NO343234B1 - Fettsyresammensetning som inneholder DHA og EPA for behandling og/eller forebygging av amyloidose relaterte sykdommer - Google Patents

Abstract

Denne oppfinnelsen vedrører anvendelsen av en fettsyresammensetning som innbefatter minst (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA) for fremstilling av et medisinsk produkt eller et næringsmiddel for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer. Den foreliggende oppfinnelsen vedører også en fremgangsmåte for behandling og/eller forebygging av amyloidose realterte sykdommer, slik som IgA nefropati.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører et nytt medisinsk produkt for behandling og/eller forebygging av amyloidose relaterte sykdommer. Anvendelse av et næringsmiddel eller kosttilskudd for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer er også beskrevet. Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer f.eks. Alzheimers sykdom. Oppfinnelsen er basert på en fettsyresammensetning som innbefatter en kombinasjon av (all-Z omega-3)-5,8,11,14,17-eikosapentaensyre (EPA), og (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA).

Den biologiske funksjonen til et protein avhenger av dets tredimensjonale struktur, som bestemmes av dets aminosyresekvens under proteinfoldeprosessen. Normal folding er nødvendig for vellykket cellefunksjon og er derfor viktig for å opprettholde god helse. Flere typer av sykdommer er funnet der feil proteinfolding (proteinmisfolding) og endringer i konformasjon er hovedårsaken for tilsynekomst og progresjon av sykdommene (1).

Misfolding av proteiner kan føre til dannelse av såkalte fibriller. Proteiner eller proteinfragmenter omdannes fra deres normale løselige form til uløselige fibriller eller plakker, som akkumulerer i et mangfold av organer. Sluttformene til disse aggregatene har ofte et veldefinert patologisk anatomisk utseende kjent som amyloid.

Til tross for omfanget av proteiner involvert med deres unike og karakteristiske naturlige folder, er fibrillene til amyloid hvori de finnes i sykdomstilstandene ekstremt like i deres generelle utseende. Proteiner som er kjent for å ha tilbøyelighet til fibrillære konformasjon hos mennesker, kalt forløperproteiner, utgjør en liste på 21 eksponenter (3) og antallet er økende. Vanligvis utgjøres proteinet i fibrillen av et lite antall aminosyrer på et gjennomsnitt rundt 20-60 som grupperer dem i kategorien polypeptider eller enn proteiner.

Proteiner utgjøres vanligvis av en α-helix og en β-platestruktur. Amyloidfibriller inneholder imidlertid vanligvis β-platestrukturmateriale som kun gir molekylene fysiske egenskaper som er forskjellige fra morproteinet. Mens normale proteiner underkastes en kontinuerlig nedbrytningsprosess med proteolyse, er et svært viktig trekk ved fibriller evnen de har, med en gang de er dannet, og i det alt vesentlige være uforgjengelige under fysiologiske betingelser. Amyloidfibriller domineres av hydrogenbinding mellom amid- og karbonylgruppene i hovedkjeden, eller av spesifikke interaksjoner i sidekjedene, hvilket bestemmer strukturen til normale proteiner. Denne abnorme bindingen indusert ved et stort antall hydrogenbindinger i β-platestrukturen som må avbrytes for å redde polypeptidkjeden fra den aggregerte tilstanden, resulterer i en høy motstand mot degradering og riktig fjerning fra avsetningsvevet.

Mens hydrogenbindingene i α-helixene er mellom sidegrupper i den samme tråden, er bindingene i β-platestrukturer mellom en tråd og en annen. Siden den andre β-tråden kan komme fra forskjellige områder av det samme proteinet eller fra et forskjellig molekyl, stabiliseres så vanligvis dannelse av β-platestrukturer ved proteinoligomerisering eller aggregering. På denne måten selvforbindes det feilfoldete proteinet og blir avsatt i amyloid aggregater i forskjellige organer, hvilket induserer vevsskade og organdysfunksjon. En viktig del av avsetningsprosessen er at en kritisk konsentrasjon av forløperproteinene må være tilstede før fibrilldannelse forekommer (4). Det ser også ut til at så snart en amyloidkjerne er dannet, eskalerer prosessen med aggregering og avsetning av amyloidmaterialet.

Mange av forløperproteinene er ikke direkte tilbøyelige til fibrilldeformering. Når peptidfragmenter av forløperproteinet spaltes fra mormolekylet har imidlertid slike peptider ikke en stabil kuleformet folding for å beskytte mot aggregering.

Proteinfolding er en funksjon av fysiske egenskaper iboende i aminosyresekvensen i kjeden. Disse såkalte ikke-kovalente interaksjonene er svake bindingskrefter men imidlertid betyr det store antallet av individuelle kontakter i proteinet en stor energifaktor som favoriserer normal proteinfolding. Den viktigste kraften er den hydrofobe interaksjonen, men til og med hydrogenbindinger nevnt over er ekstremt viktige. Eksempler på enda svakere krefter er elektrostatiske interaksjoner og van der Waals krefter. Antallet av ikke-kovalente interaksjoner er til en viss grad en funksjon av proteinkjedelengden hvilket betyr at spleising av en seksjon av proteinet til et peptid vil gjøre peptidet mindre stabilt på grunn av det lave antallet av ikke-kovalente interaksjoner. De normale foldekreftene vil være svakere hvilke kunne favorisere dannelsen av fibriller.

Mindre kjent, men betydelig viktig for normal folding, så vel som for vedlikeholdelse av en stabil tredimensjonal struktur, er proteinasylering med kovalent binding av fettsyrer (5). Det er vel etablert at protein albumin er i stand til å binde flere fettsyremolekyler. Mettede fettsyrer slik som stearinsyre, palmetinsyre og myristinsyre er de dominerende fettsyrene som bindes til proteiner i eukaryote celler (6). Fra studier som benytter radiomerkede fettsyrer kjenner vi at hver fettsyre merker en forskjellig underpopulasjon av proteiner med fettsyren som interagerer med basiske aminosyrer slik som lysin, glysin og arginin. Karboksylgruppen i fettsyren danner en saltbro eller en hydrogenbinding med basiske aminosyre sidekjeder. Alle seter har sylindriske hydrofobe kanaler med varierende fasong som tvinger de mettede fettsyrene til å anta en nærmest lineær konfigurasjon. Bindingslommene er imidlertid store nok til å ha plass til umettede fettsyrer slik som oljesyre og arakidonsyre (7).

Det er interessant å merke seg at etablert amyloid også inneholder en viss mengde av fettsyrer. Med metanolekstraksjon av amyloid utvunnet fra transtyretin var omtrent 10% av den tørre massen løselig hvilket peker på nærværet av en lipidfraksjon (8).

Gasskromatografi avslørte nærvær av blandinger av mettede fettsyrer slik som de som er nevnt over, men også av flerumettede fettsyrer slik som palmitoleinsyre, linolsyre, αlinoleinsyre og arakidonsyre. Dette fettsyremønsteret er typisk for en moderne vestlig diett, som i svært stor grad er basert på mettet fett fra meieriprodukter og kjøtt sammen med frøutvunnede oljer. Det er nokså klart at fettsyrer har en funksjon i den normale foldingen av proteiner. Årsaken til at fettsyrer finnes i amyloid er uklar, men interessant nok er fettsyrene som er funnet overensstemmende med fettypene i vår diett. En hypotese er basert på antagelsen om at noen fettsyrer bundet til polypeptidet eller proteinet har svakere affinitet hvilket gjør kjeden mindre stabil og derfor er tilbøyelig til fibrillær deformering.

Amyloide avsetninger kan reabsorberes og organfunksjon reverseres dersom syntesen av amyloidogent protein avsluttes. Det ser ut til å være en fin balanse mellom hastigheten/graden hvorved amyloid dannes og dets spalting. Det kan derfor være mulig å fremme resorpsjonen av amyloid ved å redusere konsentrasjonen av det amyloidogenet proteinet til et nivå under en kritisk terskel uten nødvendigvis å eliminere forløperen (AA). Studier av omdannelsesmekansimen fra normale løselige forløperproteiner til amyloidfibriller har dratt nytte av det faktum at det overgangen kan reproduseres under laboratoriebetingelser. In vitro eksperimenter har vist at omdannelse av naturlig, fullstendig foldet protein til en i høy grad amyloidogen, delvis foldet konformer kunne blokkeres ved å stabilisere naturlige proteiner med en spesifikk ligand (9). Andre eksperimenter som benytter naturlige forløperproteiner slik som tau-protein (10) og øyeamyloidpolypeptid (IAPP) (11) har vist en stimulerende effekt av visse fettsyrer på oppsamlingen av fibriller og amyloid. Alle langkjedete fettsyrer som ble testet økte oppsamlingen i noen grad, selv om større stimulering ble forbundet med umettede former. Begge artiklene konkluderer med at flerumettede fettsyrer slik som arakidonsyre, oleinsyre og lynolsyre men også myristinsyre utøver uttalte effekter på fibrill- og amyloiddannelse. Det så derfor ut til at vanlige umettede fettsyrer i vår diett kunne stimulere dannelsen av fibriller og amyloid og som en konsekvens av dette øker risikoen for å indusere invaliderende sykdommer slik som Alzheimers demens, diabetes type 2 og nyresvikt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fettsyresammensetning som innbefatter minst (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA) og (all-Z omega-3)-5,8,11,14,17-eikosapentaensyre (EPA), der fettsyresammensetningen omfatter minst 70% umettede omega-3 fettsyrer der fettsyrene DHA og EPA er tilstede i et vektforhold fra omtrent 1:2 til 2:1,

for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer som er valgt blant Alzheimers sykdom, demens, IgA nefropati, type II diabetes mellitus, amyloidose, Parkinson’s sykdom, nyreamyloidose etter kronisk inflammasjonssykdom og Creutzfeld-Jacob sykdom,

ved administrering av mellom 2 og 10 g av nevnte fettsyresammensetning pr. dag.

Fra forskning som førte til oppfinnelsen ble det overraskende funnet at en fettsyresammensetning ifølge oppfinnelsen hindrer dannelse av såkalte fibriller eller plakker, og/eller reduserer avsatte fibriller eller plakker, kjent som amyloid. Videre så en fettsyresammensetning ifølge oppfinnelsen som hovedsakelig inneholdt DHA ut til å forhindre og/eller forsinke dannelse av fibriller svært effektivt, der DHA kan virke som en antagonist. Samtidig demonstrerer en fettsyresammensetning som inneholder minst en kombinasjon av de to fettsyrene DHA og EPA også preventiv effekt mot fibrilldannelse.

Videre kunne behandlingen ifølge oppfinnelsen preventivt redusere tilbøyeligheten til fibrilldannelse så vel som terapeutisk ved situasjoner med etablert amyloid.

Under ugunstige betingelser omdannes videre proteiner eller fragmenter av proteiner fra deres normale løselige former til uløselige fibriller eller plakker, hvilket akkumulerer i et mangfold av organer inkludert leveren, nyrene, milten, hjernen og indre sekretoriske kjertler slik som β-cellene i bukspyttkjertelen (pankreas) som induserer toksiske effekter på celler og vev. Sluttformene til disse aggregatene har ofte et veldefinert patologisk anatomisk utseende, kjent som amyloid. Dette er årsaken til å anvende betegnelsen amyloidoser for å beskrive mange av de kliniske tilstandene som avsetning av amyloid er forbundet med. Således betyr, slik det her er benyttet, betegnelsen "amyloidose relaterte" sykdommer kliniske tilstander eller sykdommer hvorved amyloid avsetning, fortrinnsvis som en konsekvens av fibrilldannelse, er forbundet, slik som for eksempel Alzheimers demens, type II diabetes, IgA nefropati, nyreamylidoser etter kroniske inflammatoriske sykdommer og Parkinson’s sykdom.

Betegnelsen "mengde" her vedrører vekten eller volumet av fettsyresammensetningen.

Videre kan den ønskede farmakologiske og/eller terapeutiske effekten oppnås ved fettsyresammensetningen ifølge oppfinnelsen.

Ved en annen utførelsesform presenteres videre fettsyrene i sammensetningen ifølge oppfinnelsen ved minst en av den forestret form, etylesterform, saltform eller fri syre form, eller hvilken som helst kombinasjoner derav. Ved en foretrukken utførelsesform innbefattes fettsyresammensetningen av en kombinasjon av EPA og DHA i triglyceridform.

Ved en annen utførelsesform er i det minste DHA oppnådd fra minst en av vegetabilsk, mikrobiell eller animalske opprinnelser, eller kombinasjoner derav. Videre, ved en ytterligere utførelsesform, er minst en av DHA og EPA oppnådd fra i det minste en av vegetabilske, mikrobielle og animalske oppfinnelser eller kombinasjoner derav. Det medisinske produktet eller farmasøytiske produktet inkluderer derfor for eksempel en fettsyresammensetning som innbefatter minst en av en DHA-holdig mikrobiell olje og en blanding av en DHA-holdig olje fra mikrobiell opprinnelse og en EPA-holdig olje fra en marinopprinnelse. Videre kan fettsyresammensetningen ifølge oppfinnelsen i tillegg også omfatte minst en av arakidonsyre (ARA), dokosapentaensyre, heneikosapentaensyre, oktadekatentraensyre, eller en hvilken som helst kombinasjon derav. Passende er minst en del av EPA/DHA fremstilt fra en marinolje, fortrinnsvis en fiskeolje. En annen utførelsesform av det medisinske produktet fremstilles videre fettsyresammensetningen fra en marin olje, slik som en fiskeolje.

En spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfattes fettsyresammensetningen av minst en kombinasjon av EPA og DHA på triglyceridform. Videre bør det gjøres oppmerksom på at fettsyresammensetningen administreres til et menneske eller et dyr, fortrinnsvis oralt. Videre kan det medisinske produktet ifølge oppfinnelsen også fremstilles for administrering via en hvilken som helst annen rute der de aktive ingrediensene effektivt kan absorberes og utnyttes, for eksempel intravenøst, subkutant, intramuskulært, intranasalt, rektalt, vaginalt, eller topisk.

Fettsyresammensetningen administreres i en mengde som tilveiebringer en daglig dosering på mellom 2 og 10 g av nevnte fettsyresammensetning for et menneske. Ved en foretrukken utførelsesform administreres mellom 2 og 8 g av nevnte fettsyresammensetning pr. dag. Det medisinske produktet eller den farmasøytiske sammensetningen eller det farmasøytiske preparatet ifølge oppfinnelsen kan også omfatte andre substanser slik som et inert bindemiddel, eller farmasøytisk akseptable hjelpestoffer, bærere, konserveringsmidler etc., som er velkjente for en fagmann på området. Det medisinske produktet kan imidlertid også administreres til et dyr, slik som et kjæledyr eller en hest. Videre bør det bemerkes at det medisinske produktet kan være minst en av et amyloid forebyggende middel eller amyloid avsetningsminkende middel.

Det beskrives videre anvendelse av en fettsyresammensetning som omfatter minst (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA), som ved administrering til et menneske eller et dyr vil forhindre dannelsen av aggregater av proteinfibriller eller plakk og/eller redusere avsatte fibriller, til fremstilling av et medisinsk produkt for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer.

Nevnte amyloidoserelaterte sykdommer kan være Alzheimers demens.

Nevnte amyloidoserelatert sykdom kan også være IgA nefropati. Ved en spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen anvendes en fettsyresammensetning som innbefatter en kombinasjon av minst DHA og EPA for behandling og/eller forebyggelse av IgA nefropati. Videre inkluderer oppfinnelsen også anvendelse av en fettsyresammensetning som innbefatter en effektiv mengde av en kombinasjon av EPA og DHA som ved administrering til et menneske eller dyr fortrinnsvis vil forhindre dannelsen av proteinfibrill- eller plakkaggregater og/eller redusere avsatt fibriller, for fremstilling av et medisinsk produkt for behandling og/eller forebyggelse av IgA for nefropati.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen vedrører en fettsyresammensetning som innbefatter minst (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA) og (all-Z omega-3)-5,8,11,14,17-eikosapentaensyre (EPA), for behandling av type II diabetes. Ved en spesifikk utførelsesform er videre mengden av DHA større eller lik mengden av EPA.

Ved en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er videre den amyloidoserelaterte sykdommen minst en av amyloidoser, Parkinson’s sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, de spongiforme encefalopatiene slik som Creutzfeld-Jacob sykdom, systisk fibrose, nyreamyloidoser etter inflammatoriske sykdommer og nyreamyloidoser, og amyloid avsetning i myokardium og nervevev.

Anvendelsen av en fettsyresammensetning som innbefatter minst (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA), for fremstilling av et næringsmiddel eller et kosttilskudd for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer beskrives også.

En fordel ved fremstilling og salg av næringsmidler for behandling og/eller forebyggelse av amyloidoserelaterte sykdommer er at et slikt næringsmiddel vil være lettere tilgjengelig for folk. Ved preventive formål kjøper de fortrinnsvis produktet eller tilskuddet i en helsekostforretning og/eller en dagligvarebutikk, og de trenger ikke å oppsøke lege.

Næringsmidlet eller kosttilskuddet kan være på en formen av en kapsel. Fortrinnsvis er kapslene smaksatt. Mer foretrukket er kapselen en gelatinkapsel som er smaksatt. Denne utførelsesformen inkluderer også en kapsel, der både kapselen og den innkapslede fettsyresammensetningen er smaksatt. Med smakssetting av kapselen som nevnt over, blir kapselen mer attraktiv for brukeren.

Den nevnte sammensetningen kan administreres i en mengde som tilveiebringer en daglig dosering på 1 g til 15 g av nevnte fettsyresammensetning for et menneske. Ved en mer foretrukken utførelsesform administreres mellom 2 og 10 g av nevnte fettsyresammensetning pr. dag, og ved en mer foretrukken utførelsesform mellom 2 og 8 g av nevnte fettsyresammensetning. Næringsmidlet eller kosttilskuddet kan også omfatte andre substanser slik som et inert bindemiddel, eller farmasøytiske akseptable hjelpestoffer, bærere, konserveringsmidler etc., som er velkjente for en fagmann på området. I tillegg kan også næringsmidlet eller kosttilskuddet administreres til et dyr, slik som et kjæledyr eller en hest. Videre bør det bemerkes at næringsmidlet eller kosttilskuddet kan være minst en av et amyloidforebyggende middel eller amyloid avsetningsminkende middel.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen vedrører utførelsesformen anvendelse av en fettsyresammensetning som omfatter minst en kombinasjon av DHA og EPA, som ved administrering til et menneske eller et dyr vil føre til forhindring av eller reduksjon av amyloidavsetning for fremstilling av et medikament, for behandling og/eller forebygging av Alzheimers sykdom, fortrinnsvis forårsaket av amyloidose. Den spesifikke utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter fettsyresammensetningen minst 70% umettede omega-3 fettsyrer der fettsyrene DHA og EPA er tilstede i et vektforhold fra omtrent 1:2 til 2:1. Anvendelsen av en fettsyresammensetning, der vektforholdet av EPA:DHA i fettsyresammensetningen er 1:X, der X er lik eller større enn 1 er også beskrevet. Det skal bemerkes at X er en av et helt tall eller et ikke-helt tall. Videre oppnås en foretrukken effekt ved en fettsyresammensetning som er rik på DHA.

Uttrykket "rik" inkluderer her mer eller mindre en fettsyresammensetning som primært inneholder DHA (intet EPA), og en fettsyresammensetning der mengden av DHA ≥ EPA. Videre vedrører uttrykket "mengde" her vekt eller volum av fettsyresammensetningen. Videre kan den ønskede farmakologiske og/eller terapeutiske effekten oppnås ved fettsyresammensetningen ifølge oppfinnelsen.

Slik det her er benyttet inkluderer amyloidoserelaterte tilstander eller sykdommer minst Alzheimers sykdom eller demens, Parkinson’s sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, de spongiforme ensefalopatiene slik som Creutzfeld-Jacob sykdom, systisk fibrose, type II diabetes, nyreamyloidoser, IgA nefropati og amyloid avsetning i myokardium og nervevev. Disse sykdommene kan være sporadiske, nedarvede eller til og med smittsomme, og forekommer ofte kun sent i livet selv om nedarvede former kan komme til syne mye tidligere. Hver sykdom er forbundet med et bestemt protein og aggregater av disse proteinene ansees å være den direkte opprinnelsen til de patologiske tilstandene forbundet med sykdommen. Videre kan behandlingen og/eller forebyggelsen i henhold til administrering av fettsyresammensetningen ifølge oppfinnelsen også inkludere at minst en av; behandling på grunn av reduksjon av amyloidaggregater, forhindring av gal proteinfolding som fører til dannelse av såkalte fibriller eller plakker, behandling på grunn av reduksjon av produksjon av A β-protein (amyloid β-protein), og forebygging og/eller behandling på grunn av inhibering eller for å gjøre dannelsen av proteinfibriller, aggregater eller plakker langsommere. Den foreliggende oppfinnelsen inkluderer videre også forebygging av fibrillakkumulering eller dannelse, ved administrering av en fettsyresammensetning ifølge oppfinnelsen.

I tillegg betyr uttrykket "behandling" slik det her er benyttet både behandling med en helbredende eller lindrende hensikt og behandlingen av en amyloidose relatert sykdom kan enten være akutt eller kronisk. Med kronisk behandling menes en behandling som fortsetter i uker eller år.

Kort beskrivelse av tegningene.

I studiene og eksemplene nedenfor henvises det til de vedlagte tegningene, der figurene vedrører studier utført in vitro så vel som in vivo. Studiene ble utført for å demonstrere at en behandling, med en fettsyresammensetning som innbefatter minst DHA, forhindrer fibrill- og amyloiddannelse. Det henvises her til de vedlagte tegningene hvor: Fig 1. viser fibrilldannelse av omega-3 preparatet i løpet av 30 minutter. Figur 2 demonstrerer fibrilldannelse mellom fettsyrepreparatene med den mest utpregete fibrillinduserte effekt, soyaolje og olivenolje, sammenlignet med det fibrillforhindrende DHA-konsentratet EPAX 2050 (som omfatter tilnærmet 20% EPA og 50% DHA). Videre viser figur 3 preventiv effekt mot fibrilldannelse opptil minst 150 minutter ved å sammenligne forskjellige omega-3 preparater. Figur 4 illustrere effekter mot fibrilldannelse med et DHA konsentrat sammenlignet med olivenolje og soyaolje.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Et antall foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen ble utført for å demonstrere at en fettsyresammensetning som er rik på DHA er effektiv ved behandling og/eller forebyggelse av amyloidoserelaterte sykdommer.

Fibrilldannelse er en konsekvens av gal folding av forløperproteinene. Årsaken til denne abnormale atferden for dannelse av normale tredimensjonale strukturer er ikke fullstendig klarlagt. Som diskutert i bakgrunnsmaterialet, kunne det se ut som at vanlige flerumettede fettsyrer som ofte anbefales av ernæringsfysiologer for å forebygge kardiovaskulær sykdom og kreft, faktisk kunne øke tilbøyeligheten til gal folding av forløper proteiner, for derved å indusere amyloid avsetning. Den foreliggende oppfinnelsen beskriver imidlertid resultater som viser at en annen langkjedet flerumettet fettsyre, nemlig dokosaheksaensyre (DHA), overraskende så ut til å indikere en preventiv effekt på amyloid dannelse ved å forlenge tiden for spontan fibrilldannelse av IAPP.

Den foreliggende oppfinnelsen beskriver resultatene av eksperimenter med et syntetisk forløperprotein, syntetisk IAPP, som spontant danner fibriller, så vel som semi-vivo eksperimenter med pankreatiske små øyer fra transgene dyr, som produserer human IAPP. Oppfinnelsen beskriver også resultater fra in vivo eksperimenter hos dyr der organamyloid induseres ved injeksjoner av en proinflammatorisk forbindelse, nemlig sølvnitratet. Dette peptidet ble inkubert med frie fettsyrer fra marin opprinnelse ved å sammenligne effektene på fibrilldannelse med fettsyrer slik som oljesyre og linolsyre som er kjent for å stimulere dannelsen av amyloidfibriller. Videre beskriver den foreliggende oppfinnelsen også resultater av eksperimenter i en semi-vivo modell, der pankreatiske små øyer fra transgene mus som produserer human IAPP og spontant danner β-call amyloid ble fremstilt og inkubert med oljesyre og dokosaheksaensyre.

Det er velkjent at inflammatoriske sykdommer skaper en høy risiko for å utvikle amyloid i forskjellige organer, en situasjon som kalles sekundær amyloid. En situasjon med ekstrem inflammasjon ble dannet hos mus som ble injisert ukentlig med sølvnitrat. Forskjellige grupper av dyr ble behandlet med EPAX 1050 (en høy DHA omega-3 olje), ren DHA (97% konsentrat), eller olivenolje (som inneholder omtrent 80% oljesyre). En kontrollgruppe ble gitt standard fôr.

Ved en første foretrukken utførelsesform ble effektene av forskjellige omega-3 preparater på fibrilldannelse studert.

Ved en andre utførelsesform ble effektene av en fettsyresammensetning som er rik på DHA, EPAX 2050 (en høy omega-3 olje), en olje som omfatter minst en kombinasjon av DHA og EPA (K85: tilnærmet 460 mg EPA og 375 mg DHA), og en olivenolje, på avsetning av amyloidfibriller i pankreatiske små øyer, studert.

Den tredje utførelsesform ble effektene av behandling med EPAX 1050, DHA, eller oljesyre hos dyr med sekundær amyloid indusert med subkutane injeksjoner av sølvnitrat studert. Avsetning av amyloid ble registrert hos dyr gitt normalt fôr. Etter 25 uker med sølvnitratinjeksjoner ble signifikant amyloid avsetning etablert i organer hos kontrolldyr. Eksperimentene ble deretter terminert og alle dyr ble avlivet og milten ble undersøkt for amyloid avsetning.

EKSEMPLER

In vitro eksperimenter på fibrilldannelse

I det første studie ble effektene på fibrilldannelse av forskjellige omega-3 preparater studert. In vitro fibrilldannelseseksperimentene ble utført i små glasstestrør. En beholdning av oppløste fettsyrer i etanol ble tilberedt ved å oppløse fettsyrer i 100% etanol ved en konsentrasjon på 10 mm. Etter blanding med den samme mengden av konsentrert NaOH, var den endelige konsentrasjonen av etanol 3%. Fettsyrene eller fettsyrekombinasjonene i tabellen nedenfor ble testet.

Syntetisk forløperprotein, syntetisk IAPP som spontant danner fibriller, ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) ved en konsentrasjon på 10 mg/ml. 26 µm ble inkubert med hver av fettsyrene, hver en konsentrasjon på 125 µm, i destillert vann. En µl alikvot av hver prøve ble analysert etter 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, og 240 minutter i elektronmikroskopet etter negativ jevnføring med 2% uranylacetat i 50% etanol.

Dannelse av fibriller ble observert ved elektronmikroskopisk analyse og registrert som poeng vilkårlig mellom 0 og 5 i 30 minutteksperimentene og mellom 1 og 2 i 240 minutteksperimentene. Fig. 1 demonstrerer fibrilldannelse av omega-3 preparatene i løpet av 30 minutter. Omega-3 konsentrater som inneholder hovedsakelig DHA, EPAX 2050, så ut til å forhindre eller forsinke den spontane dannelsen av fibriller mest effektivt. Videre demonstrerer fig.2 fibrilldannelse mellom fettsyrepreparatet med den mest utpregete fibrillinduserende effekten, olivenolje og soyaolje, sammenlignet med det fibrille forhindrende DHA konsentratet EPAX 2050. I tillegg ble fibrillinduksjon også fulgt i 240 minutter for å kvantifisere en fibrillforhindrende effekt av DHA konsentratet. Fig. 3 demonstrer at preventiv effekt mot fibrilldannelse var tydelig opptil 150 minutter i eksperimentet sammenlignet med forskjellige omega-3 preparater.

Lignende forhindring ble oppnådd i eksperimentet med DHA konsentratet sammenlignet med olivenolje og soyaolje, se fig.4.

Således viser dette studiet at behandling med en fettsyresammensetning som er rik på DHA fører til forhindring av fibrill- eller plakkdannelse. Videre ser det ut til at DHA virker som en fibrillinhibitor. Samtidig viser oppfinnelsen også forebyggende effekt på fibrilldannelse av et produkt som omfatter minst en kombinasjon av DHA og EPA, der fortrinnsvis mengden av DHA ≥ EPA. Resultatene antyder også en spesifikk preventiv effekt mot fibrilldannelse av et omega-3 produkt av marin opprinnelse sammenlignet med soyaolje og olivenolje.

In vitro eksperimenter på amyloiddannelse i pankreatiske små øyer

I det andre studie med effekter på amyloid avsetning av en olivenolje, en høy DHA omega-3 olje, og en sammensetning som innbefatter minst DHA og EPA, der mengden av EPA ≥ DHA, studert.

Transgene mus som bærer det humane IAPP-genet kan benyttes for å studere avsetning av amyloidfibriller i de pankreatiske små øyene (11). Derfor ble enkle pankreatiske små øyer isolert og dyrket fra transgene mus. Pankreas/bukspyttkjertelen ble fjernet under sterile forhold og plassert i Hank’s balanserte salter og finhakket. Små stykker av vev ble enzymatisk fordøyet med kollagenase i 10 minutter i et 37ºC vannbad. De små øyene ble individuelt utvalgt under mikroskopet. Deretter ble de små øyene dyrket over natten i 24 brønncelleklustere som inneholdt RPMI 1640 medium supplementert med 10% kalvefosterserum, penicillin (1000/ml), streptomycin (1,1 mg/ml) og 22, 0 mm glukose ved 37 grader i fuktet luft som inneholdt 5% karbonmonoksid.

50 µm olivenolje, høy DHA omega-3 olje (EPAX2050) og K85 olje og 1% fettsyre-fri albumin ble tilsatt til brønnene og de små øyene ble dyrket i RPMI medium i 2 uker. Det var omtrent 60 små øyer i hver brønn. Kongo rød fra en beholdningsløsning ble tilsatt til brønnene og de små øyene ble undersøkt ved å benytte lysmikroskopi.

Amyloid avsetning er farget med Kongo rød mens annet cellemateriale ikke er det.

Ingen forskjell ble observert mellom de forskjellige små øygruppene når det gjaldt overlevelse (se tabell nedenfor).

Resultatene fra dette studiet viser at 4-5% av de små øyecellene som var inkubert i olivenoljeløsningen ble farget med Kongo rød hvilket indikerte intracellulær amyloid avsetning. Overraskende var kun 1% av cellene fra små øyer inkubert med høy DHA, men også K85 konsentratet, farget med Kongo rød hvilket indikerte en beskyttende effekt mot amyloidavsetning. Imidlertid viste det DHA rike produktet, EPAX 2050TG, sterkere effekt sammenlignet med K85 (EPA ≥ DHA). I tillegg bekrefter resultatene fra dette studiet effekter som støtter forebyggelse og behandling av amyloidoserelaterte sykdommer påvirket av en fettsyresammensetning som inneholder minst DHA.

Sekundær amyloidose hos dyr indusert med sølvnitratinjeksjoner

Sekundær amyloidose kan induseres hos mus som gis en inflammatorisk utfordring slik som sølvnitrat. Dette ble studert i det etterfølgende.

NMRI hunnmus ble injisert en gang i uken, subkutant med 0,3 ml av en 1% sølvnitratløsning i 25 uker. Dyrene ble fôret med en høy fett diett som inneholdt hovedsakelig solsikkeolje med et fettinnhold på 55% av de totale daglige kaloriene. Tre grupper som hver bestod av 6 dyr ble gitt forskjellige omega-3 fettsyrekonsentrater (intervensjonsgruppe) eller standard olivenolje som inneholdt omtrent 78% oljesyre (oljesyregruppe). I intervensjonsgruppen ble 15% av fettinnholdet byttet ut med enten 97% dokosaheksaensyre (DHA gruppe) eller EPAX1050TG som inneholdt 10% av EPA og 50% av DHA (EPAX gruppe).

Etter fullførelse av studiet ble musene avlivet og milten ble tatt ut. For amyloid demonstrering ble en halvdel av hver milt klemt mellom to glassplater, påsmurt homogent over begge platene, og lufttørket ved romtemperatur over natten, mens den andre halvparten av milten ble fiksert i 10% bufret nøytral formalinløsning og nedsenket i parafin.

Det lufttørkede påsmurte materialet og 10-µm-tykke biter fra det formalinfikserte materialet ble farget for amyloid med spesifikt fargestoff alkalisk Kongo rød. Platene ble undersøkt i krysspolarisert lys for lys grønn dobbel brytning, spesifikt for amyloid. Evaluering av materialet ble utført på kodede plater.

Amyloid forekom i milten i tre av fire mus fôret med oljesyre, i en av seks mus fôret med DHA og en av fem mus fôret med EPAX (tabell nedenfor). To dyr døde under studie.

Det kan klart sees at sekundær amyloidose ble utviklet i en høyere grad hos mus fôret med oljesyrediett sammenlignet med mus fôret med DHA eller EPAX.

På grunn av det lave antallet dyr som var en i hvert studie, kunne imidlertid ingen konkluderende resultater angis mellom DHA- og EPAX gruppen.

Diskusjon

I studiene som er presentert over ble det syntetiske forløperproteinet IAPP som spontant danner fibriller inkubert in vitro med en serie fettsyrer fra omega-3 seriene så vel som omega-6 og omega-9. Omega-3 konsentratet som hovedsakelig inneholdt DHA så ut til å forhindre eller forsinke den spontane dannelsen av fibriller mens omega-6 (soyaolje) og omega-9 (olivenolje) fettsyrene så ut til å fremkalle fibrilldannelse. Det siste mønsteret er kjent fra tidligere eksperimenter (10, 11). Den preventive effekten av DHA er imidlertid et uønsket funn. Andre omega-3 fettsyrer hadde ikke den samme effekten som DHA selv om noen preventive effekter ble observert sammenlignet med omega-6 og -9 oljene. Ved den amyloide in vitro modellen på små øyer fra transgene IAPP produserende mus induserte videre DHA, men også et annet høyomegakonsentrat, K85, amyloidavsetning i en signifikant mindre grad sammenlignet med omega-9 olivenoljen.

Oppfinnelsen viser preventiv effekt på fibrilldannelse av et produkt som inneholder minst en kombinasjon av DHA og EPA, der fortrinnsvis mengden av DHA er større eller lik EPA.

En preventiv effekt av amyloid avsetning kunne til og med demonstreres in vivo ved å gi dyr med sølvnitratindusert sekundær amyloidose forskjellige fettsyrer eller fettsyrekombinasjoner. Etter 25 uker med behandling utviklet dyr gitt EPAX1050 eller tilnærmet ren DHA ikke amyloid i samme grad som dyr gitt i oljesyre. Faktisk utviklet kun et dyr i DHA gruppen (EPAX1050 og ren DHA) amyloid etter sølvnitratinjeksjoner sammenlignet med tre dyr i oljesyregruppen. Selv om antallet dyr som ble benyttet er for lite for den statistiske evaluering, er tendensen nokså klar hvilket betyr at DHA eller høy DHA konsentrater ser ut til å være forebyggende mot utvikling av amyloid.

Kongruensen mellom in vitro frembrakt data og in vivo data er slående, hvilket indikerer en ny terapeutiske modalitet for sykdommer etc.

De foreliggende funnene antyder en ny terapeutisk modalitet for sykdommer forårsaket av amyloid avsetning. Behandlingen kan være preventiv ved å redusere tilbøyeligheten til fibrilldannelse så vel som terapeutisk ved situasjoner med etablert amyloid.

Endelig, støtter resultatene sterkt anvendelsen av et medisinsk produkt, en farmasøytisk sammensetning, et næringsmiddel eller et kosttilskudd, som innbefatter en fettsyresammensetning som omfatter minst DHA, for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer, slik som for eksempel Alzheimers sykdom, IgA nefropati og type II diabetes.

Oppfinnelsen skal ikke begrenses til de viste utførelsesformene og eksemplene.

Referanser

1) Zerovnik A. Eur J Biochem 2002;269:3362-3371

2) Merlini G and Belotti V. NEJM 2003;349:583-596

3) Westermark P, Benson MD, Buxbaum JN, et al. Amyloid 2002;9:197-200

4) McLaurin J, Yang D, Yip CM, et al. J Struct Biol 2000;130:259-270

5) Schmidt MFG. Biochim. Biophys. Acta 1989;988:411-426

6) Mclhinney RAJ, Cdadwixk JK, og Pelly SJ. Biochim.1987;244:109-115

7) Bhattacharya AA. J Mol Biol 2000;303:721-732

8) Hermansen LF, Bergman T, Jörnvall H, et al. Eur J Biochim 1995;227:772-779 9) Miroy GJ, Lai Z, Lashuel HA, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:15051-15056 10) Wilson DM og Binder LI. Am J Pathol 1997;150:2181-2195)

11) Ma Z og Westermark GT. Medical Dissertation Nr.655, Linkoping, Sweden 2001

Claims (8)

Patentkrav

1.

Fettsyresammensetning som innbefatter minst (all-Z omega-3)-4,7,10,13,16,19-dokosaheksaensyre (DHA) og (all-Z omega-3)-5,8,11,14,17-eikosapentaensyre (EPA), der fettsyresammensetningen omfatter minst 70% umettede omega-3 fettsyrer der fettsyrene DHA og EPA er tilstede i et vektforhold fra omtrent 1:2 til 2:1,

for behandling og/eller forebygging av amyloidoserelaterte sykdommer som er valgt blant Alzheimers sykdom, demens, IgA nefropati, type II diabetes mellitus, amyloidose, Parkinson’s sykdom, nyreamyloidose etter kronisk inflammasjonssykdom og Creutzfeld-Jacob sykdom,

ved administrering av mellom 2 og 10 g av nevnte fettsyresammensetning pr. dag.

2.

Fettsyresammensetning ifølge krav 1, der fettsyrene i sammensetningen er til stede i minst en av forestret form, etylesterform, saltform og fri syreform, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.

3.

Fettsyresammensetning ifølge krav 1, der minst DHA er oppnådd fra minst en av vegetabilske, mikrobielle og animalske opprinnelser, eller kombinasjoner derav.

4.

Fettsyresammensetning ifølge krav 1, der minst en av DHA og EPA er oppnådd fra minst en av vegetabilske, mikrobielle og animalske opprinnelser eller kombinasjoner derav.

5.

Fettsyresammensetning ifølge krav 1, der minst en del av EPA og/eller DHA er fremstilt fra en marin olje, fortrinnsvis en fiskeolje.

6.

Fettsyresammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der fettsyresammensetningen er fremstilt fra en marin olje.

7.

Fettsyresammensetning ifølge krav 1, der fettsyresammensetningen er omfattet av minst en kombinasjon av EPA og DHA i triglyceridform.

8.

Fettsyresammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der fettsyresammensetningen administreres oralt, til et menneske eller et dyr.