet. Etter 3 timers henstand ved -15°G frafiltreres det dannede

bunnfall og tørres etter vasking med aceton og eter i 24 tåmer ved romtemperatur over & 2®5 ^ høyvakuum. SL 7810/F erholdes som fargeløst pulver med smeltepunkt 160 - 163°C (spalting).

Ved fortsatt kromatografering av de aktive blandingsfraksjoner av SL 7810/F-II og SL 7810/F-III .fra den ovennevnte kiselgelkromato-grafering kunne de to atatibiotika isoleres. For dette løses materialet (2,5 g) i kloroform + 20% metanol og løsningen ble absorbert på en kolonne med 1 kg kiselgel, som var behandlet med den samme løsningsmiddelblanding. Elueringen skjedde gjennomgående med kloroform + 20% metanol, idet først overveiende SL 7810/F-III elueres og deretter overveiende;SL 7810/F-II. For utvinning av rent SL 7810/F-III løses de inndampede blandingsfKaksjoner (0,75 g) som inneholder dette antibiotikum, i kloroform + 10% metanol og løsningen, adsorberes analogt med det som tidligere er beskrevet på 1 kg kiselgel "Merk". Elueringen ved kloroform + 10% metanol til 15% metanol gav det sterkt anrikede material av SL 7810/F-III. Etter Éjelf il trering (0,55 g) på 500 g "Séphadex LH 20" med metanol erholdes rent SL 7810/F-III: Fargeløst amorft pulver med smeltepunkt 164 - 168°C (spalting).

Fjor isolering av SL 7810/F-II løses blandingsf raks j onene (l,7.£.§) som inneholder SL 7810/F-II i kloroform + 20% metanol og denne løsning adsorberes på en medden samme løsnåmgsmiddelblancling behandlede kolonne med 1 kg kiselgel. Elueringen med kloroform + 20% metanol gir steEkt anrikede fraksjoner av SL 7810/F-II. Den etterfølgende gelfiltreringe(1,2 g) på 1,2 kg ^Séphadex LH 20" med metanol gir rent SL 7810/F-II, et amorft pulver med smeltepunkt '158 / 160°C (spalting).

Eksempel 2: Tetrahydro- SL 7810/ F

En suspensjon av 1 g palladiumkull (10% Pd) i 250 ml alkohol eller 250 ml alkohol-iseddik (l : 1) forhydrogeneres i 30 min. Deretter tilsettes en løsning av 5 g SL 7810/F i 50 ml alkohol-iseddik

(1 : 1). Etter 3 timers hydrogenering ved 20°C under atmosfæretrykk fraskilles katalysatoren ved filtrering og det klare filtrat inndampes i vakuum. Inndampningsresten løses i kloroform-metanol

(l : 1), med denne løsning impregneres 10 g kiselgel 60 "Merk"

(kornstørrelse 0,063 - 0,20 mm) og dette innføres på en kolonne medj500 g kiselgel. Den etterfølgende eluering med kloroform-metanol (4 : l) gir det amorfte hydrogeneringsprodukt som fargeløst pulver med smeltepunkt 173 - 178°C (spalting). Preparatet krystalliseres fra etanol-vann (95 : 5). Smeltepunkt etter tørring i 3 timer i høyvakuum med 50°C: 190 - 205°C / 210 - 212°C (under spalting).

Eksempel 3: Tetrahydro- SL 7810/ F- II

, Fremstillingen skjer analogt med eksempel 2, idet det som utgangs-material anvendes antibiotikum SL 7810/F-II.

Eksempel 4: Tetrahydro- SL 7810/ F- III

Fremstillingen skjer analogt med eksempel1 2, idet det som utgangs-material anvendes antibiotikum SL 7810/F-III, hydrogeneringsvarig-heten var 4 timer og som løsimingsmiddelblanding for kromatograferingen på kiselgel ble det anvendt kloroform-metanol-vann (80 : 17,5 : 2).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av de nye antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II, SL 7810/F-III og detes tetrahydroderivater, karakterisert ved at

a) en stamme av slekten aspergillus rugulosus Thorn & Raper dyrkes i nærvær av et næringsmédium, eller b) et av antibiotika SL 7810/F, SL 7810/F-II og SL 7810/F-III hydrogeneres.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,'' karakterisert ved at det anvendes en stamme som er utvunnet fra utgangsstammen aspergillug. rugulosus Thorn & Raper ved behandling med mutagene substanser eller stråler eller ved seleksjon.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det" som ny stamme av slekten aspergillus rugulosus Thorn & Raper anvendes stammen NRRL 8039.

4. Fermentasjonsløsninger erholdt ved dyrking av en stamme av slekten aspergillus rugulosus Thorn & Raper som produserer antibiotika SLS7810/F og/eller SL 7810/F-II og/eller SL 7810/F-III.