CN115666548A - 富含lpc-dha和lpc-epa的磷虾油组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特别是在全身给药时用于预防病或疗法的包括携带ω‑3脂肪酸的磷脂酰胆碱衍生的化合物的组合物。本发明还涉及富含LPC‑DHA和LPC‑EPA的改性磷虾油组合物、制备方法及用于治疗神经和眼部疾患的方法。

Description

富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月31日提交的美国临时申请63/002,425和于2020年11月15日提交的美国临时申请63/113,908的权益，其两者均通过援引整体并入本文。
技术领域
本发明提供了特别是在全身给药时用于防病或疗法的包括携带ω-3脂肪酸的磷脂酰胆碱衍生的化合物的组合物。本发明还涉及富含LPC-DHA和LPC-EPA的改性磷虾油组合物、制备方法及用于治疗神经和眼部疾患的方法。
背景技术
脑包含非常高浓度的ω-3脂肪酸DHA，它在脑的发育和功能中发挥重要作用。脑DHA的缺乏与若干神经疾病，包括阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s)、帕金森氏症(Parkinson’s)、精神分裂症和抑郁相关(1-3)。DHA还示出预防卒中(4)和颅脑损伤(5)的并发症。尽管已经报道了膳食DHA在神经退行性疾病的各种动物模型中的有益作用(6-9)，但采用目前可得的补充剂(鱼油、藻油、磷虾油、乙酯)的临床试验在患有阿尔茨海默病(10-12)、亨廷顿病(13)和精神分裂症(14)的患者中提供了令人失望的结果。已提出，这些试验的失败是由于这些补充剂无法富集脑DHA，因为来自它们的DHA主要以三酰甘油(TAG)的形式被吸收，而BBB的转运蛋白需要DHA的溶血磷脂酰胆碱形式(LPC-DHA)(15)。事实上，最近已证实，向正常成年小鼠饲喂LPC形式的DHA使大脑DHA增加最高达100％，而相同剂量的游离DHA无作用(16)。其还示出在大鼠中富集脑DHA中，LPC-DHA优于PC-DHA或TAG-DHA(17)。尽管膳食EPA已示出比DHA更有益于预防和治疗抑郁症(22-24)，但与DHA相比，脑包含非常少的EPA，并且富含EPA的补充剂不会显著增加脑EPA含量(18-21)。已提出，大脑缺乏EPA富集是由于EPA在脑中快速氧化(25)。然而，已证实，通过提供呈LPC形式的膳食EPA，脑EPA确实可以增加至最高达100倍(26)，这表明EPA水平低主要是由于血浆中LPC-EPA的水平低。
此外，在体内，视网膜具有最高浓度的DHA。它还具有大比例的衍生自EPA和DHA的超长链脂肪酸(32-36n-3)，并且在sn-1和sn-2位两者处都包含含有ω-3脂肪酸的磷脂。这些脂肪酸和独特的磷脂在维持光感受器细胞完整性方面执行着重要功能(41)。
DHA在视网膜中具有抗炎、抗血管生成和促进内稳态的作用，而DHA的缺乏与黄斑变性及其它视网膜病变相关(42)。若干流行病学研究示出摄入ω-3脂肪酸对预防各种视网膜病变的有益作用(42)(43)。此外，Tikhonenkho等人(44)报道，通过在饮食中提供DHA可以预防实验动物的糖尿病视网膜病变。DHA还示出，在动物模型中，DHA能够预防干眼病(45)和年龄相关性黄斑变性(46)。然而，尽管流行病学和实验研究的积极的结果，但使用膳食补充剂对患者进行的干预研究未示出明显的益处(47)(48)，这很可能是由于视网膜对常规DHA补充剂的低效摄取。值得注意的是，据Nishizawa等人(49)报道，虽然生长期大鼠中的视网膜DHA可以增加，但即使使用高DHA剂量(8.5％卡路里)，成年视网膜的DHA含量也不能增加。这可能解释了先前临床试验失败的原因。
眼部感染和炎症包括广泛的病理病症，其可以原发或继发于原发性疾病。
一个实例是干眼病(DED)，其为非常普遍的泪液膜和眼表的多因子疾病，其会导致眼疼痛和视觉受损。DED疗法主要涉及滴注润滑剂滴眼液以提供暂时的症状缓解，其为支持性的而非治疗性的。炎症是DED发病机制的核心机制，其中泪液高渗透压和不稳定性有助于炎症反应。这为DED患者所经历的慢性刺激和疼痛提供了条件。局部抗炎剂诸如皮质类固醇，目前用于处理DED，但潜在的长期副作用限制了其使用。
ω-3(n-3)长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)、二十碳五烯酸(EPA,20:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)被公认为健康均衡饮食的必需组分，对发育和减轻一系列病理病症具有有益作用，该病理性病症包括眼部病患，诸如例如视网膜疾病和年龄相关性黄斑变性(AMD)。
正如Querques等人所评论的，在体内，视网膜具有的DHA浓度最高，一些研究表明，ω-3多不饱和脂肪酸可乙在减少视网膜疾病的发作和进展方面具有保护作用(Querqueset al.,J Nutr Metab.2011；2011:748361)。已提出高浓度的DHA优化光感受器膜的流动性、视网膜完整性和视觉功能。此外，许多研究表明DHA在视网膜中发挥保护例如抗凋亡作用。相比于DHA，脑、神经组织和视网膜包含非常少的二十碳五烯酸(EPA)，但有迹象表明EPA可能在预防神经变性中具有保护作用(Yalagala et al J Lipid Res.2019Mar；60(3):566-578.doi:10.1194/jlr.M090464.Epub 2018Dec 10)。从营养的角度来看，已知西方人群特别是老年个体，具有的ω-6/ω-3比率高于最佳，并且应当使他们的饮食中丰富更多的ω-3多不饱和脂肪酸，以改善与炎症相关的发病机制。
干眼是常见的眼疾病。取决于所观察的人群，其在一定程度上影响着5％-34％的人。在老年人中，其影响最高达70％。虽然已建议将膳食ω-3补充剂用于预防和治疗若干种眼部疾病，但用来自鱼油和富含磷脂的磷虾油的ω-3来治疗DED的一项临床试验并未证实润滑用滴眼液的使用频率发生显著变化(Deinema et al.Ophthalmology.2017Jan；124(1):43-52)。
尽管在该领域做出了努力，但干眼的问题仍然非常广泛且尚未解决，是有待满足的医疗需求。因此，期望的是为干眼提供新的改善的治疗。
如果这样的治疗可以提供症状和治疗两者上的缓解，则将是优选的。
尤其，如果这种改善的治疗可以通过防止眼部组织和视网膜退化来预防眼部病患诸如青光眼、AMD、糖尿病视网膜病变和神经病，则将是优选的。
发明内容
脑DHA缺乏与若干种神经退行性疾病有关，但目前的补充剂并不能富集大脑DHA，原因是需要血脑屏障处溶血磷脂酰胆碱(LPC-DHA)的转运蛋白。磷虾油磷脂在sn-2位处包含DHA和EPA，但不会生成LPC-DHA和LPC-EPA，因为胰磷脂酶A2将它们释放作为游离酸。
然而，本发明人发现，如果用sn-1特异性脂肪酶预处理膳食磷虾油，则生成LPC-DHA和LPC-EPA，并因此应当富集脑DHA和EPA。我们通过向正常小鼠饲喂未处理的磷虾油(UTKO)和脂肪酶处理的磷虾油(LTKO)并确定脑及其它组织的脂肪酸组成来测试这一假设。UTKO在很小程度上增加脑DHA和EPA，而LTKO分别以5倍和70倍更有效地富集大脑DHA和EPA，并增加脑BDNF。相比之下，无论是否有脂肪酶处理，鱼油(其不包含磷脂)对脑DHA或EPA没有作用。LTKO在富集肝脏DHA和EPA方面也更高效，但在脂肪组织和心脏中富集方面的效率低于鱼油或UTKO。这些结果为将以膳食DHA和EPA为目标针对脑以预防和治疗神经疾病诸如阿尔茨海默氏症提供了新策略。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于治疗、预防和/或缓解眼的疾病或病症的一种或更多种症状和/或体征的方法，所述方法包括向有此需要的受试者给药有效量的包括含有选自由式1至8中任一项及其任意组合组成的组的LPC-化合物的溶血磷脂酰胆碱(LPC)组合物的制剂，从而改善、控制、减轻或缓解所述疾病或病症的症状：
Figure BDA0003872494670000041
Figure BDA0003872494670000051
其中
R1是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；
R2是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；以及
n是0、1或2。
在第一方面的一种实施方式中，R1是OH，以及R2是OH。
在第一方面的一种实施方式中，条件是：如果LPC组合物包括i)根据式1的化合物，其中，R2是OH；和/或ii)根据式3的化合物，其中，R1是OH；则所述LPC组合物进一步包括第一方面中提及的其它LPC-化合物中的至少一种。
在第一方面的一种实施方式中，一种或更多种LPC-化合物是：
-根据式1的化合物；和/或根据式3的化合物；以及
-根据式2的化合物；和/或根据式4的化合物。
在第一方面的一种实施方式中，
-R1和R2是OH；并且
-lysoPC-DHA:lysoPC-EPA的摩尔比在1:1至3:1的范围内；或者lysoPC-EPA:lysoPC-DHA的摩尔比在1:1至5:1的范围内；条件是i)lysoPC-EPA的摩尔数为1-lysoPC-EPA的摩尔数+2-lysoPC-EPA的摩尔数；以及ii)lysoPC-DHA的摩尔数为1-lysoPC-DHA的摩尔数+2-lysoPC-DHA的摩尔数。
在第一方面的一种实施方式中，所述疾病或病症是干眼，诸如选自由眼的炎症、角膜神经异常和眼表面擦伤组成的组的干眼病。
在第一方面的一种实施方式中，所述疾病或病症是眼的神经退行性疾病。
在第一方面的一种实施方式中，所述眼的神经退行性疾病选自由以下项组成的组：年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、非增殖性视网膜病变、增殖性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜色素变性、中央静脉阻塞和青光眼。
在第一方面的一种实施方式中，通过选自由口服给药和血管内或静脉内给药组成的组的方式来给药。
在第一方面的一种实施方式中，给药方式为口服给药。
在第一方面的一种实施方式中，给药方式为血管内或静脉内给药。
在第一方面的一种实施方式中，所述制剂中的LPC组合物包括选自由式1至8中任一项组成的组的LPC-化合物，并且其中，所述LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计10％-100％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物进一步包括不同于LPC的脂质。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括按重量计5％至12％的DHA，其中，DHA是LPC-组合物中的游离脂肪酸或乙酯或脂质。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包含按重量计10％至24％的EPA，其中，EPA是游离脂肪酸或乙酯或者与LPC-组合物中的任何脂质相结合。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物进一步包括棕榈油酸和/或棕榈酸。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括按重量计2％至5％的棕榈油酸，其中棕榈油酸与LPC-组合物中的任何脂质相结合。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包含按重量计10％至15％的棕榈酸，其中，棕榈酸与LPC-组合物中的任何脂质相结合。
在第一方面的一种实施方式中，不同于LPC的脂质选自由以下项组成的组：甘油三酯、乙酯、游离脂肪酸和磷脂诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计至少35％的量的总磷脂。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计至少23％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计至少40％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计至少60％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计至少90％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计90％-98％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC-组合物的按重量计至少95％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，所述制剂包括按重量计1％至35％的LPC-组合物。
在第一方面的一种实施方式中，所述制剂包括按重量计25％的LPC-组合物。
在第一方面的一种实施方式中，所述制剂包括按重量计40％的LPC-组合物。
在第一方面的一种实施方式中，与磷脂酰胆碱的量相比，LPC组合物包括占优势的量的LPC-化合物。
在第一方面的一种实施方式中，LPC-化合物选自LPC-EPA、LPC-DHA及其任意组合。
在第一方面的一种实施方式中，与磷脂酰胆碱的量相比，LPC组合物包括占优势的量的LPC-化合物。
在第一方面的一种实施方式中，所述制剂进一步包括选自由叶黄素、虾青素、玉米黄质及其任意组合组成的组的组分。
在第一方面的一种实施方式中，受试者是哺乳动物受试者。
在第一方面的一种实施方式中，受试者是人受试者。
在第二方面，本发明涉及制备富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物的方法，包括用对所述磷虾油中的含DHA和EPA的磷脂的sn-1位具有特异性的脂肪酶来处理磷虾油。
在第二方面的一种实施方式中，本发明是富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物，通过用对所述磷虾油中含DHA和EPA的磷脂的sn-1位具有特异性的脂肪酶来处理磷虾油而制备。
在第二方面的一种实施方式中，所述脂肪酶包括来自米赫毛霉(Mucor meihei)的脂肪酶。在另一种实施方式中，所述脂肪酶包括来自米赫毛霉的固定化脂肪酶。在另一种实施方式中，磷虾油组合物包括溶血磷脂酰胆碱，所述溶血磷脂酰胆碱包括按重量计大于约80％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约80％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约70％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约60％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约50％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约40％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约30％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约20％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，包括溶血磷脂酰胆碱的磷虾油组合物包括按重量计大于约10％的LPC-DHA和LPC-EPA。
在第二方面的一种实施方式中，本发明提供了包括如上所述的磷虾油组合物的营养品组合物。
在第二方面的一种实施方式中，本发明提供了包括如上所述的磷虾油组合物的药物组合物。
在第三方面，本发明涉及治疗或预防受试者的神经疾病或疾患的方法，包括向所述受试者给药有效量的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。在某些实施方式中，所述神经疾病或疾患选自帕金森氏症、精神分裂症、颅脑损伤、卒中和阿尔茨海默氏症。在具体实施方式中，所述神经疾病或疾患是阿尔茨海默氏症。
本发明人另外发现，向正常小鼠饲喂根据本发明的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物致使视网膜EPA和DHA显著增加。包含EPA和DHA的仅呈甘油三酯形式的鱼油的类似治疗对视网膜EPA或DHA无作用。
因此，在另一方面，本发明涉及治疗或预防受试者的视网膜疾病或疾患的方法，包括向受试者给药有效量的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。在某些实施方式中，视网膜疾病或疾患选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和干眼病。
另外，由于脂肪酶处理的磷虾油在富集肝脏ω3脂肪酸方面优于鱼油未处理的磷虾油，因此本发明的组合物可用于治疗肝脏疾病，诸如非酒精性脂肪肝(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，已知该疾病通过肝脏的DHA富集来减轻。
因此，在另一方面，本发明涉及治疗或预防通过肝脏的DHA富集而减轻的肝脏疾病的方法，包括向需要治疗的受试者给药有效量的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。在某些实施方式中，所述肝脏疾病选自非酒精性脂肪肝(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
附图说明
图1示出研究结束时视网膜EPA含量(AUC/mg干组织)。
图2示出研究结束时视网膜EPA/ETA比率。
图3示出口灌喂0周(T0，基线)、2周(T1)和3周(T2)后采集的血浆LPC-EPA(ng/ml)。
图4示出研究结束时视网膜DHA/ETA比率。
图5示出口服灌胃0周(T0，基线)、2周(T1)和3周(T2)后采集的血浆LPC-DHA(ng/ml)。
图6示出六个实验组的视网膜EPA浓度，表示为占总脂肪酸的％。
图7示出六个实验组中每一组的视网膜ARA(20:4n-6)浓度与DHA剂量之间的关系。
图8示出口服和i.v.给药后眼部组织的时间浓度曲线下面积。
图9示出口服和i.v.给药LPC-EPA和LPC-DHA前24小时后眼部组织(全眼)的时间浓度曲线下面积。
图10示出口服和i.v.给药LPC-EPA和LPC-DHA前72小时后眼部组织(全眼)的时间浓度曲线下面积。
图11示出磷虾油在PC的sn-2位处包含EPA和DHA，并且因此在胰磷脂酶A2的消化期间作为游离脂肪酸释放。然后，释放的EPA和DHA作为TAG被吸收，其不会生成转运至脑所需的LPC-EPA或LPC-DHA。因此，饲喂磷虾油不会致使脑中显著富集EPA和DHA。然而，如果我们用对sn-1酯键具有特异性的脂肪酶来预处理磷虾油，则会生成LPC-EPA和LPC-DHA。饲喂该改性磷虾油会致使EPA和DHA以磷脂的形式被吸收，从而导致它们在脑中的富集。另一方面，鱼油的脂肪酶处理不会生成LPC-EPA或LPC-DHA，并且因此不会致使EPA和DHA在脑中富集(未示出)。
图12示出膳食处理对血浆中长链PUFA水平的作用。如文中所述，提取空腹血浆的总脂质、转甲基化并通过GC/MS分析脂肪酸组成。示出的值是每组5只动物的平均值±SD。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较校正(Graphpad 8.0软件)来确定统计学显著性。与对照组相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图13示出饲喂天然的和脂肪酶处理的磷虾油和鱼油对血浆LPC物质的作用。用酸化甲醇提取血浆样品并使用HILIC柱通过LC/MS分析ω3LPC物质的浓度以及异构体组成，如文中所述。使用17:0LPC作为内标测定LPC浓度。由于17:0-LPC和22:6LPC标准品的强度值在所用条件下相差此量，因此应用校正因子(x 0.233)来计算这些值。如通过单因素方差分析与Tukey多重比较校正(总LPC)所确定的，具有不同上标的条(bar)彼此之间存在显著差异。
图14示出前额叶皮质的PUFA组成。通过GC/MS分析总脂肪酸组成，并且仅示出20:4(ARA)、20:5(EPA)、22:5(DPA)和22:6(DHA)的组成百分比。示出的值是每组5只动物的平均值±SD。通过单因素方差分析确定统计学显著性，并且符号与图12相同。
图15示出海马体的PUFA组成。如文中所述分析脂肪酸组成。示出的值是每组中5只动物的平均值±SD。统计学显著性符号与图12相同。
图16示出纹状体的PUFA组成。如文中所述分析PUFA组成。示出的值是每组中5只小鼠的平均值±SD。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验来确定对照和实验饮食之间的统计学显著性。显著性符号与图12相同。
图17示出小脑中的PUA组成。如文中所述通过GC/MS分析脂肪酸组成。示出的值是每组中6只小鼠的平均值±SD。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验来确定对照和实验饮食之间的统计学显著性。显著性符号与图12相同。
图18示出膳食治疗对前额叶皮质和海马体中BDNF水平的作用。如文中所述使用β-肌动蛋白作为内标进行BDNF水平的免疫测定。示出的BDNF/β-肌动蛋白比率是每组3只小鼠的平均值±SD。插图示出具有代表性的免疫印迹。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验来确定对照和实验饮食之间的统计显著性。相比于对照，***p<0.001；相比于对照，****p<0.0001。
图19示出性腺周围脂肪组织的PUFA组成。示出的百分比值是每组5只小鼠的平均值±SD。统计学显著性值(单因素方差分析)为对照和实验饮食之间，并且符号与图12相同。
图20示出腹股沟脂肪组织的PUFA组成。示出的百分比值是每组5只小鼠的平均值±SD。统计学显著性值(单因素方差分析)为对照和实验饮食之间，并且符号与图12相同。
图21示出膳食脂肪对肝脏的脂肪酸组成的作用。如文中所述，通过GC/MS对总脂质进行的脂肪酸分析。示出的值是每组中5只小鼠的平均值±SD。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验来确定对照和实验饮食之间的统计学显著性。显著性符号与图12相同。
图22示出膳食脂肪对心脏的脂肪酸组成的作用。如文中所述，提取心脏的总脂质，并通过GC/MS分析脂肪酸组成。示出的值是每组中5只小鼠的平均值±SD。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验来确定对照和实验饮食之间的统计学显著性。显著性符号与图12相同。
图23示出用特异性水解sn-1脂肪酸的脂肪酶处理在PC的sn-2位处包含EPA和DHA的磷虾油，生成LPC-EPA和LPC-DHA。向正常小鼠饲喂该制备剂致使视网膜EPA和DHA显著增加。包含EPA和DHA的仅呈甘油三酯形式的鱼油的类似治疗对视网膜EPA或DHA无作用。
图24示出以PC、TAG或LPC形式饲喂的膳食DHA掺入大鼠视网膜脂质中。每日将在250μL玉米油中呈TAG-DHA、di-DHA PC或LPC-DHA形式的10mgDHA灌喂正常雄性Sprague-Dawley大鼠(8周龄；每组n＝5)30天。另外，使用半剂量的LPC-DHA(5mg DHA)以与预期在消化期间由di-DHA PC生成的LPC-DHA的量相当。所有动物都食用不含DHA但包含每克食物17.4mgα-亚麻酸(18:3,n-3)的常规啮齿动物食物。如文中所述，通过GC/MS来分析视网膜FA。在此示出20:4(n-6)、20:5(n-3)、22:5(n-3)和22:6(n-3)的百分比组成。总FA组成在表1中示出。通过单因素方差分析与Tukey多重事后检验(Graphpad Prism 8.0)来确定治疗组之间的差异显著性。没有共同上标的条彼此存在显著性差异(p<0.05)。TG：三酰甘油；PC：磷脂酰胆碱；LPC：溶血磷脂酰胆碱；FA：脂肪酸；GC/MS：气相色谱法/质谱法。
图25示出膳食中不含(未酯化的)DHA、sn-1DHA-LPC和sn-2DHA LPC对小鼠视网膜FA的作用。每日将在80μL玉米油中呈游离DHA、sn-1DHA LPC或sn-2DHA LPC形式的1mg DHA灌胃正常雄性小鼠(C57 BL/J6，16周龄)30天。通过GC/MS分析视网膜FA组成。在此仅示出花生四烯酸和ω-3FA的值(平均值±SD，8只动物/组)。总FA组成在表2中示出。通过单因素方差分析与Tukey事后校正，没有共同上标的条彼此之间存在显著性差异(p<0.05)。SD：标准偏差；sn-1和sn-2：立体特异性编号分别为1和2；LPC：溶血磷脂酰胆碱；DHA：二十二碳六烯酸。
图26示出包含DHA的小鼠视网膜磷脂的分子物质。如图2所述，向动物灌喂游离(未酯化)DHA或LPC-DHA的两种异构体。如文中所述，使用17:0LPC、17:0–17:0PC和17:0–17:0PE作为内标，通过LC/MS/MS使用多反应监测来分析包含DHA的PC(A)和PE(B)的分子物质。通过单因素方差分析和Tukey事后分析(平均值±SD)，6只动物/组)，没有共同上标的条彼此之间存在显著性差异。PE：磷脂酰乙醇胺；PC：磷脂酰胆碱；sn-1和sn-2：立体特异性编号分别为1和2；DHA：二十二碳六烯酸；LC/MS/MS：液相色谱法/串联质谱法；SD：标准偏差；LPC：溶血磷脂酰胆碱；DHA：二十二碳六烯酸。
图27示出饲喂未处理的和脂肪酶处理的鱼油和磷虾油对小鼠视网膜FA的作用。向正常雄性小鼠(8周龄)饲喂包含7％总脂肪并补充有呈鱼油或磷虾油形式的0.264％EPA+DHA的饮食(AIN93G)，这些饮食已用毛霉脂肪酶处理(或未处理)。向小鼠随意饲喂饮食30天，并通过GC/MS分析视网膜FA。在此示出20:4(n-6)、20:5(n-3)、22:5(n-3)和22:6(n-3)的百分比(平均值±SD，5只小鼠/组。总FA组成在表3中示出。通过单因素方差分析和Tukey事后分析，没有共同上标的条彼此之间存在显著性差异。KO：磷虾油；FO：鱼油；FA：脂肪酸；EPA：二十碳五烯酸；GC/MS：气相色谱法/质谱法；DHA：二十二碳六烯酸。
定义
在本公开通篇中，应当将相关术语理解为与其在相关领域，即药物化学、医学、生物学、生物化学和生理学的领域中确立的典型含义相一致。
然而，如在下文中对某些术语进行了进一步的阐释和描述。
一下缩写应具有所说明的含义：ARA：花生四烯酸(20:4，n-6)；BBB：血脑屏障；BDNF：脑源性神经营养因子；DHA：二十二碳六烯酸(22:6，n-3)；DPA：二十二碳五烯酸(22:5，n-3)；EPA：二十碳五烯酸(20:5，n-3)；FA：一种或更多种脂肪酸；FO：鱼油；GC/MS：气相色谱法/质谱法；KO：磷虾油；LC/MS/MS：液相色谱法/串联质谱法；LPC：溶血磷脂酰胆碱；PC：磷脂酰胆碱，TAG：三酰甘油。
“磷虾油”是指由南极磷虾(南极磷虾(Euphausia superba))的物种制备的提取物。磷虾油中最重要组分中的两种是呈DHA和EPA形式的ω-3脂肪酸，以及磷脂衍生的脂肪酸(PLFA)，主要是磷脂酰胆碱(替代地称为海洋卵磷脂)。磷虾油是商购的。
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术语“2-lysoPC-DHA”和“2-LPC-DHA”在本文中可互换使用并且是指根据式1的化合物，其中，R2是OH。
术语“2-lysoPC-EPA”和“2-LPC-EPA”在本文中可互换使用并且是指根据式2的化合物，其中，R2是OH。
术语“2-lysoPC-DPA”和“2-LPC-DPA”在本文中可互换使用并且是指根据式5的化合物，其中，R2是OH。
术语“2-lysoPC-SDA”和“2-LPC-SDA”在本文中可互换使用并且是指根据式6的化合物，其中，R2是OH。
术语“1-lysoPC-DHA”和“1-LPC-DHA”在本文中可互换使用并且是指根据式3的化合物，其中，R1是OH。
术语“1-lysoPC-EPA”和“1-LPC-EPA”在本文中可互换使用并且是指根据式4的化合物，其中，R1是OH。
术语“1-lysoPC-DPA”和“1-LPC-DPA”在本文中可互换使用并且是指根据式7的化合物，其中，R1是OH。
术语“1-lysoPC-SDA”和“1-LPC-SDA”在本文中可互换使用并且是指根据式8的化合物，其中，R1是OH。
术语“lysoPC-DHA”和“LPC-DHA”在本文中可互换使用并且包括1-lysoPC-DHA和2-lysoPC-DHA两者。
术语“lysoPC-EPA”和“LPC-EPA”在本文中可互换使用并且包括1-lysoPC-EPA和2-lysoPC-EPA两者。
术语“lysoPC-DPA”和“LPC-DPA”在本文中可互换使用并且包括1-lysoPC-DPA和2-lysoPC-DPA两者。
术语“lysoPC-SDA”和“LPC-SDA”在本文中可互换使用并且包括1-lysoPC-SDA和2-lysoPC-SDA两者。
术语“EPA”是指二十碳五烯酸。
术语“DHA”是指二十二碳六烯酸。
术语“DPA”是指n3-二十二碳五烯酸。术语“n3”表示该化合物是ω-3脂肪酸。
术语“SDA”是指硬脂酸。
如本文所用与本发明的组合物有关的EPA、DHA、DPA、SDA是指可以与脂质主链诸如与磷脂、溶血磷脂、三酰甘油、二酰甘油、单酰甘油或任何其它脂质主链结合的脂肪酸链，或者它可以作为游离脂肪酸或乙酯存在于组合物中。
术语“总LPC”在本文中用于描述组合物中溶血磷脂酰胆碱的总含量。
术语“总磷脂”在本文中用于描述组合物中包括溶血磷脂在内的磷脂的总含量。
如本文所用，术语“静脉内给药”是指将液体物质直接递送到静脉中的给药方式。静脉内给药途径可用于注射(使用高压注射器)或输注(通常仅使用由重力提供的压力)。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指不同于权利要求中提及的LPC组合物的组分并且其通常与油性药物一起使用的物质。这样的赋形剂包括但不限于三油酰甘油、大豆油、红花油、芝麻油、蓖麻油、椰子油、甘油三酯、三丁酰甘油、三己酰甘油、三辛酰甘油、维生素E、抗氧化剂、α-生育酚、抗坏血酸、甲磺酸去铁胺、巯基乙酸、乳化剂、卵磷脂、聚山梨醇酯80、甲基纤维素、明胶、血清白蛋白、脱水山梨糖醇月桂酸酯(sorbitan lauraute)、脱水山梨糖醇油酸酯(sorbitan oleate)、脱水山梨糖醇三油酸酯(sorbitan trioleate)、聚乙二醇(PEG)、PEG 400、聚乙二醇改性的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、泊洛沙姆、甘油、山梨糖醇、木糖醇、pH调节剂；氢氧化钠、抗微生物剂EDTA、苯甲酸钠、苯甲醇和蛋白诸如白蛋白。药学上可接受的赋形剂必须在与组合物的其它成分相容且对其接受者无害的意义上是可接受的。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域公知的各种各样的有机和无机反荷离子的药学上可接受的盐，并且仅作为示例包括钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵，并且当分子包含碱性官能团时，有机酸或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。合适的盐包括P.Heinrich Stahl,Camille G.Wermuth(Eds.),Handbook of pharmaceutical salts properties,Selection,and Use；2002中描述的那些。
术语“防病(prophylaxis)”意指为预防而非治疗疾病或病症而采取的措施。
术语“有效量”是指本文提供的所公开化合物或组合物的足以影响细胞、组织、系统、动物或人的有益或期望的生物学、情绪、医学或临床反应的量。有效量可以以一次或更多次给药、应用或用料来给药。该术语还可以在其范围内包括有效增强或恢复到基本正常的生理功能的量。
术语“治疗有效量”是本领域公知的术语。在某些实施方式中，该术语是指本文公开的组合物的以适用于医学治疗的合理益处/风险比率产生一些期望的作用的量。在某些实施方式中，该术语是指在一段时间内消除、减轻或缓解医学症状所必需的量或足以在一段时间内消除、减轻或缓解医学症状的量。有效量可以取决于因素诸如所治疗的疾病或病症、所给药的特定组合物、受试者的大小或者疾病或病症的严重程度而变化。本领域普通技术人员可以凭经验确定特定组合物的有效量，而无需过度实验。
例如，本领域技术人员完全能够以低于实现所期望的治疗作用所需的水平开始化合物的剂量并逐渐增加用量直至实现期望的作用。如果期望，为了给药的目的，可以将有效每日剂量分成多个剂量。因此，单剂量组合物可以包含这样的量或其约数以构成每日剂量。如果有任何禁忌症，可以由医生个人调整用量。通常优选使用本发明药剂的最大剂量(单独或与其它治疗剂组合)，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，出于医学原因、心理原因或几乎任何其他原因，患者可能坚持较低剂量或可耐受剂量。
例如，可以通过确定治疗或药物的生理作用，诸如给药治疗剂和/或药剂之后疾病症状的减轻或消失来测量对治疗有效剂量的所公开的化合物和/或药物组合物的反应。其它测定对于本领域普通技术人员而言是已知的并且可以用于测量反应的水平。可以改变治疗的量，例如通过增加或减少公开化合物和/或药物组合物的量、通过改变所给药的公开化合物和/或药物组合物、通过改变给药途径、通过改变用量定时等等。可以改变剂量，并且可以每日以一个或更多个剂量给药一天或若干天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到用于适当用量的指导。
术语“治疗”在本领域中是公知的并且包括预防可能易该疾病、疾患和/或病症但尚未被诊断为患有该疾病、疾患和/或病症的受试者中发生的疾病、疾患或病症；抑制疾病、疾患或病状，例如阻碍其进展；和缓解疾病、疾患或病症，例如引起疾病、疾患和/或病症消退。治疗疾病或病症包括改善特定疾病或病症的至少一种症状，即使潜在的病理生理学不受影响，诸如治疗选自眼的炎症、角膜神经异常和眼表面擦伤的干眼病；或者选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、非增殖性视网膜病变、增殖性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜色素变性、中央静脉阻塞和青光眼的神经退行性疾病；以及其它相关疾病或任何其它医学病症，在本领域中是公知的并且包括给药组合物，相对于未接受该组合物的受试者，给药该组合降低受试者的医学病症的症状的频率或延迟其发作。
具体实施方式
除非本文特别定义，否则所使用的全部技术和科学术语具有的含义与医学、药理学、药物化学、生物学、生物化学和生理学领域的技术人员通常理解的含义相同。
与本文描述的方法和材料相似或等效的全部方法和材料都可以用于本发明的实践或测试，本文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献均通过援引整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
在本文中说明数值限制或范围的情况下，包括端点。此外，数值限制或范围内的所有值和子范围都被特别包括在内，如同明确写出一样。
如先前所讨论的，包括干眼病(DED)(Deinema et al.,American Academy ofOphthalmology 2016,ISSN 0161-6420)在内的许多医学病症要么与视网膜ω-3水平低有关，要么受益于视网膜长链ω-3水平升高。在这方面，DHA、EPA、DPA和SDA是特别受关注的ω-3脂肪酸。
因此，需要用于增加视网膜中ω-3脂肪酸水平，以及尤其是增加视网膜中DHA、EPA、DPA和/或SDA水平的方法。
与其它组织不同，ω-3的摄取不是通过视网膜中的脂蛋白受体发生的。先前动物模型研究已经报道，呈LPC形式的DHA经由Mfsd2a穿过血视网膜屏障，Mfsd2a是钠依赖性溶血磷脂酰胆碱(LPC)同向转运体，该同向转运体转运包含DHA的LPC和其它长链脂肪酸。
视杆外节中的眼的光感受器膜盘(photoreceptor membrane discs)高度富含视觉色素视紫红质和ω3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)。眼从血液中获取DHA，并且已经证实LPC经由Mfsd2a转运是眼中DHA摄取和光感受器膜盘发育的重要途径。此外，已经证实，在光感受器发育之前，Mfsd2a在胚眼的视网膜色素上皮中高表达，并且视网膜色素上皮是眼中Mfsd2a表达的主要位点。
正如Querques等人所评论的，在体内，视网膜具有的DHA浓度最高，一些研究表明，ω-3多不饱和脂肪酸可乙在减少视网膜疾病的发作和进展方面具有保护作用(Querqueset al.,J Nutr Metab.2011；2011:748361)。已提出高浓度的DHA优化光感受器膜的流动性、视网膜完整性和视觉功能。此外，许多研究表明DHA在视网膜中起到保护作用，例如抗凋亡作用。在这篇评述中，公开了ω-3的膳食摄取影响AMD的发病率。
此外，关于磷虾油补充剂的研究证实，每日适当剂量的磷脂形式为主的ω-3EFA(如在磷虾油中)3个月，使得降低DED患者的泪液渗透压并提高泪液稳定性。还证实，相对于安慰剂，来自磷虾油的磷脂可能会带来额外的治疗益处，改善DED症状并降低白细胞介素17A的基础泪液水平(Deinema et al,2017)。
尽管通常包含ω-3EFA的膳食补充剂似乎既能影响眼部疾病的患病率，并且也有可能治疗这样的疾病，但摄取和作用似乎受ω-3以何种递送形式的影响。
这在实例中得到了证实。例如，实施例4描述了与来自普通磷虾油和鱼油的EPA和DHA相比，视网膜的EPA和DHA含量两者都更多地从脂肪酶处理的磷虾油中富集。鉴于这一结果，本发明的一个目的是提供将增加眼部组织和视网膜中EPA和DHA的摄取以及优化眼部组织中的ω-6/ω-3比率的组合物。不受理论束缚，据信增加ω-3必需脂肪酸的摄取将通过调节细胞因子的产生来改变眼的炎性状态，从而有助于治疗和预防炎症。由于源自ω-6脂肪酸途径的大多数类花生酸是促炎症的，因此ω-3EFA使前列腺素代谢偏向于产生抗炎类花生酸，这限制并解决了炎症。
在现有技术中已经指出14个或更多个碳原子的长度对于通过Mfsd2a转运蛋白穿过血脑屏障(BBB)或血视网膜屏障(BRB)的转运是必不可少的。认为DHA、EPA、SDA和DPA是对于人的积极健康具有非常重要的作用，它们全部都具有超过14个碳原子。因此，基于我们目前掌握的信息，当与LPC结合时，这些脂肪酸的每一种及全部都应当有效地转运穿过血视网膜屏障。因此，在本研究中选择LPC-DHA和LPC-EPA作为模型分子(实施例2-4)，但认为本文提供的关于眼摄取的所有数据也示出上文提及的其他两种ω-3脂肪酸即SDA和DPA的预期摄取谱。
在本研究中，LPC-DHA和LPC-EPA通过口服给药和静脉内给药两种方式来给药。对于静脉内给药，决定将LPC-DHA和LPC-EPA与一种或更多种药学上可接受的赋形剂混合。Sigma Aldrich提供的Intralipid(IV)与油性物质相容，并且因此被选择作为一种或更多种药学上可接受的赋形剂。实施例2至4中使用的药物组合物的进一步细节则参考实施例1。
32只雄性Sprague Dawley大鼠接受了LPC-DHA或LPC-EPA的口服给药或单次静脉内给药。静脉内剂量经30秒以缓慢推注方式直接给药于尾静脉。在以下时间的每一个时间处通过过量的二氧化碳气体对单只大鼠安乐死：施用后0.5、3、8、24、72、96、168和336小时。收集后立即将每个屠体在己烷/固体二氧化碳混合物中速冻，并然后储存在大约-20℃，等待进一步分析。
如实施例2中详述的，对冷冻的屠体进行眼部定量放射自显影，以研究在施用后0.5、3、8、24、72、96、168和336小时眼部组织中DHA和EPA的摄取。
LPC-DHA的最终结果呈现在实施例2的表1a和1b中。LPC-EPA的最终结果呈现在实施例3的表2a和2b中。数据也图示在图8-10中。
当血管内给药以避免首先暴露于肠道时，呈LPC形式的DHA和出乎意料地还有EPA(如通过它们各自的14C放射性标记的羧酸残基所测量的)呈现出非常快速且持久的摄取以及大量积聚到眼部组织中。对于以短血管内(i.v.)推注给予的LPC-EPA，证实了前24小时的浓度时间曲线下面积(AUC)是口服施用LPC的等效测量值大于5倍。对于以短血管内(i.v.)推注给予的LPC-DHA，证实了前24小时的浓度时间曲线下面积(AUC)是口服施用LPC-DHA的等效测量值大于40倍。这证实了可以避免首先暴露于肠道的给药途径致使LPC-EPA和LPC-DHA非常快速且持久地摄取到眼部组织中。
实施例3提供了来自使用包含LPC-EPA和LPC-DHA的不同磷虾油溶血磷脂组合物进行三周每日施用的数据。24只雄性大鼠被分组，并且接受每日口服灌胃包含橄榄油、不同剂量的LPC组合物和Superba增强型磷虾油3周。提取并分析视网膜FA。
图1和图2示出EPA的结果。其证实了强剂量反应关系，其中更高剂量的EPA与更高的视网膜EPA浓度(图1)和EPA/ETA(20:4)比率增加相关(图2)。二十碳四烯酸(ETA)的一种异构体是花生四烯酸，一种ω-6脂肪酸。EPA/ETA比率是ω-3/ω-6转变的指标，这种转变随着ω-3PUFA摄取的增加而发生。如所解释的，据信这对眼的炎性状态有积极影响。如引言中所述，ω-6脂肪酸与炎症有关，而ω-3脂肪酸诸如EPA和DHA与抗炎信号有关。如可以参见图15，饲喂了粗制溶血磷脂组合物的大鼠示出比饲喂了相似剂量的Superba增强型磷虾油的大鼠更高的视网膜EPA/ETA比率。这意味着与饲喂了Superba增强型磷虾油和橄榄油的大鼠相比，饲喂了LPC组合物的大鼠在视网膜中示出更有利的EPA特性，并且此外，更高剂量的溶血磷脂组合物与视网膜中更有利的EPA特性相关。
对图3的观察表明，视网膜EPA特性的改善可能与血浆中存在的更高量的LPC-EPA以及随后经由mfsd2a增加的视网膜EPA摄取有关。例如，以高剂量提供的粗制品(第4组)示出血浆中最高水平的LPC-EPA以及最高的视网膜EPA含量和改善的EPA/ETA比率。
图4和图5与DHA的结果有关。对于DHA，它还示出强剂量反应关系，较高剂量的溶血磷脂组合物与较高的DHA/ETA比率以及粗制品高剂量组中特别显著的DHA/ETA比率增加相关。这表明无论溶血磷脂产品纯度的差异如何，DHA都以剂量依赖性方式从溶血磷脂组合物中被吸收到视网膜中。
图5进一步描绘了粗制品高剂量组(第4组)，示出在研究时期结束时(T2)最高水平的LPC-DHA，这支持了经由Mfsd2a发生穿过血视网膜屏障摄取DHA的观点。
图6证实了眼EPA浓度与总脂肪酸的相关性。如可以参见图6，较高剂量的“粗制品”溶血磷脂组合物与相对于总脂肪酸较高的视网膜EPA浓度相关。
图7示出花生四烯酸(ARA；20:4n-6)、DHA剂量和测试产品之间的关系。图7示出，相对于总脂肪酸，较高剂量的“粗制品”DHA/EPA溶血磷脂组合物与较低水平的视网膜ARA浓度相关，并且与相当剂量的增强型Superba相比，粗制品溶血磷脂组合物示出更明显的ARA降低。这再次表明增加溶血磷脂组合物的剂量与视网膜中更有益的脂肪酸特性有关。
因此，实施例3证实了口服给药途径可以导致视网膜的有利脂肪酸含量，这将对视网膜的炎性状态具有积极作用。基于这些结果，发明人提出了包括本文所述LPC组合物的口服膳食补充剂，用于如本文公开的眼病的疗法，诸如预防性疗法。
因此，在第一方面中，本发明涉及用于治疗、预防和/或缓解眼的疾病或病症的一种或更多种症状和/或体征的方法，所述方法包括向有此需要的受试者给药有效量的包括含有选自由式1至8中任一项及其任意组合组成的组的LPC-化合物的溶血磷脂酰胆碱(LPC)组合物的制剂，从而改善、控制、减轻或缓解所述疾病或病症的症状：
Figure BDA0003872494670000241
其中
R1是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；
R2是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；以及
n是0、1或2。
在根据本发明的一种实施方式中，R1是OH，以及R2是OH。
根据本发明的替代方面涉及本发明的第一方面，其中，R1是OH或保护基团，以及R2是OH或保护基团。保护基团的一个实例是O-CO-(CH2)n-CH3，其中，n是0、1或2。
保护基团优选地为以下基团，该基团不干扰与Mfsd2a转运蛋白结合并同时阻止ω-3(即DHA、EPA、SDA和DPA)酰基基团迁移。如果ω-3脂肪酸部分(例如，DHA部分、EPA部分、SDA部分和DPA部分)位于甘油主链的sn-1位，则保护基团通常会阻止ω-3脂肪酸部分从sn-1位迁移到sn-2位。如果ω-3脂肪酸部分(例如，DHA部分)位于甘油主链的sn-2位，则保护基团通常将阻止ω-3脂肪酸部分从sn-2位迁移到sn-1位。
式1和3是指具有连接DHA部分的化合物。式2和4是指具有连接EPA部分的化合物。式5和7是指具有连接n-3DPA部分的化合物。式6和8是指具有连接SDA部分的化合物。在实践中，原则上，DHA、EPA、DPA和SDA部分可以被任何ω-3脂肪酸取代，只要ω-3脂肪酸具有14个或更多个C原子即可。然而，DHA、EPA、DPA和SDA被认为与人的眼健康最相关。
根据本发明的替代方面涉及本发明的第一方面，其中，DHA、EPA、DPA和SDA部分被以下项取代：任何ω-3部分；至少i)在其链中具有14个或更多个C原子的任何ω-3部分或ii)具有对应于14个或更多个C原子的链长度的长度的任何ω-3部分。
根据本发明的替代方面涉及本发明的第一方面，其中，DHA、EPA、DPA和SDA部分被DHA、EPA、DPA、ALA和SDA部分取代。
在本申请通篇中，术语LPC-化合物和术语“活性组分”/“活性成分”都是指式1至8的化合物。
本发明的第一方面中提及的一种或更多种活性组分都是具有连接至LPC的三酰甘油部分的DHA、EPA、DPA或SDA分子的LPC分子，其中，R1是OH以及R2是OH。LPC-DHA和LPC-EPA的技术作用已得到证实。基于WO2018162617和WO2008068413中呈现的数据，还据信本发明的第一方面中提及的一种或更多种活性组分将获得类似的作用，在所述一种或更多种活性组分中，R1是O-CO-(CH2)n-CH3，和R2是O-CO-(CH2)n-CH3；以及n是0、1或2，以及特别地，n＝0。
尽管在本文针对i.v.给药包括LPC组合物的制剂呈现的结果是令人印象深刻的，但是作用甚至可以例如通过包括药学上可接受的载体来进一步改善。脂质体可以例如为通过为油性物质提供疏水内部和面向亲水环境的亲水外部从而成为本发明油性成分的合适载体。此外，还已知LPC通常与血液中的蛋白诸如白蛋白相关以降低LPC的有效浓度。
本发明的包括LPC组合物的制剂可以包括或不包括一种或更多种溶剂，诸如乙醇和/或水。如果所述组合物包括一种或更多种溶剂，则可以将所述组合物中一种或更多种活性组分的量提述为按干重计组合物的％。然而，如果组合物不包括一种或更多种溶剂，则可以将组合物中一种或更多种活性组分的量提述为按重量计组合物的％。
在根据本发明的一种实施方式中，包括LPC组合物的制剂可以包括一种或更多种活性组分中的两种或更多种的组合。活性组分之一可以具有连接至甘油主链的DHA部分，以及另一种活性组分可以具有连接至甘油主链的EPA部分。
因此，在本发明的一种实施方式中，包括LPC组合物的制剂包括一种或更多种活性组分中的两种或更多种的组合。活性组分之一具有连接至甘油主链的DHA部分，以及另一种活性组分具有连接至甘油主链的EPA部分。在优选的实施方式中，具有连接至甘油主链的DHA部分的活性组分与具有连接至甘油主链的EPA部分的活性组分具有特定的摩尔比。具有连接至甘油主链的DHA部分的活性组分：具有连接至甘油主链的EPA部分的活性组分的摩尔比优选地在1:1至10:1的范围内，诸如在1:1至7:1的范围内，或在1:1至5:1范围内，或在1:1至3:1范围内。在根据本发明的另一种实施方式中，具有连接至甘油主链的EPA部分的活性组分：具有连接至甘油主链的DHA部分的活性组分的摩尔比优选地在1:1至10:1的范围内，诸如在1:1至7:1的范围内，或在1:1至5:1范围内，或在1:1至3:1范围内。
参考说明如何计算摩尔比的以下实例。如果组合物包括10mol LPC-DHA和2molLPC-EPA，则具有连接至甘油主链的DHA部分的活性组分与具有连接至甘油主链的EPA部分的活性组分的摩尔比为10:2，即5:1。如果没有特别说明，则LPC-EPA的摩尔数是1-LPC-EPA的摩尔数+2-LPC-EPA的摩尔数，LPC-DHA的摩尔数是1-LPC-DHA的摩尔数+2-LPC-DHA的摩尔数。
先前已经讨论过，ω-3脂肪酸部分在甘油主链上的位置可能影响眼摄取脂肪酸。因此，在根据本发明的一种实施方式中，列出的ω-3脂肪酸部分与甘油主链的sn1位键合。在根据本发明的另一种实施方式中，列出的ω-3脂肪酸部分与甘油主链的sn2位键合。在根据本发明的替代实施方式中，具有与甘油主链的sn1位结合的ω-3脂肪酸部分的活性组分与具有与甘油主链的sn1位结合的ω-3脂肪酸部分的活性组分具有特定摩尔比。具有与甘油主链的sn2位结合的ω-3脂肪酸部分的活性组分：具有与甘油主链的sn1位结合的ω-3脂肪酸部分的活性组分的摩尔比优选地在1:8至18:1的范围内，诸如在1:8至15:1的范围内，或在1:8至10:1的范围内。
参考说明如何计算摩尔比的以下实例。如果组合物包括5mol2-LPC-DHA、5mol 2-LPC-EPA和2mol 1-LPC-DHA，则具有与甘油主链的sn1位结合的ω-3脂肪酸部分的活性组分：具有与甘油主链的sn2位结合的ω-3脂肪酸部分的活性组分的摩尔比为10:2，即5:1。
本发明的第二个方面涉及富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。虽然磷虾油包含大量的呈磷脂形式的EPA和DHA，但这些脂肪酸位于磷脂的sn-2位，并在消化过期间由胰腺PLA2释放作为游离酸，然后作为TAG被吸收，并因此未有效地转运到脑中(16)。然而，如果我们用对sn-1位具有特异性的脂肪酶对磷虾油进行预处理，则EPA和DHA被释放作为LPC，然后作为磷脂吸收，并且更有可能被整合到脑中(图11)。
另一方面，由于鱼油不含磷脂，因此用脂肪酶处理不会生成LPC-EPA或LPC-DHA，但会释放出作为游离酸或单酰甘油的ω3脂肪酸，这些脂肪酸会作为TAG被吸收，并且因此不会在脑中富集ω3脂肪酸。在此项研究中，我们比较了在用脂肪酶处理之前和之后鱼油和磷虾油在正常小鼠中富集脑ω3脂肪酸的能力。结果清楚地示出，磷虾油的脂肪酶处理致使脑EPA和DHA的富集，而鱼油的脂肪酶处理指出对其增加脑EPA或DHA的能力没有作用。
本发明的一些另外实施方式的磷虾油组合物通过以下制备：通过在约40℃至约50℃的温度下在惰性气氛下，在过量的对磷虾油磷脂的sn-1位具有特异性的脂肪酶的存在下水解磷虾油足以确保sn-1酯键基本上完全水解的时间量。合适的脂肪酶包括来自米赫毛霉的脂肪酶、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶、Novozyme 435(来自念珠菌属(Candidasp)))和Lipozyme TLIM(来自嗜热真菌属(Thermomyces sp))等。在一些实施方式中，脂肪酶包括来自米赫毛霉的脂肪酶。在一些实施方式中，使用最高达按重量计过量50％的脂肪酶来水解磷虾油。在一些实施方式中，脂肪酶是固定化的。
在特定的实施方式中，在40℃下将磷虾油在95％乙醇中的溶液用按重量计1.33x的来自米赫毛霉的固定化脂肪酶处理搅拌约72小时，随后蒸发乙醇以提供脂肪酶处理的磷虾油组合物。
可以另外纯化如本文所述制备的脂肪酶处理的磷虾油以用作食品添加剂或掺入营养品或药物组合物中。用于纯化磷虾油组合物的方法在本领域中是已知的并且可以包括溶剂萃取、色谱法等。色谱纯化通常涉及将脂质提取物加载到硅胶柱上并用极性增加的溶剂洗脱。去除中性脂质和未反应的磷脂后，用甲醇洗脱lyso PC，以得到包含约85％EPA和DHA的纯化合物。
本文还公开了包括本发明的脂肪酶处理的磷虾油的组合物。本发明的制剂、组合物或物质可以多种方式，包括作为干粉末、作为胶囊、作为即饮品果汁或作为食品添加剂来制备。替代地，也可以将该制剂酿造、发酵、煮沸以产生煮熟物(compote)，来制备成醇或水提取物。一般而言，以任何方式使用如本文所述的提取物的任何制剂都将在本发明的精神范围内。
在一种实施方式中，脂肪酶处理的磷虾油组合物可以作为粉末包装和销售。然后可以用水重构粉末或与食物共混，并且从而被摄入用于药用、预防、营养或其它与健康相关的目的。替代地，可以封装粉末。然后可以将胶囊吞服或打开从而作为上述粉末来使用。最后，粉末可以形成固体丸剂。该固体丸剂可以溶解在水中服用，如上所述粉碎成粉末，或者可以吞服。
可以将脂肪酶处理的磷虾油掺入固体组合物中。固体组合物可以包括常规的无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
液体组合物可以例如通过以下来制备：通过将本文所述的脂肪酶处理的磷虾油和任选的佐剂在赋形剂诸如例如水、盐水、水性右旋糖、甘油、乙醇等中溶解、分散等，从而形成溶液或混悬剂。如果期望，液体组合物还可以包含少量无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠(triethanolamine sodium acetate)、油酸三乙醇胺盐等。制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显而易见的；例如，参见上文引用的Remington’sPharmaceutical Sciences。
其它实施方式包括使用渗透促进剂赋形剂，包括聚合物诸如：聚阳离子(壳聚糖及其季铵衍生物、聚-L-精氨酸、胺化明胶)；聚阴离子(N-羧甲基壳聚糖、聚丙烯酸)；以及硫醇化聚合物(羧甲基纤维素-半胱氨酸、聚卡波非-半胱氨酸、壳聚糖-硫代丁基脒、壳聚糖-巯基乙酸、壳聚糖-谷胱甘肽缀合物)。
对于口服给药，该组合物通常将采用片剂、胶囊、软胶囊的形式，或者可以是水性或非水性溶液、混悬剂或糖浆。用于口服使用的片剂和胶囊可以包括一种或更多种常用的载体，诸如乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。通常，本公开的组合物可以与以下项组合：口服的、无毒的、药学上可接受的的惰性载体，诸如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨糖醇等。此外，当期望或必要时，也可以将合适的粘结剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘结剂包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、黄芪胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
用于口腔给药的制剂包括片剂、锭剂、凝胶等。替代地，可以使用本领域技术人员已知的经粘膜递送系统进行口腔给药。本公开的提取物也可以使用常规的经皮药物递送系统即经皮“贴剂”通过皮肤或粘膜组织进行递送，其中药剂通常包含在层压结构中，该层压结构用作药物递送装置以固定至体表。在这种结构中，药物组合物通常包含在上背衬层下方的层或“储器”中。层压装置可以包含单个储器，或者它可以包含多个储器。一方面，储器包括药学上可接受的接触胶粘剂材料的聚合物基质，其用于在药物递送期间将系统固定至皮肤。合适的皮肤接触胶粘剂材料的实例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。替代地，含药物的储器和皮肤接触胶粘剂作为单独和不同的层存在，储器下方的胶粘剂在这种情况下可以是如上所述的聚合物基质，或者可以是液体或凝胶储器，或者可以采取其它形式。这些层压材料中的背衬层用作装置的上表面，用作层压结构的主要结构元件，并为装置提供了很大的灵活性。选择用于背衬层的材料应当对于活性剂及存在的任何其它材料基本上是不可渗透的。
当使用液体混悬剂时，活性剂可以与任何口服的、无毒的、药学上可接受的的惰性载体诸如乙醇、甘油、水等以及与乳化剂和助悬剂组合。如果期望，也可以添加调味剂、着色剂和/或甜味剂。用于掺入本文的口服制剂的其它任选组分包括但不限于防腐剂、助悬剂、增稠剂等。
脂肪酶处理的磷虾油可以配制成软膏或乳膏。软膏是半固体制备剂，通常基于矿脂或其它石油衍生物。如在本领域中已知的，包含所选活性剂的乳膏是粘性液体或半固体乳剂，水包油或油包水。乳膏基质可水洗，并包含油相、乳化剂和水相。油相，有时也称为“内”相，通常由矿脂和脂肪醇诸如鲸蜡醇或硬脂醇组成；水相的体积通常超过油相(但不是必不然如此)，并且通常包含保湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。如本领域技术人员将理解的，待使用的特定软膏或乳膏基质是提供最佳药物递送的一种。与其它载体或载负载体一样，软膏基质应当是惰性的、稳定的、无刺激性和无致敏性。
本发明的另一方面提供了食品组合物，其包括本发明的脂肪酶处理的磷虾油。在某些实施方式中，根据本发明的脂肪酶处理的磷虾油可以用作健康功能食品或普通食品中的活性成分。本发明的食品组合物可以用于预防或治疗神经疾病诸如阿尔茨海默氏症。在这种情况下，本发明的脂肪酶处理的磷虾油可以不经进一步加工而添加，或者可以根据本领域已知的方法连同其它食品或食品成分一起使用。活性成分的量可以根据其预期目的诸如预防、保健或治疗目的适当地确定。本发明的食品组合物可以另外包含选自以下项中的一种或更多种添加剂：营养物、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和用于碳酸饮品的碳酸化剂。本发明的食品组合物可以另外包含用于生产天然果汁、果汁饮料和植物饮料的果肉或植物浆状物。这些成分可以单独使用或作为其混合物使用。基于100重量份的本发明的组合物，所述添加剂的比例不受限制，但通常选自0.01至0.1重量份的范围内。
当预期生产食品或饮料时，基于100重量份的食品或饮料的原材料，本发明的脂肪酶处理的磷虾油的添加量通常为15重量份或更少，优选10重量份或更少。在出于健康和卫生或保健目的而长时间服用食品或饮料的情况下，可以将西兰花或提取物的量调节至低于上面限定的限制。本发明的食品组合物不存在与安全相关的问题，因为它使用仅由天然存在的化学物质组成的天然产物或西兰花植物提取物。因此，西兰花或提取物也可以以超过上面限定的上限的量使用。
对食物的种类没有特别限制。可以与脂肪酶处理的磷虾油添加的食品的实例包括所有常见的食品，诸如肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、饼干、比萨饼、方便面、其它面条、口香糖、包括冰激淋在内的乳制品、汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合物。
饮料可以包含一种或更多种额外成分，诸如调味剂或天然碳水化合物，如一般饮料。天然碳水化合物可以是单糖，诸如葡萄糖和果糖；二糖，诸如麦芽糖和蔗糖；多糖，诸如糊精和环糊精，以及糖醇，诸如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。饮料可以包含一种或更多种甜味剂。作为甜味剂，例如，可以使用天然甜味剂，诸如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物，以及合成甜味剂、糖精和阿斯巴甜。
本发明的第三方面涉及包括根据本发明第一或第二方面的LPC组合物的制剂用于防病和/或疗法的用途。在一些优选的实施方式中，制剂是口服给药或静脉内给药。
眼表可能会受特定疾患诸如干眼(1)和角膜病变(2)影响。
眼周区域(3)的正确卫生对于眼表和整个眼的健康至关重要。
在根据本发明的第四方面的优选实施方式中，将受益于增加水平的视网膜DHA和/或EPA水平的病症是眼表疾患。
干眼病(DED)是全球最常见的眼病症之一，并且是去看眼科医生的主要原因。
DED是影响泪液膜和眼表的多因素疾病，并且引起泪液膜不适、视觉障碍和不稳定的症状，对眼表有潜在损害，伴随有泪液膜渗透压增加和眼表炎症(由DEWS II-2017定义)。
在根据本发明的第四方面的优选实施方式中，将受益于增加水平的视网膜DHA和/或EPA水平的病症是干眼病。
角膜病变
角膜是位于虹膜前面的透明膜，作为人眼最强大的会聚晶状体发挥作用。
影响角膜的病变非常常见，并且通常与随后的炎症发展有关。
角膜损伤包括擦伤(诸如限于眼表面的划伤或擦伤)、化学损伤(由进入眼的流体引起)、接触式眼镜或异物引起的病变。
由于涉及眼前段的手术治疗，也存在角膜病变。
青光眼是影响视神经的慢性退行性疾病，其特征是构成视神经的神经纤维受损伤，并导致视野丧失。如果不及时治疗，视野的逐渐缩小可能导致失明。
青光眼是重大的社会问题：它是全球第二大失明诱因，并且影响约6000万人，使超过800万人失明。另外，大约50％的青光眼受试者不知道患有青光眼。
青光眼是潜伏性疾病，因为我们经常在视觉变化已经发展到晚期时才发现这种疾病，而我们在此之前没有注意到任何症状。然而，如果早期诊断并适当治疗，它可以被有效的控制，让患者的余生都拥有良好的视觉。
存在与疾病发作相关的许多危险因素。主要有：
-高眼压(IOP)，
-年老，
-熟悉的倾向。
IOP值由在眼内循环的液体——房水决定。在健康的眼中，产生的房水和消除的房水之间的比率可以维持恒定的眼内压，通常在11到20mmHg之间。在存在青光眼的情况下，由于发生在小梁网允许这种流体从眼流出的结构)水平处的房水的消除流出减少，该比率会变化。
青光眼可按以下几种方式分类：
-根据病因，青光眼可以是原发性的，当它不存在其它眼或全身性疾病下发生时；或者是继发性的，当它与已存的病症相结合时；
-根据房水流出的变化，我们区分开角型青光眼和闭角型青光眼，该开角型青光眼是由于小梁网水平处的流出阻力增加，该闭角型青光眼中存在阻止房水到达到小梁网的解剖学问题；
-基于主要危险因素的值IOP，我们区分高压力青光眼和正常压力青光眼。
然后，如果IOP自出生以来就高于正常水平，则为先天性或获得性青光眼，如果在生命的最初几年期间出现，则为婴儿型青光眼。
在本发明的优选实施方式中，提供了包括根据第一方面或第二方面的LPC组合物的制剂用于抑制、预防或治疗青光眼的用途。
视网膜疾患
健康的视网膜对视觉至关重要，因为视网膜的特殊光感受器、视锥细胞和视杆细胞将光刺激转化为电脉冲，通过视神经传输到大脑，在那里发生对视觉图像的处理和感知。
许多严重的病患会影响视网膜，诸如：
-年龄相关性黄斑变性(AMD)，其引起黄斑(视网膜中央和最重要的区域)的进行性损伤，导致中央视觉逐渐丧失。
-糖尿病视网膜病变(DRP)：糖尿病的主要和最常见的眼部并发症。DRP的特征是病变影响患有1型或2型糖尿病(DM)两者的患者的视网膜毛细血管。如果不加以诊断和治疗，可能会引起失明。
-糖尿病性黄斑水肿(DME)是糖尿病的主要并发症之一，连同DRP，并且如果不加以治疗可严重妨碍中央视觉。发展DME的机会连同糖尿病的长度和严重程度而增加：约30％患有DM超过20年的患者会发展DME。
在根据任意上面方面的优选实施方式中，将受益于增加水平的视网膜DHA和/或EPA水平的病症是干眼病，诸如眼的炎症、角膜神经异常和眼表面的擦伤。
在一些实施方式中，眼的炎性疾病包括角膜营养不良、沙眼、盘尾丝虫病、葡萄膜炎、交感性眼炎和眼内炎。
在根据任意上面方面的替代实施方式中，将受益于增加水平的视网膜DHA和/或EPA水平的病症是选自由以下项组成的组的眼的神经退行性疾病：年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、非增殖性视网膜病变、增殖性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜色素变性、中央静脉阻塞和青光眼。
LPC组合物
在一些优选的实施方式中，根据如WO2019/123015中描述的方法分析LPC组合物，该文献通过援引整体并入本文。
在根据任意上述方面的一些实施方式中，LPC组合物包括式1至8的LPC化合物中的至少一种，及其任意组合：
Figure BDA0003872494670000351
Figure BDA0003872494670000361
在一些实施方式中，LPC组合物进一步包括不同于LPC的脂质，其选自由以下项组成的组:甘油三酯、乙酯、游离脂肪酸和磷脂诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。在一些实施方式中，不同于LPC的脂质来自不同来源，诸如非磷虾来源。
在一些实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计10-100％的量的总LPC，诸如LPC组合物的按重量计10％至100％，优选按重量计15％至100％，更优选按重量计20％至100％，进一步优选按重量计30％至100％，最优选按重量计50％至100％的量的总LPC。
在一些实施方式中，LPC组合物包括脂肪酸特性，其中DHA的量对应于组合物的按重量计5％至12％，其中，DHA为游离脂肪酸或乙酯或者与LPC组合物中的任何脂质结合。
在一种实施方式中，LPC组合物包括脂肪酸特性，其中，EPA的量对应于组合物的按重量计10％至24％，其中，EPA为游离脂肪酸或作为乙酯或者与LPC组合物中的任何脂质结合。
在一种实施方式中，LPC组合物进一步包括棕榈油酸和/或棕榈酸。
在一种实施方式中，LPC组合物包括脂肪酸特性，其中，棕榈油酸的量对应于组合物的按重量计2％至5％，其中，棕榈油酸为游离脂肪酸或作为乙酯或者与LPC组合物中的任何脂质结合。
在一种实施方式中，LPC组合物包括脂肪酸特性，其中，量为组合物的按重量计10％至15％，其中，棕榈酸为游离脂肪酸或作为乙酯或者与LPC组合物中的任何脂质结合。
在一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计至少35％的量的总磷脂。
在另外的实施方式中，与磷脂酰胆碱的量相比，LPC组合物包括占优势的量或大部分的根据本发明的至少一种LPC化合物。
在一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计至少23％、24％、25％、26％、27％或28％的量的总LPC。
在一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计至少60％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计至少90％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计90％至98％的量的总LPC。
在第一方面的一种实施方式中，LPC组合物包括对应于LPC组合物的按重量计约95％的量的总LPC。
例如，在一种实施方式中，LPC组合物包括按重量计60％至100％的总LPC，诸如按重量计约60％至95％的总LPC。
在本发明的一些实施方式中，LPC化合物是包含与由Aker Biomarine制造的PC相比占优势的量的LPC的任何磷虾来源的加工磷脂产品。
在任意上面方面的另外实施方式中，LPC化合物选自LPC-EPA、LPC-DHA及其任意组合。
在任意上面方面的另外实施方式中，LPC组合物是磷虾油LPC组合物。在一些优选的实施方式中，磷虾油LPC组合物富含LPC-EPA和LPC-DHA。在一些优选的实施方式中，磷虾油组合物是脂肪酶处理的磷虾油。在一些实施方式中，脂肪酶处理的磷虾油如实施例4中所述制备。在一些优选的实施方式中，脂肪酶处理的磷虾油包括按重量计至少80％的LPC-DHA和LPC-EPA。在一些优选的实施方式中，脂肪酶是来自米赫毛霉的脂肪酶。在一些优选的实施方式中，脂肪酶是固定化的。
其它治疗用途
在第六方面，本发明涉及在上面第一和第二方面中描述的组合物和制剂在治疗神经疾患中的用途。在一些实施方式中，神经疾患选自帕金森氏症、精神分裂症、颅脑损伤、卒中和阿尔茨海默氏症。在一些特别优选的实施方式中，神经疾患是阿尔茨海默氏症。
在第七方面，本发明涉及在上面第一和第二方面中描述的组合物和制剂在治疗通过肝脏的DHA富集而减轻的肝脏疾病中的用途。在一些优选的实施方式中，肝脏疾病选自非酒精性脂肪肝(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
已经对本发明进行了一般性描述，通过参考某些特定实施例可以获得进一步的理解，除非另有说明，否则这些实施例在本文中仅出于说明的目的而提供，并且不旨在限制。
实验
实施例1：实施例2至4中使用的口服和静脉内制备剂的制备
材料
Figure BDA0003872494670000381
Figure BDA0003872494670000382
Figure BDA0003872494670000391
Figure BDA0003872494670000392
[14C]-LPC-DHA制剂，在本文中称为制剂A
根据以下目标说明制备后续静脉内给药的制剂：
Figure BDA0003872494670000393
Figure BDA0003872494670000401
按照如下将[14C]-LPC-DHA与脂类乳剂制剂混合以得到包含最终浓度为190mg/kg的磷脂和浓度为约1.5mg/kg(155μCi/kg)的[14C]-LPC-DHA的施用制剂：
在环境温度在氮气流下，将0.394mL乙醇[14C]-LPC-DHA (2361μCi/mL)分配到20mL玻璃小瓶中，并减少至大约0.30mL的最终体积。将5.70mL的20％脂类乳剂添加至浓缩的乙醇[14C]-LPC-DHA溶液中并轻轻涡旋混合以确保同质性。
[14C]-LPC-EPA制剂，本文中称为制剂B
根据以下目标说明制备后续静脉内给药的制剂：
Figure BDA0003872494670000402
按照如下将[14C]-LPC-EPA与脂类乳剂制剂混合以得到包含最终浓度为190mg/kg的磷脂和浓度为约1.5mg/kg(155μCi/kg)的[14C]-LPC-EPA的施用制剂：
在环境温度在氮气流下，将0.394mL乙醇[14C]-LPC-EPA (2361μCi/mL)分配到20mL玻璃小瓶中，并减少至大约0.30mL的最终体积。将5.70mL的20％脂类乳剂添加至浓缩的乙醇[14C]-LPC-EPA溶液中并轻轻涡旋混合以确保同质性。
[14C]-LPC-EPA和[14C]-LPC-DHA的口服施用制剂
通过将每种放射性标记化合物的乙醇溶液以10:90v/v放射性标记乙醇：改性磷虾油的浓度比掺入改性磷虾油LPC制剂中来制备[14C]-LPC-EPA和[14C]-LPC-DHA的口服施用制剂。
根据以下目标说明制备后续口服给药的每种制剂：
Figure BDA0003872494670000411
按照如下将[14C]-LPC-EPA与磷脂制剂混合以得到包含最终浓度为855mg/mL的磷脂和最终浓度为约1.5mg/kg(155μCi/kg)的[14C]-LPC-EPA的施用制剂：
制剂中乙醇的最终总浓度为大约10％。
将0.328mL乙醇[14C]-LPC-EPA(2361μCi/mL)分配到20mL玻璃小瓶中。添加0.172mL乙醇(占最高达10％体积)。将4.5mL改性磷虾油LPC制剂(在37℃的温度下)添加至浓缩的乙醇[14C]-LPC-EPA溶液中，并通过涡旋混合器和强力移液器混合以确保同质性。
将[14C]-LPC-DHA制剂掺入到磷脂制剂中，如上面中针对[14C]-LPC-EPA所述。
实施例2：眼部组织中LPC的摄取——口服给药和静脉内给药
将施用剂时的体重范围为213-289g以及大约7-8周龄的32只雄性SpragueDawley大鼠饲养在聚丙烯笼中并且除了施用期间的短时期外，保持在其中。对动物所在的房间进行恒温监测并连续记录数据(通常温度范围为21±2℃；湿度范围为55±10％)，并且每天暴露于12小时荧光灯和12小时黑暗中。在使用前，在标准动物房条件下平衡动物最少3天。在此时期监测动物的健康状况，并在使用前确认每只动物是否适合实验使用。
团粒饮食(RM1(E)SQC，Special Diets Services，Witham，英国，埃塞克斯郡)和水(来自家庭供水)在整个饲养、适应和施用后时期可随意获取。
根据实施例1中规定的剂量说明，16只大鼠接受制剂A或制剂B的单次静脉内给药(每种制剂8只)。在剂量施用前对每只大鼠进行称重，并基于体重和特定的剂量体积来计算给药的个体剂量。
对选择用于进行口服给药的16只大鼠进行禁食过夜，并在重新引入饮食后1小时给药剂量。用于口服给药的施用器具由注射器和灌胃管组成。在给药剂量期间，灌胃法为喂入食道以使制剂能够直接分配到胃中。
用于静脉内给药的施用器具由皮下注射器和针头组成。将剂量以缓慢推注直接给药于尾静脉30秒。
在向雄性大鼠给药制剂之后，在以下时间的每一个时间处通过过量的二氧化碳气体对单只大鼠安乐死：施用后0.5、3、8、24、72、96、168和336小时。
收集后立即将每个屠体在己烷/固体二氧化碳混合物中速冻，并然后储存在大约-20℃，等待通过QWBA(定量整体放射自显影)分析。
使用基于Ullberg工作的程序(Acta.Radiol.Suppl 118,22 31,1954)对冷冻的屠体进行QWBA。切片呈现大鼠身体的最高达五个不同水平以包括30至40个组织(经历充足放射性的存在)之间，其在脑、血液、肾脏和脾中的摄取公开于本文中。
将冷冻干燥的全身放射自显影切片暴露于存储荧光体成像板，并在黑暗中于环境温度下孵育最少五天。
将包含已知量的放射性(nCi/g，由Perkin Elmer生产)的一系列校准的自动放射照相[14C]微尺度与每个板上的动物切片一起暴露。
在眼部样品中并以微尺度测定放射性分布，并使用FujiFLA-5100荧光图像分析系统及相关的Tina(2.09版)和SeeScan(2.0版)软件进行量化。
对使用的每个曝光板进行有代表性的背景放射性测量。认为准确定量的限制是可见的最低[14C]微尺度。使用Seescan从微尺度生成标准曲线，并依此确定组织的放射性浓度(nCi/g)。为了计算重量当量/g数据，用nCi/g数据除以相关比活性(nCi/μg)。
表1a示出向雄性白化大鼠单次静脉内给药平均为1.5510mg/kg[14C]-LPC-DHA后眼部组织中的放射性总量。
表1b呈现了与1a中相同的数据，但以摩尔浓度并标准化至2.80微mol/kg(1.5949mg/kg)的剂量。
表2a示出向雄性白化大鼠单次静脉内给药平均1.4968mg/kg[14C]-LPC-EPA后眼部中的放射性总量。
表2b呈现了与2a中相同的数据，但以摩尔浓度并标准化至2.80微mol/kg(1.5218mg/kg)的剂量。
表3a示出向雄性白化大鼠单次口服施用平均1.6914mg/kg[14C]-LPC-DHA后眼部中的放射性总量。
表3b呈现了与3a中相同的数据，但以摩尔浓度并标准化至2.80微mol/kg(1.5949mg/kg)的剂量。
表4a示出向雄性白化大鼠单次口服施用平均1.6759mg/kg[14C]-LPC-EPA后眼部中的放射性总量。
表4b呈现了与4a中相同的数据，但以摩尔浓度并标准化至2.80微mol/kg(1.5218mg/kg)的剂量。
结果也呈现在图8-10中。
表1a：向雄性白化大鼠单次静脉内给药平均1.5510mg/kg[14C]-LPC-DHA后眼部组织中的放射性浓度(表示为μg DHA当量/g)。
Figure BDA0003872494670000431
Figure BDA0003872494670000441
表1b：数据如表1a中呈现，但表示为纳mol当量/kg，并归一化至2.80微mol(1.5949mg)LPC-DHA/kg的标准剂量
Figure BDA0003872494670000442
表2a：向雄性白化大鼠单次静脉内给药平均1.4968mg/kg[14C]-LPC-EPA后全部眼部组织中的放射性浓度(表示为μg EPA当量/g)。
Figure BDA0003872494670000443
Figure BDA0003872494670000451
表2b：数据如表1a中呈现，但表示为纳mol当量/kg，并归一化至2.80微mol(1.5218mg)LPC-EPA/kg的标准剂量
Figure BDA0003872494670000452
表3a：向雄性白化大鼠单次口服施用平均1.6914mg/kg[14C]-LPC-DHA后眼部组织中的放射性浓度(表示为μg DHA当量/g)。
Figure BDA0003872494670000453
Figure BDA0003872494670000461
表3b：数据如表1a中呈现，但表示为纳mol当量/kg，并归一化至2.80微mol(1.5949mg)LPC-DHA/kg的标准剂量
Figure BDA0003872494670000462
表4a：向雄性白化大鼠单次口服施用平均1.6759mg/kg[14C]-LPC-EPA后全部眼部组织中的放射性浓度(表示为μg EPA当量/g)。
Figure BDA0003872494670000463
Figure BDA0003872494670000471
表4b：数据如表1a中呈现，但表示为纳mol当量/kg，并归一化至2.80微mol(1.5218mg)LPC-EPA/kg的标准剂量
Figure BDA0003872494670000472
当进行口外给药以避免在口腔和肠道中首先暴露并降解时，LPC形式的DHA和出乎意料地还有EPA (如通过它们各自的14C放射性标记的羧酸残基所测量的)呈现出非常快速和持久的摄取以及大量积聚到眼部组织中，如表1至4和图8至10所示。
对于以短血管内(i.v.)推注给予的LPC-EPA，证实了前24小时的浓度时间曲线下面积(AUC)是口服施用LPC的等效测量值的大于5倍(图9)。
对于以短血管内(i.v.)推注给予的LPC-DHA，证实了前24小时的浓度时间曲线下面积(AUC)是口服施用LPC-DHA的等效测量值的大于40倍(图9)。
实施例3：包括LPC EPA和LPC DHA的组合的组合物的作用。
本实施例提供了来自使用包含LPC-EPA和LPC-DHA的不同磷虾油溶血磷脂组合物进行三周每日施用的数据。研究磷虾油溶血磷脂组合物是否会引起视网膜EPA和DHA含量增加是有意义的。这些油的EPA、DHA和总ω-3含量在下表5中给出。各种纯度的磷虾油溶血磷脂组合物及其生产先前已有详细描述(WO2019/123015)。
表5测试产品中EPA、DHA和总ω-3含量。
Figure BDA0003872494670000481
将24只雄性大鼠分成6组，并且每日接受口灌胃3周，其中包含：第1组)橄榄油(0mg/kg/天EPA和0mg/kg/天DHA)；第2组)粗制品(27％LPC)、低剂量(185mg/kg/天EPA和108mg/kg/天DHA)；3)粗制品(27％LPC)、中等剂量(370mg/kg/天EPA和217mg/kg/天DHA)；4)粗制品(27％LPC)、高剂量(926mg/kg/天EPA和543mg/kg/天DHA)；5)纯制品(89％LPC)，中等剂量(324mg/kg/天EPA和160mg/kg/天DHA)；6)Superba增强型磷虾油，中等剂量(379mg/kg/天EPA和219mg/kg/天DHA)。
在组织均质化后，提取视网膜FA并通过HPLC分析。如可以参见图1和图2中，存在强剂量反应关系，较高的EPA剂量与较高的视网膜EPA浓度(图1)和EPA/ETA(20:4)比率增加(图2)有关。出乎意料的是，图1未示出“粗制品”和“纯制品”磷虾油溶血磷脂组合物之间视网膜EPA浓度的差异。然而，饲喂了粗制品溶血磷脂组合物的大鼠示出比饲喂了相似剂量的Superba增强型磷虾油的大鼠更高的视网膜EPA/ETA比率。这意味着与饲喂了Superba增强型磷虾油和橄榄油的大鼠相比，饲喂了LPC组合物的大鼠在视网膜中示出更有利的EPA特性，并且此外，更高剂量的溶血磷脂组合物与视网膜中更有利的EPA特性相关。对图3的观察表明，视网膜EPA特性的改善可能与血浆中存在较高量的LPC-EPA(以及随后经由mfsd2a增加EPA摄取)有关，粗制品高剂量示出血浆中最高水平的LPC-EPA以及最高的视网膜EPA含量和EPA/ETA比率。
图4示出强剂量反应关系，较高剂量的溶血磷脂组合物与较高的DHA/ETA比率以及粗制品高剂量组中特别显著的DHA/ETA比率增加相关。这表明无论溶血磷脂产品纯度的差异如何，DHA都以剂量依赖性方式从溶血磷脂组合物中被吸收到视网膜中。图5进一步示出粗制品高剂量组在研究时期结束时(T2)的最高水平的LPC-DHA，这支持了经由Mfsd2a发生穿过血视网膜屏障摄取DHA的观点。
使用通过GC-FID对脂肪酸甲酯(FAME)的分析进一步评估脑EPA浓度与总脂肪酸的关系(图6)以及花生四烯酸(ARA；20:4n-6)、DHA剂量和测试产品之间的关系(图7)。GC-fid进一步支持HPLC数据，较高剂量的“粗制品”溶血磷脂组合物与相对于总脂肪酸较高的视网膜EPA浓度相关。此外，图7示出，相对于总脂肪酸，较高剂量的“粗制品”DHA/EPA溶血磷脂组合物与较低水平的视网膜ARA浓度相关，并且与相当剂量的增强型Superba相比，粗制品溶血磷脂组合物示出更明显的ARA降低。这再次表明增加溶血磷脂组合物的剂量与视网膜中更有益的脂肪酸特性有关。
实施例4：使用磷虾溶血磷脂组合物将EPA和DHA递送至脑、视网膜和肝脏。
材料和方法
磷虾油和鱼油是来自加拿大萨斯卡通的Bioriginal Food&Science Corporation的慷慨馈赠。BDNF的抗体获得自Abcam,Cambridge,MA)。17:0LPC,22:6LPC的标准品购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)。来自米赫毛霉的固定化脂肪酶购自Creative酶(Shirley,NY)。按照如下所述用脂肪酶处理磷虾油和鱼油：将油(15g)溶解于300mL的95％乙醇在水中(v/v)，并添加20g的固定化脂肪酶。在40℃在黑暗中，在氮气下，将反应混合物在轨道培养箱中以175rpm震荡72h。在真空下蒸发乙醇，并通过TLC和GC/MS分析样品的脂质和脂肪酸组成。通过TLC使用氯仿：甲醇：水(65:25:4，按体积计)的溶剂系统来分析对照和脂肪酶处理的磷虾油的样品。刮取对应于LPC、PC和PE的点并通过GC/MS分析脂肪酸组成。使用己烷：乙醚：乙酸(90:10:1，按体积计)的溶剂系统在TLC板上分离对照与脂肪酶处理的鱼油样品，并通过GC/MS分析对应于MAG、DAG、游离脂肪酸和TAG的点。
饮食和治疗.将包含相当量的总EPA和DHA(～1.2μmol/g饮食)的处理和未处理的磷虾油和鱼油与玉米油混合，以使饮食中的总脂肪达到7％，与AIN93G啮齿动物饮食共混，并制成团粒并由Diets Inc.真空密封。对照饮食仅包含玉米油。将饮食在-20℃下储存，并且每周使用前解冻。膳食油(包括混合玉米油)的脂肪酸组成在表6中示出。正如预期的，脂肪酶处理致使生成富含EPA和DHA的LPC。未处理的磷虾油的LPC中EPA+DHA的百分比为18％，而在脂肪酶处理的磷虾油中其为>80％。表7示出ω3脂肪酸(EPA+DHA)在膳食油的主要脂质级分中的分布。PC在未处理的磷虾油中包含最大百分比的总EPA+DHA，而LPC在脂肪酶处理的磷虾油中包含最大百分比。鱼油的脂肪酶处理导致EPA和DHA转变为游离脂肪酸，以及TAG转变为MAG。
所有实验均在UIC机构动物护理和使用委员会协议的伦理批准下进行。雄性C57BL/6小鼠(年龄，2个月)购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)。将小鼠随机分成5组，每组5只动物，并随意饲喂饮食30天。每周测量体重。30天时期后，用氯胺酮(90mg/ml)和赛拉嗪(xylazine)(10mg/ml)麻醉小鼠。使用肝素化注射器通过心脏穿刺抽取血液，并通过以1500x g离心15min制备血浆。然后用冰冷的100mM PBS(pH 7.4)经心脏灌注小鼠，并收获肝脏、心脏、脑和脂肪组织。进一步解剖脑以分离前额叶皮质、海马体、纹状体和小脑。将所有样本均在液氮中快速冷冻并在80℃下储存直至分析。
统计学使用GraphPad Prism 8.0软件(La Jolla,CA)进行统计学分析。通过单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验来确定治疗之间的显著性。
脂质提取和脂肪酸分析基本上按照Ivanova等人(27)的描述来提取用于LPC物质和异构体的LC/MS分析的血浆样品。在添加17:0LPC(10μg)内标后，用900μl酸化甲醇(0.01NHCl,pH 4.0)对血浆样品(100μl)进行脱蛋白。将样品在Branson超声仪中超声处理3min，并在4℃下以21,500x g离心10min。收集上清液，并将10μl注入HPLC系统。按照此前所述(28)，使用Atlantis(Waters Corp.,Milford,MA)HILIC柱，并通过正模式电喷雾质谱法中的多反应监测来进行LPC异构体的分析。LPC物质的定量使用17:0的内标进行，并应用校正因子(x0.233)来解释17:0LPC和22:6LPC物质的离子强度差异，这是使用已知标准单独确定的。我们先前的研究不包括该校正因子，并且因此先前报道的ω3LPC物质的血浆值(16,17,29)是在此报道的约4倍高。
对于脂肪酸分析，通过Bligh和Dyer程序(30)提取脂质，用甲醇HCl制备脂肪酸甲酯，并按照先前所述通过GC/MS进行分析(16)。
蛋白质印迹分析通过蛋白质印迹分析来确定脑级分中的BDNF水平。简而言之，将组织在裂解缓冲液(50mM Tris、pH 8.0、25mM Kcl、0.5mM EDTA、Nonidet P-40、0.1mMEGTA、10μL/mL抑肽酶、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM Na4P2O7、1mM Na4MO4、1％蛋白酶抑制剂混合物、1mM苯甲磺酰氟、10mM NaF、1mM NaV)中均匀化，并将混悬剂置于冰上30min，并在4℃下以13000×g离心10min。将上清液(20μg蛋白)在10％SDS凝胶上以80V电泳2h。将分离的蛋白转移到用甲醇冲洗的聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Burlington，MA)，并在4℃下用包含0.1％吐温-20的Tris缓冲盐水(TBST)中的5％(w/v)脱脂奶粉封闭膜1h。在4℃下，用TBST中的第一抗体(BDNF,EPR1292,Abcam,Cambridge,MA)对膜进行探测过夜。用TBST洗涤膜3次，并在室温下用辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG(Cell Signaling Technologies,Danvers,MA)孵育1h。最后，用TBST洗涤膜3次，用增强的化学发光(ECL)检测试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)显色1min，通过Bio-RadChemiDoc MP成像系统对各自蛋白进行定量，并将结果表示为BDNF/β-肌动蛋白比率。
结果
用不同饮食处理的小鼠的食物摄取或体重没有显著性差异(结果未示出)。
血浆ARA(20:4)、EPA(20:5)、DPA(22:5)和DHA(22:6)的百分比组成在图12中示出。尽管未处理的鱼油和磷虾油的EPA和DHA仅适度增加，但鱼油以及磷虾油的脂肪酶处理致使血浆中EPA和DHA更高的积累。就血浆EPA和DHA的增加而言，与鱼油相比，脂肪酶处理使磷虾油的功效增加更多(就磷虾油而言，EPA增加到9倍，DHA增加到3倍，就鱼油而言，EPA增加到2.2倍，DHA增加70％)。这些结果表明，与鱼油相比，脂肪酶处理更能增加磷虾油的总体吸收。仅在饲喂了未处理的磷虾油或脂肪酶处理的鱼油的小鼠中，花生四烯酸盐/酯(arachidonate)含量显著降低。
通过LC/MS测量了包含EPA、DPA和DHA的LPC物质的浓度和异构体组成(图13)。虽然所有饮食中三种LPC的含量都增加了，但饲喂了经脂肪酶处理的磷虾油后其含量的增加是其它饮食的4-5倍高。此外，在所有情况下，大部分增加都是由于sn-2酰基异构体。虽然脂肪酶处理的磷虾油包含sn-2酰基LPC异构体，但血浆中发现的LPC可能并不都是由于最近吸收的LPC，原因是在饲喂不包含任何LPC的鱼油后血浆sn-2酰基LPC也略有增加。此外，与饮食中的中LPC-DHA/LPC-EPA的比率相比，血浆中LPC-DHA/LPC-EPA的比率高得多，这表明可能在肝脏中发生了EPA向DHA的一些转化。与未处理的磷虾油相比，磷虾油的脂肪酶处理致使血浆ω-3LPC水平增加至4倍，而鱼油的脂肪酶处理未发生增加。
脑区域中的PUFA对脑的四个独立区域的脂肪酸组成进行了分析。在前额叶皮质(图14)中，未处理的磷虾油显著增加了EPA含量(从总FA的0.23％到1.66％)。然而，与未处理的磷虾油相比，磷虾油的脂肪酶处理致使皮质EPA进一步增加至3倍。相比之下，无论是否经过脂肪酶处理，鱼油对EPA含量都没有作用。饲喂未处理的磷虾油后，皮质的DHA含量增加了25％，但磷虾油的脂肪酶处理致使增加118％，这示出脂肪酶处理产生4.7倍的刺激。在脂肪酶处理之前或之后，鱼油对皮质的DHA含量没有作用。脂肪酶处理的磷虾油的DPA(22:5)增加至4.5倍，但任何其它制备剂都未如此。磷虾油制剂以及脂肪酶处理的鱼油两者都显著降低了皮质的ARA(20:4)含量，而未处理的鱼油未如此。ARA的减少显然是因为它被EPA或DHA替代，尽管在脂肪酶处理的鱼油的情况下，ω3脂肪酸没有净增加。
在海马体(图15)中，EPA含量仅因脂肪酶处理的磷虾油而显著增加(与对照相比增加至12.5倍)。通过未处理的磷虾油，DHA含量增加了15％，而脂肪酶处理导致46％的增加(脂肪酶处理产生3倍刺激)。所有制剂的ARA含量均显著降低，尽管未处理的鱼油示出相比于其它制备剂降低较少。任何饮食的DPA都未改变。
在纹状体中(图16)，通过脂肪酶处理的磷虾油，EPA含量增加(至70倍)，而对于未处理的磷虾油而言则未如此。有趣的是，脂肪酶处理的鱼油也增加了EPA含量(至12倍)，尽管未处理的鱼油没有作用。未处理的磷虾油使DHA含量增加23％，而脂肪酶处理的磷虾油使之增加107％(脂肪酶处理产生4.7倍刺激)。未处理或处理的鱼油对纹状体的DHA含量没有作用。只有脂肪酶处理的磷虾油(从0.14％到1.45％)显著增加了DPA百分比。仅通过未处理的磷虾(-51％)油和未处理的鱼油(-27％)显著降低了ARA含量。
在小脑中，只有脂肪酶处理的磷虾油显著增加了EPA含量(至11倍)(图17)。未处理和脂肪酶处理的磷虾油两者都增加了DHA含量，但脂肪酶处理后增加得更大(脂肪酶处理产生12％刺激)。无论是否经过脂肪酶处理，鱼油都没有显著作用。脂肪酶处理的磷虾油发生了ARA含量的显著降低。通过脂肪酶处理的鱼油也降低了ARA，尽管ω3脂肪酸没有显著增加。
这些结果示出，在所有脑区域中，通过磷虾油的部分脂肪分解，EPA和DHA的积聚增加至最高达若干倍，而鱼油的作用即使在脂肪酶处理后也是最小的。这些结果支持以下结论：LPC-EPA和LPC-DHA的生成对于通过脑积聚ω3脂肪酸必不可少。尽管血浆中LPC-EPA的量高于LPC-DHA的量，但脑DHA的增加大于EPA，表明EPA在脑中转化为DHA或在进入脑前转化为LPC-DHA。
脑中的BDNF：我们先前的研究示出，通过LPC-DHA和LPC-EPA增加脑DHA或EPA会致使脑BDNF增加(16,26)，这是神经元存活和认知功能所必需的神经营养因子。为了确定在饲喂磷虾油和鱼油后是否发生了类似的变化，我们通过蛋白质印迹测定了前额叶皮质和海马体中的BDNF水平。如图18中示出，未处理和处理的磷虾油两者都显著增加两个脑区域的BDNF水平，但就脂肪酶处理的磷虾油的增加而言是未处理的磷虾油的3倍。通过鱼油饮食，海马体中的BDNF有少量但显著的增加，但在皮质中未如此，而脂肪酶处理未示出进一步的增加。
脂肪组织与脑区域相比，脂肪酶处理的磷虾油对性腺周围(图19)或腹股沟脂肪组织(图20)的EPA或DHA含量没有作用。然而，未处理和处理的鱼油以及未处理的磷虾油都增加了两种脂肪组织类型的EPA和DHA含量。任何制备剂对腹股沟脂肪组织的ARA水平均无作用。在此，ω3脂肪酸的增加是以18:1和18:2为代价(未示出)发生的，而不是如在脑区域中那样取代ARA。然而，在性腺周围脂肪组织中，除脂肪酶处理的磷虾油外，所有制备剂均降低了ARA含量，这与ω3脂肪酸的增加相对应。
肝脏在肝脏中，通过未处理和脂肪酶处理的磷虾油两者，EPA含量均显著增加(图21)。然而，脂肪酶处理后增加至6倍。仅通过脂肪酶处理的磷虾油，DHA水平显著增加。EPA和DHA的增加以16:0为代价发生，从对照的28.8％降低到脂肪酶处理的磷虾油组的25.5％。无论是否经脂肪酶处理，鱼油对EPA或DHA均无作用。然而，在脂肪酶处理的鱼油组，存在18:0减少(8.3％相对于对照组的10.6％)。使用任何制备剂，肝脏的ARA或DPA含量均未发生显著变化。
心脏在心脏中，所有制剂都增加了EPA和DHA两者(图22)，但有趣的是，鱼油或磷虾油的脂肪酶处理致使其富集心脏ω3脂肪酸的能力下降。利用任何膳食补充剂，均未观察到ARA或DPA水平的变化。其它主要脂肪酸未发生显著变化，包括16:0、18:0、18:1或18:2(未示出)。
讨论
膳食EPA和DHA最通常以TAG(鱼油、藻油)或磷脂(磷虾油)的形式出现。目前补充剂也可作为EPA和DHA的乙酯(例如：Lovaza、Vascepa)和游离脂肪酸(例如：Epanova)形式获得。然而，这些制备剂都没有以推荐剂量显著富集脑EPA或DHA，尽管它们在大多数其它组织中富集。这显然是因为这些补充剂主要作为TAG被吸收(16,31)，而BBB的转运蛋白对EPA或DHA的LPC形式具有特异性(15)。虽然磷虾油具有按重量计约40％的磷脂，但磷脂中的EPA和DHA存在于sn-2位，并且在胰腺PLA2消化期间作为游离脂肪酸被释放释放。释放的EPA和DHA随后作为TAG被吸收，并且因此不会富集脑ω3脂肪酸。本研究的目的是证实可以通过用对sn-1位具有特异性的脂肪酶预消化磷虾油的PC，并且从而生成LPC-EPA和LPC-DHA，然后其将作为磷脂被吸收并优先富集脑ω3脂肪酸，从而提高磷虾油富集脑EPA和DHA的功效。为了比较，我们还用脂肪酶处理了不含磷脂的鱼油，并且因此不会生成LPC，但会生成MAG和游离脂肪酸。在此呈现的结果示出，与未处理的磷虾油相比，磷虾油的脂肪酶处理使其富集脑EPA的能力提高至10-70倍，富集脑DHA的能力提供15-83％，而鱼油无论是否经过脂肪酶处理对脑ω3脂肪酸均没有作用。应当指出的是，未处理的磷虾油使脑DHA有少量但显著的增加，显然是因为其中存在少量的LPC-EPA和LPC-DHA，并且因此脂肪酶处理的刺激似乎不那么显著。此外，由于在所采用的条件下脂肪酶处理并未将所有PC转化为LPC，因此通过磷虾油的脂肪酶处理增加脑ω3脂肪酸的潜力甚至高于此处所示。
虽然脂肪酶处理的磷虾油在增加脑EPA和DHA方面非常有效，但它对脂肪组织的ω3脂肪酸没有作用。同样，在心脏中，所有其它制剂比脂肪酶处理的磷虾油更有效地增加EPA和DHA，而在肝脏中，脂肪酶处理的磷虾油比所有其它制备剂更有效。正如我们此前提出的，这些结果示出作为TAG或磷脂吸收的ω3脂肪酸的不同代谢命运(17)。由于乳糜微粒在作为残余物进入肝脏之前首先通过脂肪组织、肌肉和心脏，因此来自乳糜微粒TAG的大部分ω3脂肪酸被脂肪组织、肌肉和心脏中脂蛋白脂肪酶介导的摄取所吸收。另一方面，来自磷脂的ω3脂肪酸主要以乳糜微粒残余物的形式被肝脏吸收。EPA和DHA被水解并整合入膜或脂蛋白中，部分以LPC的形式由肝脏分泌(32-34)，然后通过Mfsd2a途径被大脑吸收(15)。经脂肪酶处理的磷虾油中的部分LPC-EPA和LPC-DHA也有可能作为LPC被吸收到循环中，绕过肝脏，直接输送到大脑，尽管我们对此并没有直接证据。
关于鱼油和磷虾油中ω3脂肪酸的相对生物利用度存在一些争议。虽然许多研究声称磷虾油脂肪酸具有更高的生物利用度(35,36)，但由于用于比较的方法论，其他人质疑这一结论(37)。基于我们研究中EPA和DHA的空腹血浆值，未处理的鱼油和磷虾油示出相似的生物利用度。然而，在这两种情况下，用脂肪酶预处理油都增加了血浆EPA和DHA，但与鱼油相比，脂肪酶处理后磷虾油示出更大的增加。这些结果表明，用脂肪酶进行部分水解不仅会增加脑ω3脂肪酸，而且可能有益于所有组织对鱼油和磷虾油中ω3脂肪酸的整体生物利用度，并且这对于患有胰腺功能受损的患者而言尤为重要。
我们的研究还示出，脂肪酶处理的磷虾油显著增加了脑中的BDNF水平，示出增加脑中ω3脂肪酸的功能作用。通过磷虾油引起的BDNF增加与脑DHA和EPA的增加相对应，这表明，这些脂肪酸对BDNF的表达有直接作用，如其它研究报道的那样(38,39)。有趣的是，鱼油也示出海马体BDNF的一些增加，但DHA未增加。BDNF在神经发生、神经可塑性和神经保护中发挥至关重要的作用。已知BDNF会随着年龄的增长而减少，低水平的BDNF与各种精神疾病和神经退行性疾病有关(40)。因此，通过脂肪酶处理的磷虾油引起的脑BDNF增加可能为预防和治疗这些疾病提供安全且有效的营养品方法。
通过GC/MS进行所用油的脂肪酸分析。示出的值(占总脂肪酸的％)用于最终油混合物(玉米油和鱼油或磷虾油)。在对磷虾油混合物的氯仿提取物进行TLC分离后进行LPC的脂肪酸分析。
表6饮食中脂肪酸的百分比组成
Figure BDA0003872494670000561
SFA：饱和脂肪酸
MUFA：单不饱和脂肪酸
用于饮食制备剂的油(包括玉米油填料)通过TLC来提取并分离，对于磷虾油而言使用磷脂溶剂系统(氯仿：甲醇：水，65:25:4，按体积计)或对于鱼油而言使用中性脂质溶剂系统(己烷：乙醚：乙酸，70：30：1，按体积计)。如文中所述，刮取如下示出的脂质点，并通过GC/MS测定其脂肪酸组成。示出的值是在给定脂质中回收的总EPA+DPA的百分比，并且来自一种代表性制备剂。鱼油样品中存在的少量DAG，并且磷虾样品中存在的PE未在此处示出。
表7ω3脂肪酸(EPA+DHA)在主要膳食脂质中的分布(占总量的％)
Figure BDA0003872494670000571
*未确定
实施例5：使用磷虾油LPC组合物增加视网膜中的DHA含量
材料和方法
动物和膳食治疗：在此描述的所有动物研究都得到了芝加哥伊利诺伊大学(University of Illinois)的动物护理和使用机构委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)的批准。视网膜样品获自我们此前对小鼠和大鼠中脑DHA积聚的研究，这些研究先前已发表[16,17,67]。雄性Sprague-Dawley大鼠(8周龄)购自Harlan实验室(Indianapolis,IN,USA)。雄性C57BL/J6小鼠(2-4个月龄)购自Jackson实验室(BarHarbor.Maine)。
在第一项研究中，每日用呈TAG-DHA(DHASCO藻油，DSM Nutritional Products,Columbia,MD,USA)形式的10mg DHA(40mg DHA/kg体重)、合成二DHAPC(磷脂酰胆碱)或合成LPC-DHA(sn-1酰基)灌胃雄性Sprague-Dawley大鼠(每组n＝5，8周龄)30天[17]。DHA在TAG-DHA的三个位置上平均分布[17]。在本研究中，我们还包括另一组大鼠，用半剂量的LPC-DHA(20mgDHA/kg)对它们进行灌喂，该半剂量与消化期间从di-DHA PC生成的预期LPC-DHA量相当。在第二项研究中，按照先前所述，每日用呈游离(未酯化)DHA形式的40mg DHA/kg体重、sn-1酰基LPC-DHA或sn-2酰基LPC-DHA灌喂4月龄雄性C57 BL/J6小鼠(每组n＝8只)30天[16]。在第三项研究中，向雄性C57BL/J6小鼠(2月龄，每组n＝5)饲喂富含天然的或脂肪酶处理的鱼油或磷虾油的饮食30天。所有饮食中ω-3FA(二十碳五烯酸(EPA)+DHA)的总量为2.64g/kg饮食。未处理的磷虾油包含18％的总ω-3FA作为LPC，而脂肪酶处理的磷虾油包含>80％的总ω-3FA作为LPC。鱼油饮食不包含LPC-EPA或LPC-DHA。在麻醉下用冰冷的磷酸盐缓冲盐水对动物进行经心脏灌注，并收集视网膜并在-80℃下冷冻直至分析。
分析程序：通过Bligh和Dyer程序[30]提取视网膜的总脂质，并使用甲醇HCl将脂肪酸甲基化。按照先前所述[16]，使用配备有Supelcoωwax柱的Shimadzu QP2010SE通过GC/MS(气相色谱法/质谱法)进行脂肪酸分析。使用50–400m/z范围内的总离子电流进行甲酯的定量。对于LC/MS/MS(液相色谱法/串联质谱法)分析，通过Ivanova等人的程序提取脂质[27]。磷脂分子物质的分析在与Agilent 2600UPLC系统(Santa Clara,CA,USA)联用的ABSciex QTRAP质谱仪(Redwood City，CA，USA)上通过多反应监测进行[31]。使用内标17:0LPC、di 17:0PC和di 17:0PE(磷脂酰乙醇胺)来对相应的分子物质进行定量，未对不同分子物质的离子强度差异应用任何校正因子。
统计学和相关性：通过用Holm–Sidak方法(Graphpad Prism 8.0,San Diego,CA,USA)调整的对照和处理样品之间的单因素方差分析与Tukey事后多重比较校正或非配对t检验来确定治疗组之间差异的显著性。
结果
PC、TAG和LPC形式的膳食DHA在大鼠中的比较作用
我们先前已经证实，通过膳食LPC-DHA和di-DHA PC使得大鼠脑DHA有效富集，但TAG-DHA未能如此[17]。由于脑和视网膜的DHA摄取机制似乎相似[66]，我们确定了相同动物组中视网膜DHA的富集。用呈TAG-DHA、di-DHA PC或LPC-DHA(sn-1酰基)形式的10mg DHA/天(40mg DHA/kg)灌胃正常大鼠30天，并通过GC/MS确定视网膜FA组成。另外，使用了半剂量的LPC-DHA(20mg/kg)，以相当于由胰磷脂酶A2(PLA2)在肠道中消化di-DHA PC预期生成的LPC-DHA。ω-3FA和花生四烯酸的浓度形式图23中示出，而总FA组成在表8中示出。如图24中示出，di-DHA PC(+45％)和LPC-DHA(+101％)显著增加了视网膜中DHA的百分比，但TAG-DHA未如此(+13％，不显著)。半剂量的LPC-DHA(5mg/大鼠)比全剂量的di-DHA PC(+45％)更有效(+75％)，这表明胰腺PLA2(磷脂酶A2)水解di-DHA PC可能无效。值得注意的是，虽然正常大鼠视网膜的DHA含量非常高(占总FA的16.88％)，但通过饲喂全剂量LPC-DHA(占总FA的33.98％)DHA含量翻倍了，这表面视网膜DHA含量的范围宽，其可以通过饮食实现。正如我们在脑中发现的那样，DHA的增加主要以花生四烯酸为代价发生[17]，但DHA也取代了视网膜中的饱和FA(16:0和18:0)(表8)。通过任何治疗，视网膜的EPA(20:5(n-3))或DPA(22:5(n-3))都未发生变化。
游离DHA和LPC-DHA异构体在小鼠中的比较作用
先前的研究表明，为了使脑摄取DHA，因为DHA在体内磷脂中的天然位置，DHA必须位于LPC的sn-2位[68,69]。然而，我们最近的研究示出，sn-1DHA LPC和sn-2DHA LPC在富集小鼠脑DHA和改善脑功能方面同样有效[16]。我们对饲喂游离(未酯化)DHA、sn-1DHA LPC和sn-2DHALPC的小鼠的视网膜FA组成进行了分析，以确定LPC的sn-2酰基异构体是否优先转运通过血液-视网膜屏障。如图25和表9中示出，游离DHA对视网膜DHA没有作用，这与TAG-DHA在大鼠中的作用相似。然而，LPC-DHA的两种异构体都使视网膜DHA增加了80％，示出视网膜对DHA的摄取与脑相似，并且如其他示出的，涉及Mfsd2a转运蛋白[66]。此外，如我们在脑中发现的那样，血液-视网膜屏障处的转运蛋白无法区分LPC-DHA的两种异构体[16]。通过任何DHA处理，对EPA(20:5(n-3))或DPA(22:5(n-3))含量都没有作用。通过LPC-DHA的两种异构体，花生四烯酸盐/酯的含量显著降低，而通过游离DHA则未如此。另外，通过LPC-DHA，饱和脂肪酸(16:0和18:0)以及18:1显著降低，但通过游离DHA未如此。这些结果表明，与大鼠的结果相似，不仅通过取代花生四烯酸盐/酯而且通过取代饱和FA和18:1而发生小鼠视网膜DHA的增加。
通过LC/MS/MS分析PC和PE的分子物质(包含DHA)，以确定两种LPC异构体在视网膜中的代谢命运是否彼此不同。如图26中示出，除了20:4-22:6Pc和20:4-22:6PE之外，LPC-DHA的两种异构体都增加了大多数主要的含DHA的PC和PE，可能是因为通过LPC处理视网膜20:4的减少。LPC的两种异构体对PC或PE分子物质组成的作用之间没有显著性差异。尽管通过游离DHA并没有显著增加视网膜的总DHA含量(图27)，但少许包含DHA的PC和PE的个别物质增加了，但与LPC-DHA相比水平要低得多。用膳食LPC-DHA治疗后，视网膜LPC-DHA增加，但LPE-DHA未增加。与在其中DHA在PE物质中更普遍的脑不同[16]，视网膜在PC物质中包含更多的DHA。PE：磷脂酰乙醇胺。
鱼油和磷虾油对小鼠视网膜ω-3FA的作用
尽管先前对鱼油的研究未示出成年动物中视网膜DHA或EPA显著富集[49]，但我们最近证实，用脂肪酶预处理磷虾油，生成LPC-EPA和LPC-DHA，使得可以在成年小鼠的脑中显著富集DHA和EPA两者[67]。另一方面，使用鱼油进行的类似处理，其生成游离EPA和DHA或单酰甘油EPA和DHA，则对大脑ω-3FA没有任何作用。为了确定脂肪酶处理的磷虾油是否也可以用于富集视网膜DHA和EPA，我们分析了用鱼油和磷虾油处理的小鼠视网膜的FA组成，该鱼油和磷虾油已用脂肪酶处理或未处理。
如图27和表10中示出，在饲喂未处理的磷虾油后，视网膜DHA比对照值增加了33％，这可能是因为磷虾油制备剂中存在少量的LPC-DHA[67]。然而，饲喂脂肪酶处理的磷虾油使视网膜DHA增加了76％，这示出通过脂肪酶处理对DHA富集2.3倍的刺激。此外，通过脂肪酶处理的磷虾油使视网膜EPA增加至100倍，但使用未处理的磷虾油或鱼油则未增加。这支持了我们先前的观察，即饲喂LPC-EPA确实会增加脑和视网膜中的EPA水平，这与关于通过富含ω-3FA的饮食在这些组织中缺乏EPA富集的先前报道相反[18,19,20]。与用纯制品LPC-DHA的结果相比，在用脂肪酶处理的磷虾油进行处理后，我们未发现DHA对视网膜花生四烯酸盐/酯的显著取代。相反，DHA和EPA似乎取代了饱和FA和油酸(18:1,n-9)。在饲喂未处理的磷虾油的动物中，饱和FA和18:1也有一些降低，但这些降低没有达到统计学意义(表10)。
讨论
已知视网膜DHA会随着年龄的增长[54]以及糖尿病[57,58,59]而下降。此外，DHA水平降低与若干视网膜疾病有关，最突出的是糖尿病视网膜病变(DR)[54,56,44]。DR影响全球近1亿人，并且是成年人群失明的最常见原因[70]。据信，由高血糖症诱导的氧化应激和慢性炎症是DR的主要潜在原因[71]。独特地集中在视网膜中的DHA已被证明具有抗氧化剂特性和抗炎特性两者[54,72,73]。除了DR之外，DHA缺乏还与其它眼疾病有关，该眼疾病包括视网膜色素变性[74]、青光眼[75,76]、年龄相关性黄斑变性[55]、干眼病[77]和阿尔茨海默氏症相关的失明[41]。所有这些疾病的共同因素是慢性炎症。因此，研究是否可以通过饮食增加成年哺乳动物的视网膜DHA水平并从而预防或治疗这些疾病是很重要的。这里呈现的结果示出，尽管正常视网膜中DHA的初始水平非常高，但通过膳食LPC-DHA可以进一步增加最高达100％，但通过不含DHA或TAG-DHA的膳食未能如此。据我们所知，这是在正常成年动物中通过膳食补充在视网膜DHA中获得的最高富集。先前的研究即使在用非常高浓度的膳食ω-3FA处理后，发现视网膜ω-3水平的未增加或者只是略有增加。例如，Prokopiou等人[78]向老年(2岁)小鼠饲喂呈鱼油形式的200mgω-3FA/天，60天，并且发现实际上视网膜DHA减少了(-21％)，但是作为次要成分的视网膜EPA增加了42％。相似地，用206mg/天的ω-3FA(172mg EPA+34mg DHA)灌喂ABCA4-/-小鼠(斯塔加特病)三个月，致使观察到视网膜DHA没有变化，但视网膜EPA增加了67％(从总数的0.93％到1.56％)[79]。Schnebelen等人[80]的研究示出，用包含20％ω-3FA的5％脂肪饮食饲喂3周龄的大鼠三个月仅致使视网膜DHA增加8％。与这些研究相比，Suh等人[82]和Tanito等人[81]报道，在使用携带fat-1基因的转基因小鼠中，与野生型对照相比，视网膜DHA几乎翻了一番，该fat-1基因将内源性ω-6FA转化为ω-3FA。然而，如这些工作人员所报道的，通过基因操作而非通过饮食来增加视网膜DHA似乎会引起异常视网膜电图和对氧化应激的易感性。另一方面，Connor等人[83]报道，通过饮食增加新生小鼠视网膜中DHA含量通过抑制病理性新生血管形成来预防早产儿视网膜病变。此外，Sapieha等人[56]示出，在2型糖尿病小鼠模型中补充高浓度ω-3FA(占饮食的2％)的饮食保留视网膜功能并增强糖耐量，但未报道视网膜DHA水平的变化。Tikhonenko等人[44]在大鼠中示出对糖尿病视网膜病变的类似益处，向大鼠以鲱鱼油饲喂了5％的卡路里。然而，实现这些有益作用所需的ω-3FA的剂量在临床环境中是不切实际的，因为基于Sapieha等人的研究，使用异速生长计算[84]的人等效剂量在70kg的人中为约14g的ω-3FA/天，或者根据Tikhonenko等人的研究为约16mL鱼油/天。相比之下，使视网膜DHA几乎翻倍所需的LPC-DHA剂量是上述研究的约50分之一低，并且因此很容易适用于临床病症。
与主要通过Mfsd2a途径获得DHA的脑不同，视网膜似乎通过多种途径获得DHA，因为缺乏Mfs2a导致视网膜DHA仅减少45％，以及VLCFA减少57％[85]。因此，Bazan[41]的研究示出脂联素受体对于维持视网膜DHA水平的重要性，而其他人已经提出了FA结合蛋白和脂蛋白受体的作用[54,65]。这些途径可能解释了通过不含DHA和TAG的膳食，视网膜DHA小幅增加。视网膜还具有有效的再循环机制，通过视网膜色素上皮细胞的吞噬作用来保留DHA[52,41]，这可能是先天性Mfsd2a缺乏对视网膜功能的影响相比于对脑功能的影响[15]较缓和的原因[66,85]。脑和视网膜之间的另一个区别是，虽然DHA在脑中主要取代了花生四烯酸[16,17,67]，但它在视网膜中取代更多的饱和脂肪酸和油酸。虽然认为花生四烯酸的减少是有益的，但因为花生四烯酸在生成促炎症花生酸中的作用，所以减少视网膜中的饱和脂肪酸和油酸的生理作用尚不清楚。
尽管通过这些处理会增加DHA水平，但与DHA相比，视网膜的EPA含量非常低，并且即使在饲喂富含EPA的补充剂后也不会显著增加[80,83]。因此，假设EPA不进入脑和视网膜，快速转化为DHA，或者被氧化而没有净积累[25,86]。在目前的研究中，虽然在饲喂纯制品LPC-DHA后视网膜的EPA水平没有增加，但在饲喂包含LPC-EPA和LPC-DHA两者的脂肪酶处理的磷虾油后视网膜的EPA水平发生了显著增加。因此，我们认为先前的研究未能示出脑或视网膜EPA的增加是由于补充剂无法在体内生成LPC-EPA。我们先前已经表明，在饲喂纯制品LPC-EPA[26]后，脑EPA和视网膜EPA也会发生类似的富集。除DHA外，增加视网膜EPA可能比仅增加其DHA含量更有益，因为EPA是合成VLCFA的优选底物[87,88]，它在视网膜中具有独特的功能意义[89]。还已知EPA比DHA更有效地与花生四烯酸盐/酯竞争，并从而抑制促炎症前列腺素的合成。
关于ω-3FA的大多数研究关注仅增加组织中的EPA和DHA水平，但与鱼油或乙酯相比，膳食LPC-EPA/DHA的辅助益处是，对于通过Mfsd2a途径由视网膜和脑吸收的每个DHA或EPA分子，同时吸收胆碱分子。胆碱是乙酰胆碱以及膜磷脂的重要组分，并且在视觉中发挥关键作用[90]。事实上，胞磷胆碱(CDP-胆碱),是一种胆碱磷脂的前体，在临床上用于治疗视网膜病变和青光眼[90]。因此，LPC-EPA/DHA可以在单一有效制备剂中提供ω-3FA和胞磷胆碱的组合益处。
表8膳食TG-DHA、di-DHA PC和LPC-DHA对大鼠视网膜脂肪酸组成的影响。
Figure BDA0003872494670000631
Figure BDA0003872494670000641
Figure BDA0003872494670000651
Figure BDA0003872494670000661
与对照相比*p<0.05，与对照相比**p<0.005，使用Holm-Sidak方法调整的未配对t检验。TG：三酰甘油；PC：磷脂酰胆碱；LPC：溶血磷脂酰胆碱；DMA：二甲基缩醛；DHA：二十二碳六烯酸；F.A.：脂肪酸；S.D.：标准偏差。
表9游离DHA、sn-1DHA LPC和sn-2DHA LPC对小鼠视网膜脂肪酸组成的影响。
Figure BDA0003872494670000671
Figure BDA0003872494670000681
Figure BDA0003872494670000691
与对照相比**p<0.005，使用Holm-Sidak方法调整的非配对t检验。DMA：二甲基缩醛；sn-1和sn-2：立体特异性编号分别为1和2；LPC：溶血磷脂酰胆碱；DHA：二十二碳六烯酸；F.A.：脂肪酸；SD：标准偏差。
表10饲喂未修饰的和脂肪酶处理的磷虾油和鱼油对小鼠视网膜脂肪酸组成的影响。
Figure BDA0003872494670000701
Figure BDA0003872494670000711
Figure BDA0003872494670000721
Figure BDA0003872494670000731
与对照相比*p<0.05，与对照相比**p<0.005，使用Holm-Sidak方法调整的未配对t检验。KO：磷虾油；FO：鱼油；FA：脂肪酸；S.D.：标准偏差。
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上述说明书中提及的所有出版物和专利均通过援引并入本文。在不脱离本发明的范围和精神下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定优选的实施方式描述了本发明，但应当理解，所要求保护的本发明不应被过度地受限于这样特定的实施方式。实际上，对相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。

Claims (56)

1.一种治疗或预防受试者的视网膜疾患的方法，包括向所述受试者给药有效量的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜疾患选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和干眼病。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物是脂肪酶处理的磷虾油。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物是营养品组合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述给药是口服。
6.富含LPC-EPA和LPC-DHA的磷虾油用于治疗或预防受试者的视网膜疾患的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述视网膜疾患选自年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和干眼病。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的用途，其中所述富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物是脂肪酶处理的磷虾油。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的用途，其中所述富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物是营养品组合物。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的用途，其中将所述富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物配制成口服给药。
11.一种用于治疗、预防和/或缓解眼的疾病或病症的一种或更多种症状和/或体征的方法，所述方法包括向有此需要的受试者给药有效量的包括含有选自由式1至8中任一项及其任意组合组成的组的LPC-化合物的溶血磷脂酰胆碱(LPC)组合物的制剂，从而改善、控制、减轻或缓解所述疾病或病症的症状：
Figure FDA0003872494660000021
Figure FDA0003872494660000031
其中
R1是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；
R2是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；和
n为0、1或2。
12.根据权利要求11所述的方法，其中R1是OH，以及R2是OH。
13.根据权利要求11所述的方法，条件是：如果所述LPC组合物包括i)根据式1的化合物，其中R2是OH；和/或ii)根据式3的化合物，其中，R1是OH；则所述LPC组合物进一步包括权利要求17中提及的其它LPC-化合物中的至少一种。
14.根据权利要求11所述的方法，其中一种或更多种所述LPC-化合物是：
-根据式1的化合物；和/或根据式3的化合物；以及
-根据式2的化合物；和/或根据式4的化合物。
15.根据权利要求11所述的方法，其中
-R1和R2是OH；并且
-lysoPC-DHA:lysoPC-EPA的摩尔比在1:1至3:1的范围内；或者
lysoPC-EPA:lysoPC-DHA的摩尔比在1:1至5:1的范围内；条件是：i)lysoPC-EPA的摩尔数为1-lysoPC-EPA的摩尔数+2-lysoPC-EPA的摩尔数；以及ii)lysoPC-DHA的摩尔数为1-lysoPC-DHA的摩尔数+2-lysoPC-DHA的摩尔数。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是干眼，诸如选自由眼的炎症、角膜神经异常和眼表面擦伤组成的组的干眼病。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是眼的神经退行性疾病。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述眼的神经退行性疾病选自由以下项组成的组：年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、非增殖性视网膜病变、增殖性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜色素变性、中央静脉阻塞和青光眼。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中通过选自由口服给药和血管内给药组成的组的方式来给药。
20.根据权利要求19所述的方法，其中给药方式为口服给药。
21.根据权利要求19所述的方法，其中给药方式为血管内给药。
22.根据权利要求11至21中任一项所述的方法，其中所述制剂中的所述LPC组合物包括所述LPC组合物的按重量计10％至100％的量的总LPC。
23.根据权利要求11至22中任一项所述的方法，其中所述LPC组合物包括不同于LPC的额外脂质。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述额外脂质选自由以下项组成的组：甘油三酯、游离脂肪酸、乙酯和磷脂诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。
25.根据权利要求24所述的方法，其中与磷脂酰胆碱的量相比，所述LPC组合物包括占优势的量的LPC-化合物。
26.根据权利要求11至25所述的方法，其中所述制剂进一步包括选自由叶黄素、虾青素、玉米黄质及其任意组合组成的组的组分。
27.根据权利要求11至26中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
29.一种包括含有选自由式1至8中任一项组成的组的LPC-化合物的溶血磷脂酰胆碱(LPC)组合物的制剂：
Figure FDA0003872494660000051
Figure FDA0003872494660000061
其中
R1是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；
R2是OH或O-CO-(CH2)n-CH3；以及
n是0、1或2；
用于治疗、预防和/或缓解眼的疾病或病症的一个或更多个症状和/或体征的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中R1是OH，以及R2是OH。
31.根据权利要求29所述的用途，条件是：如果所述LPC组合物包括i)根据式1的化合物，其中R2是OH；和/或ii)根据式3的化合物，其中，R1是OH；则所述LPC组合物进一步包括权利要求35中提及的其它LPC-化合物中的至少一种。
32.根据权利要求29所述的用途，其中一种或更多种所述LPC-化合物是：
-根据式1的化合物；和/或根据式3的化合物；以及
-根据式2的化合物；和/或根据式4的化合物。
33.根据权利要求29所述的用途，其中
-R1和R2是OH；并且
-lysoPC-DHA:lysoPC-EPA的摩尔比在1:1至3:1的范围内；或者
lysoPC-EPA:lysoPC-DHA的摩尔比在1:1至5:1的范围内；条件是：i)lysoPC-EPA的摩尔数为1-lysoPC-EPA的摩尔数+2-lysoPC-EPA的摩尔数；以及ii)lysoPC-DHA的摩尔数为1-lysoPC-DHA的摩尔数+2-lysoPC-DHA的摩尔数。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症是干眼，诸如选自由眼的炎症、角膜神经异常和眼表擦伤组成的组的干眼病。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的用途，其中所述疾病或病症是眼的神经退行性疾病。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述眼的神经退行性疾病选自由以下项组成的组：年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、非增殖性视网膜病变、增殖性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜色素变性、中央静脉阻塞和青光眼。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的用途，其中所述制剂中的所述LPC组合物包括所述LPC组合物的按重量计10％至100％的量的总LPC。
38.根据权利要求29至37中任一项所述的用途，其中所述LPC组合物包括不同于LPC的额外脂质。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述额外脂质选自由以下项组成的组：甘油三酯、游离脂肪酸、乙酯和磷脂诸如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。
40.根据权利要求39所述的用途，其中与磷脂酰胆碱的量相比，所述LPC组合物包括占优势的量的LPC-化合物。
41.根据权利要求39至40所述的用途，其中所述制剂进一步包括选自由叶黄素、虾青素、玉米黄质及其任意组合组成的组的组分。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述受试者是人受试者。
44.一种制备富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物的方法，包括用对所述磷虾油中的含DHA和EPA的磷脂的sn-1位具有特异性的脂肪酶来处理磷虾油。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述脂肪酶包括来自米赫毛霉(Mucor meihei)的脂肪酶。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述脂肪酶包括来自米赫毛霉的固定化脂肪酶。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述磷虾油组合物包括溶血磷脂酰胆碱，所述溶血磷脂酰胆碱包括按重量计大于约80％的LPC-DHA和LPC-EPA。
48.一种根据权利要求44至47中任一项所述的方法制备的富含LPC-DHA和LPC-EPA的脂肪酶处理的磷虾油组合物。
49.一种脂肪酶处理的磷虾油组合物，包括溶血磷脂酰胆碱，所述溶血磷脂酰胆碱包括按重量计大于约80％的LPC-DHA和LPC-EPA。
50.一种营养品组合物，包括权利要求48所述的磷虾油组合物。
51.一种营养品组合物，包括权利要求49所述的磷虾油组合物。
52.一种治疗或预防受试者的神经疾患的方法，包括向所述受试者给药有效量的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述神经疾患选自帕金森氏症、精神分裂症、颅脑损伤、卒中和阿尔茨海默氏症。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述神经疾患是阿尔茨海默氏症。
55.一种治疗或预防通过肝脏的DHA富集而减轻的肝脏疾病的方法，包括向需要治疗的受试者给药有效量的富含LPC-DHA和LPC-EPA的磷虾油组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述肝脏疾病选自非酒精性脂肪肝(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
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