NO340715B1 - Nukleinsyremolekyl som koder for et karsinoembryonalt antigen (CEA)-fusjonsprotein, vektor som omfatter nukleinsyremolekylet, vertcelle som omfatter vektoren, fremgangsmåte for å uttrykke fusjonsproteinet i en rekombinant vertscelle, renset CEA-fusjonsprotein, adenovirusvektor og vaksineplasmid som omfatter nukleotider som koder for CEA-fusjonsproteinet, samt en vaksinevektor som omfatter nukleinsyremolekylet for anvendelse ved forebygging eller behandling av kreft i et pattedyr. - Google Patents
Nukleinsyremolekyl som koder for et karsinoembryonalt antigen (CEA)-fusjonsprotein, vektor som omfatter nukleinsyremolekylet, vertcelle som omfatter vektoren, fremgangsmåte for å uttrykke fusjonsproteinet i en rekombinant vertscelle, renset CEA-fusjonsprotein, adenovirusvektor og vaksineplasmid som omfatter nukleotider som koder for CEA-fusjonsproteinet, samt en vaksinevektor som omfatter nukleinsyremolekylet for anvendelse ved forebygging eller behandling av kreft i et pattedyr. Download PDFInfo
- Publication number
- NO340715B1 NO340715B1 NO20064044A NO20064044A NO340715B1 NO 340715 B1 NO340715 B1 NO 340715B1 NO 20064044 A NO20064044 A NO 20064044A NO 20064044 A NO20064044 A NO 20064044A NO 340715 B1 NO340715 B1 NO 340715B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cea
- vector
- fusion protein
- nucleic acid
- sequence
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 164
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 102
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 34
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 31
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 title abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 124
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 90
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 78
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000002766 immunoenhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 73
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 73
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 53
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 17
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 16
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 16
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 119
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 81
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 2
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 abstract 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 111
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 86
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 86
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 76
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 69
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 66
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 46
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 40
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 37
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 35
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 35
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 34
- 101100450270 Oryzias latipes hcea gene Proteins 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 28
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 28
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 28
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 27
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 101150045267 CEA gene Proteins 0.000 description 22
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 20
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 16
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 14
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 14
- 102100026238 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 13
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 13
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 9
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 8
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 8
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 8
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101001073212 Arabidopsis thaliana Peroxidase 33 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001123325 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102100028961 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Human genes 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101150039863 Rich gene Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 1
- 206010001197 Adenocarcinoma of the cervix Diseases 0.000 description 1
- 208000034246 Adenocarcinoma of the cervix uteri Diseases 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- -1 Amino- Chemical class 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100028791 Caenorhabditis elegans pbs-5 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028471 Eosinophil peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000006662 cervical adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000011239 genetic vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 150000003680 valines Chemical class 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse vedrører stort sett til terapien av kreft. Mer spesifikt vedrører foreliggende oppfinnelse polynukleotider som koder for fusjonsproteiner der fusjonsproteinene omfatter minst en del av det tumorassosierte polypeptidet karsinoembryonalt antigen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også rekombinante vektorer og verter som omfatter nevnte polynukleotider, rensede fusjonsproteiner og fremgangsmåter for å forsterke en immunrespons mot CEA ved å benytte preparatene og molekylene som er beskrevet her.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Immunoglobulinfamilien (IgSF) består av utallige gener som koder for proteiner med ulike funksjoner, og én av disse er intercellulær adhesjon. IgSF-proteiner inneholder minst ett Ig-relatert domene som er viktig for å opprettholde riktige intermolekylære bindings-interaksjoner. Fordi slike interaksjoner er nødvendige for de forskjellige biologiske funksjonene til IgSF-medlemmer, har forstyrrelse eller avvikende ekspresjon av mange IgSF-adhesjonsmolekyler blitt korrelert med mange humane sykdommer.
Det karsinoembryonale antigenet (CEA) tilhører en underfamilie av Ig-superfamilien som består av celleoverflateglykoproteiner kjent som CEA-relaterte celleadhesjonsmolekyler (CEACAMer). CEACAMer har blitt vist å virke som både homotypiske og heterotypiske intercellulære adhesjonsmolekyler (Benchimol et al., Cell 57: 327-334 (1989)). I tillegg til celleadhesjon inhiberer CEA (også kjent som CEACAM5) celledød som skyldes løsrivelse av celler fra den ekstracellulære matriksen og kan bidra til cellulær transformasjon som er assosiert med visse proto-onkogener slik som Sc/2 og C-Myc (se Berinstein, J. Clin Oncol. 20(8): 2197-2207 (2002)). Sekvenser som koder for humant CEA har blitt klonet ogkarakterisert(US patent nr. 5 274 087, US patent nr. 5 571 710 og US patent nr. 5 843 761. Se også Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol. 7:3221-3230 (1987); Zimmerman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:920-924 (1987); Thompson et al. Proe. Nati. Acad. Sei USA 84(9):2965-69 (1987).
Normal ekspresjon av CEA har blitt påvist i løpet av fosterutvikling og i tykktarms slimhinner hos voksne. CEA-overekspresjon ble først påvist i humane tykktarmstumorer for over 30 år siden (Gold og Freedman, J. Exp. Med. 121:439-462 (1965)) og har siden blitt funnet i nesten alle tykktarmstumorer. I tillegg er CEA-overekspresjon påvisbart i en høy prosentandel av adenokarsinomer i bukspyttkjertel, lever, bryst, eggstokker, livmorhals og lunge. På grunn av dens prevalens i disse tumortypene og begrenset normal vevs-ekspresjon er CEA ansett for å være et selv-tumorassosisert antigen og et mål for aktiv og passiv immunterapi. Nyere kliniske data har stadfestet at forskjellige vaksinestrategier kan generere humane B- og T-celler som er spesifikke for CEA, og tilveiebringer ytterligere bevis på at CEA er et mål for molekylær og immunologisk intervensjon for behandling av disse krefttypene.
Terapeutiske tilnærminger som rettes mot CEA inkluderer anvendelsen av anti-CEA-antistoffer (se Chester et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46 (suppl): S8-S12
(2000)), så vel som CEA-baserte vaksiner (for en gjennomgang, se Berinstein, ovenfor). Utviklingen og kommersialiseringen av mange vaksiner har blitt hemmet av vanskeligheter assosiert med å oppnå høye ekspresjonsnivåer av eksogene gener. Suksess for DNA-baserte vaksiner har også blitt hemmet av en manglende evne til å generere en immun-respons av tilstrekkelig størrelse hos behandlede individer. Selv om DNA-vaksiner som rettes mot forskjellige proteiner har blitt utviklet, har de resulterende immunresponsene vært relativt svake sammenlignet med konvensjonelle vaksiner.
Enkelheten av DNA-manipulasjon har gitt en mulighet for å utvikle vaksiner som inkorporerer genfusjonsstrategier der antigener blir bundet til forskjellige immunforsterkende elementer. Styrkning av immunrespons mot målantigener har blitt vist i dyremodeller av vektorer som koder for antigener som er fusjonert til heat shock-protein (HSP) 70 (Liu et al., J. Virol. 74: 2888-94 (2000); Cheng et al., J. Immunol. 166: 6218-26 (2001); Chen et al., Cancer Res. 60: 1035-42 (2000)), til Fc-del av IgGl (You et al., J. Immunol. 165: 4581-92 (2000)), til lysosom-assosiert membranprotein (LAMP (Su et al., Cancer Res. 62: 5041-48 (2002)) og universell Th-epitop fra tetanus toksin (Renard et al., J. Immunol. 171:1588-95 (2003); King et al., Nature Med. 4: 1281-86
(1988); Lund et al., Cancer Gene Ther. 10: 365-76 (2003); Padua et al., Nature Med. 9(11): 1413-17 (2003); Savelyeva et al., Nature Biotechnol. 19: 760-64 (2001); Wahren et al. WO 2004/092216). Styrkning av immunresponser mot målantigener er spesielt relevant for kreftvaksiner i lys av den begrensede immunogenisiteten til tumorantigener og av behovet for å overvinne toleranse for å utøve effektive antitumor effekter.
Til tross for identifiseringen av villtype nukleotidsekvensene som koder for CEA-proteiner som er beskrevet ovenfor, vil det derfor være svært ønskelig å utvikle en vaksine som er i stand til å utløse en forsterket CEA-spesifikk immunrespons i forhold til et villtype, fullengde-CEA-cDNA, når det blir levert til et pattedyr. Det vil også være ønskelig å utvikle fremgangsmåter for å behandle eller forebygge CEA-assosierte kreftformer som benytter nukleinsyremolekyler eller proteiner som trygt og effektivt forsterker en CEA-spesifikk immunrespons.
Oppsummering av oppfinnelse
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer polynukleotider som koder for fusjons-proteiner der fusjonsproteinene omfatter minst en del av det tumorassosierte polypeptidet karsinoembryonalt antigen, fusjonert til en betydelig del av et immunforsterkende element. CEA-delen av det kodede CEA-fusjonsproteinet er fjernet fra dens C-terminale forankrings-domene, dvs. aminosyrer 679-702 av Sekv. Id. Nr.: 20 og det immunforsterkende elementet er B-subenheten av det varmelabile enterotoksinet fra E. coli, eller en vesentlig del derav. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også rekombinante vektorer, inkludert adenovirusvektorer og plasmidvektorer, som omfatter nevnte polynukleotider og vertsceller som omfatter nevnte rekombinante vektorer. Også tilveiebrakt her er rensede fusjons-proteiner som er kodet for av polynukleotider ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre preparater for anvendelse i fremgangsmåter for å inhibere eller forebygge utviklingen av en kreft hos et pattedyr ved å utløse en immunrespons mot CEA-proteinet ved å administrere en vaksine eller et farmasøytisk preparat som omfatter CEA-fusjonene eller CEA-fusjonsproteinene som er beskrevet her. I foretrukne utførelsesformer av fremgangsmåtene her er immunresponsen forsterket i forhold til responsen som er utløst av en villtype-CEA-vaksine.
Som benyttet gjennom beskrivelsen og de tilhørende kravene inkluderer entalls-formene "en", "ei", "et" og "den", "det" og "de", flertallsreferansen hvis ikke konteksten klart dikterer noe annet.
Som benyttet gjennom beskrivelsen og i de tilhørende kravene gjelder de følgende definisjonene og forkortelsene: Uttrykket "promoter" refererer til et gjenkjenningssete på en DNA-tråd til hvilket RNA-polymerasen binder. Promotoren danner et initieringskompleks med RNA-polymerase for å initiere og drive transkripsjonen aktivitet. Komplekset kan være modifisert av aktiverende sekvenser betegnet "enhancere" eller inhiberende sekvenser betegnet "silencere".
Uttrykket "kassett" refererer til en nukleotidsekvens eller gensekvens som skal bli uttrykt fra en vektor, foreksempel nukleotidsekvensen eller gensekvensen som koder for hCEA-LTB-fusjonen. Generelt omfatter en kassett en gensekvens som kan bli satt inn i en vektor, som i noen utførelsesformer tilveiebringer regulatoriske sekvenser for ekspresjon av nukleotidsekvensene eller gensekvensene. I andre utførelsesformer tilveiebringer nukleotidsekvensen eller gensekvensen de regulatoriske sekvensene for deres ekspresjon. I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer vektoren noen regulatoriske sekvenser og nukleotid- eller gensekvensen tilveiebringer andre regulatoriske sekvenser. For eksempel kan vektoren tilveiebringe en promotor for transkribering av nukleotid- eller gensekvensen og nukleotid- eller gensekvensen tilveiebringer en transkripsjonstermineringssekvens. De regulatoriske sekvensene som kan bli tilveiebrakt av vektoren inkludere enhancere, transkripsjonstermineringssekvenser, spleiseakseptor- og donorsekvenser, introns, ribosomkoblingssekvenser og poly(A)-addisjonssekvenser.
Uttrykket "vektor" refererer til noen måter ved hvilke DNA-sekvenser kan bli introdusert inn i en vertsorganisme eller vertsvev. Det foreligger ulike typer av vektorer, inkludert plasmider, virus (inkludert adenovirus), bakteriofager og kosmider.
Uttrykket "første generasjon", slik det ble benyttet med referanse til adenovirus-vektorer, beskriver adenovirusvektorer som er replikasjonsdefekte. Første generasjon adenovirusvektorer har typisk en fjernet eller inaktivert El-genregion, og har fortrinnsvis en fjernet eller inaktivert E3-genregion.
Forkortelsen "DOM" refererer vanligvis til det N-terminale domenet fra fragment-C fra tetanus toksoid.
Forkortelsen " LT" refererer vanligvis til det varmelabile enterotoksinet fra E. coli. "LT" kan referere til det komplette enterotoksinet, som omfatter subenhetene A og B eller en vesentlig del av subenhet A eller en vesentlig del av subenhet B. Forkortelsen "LTA" refererer til A-subenheten fra det varmelabile enterotoksinet fra E. coli, eller en vesentlig del derav, inkludert subenheter som ertrunkerte på den C-terminale eller N-terminale enden, men som opprettholder biologisk aktivitet, i tillegg til subenheter som inneholder interne aminosyreinsersjoner, delesjoner eller substitusjoner, men som opprettholder biologisk aktivitet. Forkortelsen "LTB" refererer til B-subenheten til det varmelabile enterotoksin fra E. coli, eller en vesentlig del derav, inkludert subenheter som er trunkerte på den C-terminale eller N-terminale enden, men som opprettholder biologisk aktivitet, i tillegg til subenheter som inneholder interne aminosyreinsersjoner, delesjoner eller substitusjoner, men som opprettholder biologisk aktivitet.
Betegnelsen "pVU/hCEAopt" refererer til en plasmidkonstruksjon som er beskrevet her, som omfatter den umiddelbart tidlige (IE) CMV-promotoren med intron-A, et fullengde, kodonoptimalisert, humant CEA-gen, bovine veksthormonavledede polyadenylerings- og transkripsjonstermineringssekvenser og en minimal pUC-ryggrad (se Eksempel 2). Betegnelsen "pVU/hCEA" refererer til en konstruksjon i det vesentlige som beskrevet ovenfor, bortsett fra at konstruksjonen omfatter et humant villtype-CEA-gen i stedet for et kodonoptimalisert humant CEA-gen.
Betegnelsen "pVU/hCEA-LTB" refererer til en plasmidkonstruksjon som er beskrevet her, som omfatter den umiddelbart tidligere (IE) CMV-promotoren med intron-A, et humant CEA-gen som mangler sin GPI-forankringskodende sekvens, fusjonert på sin C-terminale ende med B-subenheten til varmelabilt E. coli- enterotoksin, bovine veksthormonavledede polyadenylerings- og transkripsjonstermineringssekvenser og en minimal pUC-ryggrad.
Betegnelsen "pVU/hCEAopt-LTB" refererer til en konstruksjon som er i det vesentlige som beskrevet umiddelbart ovenfor, bortsett fra at konstruksjonen omfatter et kodonoptimalisert, humant CEA-gen som mangler sin GPI-forankringskodende sekvens i stedet for den tilsvarende delen av det humane villtype-CEA-genet.
Betegnelsen "pVU/hCEAopt-LTBopt" refererer til en plasmidkonstruksjon som i det vesentlige er som beskrevet umiddelbart ovenfor, bortsett fra at begge CEA-sekvensene og LTB-sekvensene er kodonoptimaliserte for høy-nivå ekspresjon i humane celler.
Betegnelsen "pVlJ/rhCEAopt-LTBopt" refererer til en konstruksjon som er i det vesentlige som beskrevet ovenfor, bortsett fra at det humane kodonoptimaliserte CEA-genet er erstattet med et rhesus ape-CEA-gen, som er kondonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler.
Betegnelsen "pVU/hCEA-LTA" refererer til en plasmidkonstruksjon som er beskrevet her, som omfatter den umiddelbart tidligere (IE) CMV-promotoren med intron A, et humant CEA-gen som mangler den GPI-forankringskodende sekvensen, fusjonert på sin C-terminale ende til A-subenheten til varmelabilt E. co//'-enterotoksin, bovine veksthormonavledede polyadenylerings- og transkripsjonstermineringssekvenser, og en minimal pUC-ryggrad. Konstruksjon av plasmidvektoren som omfatter ulike CEA-LT-fusjoner er beskrevet i Eksempel 2.
Betegnelsen "pVU/hCEA-DOM" refererer til en plasmidkonstruksjon som er beskrevet her, som omfatter den umiddelbart tidlige (IE) CMV-promotoren med intron-A, et humant CEA-gen som mangler sin GPI-forankringskodende sekvens, fusjonert på sin C-terminale ende til det N-terminale domenet på Fragment-C fra tetanus toksoid (DOM), bovine veksthormonavledede polyadenylerings- og transkripsjonstermineringssekvenser, og en minimal pUC-ryggrad (Eksempel 2).
Betegnelsen "pVU/rhCEAopt-DOMopt" refererer til en konstruksjon i det vesentlige som beskrevet ovenfor, bortsett fra det humane kodonoptimaliserte CEA-genet er erstattet med et rhesus ape CEA-gen, som er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler.
Betegnelsen "pVlJ/hCEA-FcIgG" refererer til en plasmidkonstruksjon som er beskrevet her, som omfatter den umiddelbart tidligere (IE) CMV-promotoren med intron-A, et humane CEA-gen som mangler den GPI-forankringskodende sekvensen, fusjonert på sin C-terminale ende med det tunge fragmentet til konstantkjede fra immunoglobulin Gl, bovine veksthormonavledede polyadenylerings- og transkripsjonstermineringssekvenser, og en minimal pUC-ryggrad (Eksempel 2). pVlJ/hCEAopt-FcIgGopt refererer til en konstruksjon i det vesentlige som beskrevet, bortsett fra nukleotidsekvensen som koder for CEA og FcIgG har blitt kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler.
Betegnelsene "Ad5/hCEAopt" og "Ad5/hCEA" refererer til to konstruksjoner som er beskrevet her, som omfatter et Ad5-adenovirusgenom som har fått fjernet El- og E3-regionene. I "Ad5/hCEAopt"-konstruksjonen er El-regionen erstattet med et kodon-optimalisert humant CEA-gen i en El-parallell orientering under kontrollen av en human CMV-promotor uten intron-A, etterfulgt av et bovint veksthormon polyadenyleringssignal. "Ad5/hCEA"-konstruksjonen er i det vesentlige som beskrevet ovenfor, bortsett fra at El-regionen i Ad5-genomet er erstattet med en human villtype-CEA-sekvens. Betegnelsen "Ad5/hCEAopt-LTB" refererer til en Ad5-konstruksjon, i det vesentlige som beskrevet ovenfor, bortsett fra et den kondonoptimaliserte humane CEA-sekvensen mangler den GPI-forankringskodende sekvensen og er fusjonert på sin C-terminal med B-subenheten til varmelabilt E. co//'-enterotoksin. Konstruksjon av adenovirusvektorer som omfatter ulike CEA-LT-fusjoner er beskrevet i Eksempel 3.
"Immunforsterkende element" refererer til en del av CEA-fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å stimulere eller forsterke immunresponsen ovenfor det assosierte CEA-proteinet, i forhold til fullengde, villtype-CEA. Immun-forsterkende elementer ifølge foreliggende oppfinnelse er valgt fra gruppen bestående av: heat shock-protein (HSP)-70, lysosom-assosiert membranprotein (LAMP), fragment-C fra tetanus toksoid (FrC), det N-terminale domenet til FrC (DOM), det tunge fragmentet til konstantkjeden fra immunoglobulin-Gl (FcIgG), det vesikulære
stomatittvirusglykoproteinet (VSV-G), koleratoksin (CT) fra Vibrio cholerae, og varmelabilt enterotoksin fra E. coli (LT). Uttrykket "immunforsterkende element" blir her benyttet om hverandre med uttrykket "adjuvans".
Som benyttet her refererer et "fusjonsprotein" til et protein som har minst to polypeptider kovalent bundet der et polypeptid kommer fra en proteinsekvens eller domene, og det andre polypeptidet kommer fra en annen proteinsekvens eller domene. Fusjons-proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et CEA-polypeptid eller et fragment eller variant derav, og et annet polypeptid som omfatter en vesentlig del av et immun-forsterkende element, som i noen tilfeller er et bakterielt toksin. CEA-polypeptidet, fragmentet eller varianten derav, kan være en human CEA eller CEA-homolog fra en annen art. Polypeptidene som omfatter fusjonsproteinet er fortrinnsvis bundet N-terminus til C-terminus. CEA-polypeptidet og toksin subenheten kan bli fusjonert i en hvilken som helst rekkefølge. I noen utførelsesformer av denne oppfinnelsen er C-terminus på CEA-poly-peptidet fusjonert til N-terminus på toksinsubenheten, som eksemplifisert i Figur IA. Imidlertid er fusjonsproteiner der det immunforsterkende element er fusjonert til N-terminus på CEA-polypeptidet også forutsett. Uttrykket "CEA-fusjonsprotein" er ment å skulle være et generelt uttrykk som refererer til en fusjon som er beskrevet ovenfor, som omfatter et CEA-polypeptid eller fragment eller variant derav, fusjonert til et polypeptid som omfatter et immunforsterkende element.
Uttrykket "CEA-LT-fusjon" refererer til en nukleinsyresekvens der minst en del av CEA-genet er fusjonert til en vesentlig del av enten LTA- eller LTB-subenheten fra varmelabilt enterotoksin fra E. coli. Uttrykket "CEA-LT-fusjonsprotein" refererer til et polypeptid som er kodet for av en CEA-LT-fusjon som beskrevet. Uttrykkene "CEA-LT-fusjon" og "CEA-LT-fusjonsprotein" er også forstått å skulle referere til fragmenter derav, homologer derav og funksjonelle ekvivalenter derav (kollektivt referert til som "varianter"), slik som de der en eller flere aminosyrer er innsatt, fjernet eller erstattet med andre aminosyrer. CEA-LT-fusjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan ved administrering til et pattedyr slik som et menneske stimulere en immunrespons ved hjelpe-T-celler eller cytotoksiske T-celler, eller stimulere produksjonen av antistoffer minst like godt som en "villtype"-CEA-sekvens. I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen kan CEA-LT-fusjonen forsterke immunresponsen sammenlignet med villtype-CEA.
Uttrykket "CEA-DOM-fusjon" refererer til en nukleinsyresekvens der minst en del av CEA-genet er fusjonert til en vesentlig del av det minimaliserte domenet fra tetanus toksin fragment-C, hvis ikke konteksten klart dikterer at nevnte uttrykk refererer til protein-sekvensen. Uttrykket "CEA-DOM-fusjonsprotein" refererer til et polypeptid som er kodet for av en CEA-DOM-fusjon som beskrevet. Uttrykkene "CEA-DOM-fusjon" og "CEA-DOM-fusjonsprotein" er også forstått å skulle referere til fragmenter derav, homologer derav og funksjonelle ekvivalenter derav (kollektivt referert til som "varianter"), slik som de der en eller flere aminosyrer er innsatt, fjernet eller erstattet med andre aminosyrer. CEA-DOM-fusjoner ifølge foreliggende oppfinnelse kan ved administrering til et pattedyr slik som et menneske stimulere en immunrespons ved hjelper-T-celler eller cytotoksiske T-celler, eller stimulere produksjonen av antistoffer minst like godt som en "villtype"-CEA-sekvens. I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen kan CEA-DOM-fusjonen forsterke immun-responsen sammenlignet med en villtype-CEA.
Forkortelsen "AD" refererer til forankringsdomenet til et CEA-gen eller -protein. Forankringsdomenet til human villtype-CEA er lokalisert fra omtrent aminosyre 679 til omtrent aminosyre 702 ifølge Sekv. Id. Nr. 20.
Uttrykket "behandling" refererer til både terapeutisk behandling og profylaktiske eller preventive tiltak. De som trenger behandling inkluderer de som allerede har forstyrrelsen i tillegg til de som tilbøyelige til å få forstyrrelsen eller de der forstyrrelsen skal bli forhindret.
En "forstyrrelse" er enhver tilstand som vil dra nytte av behandling med molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, inkludert nukleinsyremolekylene som er beskrevet her og fusjonsproteinene som er kodet for av nevnte nukleinsyremolekyler. Omfattet av uttrykket "forstyrrelse" er kroniske og akutte forstyrrelser eller sykdommer, inkludert de patologiske tilstandene som predisponerer pattedyret for forstyrrelsen det er snakk om. Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er ment å skulle bli anvendt som behandlinger for forstyrrelser eller tilstander som erkarakterisert vedavvikende celleproliferasjon, inkludert brystkreft, tykktarmskreft og lungekreft.
Uttrykket "effektiv mengde" betyr at tilstrekkelig vaksinepreparat blir introdusert for å frembringe de adekvate nivåene av polypeptidet slik at resultatet blir en immunrespons. En fagperson på området vil være på det rene med at dette nivået kan variere.
En "konservativ aminosyresubstitusjon" refererer til erstatningen av én aminosyrerest med en annen, kjemisk tilsvarende aminosyrerest. Eksempler på slike konservative substitusjoner er: substitusjon av en hydrofob rest (isoleucin, leucin, valin eller metionin) med en annen, substitusjon av en polar rest med en annen polar rest med samme ladning (for eksempel arginin for lysin, glutaminsyre for asparaginsyre).
"hCEA" og "hCEAopt" refererer henholdsvis til et humant karsinoembryonalt antigen og et humant kodonoptimalisert karsinoembryonalt antigen.
"rhCEA" og "rhCEAopt" refererer henholdsvis til et karsinoembryonalt antigen fra en rhesus ape og et kodonoptimalisert karsinoembryonalt antigen fra rhesus ape.
"Vesentlig lignende" betyr at en gitt nukleinsyre- eller aminosyresekvens deler minst 75 %, fortrinnsvis 85 %, mer foretrukket 90 % og mest foretrukket 95 % identitet med en referansesekvens. I foreliggende oppfinnelsen kan referansesekvensen være relevante deler av den humane villtype-CEA-nukleotid- eller -aminosyresekvensen, eller villtype nukleotid- eller -aminosyresekvensen fra et bakterielt toksin eller subenhet derav, slik som LTB eller LTA-subenhetene fra varmelabilt enterotoksin fra E. coli, som diktert av konteksten i teksten. Referansesekvensen kan for eksempel også være villtype-CEA-sekvensen fra rhesus ape. En CEA-proteinsekvens som er "vesenlig lignende" det humane villtype-CEA-proteinet eller fragment derav vil ha minst 75 % identitet med det relevante fragmentet fra human villtype-CEA, langs lengden av fragmentet, fortrinnsvis 85 % identitet, mer foretrukket 90 % identitet og enda mer foretrukket 95 % identitet. Hvorvidt et gitt CEA-, LTB- eller LTA-proteinsekvens eller - nukleotidsekvens er "vesentlig lignende" til en referansesekvens kan foreksempel bli bestemt ved å sammenligne sekvens-informasjon ved å benytte
sekvensanalyseprogramvare slik som GAP-dataprogram, versjon 6.0, som er tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-programmet benytter sammenstillingsfremgangsmåten til Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), som revidert av Smith og Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981).
I en "vesentlig del" av et gen, variant, fragment eller subenhet derav, betyr en del på minst 50 %, fortrinnsvis 75 %, mer foretrukket 90 % og enda mer foretrukket 95 % av en referansesekvens.
Et "gen" refererer til et nukleinsyremolekyl hvis nukleotidsekvens koder for et polypeptid molekyl. Gener kan være ubrutte sekvenser av nukleotider eller de kan inkludere slike mellomliggende segmenter som introns, promoter regioner, spleiseseter og repeterende sekvenser. Et gen kan være enten RNA eller DNA. Et foretrukket gen er ett som koder for peptidet ifølge oppfinnelsen.
Uttrykket "nukleinsyre" eller "nukleinsyremolekyl" er ment for ribonukleinsyre (RNA) eller deoksyribonukleinsyre (DNA), prober, oligonukleotider, fragmenter eller deler derav og primere. DNA kan være enten komplementært DNA (cDNA) eller genomisk DNA, f. eks. et gen som koder for et CEA-fusjonsprotein.
"Villtype-CEA" eller "villtype protein" eller "wt-protein" refererer til et protein som omfatter en naturlig forekommende sekvens av aminosyrer eller varianter derav. Amino-
syresekvensen til human villtype-CEA er vist i Figur 7E (Sekv. Id. Nr. 20). Aminosyresekvensen til villtype-CEA fra rhesus ape har tidligere blitt beskrevet (WO 2004/072287, se Figurene 7A-7B).
"Villtype-CEA-genet" refererer til et gen som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et naturlig forekommende CEA-protein, inkludert proteiner av humant opphav eller proteiner som er fremskaffet fra en annen organisme, inkludert andre pattedyr slik som rotte, mus og rhesus ape. Nukleotidsekvensen til det humane CEA-genet er tilgjengelig på fagområdet (ovenfor). Se også Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol. 7:3221-3230 (1987); Zimmerman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:920-924 (1987); og Thompson et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84(9):2965-69 (1987). Nukleotidsekvensen til villtypegenet fra rhesusape er vist i Figurene 7C-7C.
Uttrykket "pattedyr" refererer til ethvert pattedyr, inkludert et menneske. Forkortelsen "Ag" refererer til et antigen.
Forkortelsene "Ab" og "mAb" refererer til antistoff og et monoklonalt antistoff. Forkortelsen "ORF" refererer til den åpne leserammen til et gen.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser en skjematisk representasjon av vektorene som er utviklet i denne studien. De vesentlige egenskapene til plasmidet og Ad-vektorene som koder for CEA-LTA- og CEA-LTB-fusjonene er angitt. De inverterte terminale repetisjonene (ITR) i Ad5-genomet er også vist. Figur 2 viser nukleotid- (Sekv. Id. Nr. 7, Panel A) og aminosyresekvensen (Sekv. Id. Nr. 8, Panel B) til en eksempelmessig hCEA-LTA-fusjon. LTA-nukleotidsekvensen er vist i fet skrift. Figur 3 viser nukleotid- (Sekv. Id. Nr. 9, Panel A) og aminosyresekvensen (Sekv. Id. Nr. 10, Panel B) til en eksempelmessig hCEA-LTB-fusjon. LTB-nukleotid-sekvensen er vist i fet skrift. Figur 4 viser nukleotidsekvensen til en eksempelmessig hCEAopt-LTB-fusjon (Sekv. Id. Nr. 11). LTB-nukleotidsekvensen er vist i fet skrift. Figur 5 viser nukleotid- (Sekv. Id. Nr. 12, Panel A) og aminosyresekvensen (Sekv. Id. Nr. 13, Panel B) for en eksempelmessig, fullt optimalisert hCEA-LTB-fusjon, her betegnet hCEAopt-LTBopt. LTB-nukleotid- og -aminosyresekvensen er vist i fet skrift. Koblings-sekvenser, som dannes ved kloningsstrategien som ble benyttet for å fusjonere CEA- og LTB-sekvensene er understreket. Figur 6 viser nukleotid- (Sekv. Id. Nr. 14, Panel A) og aminosyresekvensen (Sekv. Id. Nr. 15, Panel B) til en fullt optimalisert rhesus ape-CEA-LTB-fusjon, her betegnet som rhCEAoptLTBopt. LTB-nukleotid- og -aminosyresekvensen er vist i fet skrift. Koblings-sekvenser, som dannes ved kloningstrategien som ble benyttet for å fusjonere CEA- og LTB-sekvensene er understreket. Figur 7 viser nukleotidsekvensen til villtype-gener som koder for rhesusape-CEA (Panel A og B, Sekv. Id. Nr. 16 og 17) og aminosyresekvensen for det korresponderende proteinet (Panel C og D, Sekv. Id. Nr. 18 og 19), som tidligere er beskrevet (U.S.S.N. 60/447 203). Panel E viser aminosyresekvensen til human villtype-CEA (Sekv. Id. Nr.
20), som tidligere har blitt beskrevet (se f. eks. US patent nr. 5 274 087).
Figur 8 viser en sammenligning av CEA-ekspresjonseffektivitet i celler som er transfektert med ulike CEA-konstruksjoner. Panel A avbilder ekspresjonseffektivitetene til HeLa-celler som er transfektert med 3 ug plasmid som bærer villtype-sekvensen for hCEA, hCEA-LTA og hCEA-LTB, som med 0,2 ug plasmid pVlJ/mEPO som tracer. Panel B viser resultater fra et tilsvarende transfeksjonseksperiment ved å benytte pVU/hCEAopt og pVJ/hCEAopt-LTB. Ekspresjonseffektivitet ble bestemt tre dager etter transfeksjon ved å måle mengden av CEA-protein tilstede i ce I lee kst rakte r og ved å normalisere denne verdien for EPO-ekspresjon. Data som er vist relateres til de gjennomsnittlige CEA-ekspresjons-verdiene fra to uavhengige transfeksjoner. Figur 9 viser en sammenligning av ekspresjonseffektiviteten fra ulike rekombinante adenovirusvektorer som uttrykker CEA. HeLa-celler ble infisert med en moi (infeksjons-multiplisitet) på 100 og 1000 med Ad/hCEAopt og Ad/hCEAopt-LTB. Ekspresjonseffektivitet ble bestemt ved å måle mengden av CEA-protein frigitt i celleekstrakter tre dager etter infeksjon. Data som er vist reflekterer de gjennomsnittlige CEA-ekspresjonsverdiene fra to uavhengige infeksjoner. Figur 10 viser en analyse av den cellemedierte immunresponsen utløst av ulike plasmidvektorer som koder for humant CEA. Tre grupper med C57BL/6-mus ble elektroinjisert intramuskulært med 50 ug av det angitte plasmidet (CEA, CEA-LTA-fusjon eller CEA-LTB-fusjon) ved 0 og 3 uker. En fjerde gruppe med mus ble immunisert med en blanding av 25 ug pVU/hCEA-LTA og 25 ug pVU/hCEA-LTB. Panel A. To uker etter boostring ble antallet IFNy-utskillende T-celler som var spesifikke for CBA bestemt ved ELISPOT-analyse på splenocytter fra individuelle mus (tomme sirkler) ved å benytte peptidsamlinger som omfatter hele proteinet. Geometriske middelverdier (fylte ruter) er også angitt. Panel B avbilder resultatene fra intracelluær IFNy-farging av poolede splenocytter fra immuniserte mus ved å benytte peptid-pool D. Den ikke-spesifikke IFNy-produksjonen (DMSO) er vist for hver gruppe. Figur 11 viser antistoff titre fra mus som ble immunisert med plasmid-DNA-vektorer som koder for CEA. Individuelle titre mot renset humant CEA-protein ble målt ved hjelp av ELISA og serum fra individuelle mus som var immunisert med plasmidene pVU/hCEA, pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB. Gjennomsnittverdier er også vist (fylte ruter). Figur 12 viser en analyse av den cellemedierte immunresponsen som blir utløst av ulike plasmidvektorer som koder for CEA. Grupper på 4 BALB/c mus ble elektroinjisert med det angitte plasmidet som angitt ovenfor (Figur 4). To uker etter den siste injeksjon ble antallet IFNy-utskillende T-celler som var spesifikke for CEA bestemt ved hjelp av ELISPOT-analyse på splenocytter fra individuelle mus (tomme sirkler) ved å benytte peptid-pooler som omfatter hele proteinet. Gjennomsnittverdier (fylte ruter) er også angitt. Figur 13 viser en analyse av den CEA-spesifikke CD8<+->T-celleresponsen som ble utløst av ulike plasmidvektorer som koder for CEA. C57/DR4-mus ble elektroinjisert med det angitte plasmidet beskrevet ovenfor (se Figur 4). To uker etter den siste injeksjonen ble intracelluær IFNy-farging av poolede splenocytter fra immuniserte mus utført ved å benytte peptid-pool B og D. Den ikke-spesifikke IFNy-produksjonen (DMSO) er vist for hver gruppe. Figur 14 viser en analyse av den CEA-spesifikke CD8<+->T-celleresponsen som blir utløst av ulike plasmidvektorer som koder for CEA. HHD-mus ble elektroinjisert med det angitte plasmidet som beskrevet ovenfor (se Figur 4). To uker etter den siste injeksjonen ble intracelluær IFNy-farging av poolede splenocytter fra immuniserte mus utført ved å benytte peptid-pool B og D. Den ikke-spesifikke IFNy-produksjonen (DMSO) er vist for hver gruppe. Figur 15 viser den cellemedierte og den humorale immunresponsen hos CEA transgene mus (N=9) immunisert med 5 ukentlige elektroinjeksjoner av de angitte plasmidene. En total mengde på 50 ug plasmid-DNA ble injisert i.m. ved hver vaksinasjon. Panel A. To uker etter den siste injeksjon ble antallet IFNy-utskillende T-cellespesifikke for CEA bestemt ved hjelp av intracelluær farging på splenocytter fra individuelle mus (sirkler) ved å benytte peptid-pool D. Geometriske middelverdier (triangler) ble også angitt. Panel B. Individuelle titre mot renset humant CEA-protein ble målt ved hjelp av ELISA på hvert serum fra mus immunisert med plasmider pVU/hCEAopt og pVU/hCEA-LTB. Geometriske middelverdier er også kjent (fylte ruter). Disse dataene indikerer at CEA-LTB-fusjonene bryter toleranse ovenfor CEA hos transgene mus. Figur 16 viser en analyse av den CEA-spesifikke CD8<+->T-celleresponsen utført av ulike adenovirusvektorer som koder for CEA. CEA transgene mus ble immunisert med ulike doser av Ad/hCEAopt og Ad/CEAopt-LTB ved 0 og 2 uker. To uker etter den siste injeksjonen ble intracellulær IFNy-farging av PMBC fra hver immunisert mus utført ved å benytte peptid-pool D (fylte sirkler). Geometriske middelverdier er også vist (fylte ruter). Den ikke-spesifikke IFNy-produksjonen (DMSO) fra hver injiserte gruppe var mindre enn eller lik 0,01 %. Figur 17 viser resultatene fra tumorbeskyttelsesstudier med immuniserte, CEA-transgene mus utfordret med MC38-CEA-celler. Grupper på 10 CEA transgene mus ble immunisert med 5 ukentlige elektroinjeksjoner med det angitte plasmid-DNA (50 ng/injeksjon). To uker etter den siste DNA-injeksjonen ble mus boostret med en enkel injeksjon på lxlO<10>vp med den tilsvarende Ad-vektoren. 14 dager etter adenovirusboosten ble mus utfordret med en subkutan injeksjon på 5 x IO<5>MC38-CEA-celler. Panel A viser prosentandelen av tumorfrie mus på de angitte tidspunktene. Panel B rapporterer de gjennomsnittlige tumorvolumene fra hver immunisert gruppe. Disse dataene viser at immunisering av CEA transgene mus med CEA-LTB beskytter mus mot tumorutvikling. Figur 18. Panel A viser en skjematisk representasjon av representative CEA-fusjonsproteiner som ble benyttet i denne studien. Vektorer som uttrykker CEA-fusjons-proteiner ble avledet fra plasmid pVUns som beskrevet i Eksempel 2. Konstruksjonene omfatter en CEA-nukleotidsekvens fra nt 1 til nt 2037 med en netto delesjon på 64 aa tilsvarende til GPI-forankringssekvensen og uttrykker CEA fra aa 1 til aa 679. Sekvense-koordinatene for hvert protein fusjonert til CEA er også angitt. Panel B viser ekspresjon av pVU-avledede konstruksjoner i transfekterte celler. HeLa-celler ble transfektert med plasmider pVU/CEA-VSV-G, pVlJ/CEA-FcIgG, pVU/CEA-DOM, pVU/CEA-HSP70, pVlJ/CEA-LAMP eller pVU/CEA og prosessert for Western-blot-a na lyse som beskrevet i Eksempel 5. Spesifisiteten til antistoffet som ble benyttet for Western-blotting er angitt. CEA-proteinet er angitt (sort pil). Posisjonene til molekylstørrelsesstandarder (i kilodalton) er også vist. Figur 19 viser en sammenligning av ekspresjonseffektivitet for CEA-fusjonskonstruksjoner. HeLa-celler ble transfektert med de angitte plasmider og CEA-avledet protein til stede i cellelysatene (A) og supernatantene (B) ble målt ved hjelp av ELISA som beskrevet i Eksempel 8. Resultater oppnådd er representative for to uavhengige eksperimenter. Figur 20 viser en sammenligning av immunogenisitet for forskjellige konstruksjoner som koder for CEA-fusjonsproteiner. C57BL/6-mus ble elektroporert intramuskulært med en 5 eller 50ug/dose med de angitte plasmidene. Injeksjonene ble utført på dagene 0 og 14. Panel A. Antallet IFNy-utskillende T-celler i PBMC i hver individuell mus ble bestemt ved å benytte en pool av peptider som dekker aa 497-703 (pool D) som beskrevet i Eksempel 6 og 15. Gjennomsnittlig antall IFNy-utskillende T-celler er også vist (fylte sirkler). SFC-verdier for pVU/CEA-DOM og pVlJ/CEA-FcIgG er signifikant forskjellig fra pVU/CEA. Panel B. Antistofftiter ble målt ved hjelp av ELISA ved å benytte renset CEA som substrat. Gjennomsnittsverdier for hver kohort immunisert med 50 ug dose med det angitte plasmidet er vist. Titre som er vesentlig forskjellige fra de til mus injisert med pVU/CEA er angitt med en asterisk. Figur 21 viser induksjonen av CEA-spesifikke immunresponser hos CEA transgene mus. Gruppe på 12 CEA transgene mus ble immunisert med plasmid-DNA (50 ug/dose elektroinjisert i kvadricepsmuskelen) eller adenovirusvektorer (10<9>vp/dose) som har kodonanvendelse optimalisert cDNA fra CEA, CEA-DOM eller CEA-FcIgG. CEA-spesifikke CD8<+->T-celler utløst av DNA/DNA (A) og Ad/Ad (C)-immuniseringsregimer ble målt ved hjelp av intracellulær IFNy-farging på PBMC for hver immunisert mus. Gjennomsnitts-
verdiene for hver gruppe er også vist (fylt sirkel). CEA-DOM og CEA-FcIgG-kohorter immunisert med DNA/DNA og Ad/Ad-regimer var signifikant forskjellige fra den CEA-vaksinerte gruppen. CEA-spesifikke antistoff-titre fra hver individuell mus vaksinert med DNA/DNA (B) eller Ad/Ad (D) immuniseringsregimet ble målt ved hjelp av ELISA. Titre utløst av CEA-DOM- og CEA-FcIgG-vektorer var signifikant forskjellige fra de utløst av
CEA.
Figur 22 viser immunogenisiteten fra DNA/Ad-regimet. Grupper på 12 CEA transgene mus ble immunisert med plasmid-DNA (50ug/dose) og adenovirusvektorer (IO<9>vp/dose) som har kodonanvendelse optimalisert cDNA fra CEA, CEA-DOM eller CEA-FcIgG. CEA-spesifikke CD8<+->T-celler ble målt ved hjelp av intracellulær IFNy-farging på PBMC for hver immunisert mus (A). Gjennomsnittsverdiene for hver kohort er også vist (fylt sirkel). CEA-DOM- og CEA-FcIgG-kohortene var signifikant forskjellig fra den CEA-vaksinerte gruppen. CEA-spesifikke antistoff titre for hver individuell mus ble målt ved hjelp av ELISA (B). Titre utløst av CEA-DOM- og CEA-FcIgG-vektorer var signifikant forskjellig fra de som ble utløst av CEA. Gjennomsnittverdier er vist (fylte sirkler). Figur 23 viser påvisningen av CD4<+->T-cellerespons mot tetanus toksoid protein. CEA transgene mus ble immunisert med pVU/CEA-DOMopt som beskrevet i Eksempel 16. Intracellulær IFNy-farging av poolede PBMC fra immuniserte mus ble utført med peptid p30. Hele lymfocytt «gating» og «gating» for CD8<+>(R3) og CD4<+->T-celler (R4) er vist. Figur 24 viser antitumoreffekten av vaksinering med vektorer som har kodon-optimalisert cDNA fra CEA, CEA-DOM eller CEA-FcIgG. Grupper på 10 CEA transgene mus ble immunisert med DNA/DNA (A), Ad/Ad (B) og DNA/Ad (C)-vaksineringsregimer ved å benytte plasmid-DNA og Ad-vektorer som har kodonanvendelse optimalisert cDNA fra CEA, CEA-DOM eller CEA-FcIgG, som beskrevet i Eksempel 18. To uker etter den siste injeksjonen ble mus utfordret med sc-inokulering på 5 x IO<5>MC38-CEA-tumorceller. Prosentandel av tumorfrie mus i de vaksinerte gruppene ble bestemt ved ukentlige intervaller og sammenlignet med verdiene for ubehandlede kontroller. Mus vaksinert med CEA-DOM-vektorer (DNA/Ad modalitet) var signifikant forskjellig fra kontrollmus (Iog-rank-test p<0,05). Figur 25 viser effekten av CD4-, -CD8- eller NK-deplesjon på induksjon av antitumoreffekt indusert ved CEA-DOM DNA/Ad-immunisering. CEA transgene mus ble immunisert med gjentatte ukentlige injeksjoner av 50 ug pVU/CEA-DOMopt etterfulgt av en boostring med 1 x IO<9>vp med Ad-CEA-DOMopt (eksempel 19). En uke etter den siste injeksjonen var mus enten ikke depletert for, eller var depletert for CD4<+->T-celler, CD8<+->T-celler eller NK-celler. To uker etter den siste immuniseringen ble mus utfordret med sc-inokulering av 5 x IO<5>MC38-CEA-tumorceller. Prosentandel av tumorfrie mus i de vaksinerte gruppene ble bestemt ved ukentlige intervaller og sammenlignet med prosentandelen for ubehandlede kontroller. Dataene indikerer at prosentandelen av tumorfrie mus i den vaksinerte gruppen var signifikant forskjellig fra ubehandlede kontroller og depleterte grupper. Figur 26 viser nukleotidsekvensen (Sekv. Id. Nr. 21) for en eksempelmessig, fullt optimalisert hCEA-DOM-fusjon, her betegnet hCEAoptDOMopt. Aminosyresekvensen til det kodede proteinet er også vist (Sekv. Id. Nr. 45). CEA-delen av nukleotidsekvensen for denne spesielle CEA-fusjonen består av nukleotider 1 til 2037, som er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i en human vertscelle. DOM-delen av nukleotidsekvensen er vist i fet skrift og er også kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler. Koblings-sekvenser, som dannes ved kloningsstrategien som ble benyttet for å fusjonere CEA- og LTB-sekvensene er understreket. Figur 27 viser en eksempelmessig nukleotidsekvens (Sekv. Id. Nr. 25) for en hCEA-FcIgGopt-fusjon, heretter betegnet hCEAoptFcIgGopt. Sekvensen for det kodede proteinet (Sekv. Id. Nr. 46) er også vist. CEA-delen av nukleotidsekvensen for denne spesielle CEA-fusjonen består av nukleotidene 1 til 2037, som er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i en human vertscelle. FcIgG-delen av nukleotidsekvensen, som også er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler, er vist i fet skrift. Koblingssekvenser som dannes ved kloningsstrategien som ble benyttet for å fusjonere CEA- og LTB-sekvensen er understreket. Figur 28 viser nukleotidsekvensen for en del av det humane villtype-CEA-cDNA fra nt 1 til nt 2037 (Sekv. Id. Nr. 22, Panel A), som koder for en del av hCEA-proteinet fra aa 1 til aa 679 (Sekv. Id. Nr. 23, Panel B). Figur 29 viser den ikke-optimaliserte nukleotidsekvensen for det minimaliserte domenet fra tetanus toksin fragment C (DOM)-cDNA fra nt 1 til nt 825 (Sekv. Id. Nr. 47), som koder for DOM-proteinet, også vist (Sekv. Id. Nr. 48). Figur 30 viser den ikke-optimaliserte nukleotidsekvensen for en eksempelmessig human CEA-DOM-fusjon (Sekv. Id. Nr. 49). CEA-delen av nukleotidsekvensen til denne spesielle CEA-fusjonen består av nukleotidene 1 til 2037. DOM-delen av nukleotid-sekvensen er vist i fet skrift. Figur 31 viser en eksempelmessig nukleotidsekvens (Sekv. Id. Nr. 50) fra en rhesus ape-CEA-DOM-fusjon, her betegnet rhCEA-DOMopt. Sekvensen til det kodede fusjons-proteinet (Sekv. Id. Nr. 51) er også vist. CEA-delen av nukleotidsekvensen til denne spesielle CEA-fusjonen består av nukleotidene 1 til 2037 som er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i en human vertscelle. DOM-delen av nukleotidsekvensen, som også er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler, er vist i fet skrift. Figur 32 viser en eksempelmessig nukleotidsekvens (Sekv. Id. Nr. 52) fra en rhesus ape CEA-CTB-fusjon, her betegnet rhCEA-CTBopt. Sekvensen for det kodede fusjons-proteinet (Sekv. Id. Nr. 53) er også vist. CEA-delen av nukleotidsekvensen til denne spesielle CEA-fusjonen består av nukleotidene 1 til 2037, som er kodonoptimalisert
for høy-nivå ekspresjon i en human vertscelle. CTB-delen av nukleotidsekvensen, som også er kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler, er vist i fet skrift.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Karsinoembryonalt antigen (CEA) er vanligvis assosiert med utviklingen av adenokarsinomer. Foreliggende oppfinnelse vedrører preparater og fremgangsmåter for å utløse eller forsterke immunitet ovenfor protein produktet som blir uttrykt av det CEA-tumor-assosierte antigen, hvor avvikende CEA-ekspresjon er assosiert med karsinomet eller dets utvikling. Assosiasjon av avvikende CEA-ekspresjon med et karsinom krever ikke at CEA-proteinet blir uttrykt i tumorvev ved alle tidspunkter av dets utvikling, siden unormal CEA-ekspresjon kan foregå ved tumorinitiering og ikke være påvisbart sent i tumorprogresjonen eller vise versa.
For dette formål tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polynukleotider, vektorer, vertsceller og kodede proteiner som omfatter en CEA-sekvens eller variant derav til anvendelse i vaksiner og farmasøytiske preparater til behandlingen og/eller forebyggingen av en kreft. Polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en nukleotidsekvens som koder for et C-terminalt trunkert humant CEA-protein eller variant derav, fusjonert med en nukleotidsekvens som koder for minst en subenhet av et immunforsterkende element, nemlig LTB eller en vesentlig del derav, som effektivt kan fremme en immun-respons ovenfor det assosierte CEA.
CEA-nukleotidsekvensen ifølge foreliggende oppfinnelsen er av human opprinnelse. Den humane villtype-CEA-nukleotidsekvensen har blitt rapportert (se for eksempel US patent nr. 5 274 087, US patent nr. 5 571 710 og US patent nr. 5 843 761). Rhesus-ape-CEA-sekvensen har nylig blitt beskrevet (WO 2004/072287). CEA-delen av CEA-fusjonen kan være enhver variant som er tilstrekkelig til å utløse en CEA-spesifikk immunrespons hos et pattedyr. CEA-varianter ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer sekvenser som er N-terminalt trunkerte, sekvenser med konservative substitusjoner og sekvenser med interne delesjoner eller insersjoner.
Følgelig vedrører foreliggende oppfinnelse et syntetisk polynukleotid som definert i det etterfølgende krav 1. De syntetiske polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse koder for mRNA-molekyler som uttrykker et funksjonelt CEA-fusjonsprotein slik at det er nyttig i utviklingen av en terapeutisk eller profylaktisk kreftvaksine.
I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er CEA-delen av det kodede CEA-fusjonsproteinet et humant CEA som har fått fjernet sitt C-terminale forankringsdomene (AD) (Sekv. Id. Nr. 23), som er lokalisert fra rundt aminosyre 679 til rundt aminosyre 702 i det humane fullengde-CEA. Uten å være bundet av teori øker delesjon av forankringsdomenet utskilling av CEA-fusjonsproteinet, for dermed å forsterke krysspriming av CEA-LTB-immunresponsen.
Den immunforsterkende elementdelen av CEA-fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til å stimulere eller forsterke immunresponsen mot det assosierte CEA-proteinet og er avledet fra det varmelabilt enterotoksin fra E. coli (LT). Spesifikt omfatter adjuvansdelen av CEA-fusjonen B-subenheten fra LT, eller vesentlig del derav.
En CEA-fusjon som omfatter et trunkert humant CEA fusjonert til en enkelt epitop fra tetanus toksin (Q830-L8449 har blitt beskrevet (Lund et al. Cancer Gene Therapy 10: 365-376 (2003)). I motsetning til denne enkelt-epitopfusjonen omfatter CEA-fusjonene ifølge foreliggende oppfinnelse en vesentlig del av et immunforsterkende element eller subenhet derav, som beskrevet ovenfor, som er i stand til å forsterke immunogenisiteten til et CEA-protein eller variant derav. En vesentlig del av et immunforsterkende element som skal benyttes i preparatene og fremgangsmåtene som er beskrevet her inkluderer ikke deler som er mindre enn 50 % av en fullengde-toksinsubenhet. Strategien benyttet her, som benytter fullengde-adjuvanssubenheter eller vesentlige deler derav, blir benyttet for å sikre en sterkere immunrespons for den fusjonerte CEA-sekvensen. Uten å være bundet av teori, antas det at hvis det bakterielle toksinet som er valgt som adjuvans omfatter mer enn én hjelpeepitop, så vil begrensning av toksinsekvensen til fusjonsproteinet til en enkelt epitop sansynligvis føre til en redusert effekt på immunogenisiteten til målproteinet. I tillegg er det antatt at hvis den adjuvansmedierte forsterkningen av immunresponsen er avhengig av interaksjonen av adjuvans med spesifisikke cellereseptorer og ikke basert på en universal epitop, da kan reseptorinteraksjonen være avhengig av en spesifikk strukturell konfigurasjon som vil kreve at en vesentlig del av det immunforsterkende elementet utøver en adjuvanseffekt.
I et slikt tilfelle vil en kort adjuvanssekvens som omfatter en enkelt epitop være utilstrekkelig for å mediere økning i immunresponsen.
Også forutsatt for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er nukleotidsekvenser som koder for varianter eller mutanter av de immunforsterkende elementene som er beskrevet her, inkludert: nukleotidsubstitusjoner, delesjoner, addisjoner, aminoterminale trunkeringer og karboksyterminale trunkeringer. I noen tilfeller kan det være fordelaktig å innføre spesifikke punktmutasjoner på nukleotidsekvensen som koder for adjuvansen eller en subenhet derav for å redusere eller eliminere toksisiteten til det kodede proteinet. I eksempelmessige utførelsesformer av dette aspektet av foreliggende oppfinnelse blir en LT-subenhet fusjonert til CEA-sekvensen på CEA-fusjonen, hvor LT-subenheten har fått fjernet sin signalsekvens. Uten å være bundet av teori, så sikrer delesjon av toksin-signalsekvensen, dvs. LTB-signalsekvensen, at posttranslasjonell prosessering av CEA-fusjonen blir drevet av CEA-signalsekvensen.
Det immunforsterkende elementet, subenhet eller vesentlig del derav, kan bli fusjonert til aminoterminalen eller karboksyterminalen av CEA-sekvensen. Videre kan den immunforsterkende elementsekvensen og CEA-sekvensen bli fusjonert N-terminus til N-terminus, C-terminus til C-terminus, C-terminus til N-terminus eller N-terminus til N-terminus. I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir C-terminusen på CEA-polypeptidet fusjonert til N-terminusen på det immunforsterkende elementet.
Foreliggende oppfinnelse vedrører et syntetisk nukleinsyremolekyl (polynukleotid) som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for mRNA som uttrykker et nytt CEA-fusjonsprotein, for eksempel nukleotidsekvenser som koder for fusjonsproteinene ifølge Sekv. Id. Nr. 10 og 13. Nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er i det vesentlige frie for andre nukleinsyrer.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også rekombinante vektorer og rekombinante vertsceller, både prokaryote og eukaryote, som inneholder nukleinsyremolekylene som er beskrevet gjennom hele denne beskrivelsen. De syntetiske DNA-molekylene, assosierte vektorer og verter ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige til utviklingen av en kreft - vaksine.
Eksempler på nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en nukleotidsekvens som er valgt fra gruppen som består av Sekv. Id. Nr. 9, 11 og 12, som vist i Figurene 3-5, som koder for eksempelmessige CEA-LTB fusjonsproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer også biologisk aktive fragmenter eller mutanter av Sekv. Id. Nr. 9, 11 og 12, som koder for mRNA som uttrykker eksempelmessige CEA-fusjonsproteiner. Ethvert slikt biologisk aktivt fragment og/eller mutant vil kode for enten et protein eller proteinfragment som i det minste i det vesentlige etterligner de farmakologiske egenskapene til hCEA-proteinet, inkludert hCEA-proteinet ifølge Sekv. Id. Nr. 20. Ethvert slikt polynukleotid inkluderer: nukleotidsubstitusjoner, delesjoner, addisjoner, aminoterminale trunkeringer og karboksyterminale trunkeringer. Mutasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse koder for mRNA-molekyler som uttrykker et funksjonelt CEA-fusjonsprotein i en eukaryot celle slik at de er nyttige ved kreftvaksineutvikling.
Også inkludert i omfanget av denne oppfinnelsen er mutasjoner i DNA-sekvensen som ikke i det vesentlige endrer de ultimate fysiske egenskapene til det uttrykte proteinet. For eksempel behøver ikke substitusjon av valin for leucin, arginin for lysin eller asparagin for glutamin å forårsake endring i funksjonaliteten til polypeptidet.
Som påpekt ovenfor vedrører foreliggende oppfinnelse ytterligere rekombinante vektorer som omfatter nukleinsyremolekylene som er beskrevet i denne beskrivelsen. Disse vektorene kan være omfattet av DNA eller RNA. For de fleste kloningshensikter er DNA-vektorer foretrukket. Typiske vektorer inkluderer plasmider, modifiserte virus, bakulovirus, bakteriofag, kosmider, kunstige gjærkromosomer og andre former for episomalt eller integrert DNA som kan kode for et CEA-fusjonsprotein. Det ligger godt innenfor kunnskapene til en erfaren fagperson å bestemme en hensiktmessig vektor for en spesiell genoverføring eller annen anvendelse.
Også tilveiebrakt av foreliggende oppfinnelse er rensede CEA-fusjonsproteiner som er kodet for av nukleinsyrene som er beskrevet i denne beskrivelsen. I eksempelmessig utførelsesformer av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter CEA-fusjonsproteinet en sekvens av aminosyrer som er valgt fra gruppen som består av Sekv. Id. Nr. 10 og 13.
Inkludert i foreliggende oppfinnelse er DNA-sekvenser som hybridiserer med Sekv. Id. Nr. 9, 11 og 12 ved stringente betingelser. For eksempelets del er en prosedyre som benytter betingelser med høy stringens som følger. Prehybridisering av filtre inneholdende DNA blir utført i omtrent 2 timer til over natt ved omtrent 65°C i buffer sammensatt av 6x SSC, 5x Denhardts løsning og 100 ug/ml denaturert laksesperm-DNA. Filtre blir hybridisert i omtrent 12 til 48 timer ved 65 °C i prehybridiseringsblanding inneholdende
100 ug/ml denaturert laksesperm-DNA og 5-20x IO<6>cpm med<32>P-merket probe. Vasking av filtre ble utført ved 37°C i omtrent 1 time i en løsning som inneholder 2x SSC, 0,1 % SDS. Dette blir etterfulgt av en vasking i 0,lx SSC, 0,1 % SDS ved 50 °C i 45 minutter før autoradiografi. Andre prosedyrer som benytter betingelser med høy stringens vil inkludere enten et hybridiseringstrinn utført i 5x SSC, 5x Denhardts løsning, 50 % formamid ved omtrent 42°C i omtrent 12 til 48 timer eller et vasketrinn utført i 0,2x SSPE, 0,2 % SDS ved omtrent 65°C i omtrent 30-60 minutter. Reagenser som er nevnt i de foregående prosedyrene for å utføre hybridisering ved høy stringens er velkjente på fagområdet. Detaljer som gjelder sammensetning av disse reagensene kan bli funnet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1998) eller Sambrook og Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001). I tillegg til det foregående kan andre betingelser med høy stringens som også er velkjente på fagområdet bli benyttet.
En ekspresjonsvektor som inneholder et CEA-fusjonsproteinkodende nukleinsyre molekyl blir benyttet til høy-nivå ekspresjon av CEA-fusjonsprotein i en rekombinant vertscelle. Ekspresjonsvektorer kan inkludere kloningsvektorer, modifiserte kloningsvektorer, spesifikt designede plasmider eller virus. I tillegg kan en mengde bakterielle ekspresjonsvektorer bli benyttet til å uttrykke rekombinante CEA-fusjonssekvenser i bakterieceller hvis ønskelig. I tillegg kan en mengde soppcelle ekspresjonsvektorer bli benyttet til å uttrykke rekombinante CEA-fusjonssekvenser i soppceller. Videre kan en mengde insektscelle ekspresjonsvektorer bli benyttet til å uttrykke rekombinant protein i insektsceller.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også vertsceller som er transformert eller transfektert med vektorer som omfatter nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse. Rekombinante vertsceller kan være prokaryote eller eukaryote, inkludert bakterier slik som E. coli, soppceller slik som gjær, pattedyrceller inkludert cellelinjer av bovin, svin, ape og gnager opprinnelse, og insektsceller inkludert Drosophila og silkeorm avledede cellelinjer. Slike rekombinante vertsceller kan bli dyrket ved passende betingelser for å produsere et CEA-fusjonsprotein eller en biologisk ekvivalent form. I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er vertscellen human. Som definert her er ikke uttrykket "vertscelle" ment å skulle inkludere en vertscelle i kroppen til et menneske, humant foster eller humant embryo.
Som påpekt ovenfor kan en ekspresjonsvektor som inneholder DNA som koder for et CEA-fusjonsprotein bli benyttet til ekspresjon av CEA-fusjonsprotein i en rekombinant vertscelle. Derfor er et annet aspekt av denne oppfinnelsen en prosess for å uttrykke et CEA-fusjonsprotein i en rekombinant vertscelle, som omfatter å: (a) introdusere en vektor som omfatter en nukleinsyre i henhold til det etterfølgende krav 1 inn i en passende vertscelle, og (b) dyrke vertscellen under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte CEA-fusjonsprotein.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen er nukleotidsekvensen til CEA-delen av fusjonen og/eller den immunforsterkende elementdelen av fusjonen kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler.
I foretrukne utførelsesformer av prosessen for å uttrykke et CEA-LTB-fusjonsprotein som er beskrevet ovenfor er LT-subenheten en vesentlig del av LTB, der LTB-sekvensen har fått fjernet sin signalsekvens.
Etter ekspresjon av en CEA-fusjon i en vertscelle kan CEA-fusjonsprotein bli gjenvunnet for å tilveiebringe CEA-fusjonsprotein i aktiv form. Flere proteinrenseprosedyrer er tilgjengelige og egnet for anvendelse. Rekombinant protein kan bli renset fra cellelysater og ekstrakter ved forskjellige kombinasjoner av, eller individuell anvendelse av salt-fraksjonering, ionebytterkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, hydroksylapatitt-adsorpsjonskromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi. I tillegg kan rekombinant CEA-fusjonsprotein bli separert fra andre cellulære proteiner ved anvendelse av en immunaffinitetskolonne som er fremstilt med monoklonale eller polyklonale antistoffer som er spesifikke for et CEA-protein, eller polypeptidfragmenter av et CEA-protein.
Nukleinsyremolekylene omfatter CEA-fusjoner og de kodede fusjonsproteinene ifølge denne oppfinnelsen er designet for å forsterke den CEA-spesifikke immunresponsen, i forhold til fullengde-cDNA som koder for CEA, til anvendelse i vaksineutvikling. For ytterligere å forsterke de immunogene egenskapene til CEA-fusjonssekvensen ifølge foreliggende oppfinnelse, i noen utførelsesformer som er beskrevet her, omfatter poly-nukleotidene som koder for CEA-fusjonsproteiner optimaliserte kodon for ytterligere høy-nivå ekspresjon i en vertscelle, som beskrevet nedenfor. I disse utførelsesformene blir minst en del av kodonene i CEA-fusjonene designet slik at det benyttes de kodonene som er foretrukket av den tiltenkte vertscellen, som i foretrukne utførelsesformer er en human celle. De optimaliserte CEA-fusjonene kan bli benyttet ved utviklingen av rekombinante adenovirus eller plasmidbaserte DNA- vaksiner, som tilveiebringer effektiv immunprofylakse mot CEA-assosiert kreft via nøytraliserende antistoff og cellemediert immunitet. De syntetiske molekylene kan bli benyttet som et immunogent preparat. Denne oppfinnelsen tilveiebringer kodonoptimaliserte CEA-fusjonspolynukleotider som, når de er direkte introdusert inn i et virveldyr in vivo, inkludert pattedyr slik som primater og mennesker, induserer ekspresjonen av kodede proteiner i dyret.
Som påpekt ovenfor i noen utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse omfatter de syntetiske molekylene sekvensen av nukleotider, der noen av nukleotidene har blitt endret slik at det anvendes kodonene som er foretrukket av en human celle, for dermed å tillate høy-nivå fusjonsprotein ekspresjon i en human vertscelle. De syntetiske molekylene kan bli benyttet som en kilde for et CEA-fusjonsprotein, for eksempel CEA-LTB-fusjonsprotein, som kan bli benyttet i en kreftvaksine for å tilveiebringe effektiv immunprofylakse mot CEA-assosierte karsinomer via nøytraliserende antistoff og cellemediert immunitet. Nukleinsyre-molekylene som er beskrevet her kan også tjene som grunnlag for en DNA-basert kreft-vaksine.
Et "triplett" kodon av fire mulige nukleotidbaser kan foreligge i over 60 variant-former. Fordi disse kodonene bringer budet for kun 20 ulike aminosyrer (i tillegg til transkripsjonsinitiering og -terminering), kan noen aminosyrer bli kodet for av mer enn ett kodon, et fenomen som er kjent som kodonoverskudd. Av grunner som ikke er fullstendig forstått, er ikke alternative kodon jevnt til stede i det endogene DNA for forskjellige typer av celler. Faktisk ser det ut til å eksistere et variabelt naturlig hierarki eller en "preferanse" for visse kodoner i visse typer av celler. Som ett eksempel er aminosyren leucin spesifisert av ethvert av seks DNA-kodoner, inkludert CTA, CTC, CTG, CTT, TTA og TTG. Uttømmende analyse av genomkodon frekvenser for mikroorganismer har avslørt at endogent DNA fra E. coli oftest inneholder det CTG-leucinspesifiserende kodonet, mens DNA fra gjær og slim-sopper oftest inkluderer et TTA-leucinspesifiserende kodon. I lys av dette hierarkiet er det vanligvis antatt at sannsynligheten for å oppnå høye nivåer av ekspresjon av et leucinrikt polypeptid i en E. co//'-vert i noen grad vil være avhengig av frekvensen av kodon-anvendelse. For eksempel er det sannsynlig at et gen som er rikt på TTA-kodon vil bli dårlig uttrykt i E. coli, mens et CTG-rikt gen sannsynligvis vil bli høyt uttrykt i denne verten. Tilsvarende vil et foretrukket kodon for ekspresjon av et leucinrikt polypeptid i gjær-vertsceller være TTA.
Følgene av kodon preferanse fenomener på rekombinante DNA-teknikker er åpenbare, og fenomenet kan tjene til å forklare mange tidligere mislykkede forsøk på å oppnå høye ekspresjonsnivåer av eksogene gener i vellykket transformerte organismer, et mindre "foretrukket" kodon kan være gjentatte ganger til stede i det innsatte genet og vertens cellemaskineri for ekspresjon kan dermed ikke fungere så effektivt. Dette fenomenet tyder på at syntetiske gener som har blitt designet for å inkludere en tiltenkt vertscelles foretrukne kodoner tilveiebringer en optimal form av fremmed genetisk materiale for utførelse av rekombinante DNA-teknikker. Således er et aspekt av denne oppfinnelsen et CEA-fusjonsgen som er kodon-optimalisert for ekspresjon i en human celle. I en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen har det blitt funnet at anvendelsen av alternative kodoner som koder for den samme proteinsekvensen kan fjerne begrensningene på ekspresjon av eksogent CEA-fusjonsprotein i humane celler.
I overensstemmelse med noen utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir nukleinsyremolekylene som koder for CEA-fusjonsproteinene konvertert til en polynukleotid-sekvens som har en identisk translatert sekvens, men med alternativ kodon anvendelse som beskrevet av Lathe, "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations", J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Metodikken består vanligvis av å identifisere kodoner i villtype-sekvensen som ikke vanligvis er assosiert med høyt uttrykte humane gener, og erstatter dem med optimale kodoner for høy ekspresjon i humane celler. Den nye gensekvensen blir deretter inspisert for uønskede sekvenser som er generert ved disse kodon erstatningene (f. eks. "ATTTA"-sekvenser, utiltenkt dannelse av intron-spleisegjenkjenningsseter, uønskede restriksjonsenzym seter osv.). Uønskede sekvenser blir eliminert ved substitusjon av eksisterende kodoner med forskjellige kodoner som koder for den samme aminosyren. De syntetiske gensegmentene blir deretter testet for forbedret ekspresjon.
Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor ble benyttet til å danne syntetiske gen-sekvenser som koder for CEA-fusjonsproteiner, som resulterte i et gen som omfatter kodoner som er optimalisert for høy-nivå ekspresjon. Mens prosedyren ovenfor tilveiebringer en oppsummering av vår metodikk for å designe kodonoptimaliserte gener for anvendelse i kreftvaksiner, er det på det rene for fagfolk på fagområdet at tilsvarende vaksineeffektivitet eller økt ekspresjon av gener kan bli oppnådd ved mindre variasjoner i prosedyren eller ved mindre variasjoner i sekvensen.
En fagperson på området vil også være på det rene med at ytterligere nukleinsyre-molekyler kan bli konstruert som tilveiebringer høye nivåer av CEA-fusjonsekspresjon i humane celler, der kun en del av alle kodon i DNA-molekylene er kodonoptimalisert. I noen utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir for eksempel kodoner som omfatter CEA-delen av CEA-fusjonen optimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler, og kodoner som omfatter adjuvansdelen av CEA-fusjonen er i det vesentlige lik den villtype-adjuvans-kodende nukleotidsekvensen. I andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er kodoner som omfatter adjuvansdelen av CEA-fusjonen optimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler, og kodoner som omfatter CEA-delen av CEA-fusjonen er i det vesentlige lik et villtype-CEA-gen. I enda andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er både CEA- og adjuvansdelen av CEA-fusjonen kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler. CEA-fusjoner der kun et delsett av kodonene er optimalisert inne i CEA- og/eller adjuvansdelen av CEA-fusjonen er også omfattet av denne oppfinnelsen.
Nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli satt sammen til en ekspresjons-kassett som omfatter sekvenser som er designet for å tilveiebringe effektiv ekspresjon av proteinet i en human celle. Kassetten inneholder fortrinnsvis CEA-fusjonsprotein-kodende gen, med tilhørende transkripsjons- og
translasjonskontrollsekvenser opererbart bundet til det, slik som en promotorsekvens og terminatorsekvens. I en foretrukket utførelsesform er promotoren
cytomegaloviruspromotoren uten intron-A-sekvensen (CMV), selv om fagfolk på området vil være på det rene med at en hvilken som helst av en rekke andre kjente promotorer slik som den sterke immunoglobulin- eller andre eukaryote genpromotorer kan bli benyttet. En foretrukket transkripsjonsterminator er den bovine veksthormon-terminatoren, selv om andre kjente transkripsjonsterminatorer også kan bli benyttet. Kombinasjonen av CMV-BHG-terminator er spesielt foretrukket.
I overensstemmelse med denne oppfinnelsen blir CEA-fusjonsekspresjonskassetten satt inn i en vektor. Vektoren er fortrinnsvis en adenovirusvektor eller plasmidvektor, selv om lineært DNA bundet til en promotor, eller andre vektorer, slik som adeno-assosiert virus eller et modifisert vaksiniavirus, retrovirus eller lentivirusvektor også kan benyttes.
Hvis vektoren som er valgt er et adenovirus er det foretrukket at vektoren er en såkalt førstegenerasjon adenovirusvektor. Disse adenovirusvektorene erkarakterisertved at de har en ikke-funksjonell El-genregion, og fortrinnsvis en fjernet adenovirus-El-genregion. I noen utførelsesformer blir ekspresjonskassetten satt inn på posisjonen der adenovirus-El-genet normalt er lokalisert. I tillegg har disse vektorene eventuelt en ikke-funksjonell eller deletert E3-region. Det er foretrukket at adenovirusgenomet som blir benyttet har fått deletert både El- og E3-regionen (AE1AE3). Adenovirusene kan bli multiplisert i kjente cellelinjer som uttrykker virus-El-genet, slik som 293-celler eller PERC.6-celler, eller i cellelinjer som er avledet fra 293- eller PERC.6-celler som er transient eller stabilt transformert for å uttrykke et ekstra protein. Når det blir benyttet konstruksjoner som har en kontrollert genekspresjon, slik som et tetrasyklinregulerbart promotorsystem, kan for eksempel cellelinjen uttrykke komponenter som er involvert i det regulatoriske system. Ett eksempel på en slik cellelinje er T-Rex-293, og andre er også kjent på fagområdet.
For enkelhets skyld ved manipulering av adenovirusvektoren kan adenoviruset foreligge i en shuttle-plasmidform. Denne oppfinnelsen er også rettet mot en shuttle-plasmidvektor som omfatter en plasmiddel og en adenovirusdel, der adenovirusdelen omfatter et adenovirusgenom som har et deletert El og eventuelt deletert E3, og som har en innsatt ekspresjonskassett som omfatter en CEA-fusjonsprotein-kodende nukleotidsekvens. I foretrukne utførelsesformer foreligger det et restriksjonssete som flankerer adenovirusdelen i plasmidet slik at adnovirusvektoren enkelt kan bli fjernet. Shuttle-plasmidet kan bli replikert i prokaryote celler eller eukaryote celler.
I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir ekspresjonskassetten satt inn i pMRKAd5-HV0-adenovirusplasmidet (se Emini et al., WO 02/22080). Dette plasmidet omfatter et Ad5-adenovirusgenom hvor El- og E3-regionen er deletert. Designen til pMRKAd5-HV0-plasmidet var forbedret i forhold til tidligere adenovektorer ved å forlenge den 5' cis-virkende pakkeregionen ytterligere inn i El-genet for å inkorporere elementer som er funnet å være viktige når det gjelder optimalisering av viruspakking, for å lede til forbedret virusamplifikasjon. Denne forbedrede adenovirusvektoren er fordelaktig i stand til å opprettholde genetisk stabilitet etter høy passasje formering.
Standardteknikker med molekylær biologi for å fremstille og rense DNA-konstruksjoner muliggjør fremstillingen av adenovirusene, shuttle-plasmidene og DNA-immunogenene ifølge denne oppfinnelsen.
I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse har det blitt fastslått at de CEA-LT-fusjonsprotein-kodende molekylene som er beskrevet her (f. eks. Sekv. Id. Nr. 12), som omfatter en vesentlig del av LTA- eller LTB-subenhetene fra varmelabilt enterotoksin fra E. coli, blir uttrykt med ekvivalent effektivitet sammenlignet med den tilsvarende villtype-CEA-sekvensen (se Eksempel 4). Det har også blitt vist her at plasmidene pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB utløste en større antistoff respons enn pVU/hCEA, noe som bekrefter adjuvanseffekten utøvd av LT-su ben hetene på den CEA-spesifikke immunresponsen (se Eksempel 11). Således viser dataene som er beskrevet her at fusjon av den CEA-kodende sekvensen til LTA- eller LTB-cDNA fører til en økning i den CEA-spesifikke immunresponsen. Det ser ut til at LTB utøver en større forsterkende effekt på immunresponsen med en omfattende induksjon av CD8<+->T-celler, mens LTA overveiende utløser en CD4<+->respons.
I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse har det også blitt vist at toleranse ovenfor CEA-selvantigenet kan brytes mer effektivt, i forhold til fullengde, viltype-CEA-cDNA, på grunn av de økte immunogene egenskapene til CEA-LTB-fusjonen. Den forsterkende effekten av LTB på de immunogene egenskapene til CEA ble også observert ved injeksjon av et plasmid som bærer et fullt kodonoptimalisert cDNA for CEA-LTB-fusjonen. Til slutt tyder resultatene som er beskrevet her, ved å benytte adenovirus-vektorer som bærer CEA-LT-fusjoner, på at forsterket immunogenisitet av CEA-LT-fusjoner ikke er begrenset til plasmid-DNA-immunisering (se Eksempel 13).
Derfor kan vektorene som er beskrevet ovenfor bli benyttet i immunogene preparater og vaksiner for å forebygge utviklingen av adenokarsinomer som er assosiert med avvikende CEA-ekspresjon og/eller til behandling av eksisterende kreft. Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater vaksineutvikling og kommersialisering ved å eliminere vanskeligheter med å oppnå høye ekspresjonsnivåer av eksogen CEA i vellykket transformerte vertsorganismer og ved å tilveiebringe et CEA-fusjonsprotein som kan utløse en forsterket immunrespons når det blir administrert til et pattedyr slik som et menneske.
For å oppnå dette er ett aspekt av foreliggende oppfinnelsen en vaksine vektor for anvendelse ved forebygging eller behandling av CEA-assosiert kreft i et pattedyr, nevnte vaksinevektor omfatter et polynukleotid ifølge det etterfølgende krav 1.
I overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor kan vaksinevektoren bli administrert for behandlingen eller forebyggingen av en kreftform hos et hvilket som helst pattedyr, inkludert: lungekraft, brystkreft og tykktarmskreft. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er pattedyret et menneske.
Videre kan en fagperson på området velge enhver type vektor for anvendelse i behandlings- og forebyggingsfremgangsmåten som er beskrevet. Fortrinnsvis er vektoren en adenovirusvektor eller en plasmidvektor
Foreliggende oppfinnelse vedrører ytterligere en adenovirus vaksinevektor som omfatter et adenovirusgenom med en delesjon i El-regionen og en insersjon i El-regionen, der insersjonen omfatter en ekspresjonskassett som omfatter:(a) en sekvens av nukleotider som koder for et CEA-fusjonsprotein, der CEA-fusjonsproteinet omfatter et C-terminalt trunkert humant CEA-protein eller variant derav, fusjonert til en vesentlig del av et immun-forsterkende element, der det immunforsterkende element er LTB; og der fusjonsproteinet er i stand til å frembringe en immunrespons hos et pattedyr, og (b) en promotor opererbart bundet til polynukleotidet.
I en foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen er adenovirusvektoren en Ad-5-vektor.
I en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er adenovirusvektoren en Ad-6-vektor.
I nok en annen foretrukket utførelsesform er adenovirusvektoren en Ad-24-vektor.
Også omfattet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er en adenovirus vaksinevektor som omfatter et adenovirusgenom som naturlig infiserer en art forskjellig fra mennesket, inkludert sjimpanse adenovirusvektorer. En foretrukket utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen er en sjimpanse-Ad-3-vaksinevektor.
I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen et vaksineplasmid som omfatter en plasmid-del og en ekspresjonskassettdel, der ekspresjonskassettdelen omfatter: (a) en sekvens av nukleotider som koder for et CEA-fusjonsprotein, der CEA-fusjonsproteinet omfatter et C-terminalt trunkert humant CEA-protein eller variant derav, fusjonert til et immunforsterkende element som er LTB eller vesentlig del derav, og der fusjonsproteinet er i stand til å frembringe en immunrespons hos et pattedyr, og (b) en promotor opererbart bundet til polynukleotidet.
I noen utførelsesformer av denne oppfinnelsen blir de rekombinante adenovirusene og plasmidbaserte polynukleotidvaksinene som er beskrevet her benyttet i ulike prime/boost kombinasjoner for å indusere en forsterket immunrespons. I dette tilfellet blir de to vektorene administrert i et "prime and boost" regime. For eksempel blir den første typen av vektor administrert én eller flere ganger, så etter en forhåndsbestemt tidsperiode, for eksempel 2 uker, 1 måned, 2 måneder, 6 måneder eller annet passende intervall, blir en andre type av vektor administrert én eller flere ganger. Fortrinnsvis bærer vektorene ekspresjonskassetter som koder for det samme polynukleotidet eller kombinasjon av poly-nukleotider. I utførelsesformen der et plasmid-DNA også blir benyttet er det foretrukket at vektoren inneholder én eller flere promotorer som blir gjenkjent av pattedyrceller eller insektsceller. I en foretrukket utførelsesform vil plasmidet inneholde en sterk promotor slik som CMV-promotoren. Det syntetiske CEA-fusjonsgenet eller annet gen som skal bli uttrykt vil være bundet til en slik promotor. Et eksempel på et slikt plasmid vil være pattedyr-ekspresjonsplasmidet VlJns som beskrevet (J. Shiver et al., i DNA Vaccines, M. Liu et al., red., N.Y. Acad. Sei., N.Y., 772:198-208 (1996)).
Som påpekt ovenfor kan en adenovirusvektorvaksine og en plasmidvaksine bli administrert til et virveldyr som en del av et enkelt terapeutisk regime for å indusere en immunrespons.
I én utførelsesform av fremgangsmåten for behandling eller beskyttelse som er beskrevet ovenfor er den første vektoren et plasmid og den andre vektoren er en adenovirusvektor. I en alternativ utførelsesform er den første vektoren en adenovirusvektor og den andre vektoren er et plasmid.
I fremgangsmåten beskrevet ovenfor kan den første typen av vektor bli administrert mer enn én gang, med hver administrering av vektoren separert av en forhåndsbestemt tidsperiode. En slik serie med administrering av den første typen av vektor kan bli etter-fulgt av administrering av en andre type av vektor én eller flere ganger, etter at en forhåndsbestemt tidsperiode har passert. Tilsvarende til behandling med den første typen av vektor, kan den andre typen av vektor også bli gitt én gang eller flere enn én gang, etter forhåndsbestemte tidsintervaller.
Mengden av uttrykkbart DNA eller transkribert RNA som så blir introdusert inn i en vaksinemottager vil delvis være avhengig av styrken til promotorene som blir benyttet og på immunogenisiteten til det uttrykte genproduktet. Generelt blir en immunologisk eller profylaktisk effektiv dose på omtrent 1 ng til 100 mg, og fortrinnsvis omtrent 10 ug til 300 ug av en plasmidvaksine vektor administrert direkte inn i muskelvev. En effektiv dose for rekombinant adenovirus er omtrent IO<6>til IO<12>partikler og fortrinnsvis omtrent IO<7>til 10<11>partikler. Subkutan injeksjon, intradermal introduksjon, impregnering gjennom huden og andre former for administrering slik som intraperitoneal, intravenøs, intramuskulær eller inhalering er også innbefattet.
I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir vaksinevektoren introdusert til mottageren via intramuskulær injeksjon.
Vaksinevektoren ifølge denne oppfinnelsen kan være nakne, dvs. ikke-assosiert
med noen proteiner, eller andre midler som påvirker mottagerens immunsystem. I dette tilfellet er det ønskelig at vaksinevektorene foreligger i en fysiologisk akseptabel løsning, slik som steril, fysiologisk saltløsning eller steril bufret fysiologisk saltløsning. Alternativt kan det være fordelaktig å administrere et middel som hjelper til i det cellulære opptaket av DNA, slik som kalsiumion. Disse midlene blir generelt referert til som transfeksjonsfremmende reagenser og farmasøytisk akseptable bærere. Fagfolk på området vil være i stand til å bestemme det spesielle reagenset eller den farmasøytisk akseptable bæreren i tillegg til den passende administreringstiden og administreringsmåten.
De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen.
Eksempel 1
Konstruering av CEA-fusjonsproteiner
For å bestemme immunogenisiteten til CEA-fusjonsproteiner ble en serie av vektorer konstruert som koder for aminosyrer (heretter aa) 1 til 679 i det humane CEA-proteinet fusjonert til et panel av valgte polypeptider (se Eksempel 2). Disse sekvensene ble valgt i lys av deres rapportert immunforsterkende egenskaper, som har blitt demonstrert i en mengde eksperimentelle systemer. CEA-fusjonene ble fremstilt ved å sette sammen cDNA fra CEA-proteinet der GPI-forankringssekvensen var depletert, med de fremmede polypeptidene (eksempler på konstruksjoner er avbildet i Figur 18a). Tumorantigenet ble bundet til HSP70-, FcIgG- eller LAMP-sekvensene for å bestemme hvorvidt forsterkning av antigenopptak eller ny målsøkning mot den endosomale avdelingen ville føre til en økt immunrespons. Tilsvarende ble fusjon til fragment-C fra tetanus toksin (FrC) eller til et minimalt domene som mangler potensielt kompetitive MHC-klasse-I-bindingsepitoper (DOM, se Figur 29) (Rice et al., J. Immunol. 169:3908-13
(2002)) konstruert for å fremme humorale og CD4<+->T-celle responser. CEA ble også bundet til den VSV-G-kodende sekvensen for å bestemme hvorvidt fusjon til et virusglykoprotein ville influere på de immunogene egenskapene til CEA.
De kodende sekvensene til disse CEA-fusjonene ble klonet inn i vektorene pVljns under kontroll av den humane CMV/intron-A-promotoren pluss det bovine veksthormon (BGH)-polyadenyleringssignalet (Eksempel 2). Plasmidene pVU/CEA-FRC, pVU/CEA-DOM, pVlJ/CEA-FcIgG, pVU/CEA-LAMP, pVU/CEA-VSV-G og pVU/CEA-HSP70 bærer villtype-cDNA fra CEA fusjonert til den kodende sekvensen til de angitte fremmende polypeptidene. Eksempelmessige nukleotid- og aminosyresekvenser til hCEA-DOM- og hCEA-FcIgG-fusjonene er vist i Figurene 26, 27 og 30.
For å undersøke effekten av LTA- og LTB-subenheter fra det varmelabile enterotoksinet fra E. coli på CEA-immunogenisitet ble en serie ytterligere fusjonskonstruksjoner generert som koder for aminosyrene 1 til 679 fra CEA-protein fusjonert til enten den LTA- kodende sekvensen (aa 18 til 259) eller til den LTB-kodende sekvensen (aa 21 til 125). En skjematisk representasjon av strukturen til eksempelmessige CEA-LTA- og CEA-LTB-fusjoner som er utviklet for denne studien er vist i Figur 1. Eksempelmessige nukleotid-og aminosyresekvenser for CEA-LT-fusjoner er vist i Figurene 2-6.
CEA-LT-fusjoner ble fremstilt ved å binde sammen cDNA fra CEA-proteinet som har fått deletert forankringssekvensen, til LT-subenhetene fra hvilke den signalpeptidkodende sekvensen hadde blitt fjernet. De CEA-fusjonskodende sekvensene ble klonet inn i vektorene pVUns under kontrollen av den humane cytomegalovi rus (CMV)/intron-A-promotoren pluss det bovine veksthormon (BGH)-polyadenyleringssignalet. Plasmidene pVU/hCEA-LTA- og pVU/hCEA-LTB bærer villtype-cDNA fra CEA fusjonert med den kodende sekvensen fra henholdsvis LTA og LTB (se Eksempel 2).
Alle konstruksjoner som bærer CEA-LTB-fusjonen ble generert ved å fusjonere CEA-cDNA fra nt 1 til 2037 med LTB-cDNA-fragmentet som omfatter nt 64 til 375. Den
LTB-kodende sekvensen ble fremskaffet ved hjelp av PCR-amplifisering av genomisk DNA fra E. coli ved å benytte sekvensspesifikke primere LTB-S1 5'-TATTCTAGATGCT
CCCCAGACTATTACAGAA-3' (SEKV. ID. NR. 1) og LTB-Al 5'-TATGCGG CCGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3' (SEKV. ID. NR. 2). Det
amplifiserte DNA ble introdusert på 3' enden til den CEA-kodende sekvensen for å generere plasmider.
Eksempel 2
Plasmidkonstruksjoner
pVU/ CEAopt og pVU/ CEA: Disse to konstruksjonene bærer henholdsvis kodon-anvendelse som er optimalisert og villtype-cDNA for CEA. Den CEA-kodende sekvensen er lokalisert mellom CMV/intron-A umiddelbar tidlig promotor fra cytomegalovirus og det bovine veksthormon polyadenyleringssignalet. For generering av pVU/hCEAopt ble plasmid pCR-hCEAopt fordøyt med EcoRI i 1 time ved 37°C. Det resulterende innskuddet på 2156 bp ble renset og klonet inn i EcoRI-setet i plasmid pVUnsB ((Montgomery et al. DNA Cell Biol 12(9): 777-83 (1993)).
For generering av pVU/hCEA, ble plasmid pCI/hCEA (Song et al. Regulation of T-helper-1 versus T-helper-2 activity and enhancement of tumour immunity by combined DNA-based vaccination and nonviral cytokine gene transfer. Gene Therapy 7: 481-492 2000)) fordøyd med EcoRI. Det resulterende innskuddet på 2109 bp ble klonet inn i EcoRI-setet i plasmid pVUnsA (Montgomery et al., ovenfor).
PVU/ hCEA- LTB oa pVlJ/ hCEAopt- LTB: Det kodonoptimaliserte cDNA fra LTB ble syntetisert ved oligonukleotid sammenstilling (Geneart GmbH, Regensburg, Tyskland) og klonet i pCR-skript-vektor (Stratagene, LA Jolla, CA). For å generere pVU/hCEAopt-LTBopt, ble LTBopt amplifisert ved hjelp av PCR ved å benytte de følgende PCR-primere: LTBopt-5'XbaI (5' ende) 5'-GCTCTAGAGCCCCCCAGAGCATCACCGAG CTGTGC-3' (SEKV. ID. NR. 3) og LTBopt-3'BglII (3' ende) 5'-GCTCTAGAACC
CCTCAGAACATCACCGATCTGTGCGCC-3' (SEKV. ID. NR. 4). Det
amplifiserte produktet ble deretter satt inn i Xbal/Bglll-seter i plasmid pVU/hCEAopt.
pVU/ hCEA- LTA: Den LTA-kodende sekvensen tilsvarende til nt 54 til 774 som
koder for aa 18 til 259 ble amplifisert ved hjelp av PCR fra genomisk DNA fra E. coli ved å benytte sekvensspesifikke primere LTA-S1 5'-TATTCTAGATAATGGCGACAA
ATTATACCG-3' (SEKV. ID. NR. 5) og LTA-Al 5'-TATGCGGCCGCTCATA
ATTCATCCCGAATTCTGTT-3' (SEKV. ID. NR. 6). Det amplifiserte DNA ble fordøyt med egnede restriksjonsenzymer og satt inn i plasmid pVU/hCEA.
pVlJ/ rhCEAopt- LTB: Et 3' fragment fra rhesus ape-CEA-cDNA (nt 1641 til 2026), som var kodonoptimalisert for høy-nivå ekspresjon i humane celler, ble amplifisert ved hjelp av PCR fra pVU-rhCEAopt. Det amplifiserte cDNA manglet den GPI-forankringskodende sekvensen og var Xbal/Bglll-restriksjonssetene. Dette fragmentet ble satt inn i Pstl-setet i pCR-blunt-rhCEAopt, for slik å oppnå intermediatet pCR-blunt-rhCEAopt Xbal/Bglll. rhCEAopt ble ekstrahert som et Bglll/Sall-fragment og klonet inn i det samme setet i pVU-nsB for slik å oppnå pVU-rhCEAopt Xbal/Bglll. LTBopt ble amplifisert ved hjelp av PCR fra pCR-script-LTBopt ved henholdsvis å innføre Xbal- og Bglll-seter på 5' og 3' ende, og ble klonet i pVU-rhCEAopt Xbal/Bglll, for slik å oppnå pVU-rhCEAopt-LTBopt.
pVlJ/ CEA- FrC. pVU/ CEA- DOM. pVU/ CEA- FcIaG. dVD/ CEA- LAMP. dVU/ CEA-HSP70 oa pVIJ/ CEA- VSV- G: Alle konstruksjonene som koder for de refererte CEA-fusjons-proteinene ble generert ved å fusjonere CEA-cDNA fra nt 1 til nt 2037 (Sekv. Id. Nr. 22, Figur 28A) tilsvarende til aa 1 til aa 679 (Sekv. Id. Nr. 23, Figur 28B), der cDNA-fragmentet tilsvarerer de følgende: fragment-C fra tetanus toksoid (CEA-FrC, Sekv. Id. Nr. 24), det N-terminale domenet til FrC (CEA-DOM, Sekv. Id. Nr. 21 og 49), det tunge fragmentet fra konstantkjeden til immunglobulin-Gl (CEA-FcIgG, Sekv. Id. Nr. 25), det lysosom-assosierte membranproteinet (CEA-LAMP, Sekv. Id. Nr. 26), heat-shock protein-70 (CEA-HSP70, Sekv. Id. Nr. 27) eller det vesikulære stomatittvirus-glykoproteinet (CEA-VSV-G, Sekv. Id. Nr. 28).
FrC- og DOM-kodende sekvenser ble fremskaffet ved PCR-amplifisering fra pRep-TET.C-plasmid som beskrevet i Rice et al. (J. Immunol. 169: 3908-13 (2002)). FcIgG ble fremskaffet fra totalt RNA fra human PBMC. VSV-G og HSP70 ble fremskaffet fra p-FAST-VSV-G og fra plasmid pY3111. LAMP1 ble fremskaffet ved hjelp av gensammensetning. Amplifiseringer ble utført ved å benytte de følgende primerne: FrC-sens (5' T A T TC TA
G4TTCAACACCAATTCCATTTTCTTATTC-3' (SEKV. ID. NR. 29) FrG-antisens (5'- GCGGCCGCTAGAATCATTTGTCCATCCTTCATC-3'
(SEKV. ID. NR. 30), DOM-sens (5'- TAT7~C7~^ G^TTCAACACCAATTCCATT TTCTTATTC-3' (SEKV. ID. NR. 319 DOM-antisens (5- TTAGCGGCCGCTAGT
TCTGTATCATATCGTAAAGGG-3' (SEKV. ID. NR. 32), FcIgG-sens (5'- TCT /1G/1TAAAACTCACACATGCCCA -3') (SEKV. ID. NR. 33) FcIgG-antisens 85'-GCCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3' (SEKV. ID. NR. 34), LAMP-sens (5- TC TA G^TTTGATCCCCATTGCTGTGGGCGGTGCCCTG-3'
(SEKV. ID. NR. 35) LAMP-antisens (5'- GGCGTGACTCCTCTTCCTGCCAATG AGGTAGGCAATGAG-3' (SEKV. ID. NR. 36), VSV-G-sens (5'- A T A7~C TA GAT TTCACCATAGTTTTTCCACACAACC-3' (SEKV. ID. NR. 37) VSV-G-antisens
(5'- GCGGCCGCCTTCCTTCCAAGTCGGTTCATCTCTATG-3' (SEKV.
ID. NR. 38), HSP70-sens (5'- G C 7 C TA G^TATGGCTCGTGCGGTCGGGAT C G A C C -3' (SEKV. ID. NR. 39) og HSP70-antisens (5'GCCGCGGCCGCTCACT TGGCCTCCCGGCCGTCGTCG-3' (SEKV. ID. NR. 40). Det amplifiserte DNA blir introdusert på 3' enden av den CEA-kodende sekvensen for å generere plasmidene pVU/CEA-FrC, pVU/CEA-DOM, pVlJ/CEA-FcIgG, pVU/CEA-LAMP, pVU/CEA-HSP70 og
pVU/CEA-VSV-G.
pVU/ CEA- DOMopt og pVlJ/ CEA- FcIgGopt: Det kodonanvendelse optimaliserte cDNA for DOM og FcIgG ble syntetisert ved hjelp av oligonukleotid sammenstilling (Geneart GmbH, Regensburg, Tyskland) og klonet i pCR-script-vektor (Stratagene, La Jolla, CA). For å generere pVU/CEA-DOMopt ble DOMopt amplifisert ved hjelp av PCR ved å benytte de følgende primerne: Domopt-sens (5'- G T T A T C TA G/AAGCACCC C C A T C C C -3' (SEKV. ID. NR. 41)) og Domopt-revers (5'- TTAAGATCTCTAAGA TCTGGTGTCGTATCTCAGGGG-3' (SEKV. ID. NR. 42). Det amplifiserte produktet ble deretter satt inn i Xbal/Bglll-setene i plasmid pVU/CEAopt. For å generere pVlJ/CEA-FcIgGopt ble FcIgGoptamplifisert ved hjelp av PCR ved å benytte de følgende primerne: FcIgGopt-sens (5'-TTA7~C7~>4G>4AAGACCCACACCTGCCCCCCT T G C -3' (SEKV. ID. NR. 43)) og som FcIgGopt-revers (5'- TATAGATCTTAGGGT ACCTTACTTGCCGGGG-3' (SEKV. ID. NR. 44)) ble det amplifiserte produktet innsatt i Xbal/Bglll-setene i plasmid pVU/CEAopt.
Eksempel 3
Adenovirusvektorer
AdS/ hCEAnpt: Plasmid pCR-hCEAopt ble fordøyd med EcoRI. Det resulterende innskuddet på 2156 bp ble renset og klonet inn i EcoRI i polyMRK-Ad5-shuttle-plasmidet.
Ad5/ CEA: Shuttle-plasmidet pMRK-hCEA for generering av Ad5-vektor ble fremskaffet ved å fordøye plasmid pDeltalsplB/hCEA med Sspl og EcoRV. Fragmentet på 9,52kb ble deretter ligert sammen med et Bglll/BamHI-fordøyd, Klenow-behandlet produkt på 1272 bp fra plasmid polyMRK. Et PacI/StuI-fragment fra pMRK-hCEA og pMRK-hCEAopt inneholdende ekspresjonskassetten for hCEA og El-flankerende Ad5-regioner ble rekombinert til Clal-linearisert plasmid pAd5 i BJ5183-E co//'-celler. De resulterende plasmidene var henholdsvis pAd5-hCEA og pAd5-hCEAopt. Begge plasmidene ble kuttet med PacI for å frigjøre Ad ITRene og transfektert inn i PerC-6-celler. Ad5-vektor-amplifisering blir utført ved flere passeringer. MRKad5/hCEA og MRKAd5/hCEAopt ble renset ved hjelp av standard CsCI-gradientrensing og grundig dialysert mot A105-buffer (5 mM Tris-CI, pH 8,0, 1 mM MgCI2, 75 mM NaCI, 5 % sukkrose, 0,005 Tween-20).
Ad5/ hCEAopt- LTB: Plasmid pMRK-hCEAopt-LTB ble konstruert ved å kutte polyMRK-Ad5-shuttle-plasmid med Swal og ved å ligere den lineariserte vektoren med DNA-fragmentet på 2300 bp avledet fra pVU/hCEAopt-LTB som hadde blitt fordøyd med EcoRI, Bglll og behandlet med Klenow. pMRK-hCEAopt-LTB ble linearisert og rekombinert inn i Ad-genomet som angitt ovenfor.
Ad5/ CEA- DOMopt oa Ad5/ CEA- FcIaGopt: Plasmid pMRK-CEA-DOMopt og pMRK-CEA-FcIgGopt ble konstruert ved å kutte polyMRK-Ad5-shuttle-plasmid med Swal og ved å ligere den lineariserte vektoren med DNA-fragmentet på 2,9 kb avledet fra pVU/CEA-DOMopt eller ligere den lineariserte vektoren med DNA-fragmentet på 2700 bp avledet fra pVlJ/CEa-FcIgGlopt som hadde blitt fordøyd med EcoRI, Bglll og behandlet med Klenow. pMRK-CEA-FcIgGopt og pMRK-CEA-DOMopt ble linearisert og rekombinert inn i Ad-genomet som angitt ovenfor.
Eksempel 4
Komparativ ekspresjonseffektivitet for ulike CEA-LT-fusjonskonstruksjoner
Anvendelsen av kodonoptimalisert cDNA til genetisk vaksinering mot virus-sykdommer har blitt vist å utløse en større immunrespons i det minste delvis på grunn av en økt ekspresjon av målproteinet. For å verifisere hvorvidt den LTB-kodende sekvensen også ville forsterke de immunogene egenskapene til CEA-cDNA som var designet for å inkorporere humant-foretrukne (humaniserte) kodon for hver aminosyrerest, ble plasmid pVU/hCEAopt-LTB også konstruert. Til slutt ble en fullt kodonoptimalisert versjon av CEA-LTB-fusjonen også konstruert ved å benytte et syntetisk kodonoptimalisert cDNA fra LTB for å generere plasmid pVU/hCEA-LTBopt.
For å bestemme hvorvidt LTB-effekten på CEA-immunogenisitet ikke var begrenset til plasmid-DNA-immunisering ble en adenovirus-type-5-vektor som koder for CEAopt-LTB-fusjonen flankert av CMV/intron-A-promotoren og BGH-polyadenyleringssignalet også konstruert. Molekylmassen til CEA-fusjonsproteinene uttrykt fra begge plasmider og Ad-vektorene var ikke forskjellig fra den som ble utledet fra tilsvarende vektorer som koder for fullengdeformen av CEA-cDNA (data ikke vist).
For å sammenligne ekspresjonseffekten for vektorene som koder for CEA-LTA- og CEA-LTB-fusjoner og den for cDNA for fullengde-CEA ble HeLa-celler transfektert med plasmidene pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB. CEA-ekspresjonen for disse konstruksjonene ble sammenlignet med ekspresjonen fra det tilsvarende plasmidet som bærer wt-cDNA for CEA, pVU/hCEA. Tilsvarende ble plasmid pVU/hCEAopt-LTB- ekspresjonseffektivitet sammenlignet med den for pVU/hCEAopt. Ekspresjonseffektivitet for disse konstruksjonene ble bestemt to dager etter transfeksjon ved å overvåke mengden av CEA-protein i celleekstrakter.
Transfeksjon av plasmider pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB ga omtrent to ganger høyere mengder av CEA-protein (henholdsvis 183 og 139 ng/l, Figur 8A) påvist i kultur-supernatanten sammenlignet med plasmid pVU/CEA (91 ng/l). Tilsvarende var ekspresjonseffektiviteten for konstruksjonene pVU/hCEAopt og pVU/hCEAopt-LTB også sammenlignbart (henholdsvis 113 og 136 ng/l, Figur 8B). Til slutt ble ekspresjonseffektiviteten for Ad/hCEAopt og Ad/hCEAopt-LTB også sammenlignet ved å infisere HeLa-celler med forskjellige moi. CEA-ekspresjonseffektiviteten for disse to vektorene var sammenlignbar ved moi 1000 (henholdsvis 1790 og 1400 ng/l, Figur 9) mens vektor Ad/hCEAopt-LTB ved 100 moi ga omtrent fire ganger lavere mengder av CEA-protein påvisbart i kultursupernatanten sammenlignet med Ad/hCEAopt (henholdsvis 390 og 1500 ug/l).
Disse resultatene tyder således på at cDNA som koder for CEA-LTA- og CEA-LTB-fusjonsproteinene blir uttrykt med tilsvarende effektivitet som den for det korresponderende cDNA som koder for fullengde-CEA-proteinet. I tillegg er ikke den sammenlignbare CEA-ekspresjonen for disse cDNAene påvirket av typen av genoverføringsvehikkel som ble benyttet for deres levering.
Eksempel 5
Påvisning av CEA-ekspresjon
CEA-ekspresjon av plasmid- og Ad-vektorer ble overvåket ved Western-blott-analyse og ELISA. Plasmider ble transfektert i HeLa-celler med lipofektamin-2000 (Life Technologies). Adenovirusinfeksjoner av HeLa-celler ble utført i serumfritt medium i 30 min ved 37 °C, og deretter ble friskt medium tilsatt. Etter innkubering i 48 timer ble helcelle-lysater høstet. CEA-proteinet som var til stede i cellelysatene ble påvist ved Western-blott-analyse ved å benytte kanin-polyklonalt antiserum. Proteinet ble påvist som et bånd på 180-200 kDa. Mengden av uttrykt CEA ble påvist i cellelysatene ved å benytte Direct-Elisa-CEA-kit (DBC-Diagnostics Biochem Canada Inc.)
Ekspresjon av fusjonsproteinene i transfekterte celler ble undersøkt ved Western-blott-analyse ved å benytte antistoffer som var spesifikke for CEA, VSV-G, FcIgG, tetanus toksin eller HSP70. HeLa-celler ble enten transfektert med det angitte plasmidet eller infisert med den valgte Ad-vektoren. Etter 48 timers innkubering ble helcellelysater og kultursupernatant høstet.
CEA-ekspresjon i cellelysat eller supernatant ble også overvåket ved å benytte Direct-Elisa-CEA-kit (DBC-Diagnostics Biochem Canada Inc.). CEA-protein ble påvist med antistoffet som var spesifikt for det fusjonerte polypeptidet i transfekterte cellelysater, mens ingen ekspresjon av målantigenet ble observert i liksom-transfekterte kontrollprøver (Figur 18B). Molekylmassen til fusjonsproteinene var ikke signifikant forskjellig fra den til CEA. Denne øyensynlige mangelen på forskjell i molekylmasse mellom de ulike CEA-poly-peptidene skyldes sannsynligvis den høye graden av glykosylering på tumorantigenet.
For å sammenligne ekspresjonseffektiviteten for vektorene som koder for CEA-fusjonene med effektiviteten til pVU/CEA ble HeLa-celler transfektert med de forskjellige plasmidene og CEA-ekspresjon for disse konstruksjonene ble bestemt to dager etter transfeksjon ved ELISA. Plasmidene pVU/CEA-FrC, pVU/CEA-DOM, pVlJ/CEA-FcIgG, pVlJ/CEA-LAMP, pVU/CEA-VSV-G og pVU/CEA-HSP70 uttrykte CEA med sammenlignbar effektivitet i forhold til pVU/CEA (Figur 19A). Det meste av fusjonsproteinet ble utskilt og påvist i cellesupernatanten, men CEA-LAMP ble ikke frigjort fra de transfekterte cellene, sannsynligvis på grunn av dens omdirigering til den lysosomale rom (Figur 19B). Således indikerer disse resultatene at cDNA som koder for CEA-FrC-, CEA-DOM-, CEA-VSV-G-, CAM-FcIgG-, CEA-HSP70- og CEA-LAMP-fusjonsproteine blir uttrykt med ekvivalent effektivitet i forhold til den fra cDNA som koder for fullengde-CEA-proteinet.
Eksempel 6
Peptider
Lyofiliserte hCEA-peptider ble kjøpt fra Bio-Synthesis og resuspendert i DMSO ved 40 mg/ml. Pooler av peptider som er 15 aa lange og overlappet med 11 rester ble satt sammen som beskrevet (Facciabene et al. J. Virol. 78: 8663-72 (2004). Slutt-konsentrasjoner var som følger: Pool A = 1,2 mg/ml, Pool B = 0,89 mg/ml, Pool C = 0,89 mg/ml, Pool D = 0,8 mg/ml. Peptider ble lagret ved -80°C. Immunrespons ovenfor DOM ble overvåket ved å benytte tetanus toksoid peptidet p30
(F947NNFTVSFWLRVPKVSASHLE967(Sekv. Id. Nr. 54)) (Rice et al., J Immunol. 167: 1558-65 (2001)).
Eksempel 7
Museimmunisering og tumorutfordring
Alle dyrestudier ble godkjent av «IRBM institutional animal care and use committee». C57BL/6-hunnmus (H-2<b>) ble kjøpt fra Charles River (Lecco, Italia). HLA-A2.1-mus (HHD) ble tilveiebrakt av F. Lemmonier (Institute Pasteur, Paris, Frankrike). C57BL/DR4-mus ble kjøpt fra Taconic (Germantown, NY). CEA.tg-mus (H-2<b>) ble tilveiebrakt av J. Primus (Vanderbilt University) og holdt ved standardbetingelser (Clarke et al., Cancer Res. 58: 1469-77 (1998)). 50 ug plasmid-DNA ble elektroinjisert i et 50 ul volum i musekvadriceps som tidligere beskrevet (Rizzuto et a. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 96(11): 6417-22 (1999)). Ad-injeksjoner ble utført i muse-kvadriceps i et volum på 50 Humoral og cellemediert immunrespons ble analysert ved de angitte tidspunkter.
C57BL/6-mus ble utsatt for to DNA-injeksjoner i kvadricepsmuskel etterfulgt av elektrisk stimulering som tidligere beskrevet (Rizzuto et al., ovenfor). Injeksjoner ble utført ved tre-ukers intervaller. CEA transgene mus ble utsatt for enten fem ukentlige injeksjoner med plasmid-DNA (50^g/injeksjon), 2 injeksjoner med Ad-vektorer (1 x IO<9>viruspartikler/-injeksjon) eller 5 ukentlige injeksjoner etterfulgt av en boost med Ad. To uker etter den siste injeksjonen ble humoral og cellemediert immunrespons analysert. Mus ble også utfordret med en subkutan (s.c.) injeksjon med 5 x IO<5>MC39-CEA-celler (Clarke et al., ovenfor). Ved ukentlige intervaller ble mus undersøkt for tumorvekst.
Eksempel 8
Antistoffpåvisning og titrering
Serum for antistoff titrering ble fremskaffet ved retro-orbital blodtapping. ELISA-plater (Nunc maxisorp) ble belagt med 100 ng/brønn med meget renset CEA-protein (Fitzgerald), fortynnet i belegningsbuffer (50 mM NaHC03, pH 9,4) og inkubert O/N ved 4°C som tidligere beskrevet (Facciabene et al, ovenfor). Plater ble deretter blokkert med PBS inneholdende 5 % BSA i 1 time ved 37 °C. Museserum ble fortynnet i PBS 5 % BSA (fortynning 1/50 for å undersøke serokonverteringshastighet, fortynninger fra 1:10 til 1:31, 2150 for å evaluere titer). Pre-immune serum ble benyttet som bakgrunn. Fortynnet serum ble inkubert O/N ved 4 °C. Vaskinger ble utført med PBS 1 % BSA, 0,05 % Tween 20. Sekundært antistoff (geit-anti-mus, IgG-peroksidase, Sigma) ble fortynnet 1/2000 i PBS, 5 % BSA og inkubert 2-3 timer ved romtemperatur på en rister. Etter vasking ble plater utviklet med 100 ul/brønn med TMB-substrat (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Reaksjon ble stoppet med 25 ul/brønn med IM H2S04-løsning og plater ble avlest ved 450 nm/620 nm. Anti-CEA-serumtitre ble beregnet som den resiproke begrensende-fortynningen for serum som frembringer en absorbans som er minst 3 ganger høyere enn absorbansen til autologt pre-immunt serum ved samme fortynning.
Eksempel 9
IFN-y-ELISPOT-analyse
Analyse ble utført ved å benytte muse splenocytter og CEA-spesifikke peptider som tidligere beskrevet (Facciabene et al., ovenfor). 96-brønners MAIP-plater (Millipore Corp., Billerica, MA) ble belagt med 100 ul/brønn med renset rotte-anti-muse-IFN-y (IgGl, klon R4-6A2, Pharmingen) fortynnet til 2,5 ug/ml i sterilt PBS. Etter vasking med PBS ble blokkering av plater utført med 200 ul/brønn med R10-medium i 2 timer ved 37
Splenocytter ble fremskaffet ved å fjerne milten fra den avlivede musen på en steril måte og ved miltdestruksjon ved riving på et metallnett. Røde blodceller ble fjernet ved hjelp av osmotisk lysis ved å tilsette 1 ml 0,1X PBS til cellepellet og vortekse i omtrent 15 s. 1 ml 2 x PBS ble deretter tilsatt og volumet ble brakt til 4 ml med lx PBS. Celler ble pelletert ved sentrifugering ved 1200 rpm i 10 min ved RT, og pelletten ble resuspendert i 1 ml R10-medium. Levedyktige celler ble talt ved å benytte Turks-farging.
Splenocytter ble platet ut ved 5 x IO<5>og 2,5 x IO<5>celler per brønn i duplikat og inkubert i 20 timer ved 37 °C med 1 ug/ml suspensjon fra hvert peptid. Concanavalin-A (ConA) ble benyttet som positiv internkontroll for hver mus ved 5 ug/ml. Etter vasking med PBS, 0,05 % Tween 20, ble plater inkubert O/N ved 4°C med 50 ul/brønn med biotin-konjugert rotte-anti-muse-IFNy (RatlgGl, klon XMG 1.2, PharMingen) fortynnet til 1:2500 analysebuffer. Etter omfattende vasking ble plater utviklet ved å tilsette 50 ul/brønn NBT/B-CIP (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) inntil utviklingen avflekker var klart synlig. Reaksjonen ble stoppet ved å vaske plater grundig med destillert vann. Plater ble lufttørket og flekker ble deretter talt ved å benytte en automatisert ELISPOT-avleser.
Eksempel 10
Intracellulær cytokinfarging
1 til 2 millioner musesplenocytter eller PBMC i 1 ml RPMI 10 % FCS ble inkubert med sammenslåtte peptider (5-6 ul/ml sluttkonsentrasjon for hvert peptid) og brefeldin-A (1 ug/ml, BD Pharmingen kat.nr. 555028/2300kk) ved 37 °C og 5 % C02i 12-16 timer som tidligere beskrevet (Facciabene et al, ovenfor). Celler ble deretter vasket med FACS-buffer (PBS 1 % FBS, 0,01 % NaN3) og inkubert med renset anti-muse CD16/CD32-Fc-blokk (BD Pharmingen kat.nr. 553142) i 15 min ved 4°C. Celler ble deretter vasket og farget med overflate antistoffer: CD4-PE-konjugert anti-mus (BD Pharmingen, kat.nr. 553049), PercP-CD8-konjugert anti-mus (BD Pharmingen, kat.nr. 553036) og APC-konjugert anti-muse-CD3e (BD Pharmingen kat.nr. 553066) i 30 min ved romtemperatur i mørket. Etter vaskingen ble celler fiksert og permeabilisert med Cytofix-Cytoperm-løsning (BD Pharmingen, kat.nr. 555028/2300kk) i 20 min ved 4°C i mørket. Etter vasking med PermWash-løsning (BD Pharmingen, kat.nr. 555028/2300kk) ble celler inkubert med IFNy-FITC-antistoffene (BD Pharmingen). Celler ble deretter vasket, fikser med formaldehyd 1 % i PBS og analysert på et FACS-Calibur flowcytometer ved å benytte CellQuest-programvare (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Eksempel 11
Immunogenisitet for CEA-LT-fusjoner
For å undersøke immunresponser indusert av plasmidene som koder for CEA-LTA-og CEA-LTB-fusjonene blir grupper på 9 C57BL/6-mus immunisert med to injeksjoner i.m. med 50 ug hver av plasmidene pVU/hCEA, pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB. For å verifisere hvorvidt samtidig ekspresjon av CEA-LTA og CEA-LTB-fusjonsproteinene kunne ha en additiv effekt på immunogenisiteten til CEA-proteinene, ble ytterligere en gruppe mus immunisert ved å injisere sammen 25 ug hver av plasmidene pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB. Immuniseringen ble administrert tre uker fra hverandre. Plasmid-DNA ble rutinemessig elektroinjisert inn i muse skjelettmuskulatur i lys av den forsterkede transduksjonen og immunogenisiteten forbunnet med denne spesielle prosedyren (Zucchelli et al., J. Virol. 74: 11598-11607 (2000), Widera et al., J. Immunol. 164: 4635-4640 (2000)).
Den cellulære immuniteten utløst av de ulike plasmidene ble målt ved hjelp av ELISPOT-analyse 2 uker etter den siste injeksjonen. Antigen-spesifikk IFNy-utskilling fra stimulerte splenocytter ble målt ved å benytte fire pooler av 15mer peptider overlappende med 11 aa og omfattende hele CEA-glykoproteinet. Pool A dekker aal til 147, pool B aa 137 til 237, pool C aa 317 til 507 og pool D aa 497 til 703. Som en negativ kontroll ble cytokinproduksjon også målt ved stimulering av splenocyttene med DMSO ved den samme konsentrasjonen som ble benyttet for å solubilisere CEA-peptidene.
Immunresponsen utløst av DNA-vaksinering hos C57BL/6-mus var først og fremst ensidig rettet mot den C-terminale regionen av proteinet i og med at SFC-verdiene som ble påvist med peptid-pool A lå noe over bakgrunnen for alle konstruksjoner (Figur 10). pVU/hCEA-LTB-vaksinasjonsregimet var overlegent i forhold til det som ble utløst av pVU/hCEA som indikert ved de høyere geometriske middelverdiene for SFC påvist med peptid-pool B, C og D, pVU/hCEA-LTB: henholdsvis 482,1436 og 2054 SFC/10<6>splenocytter, pVU/hCEA: henholdsvis 45, 350 og 264 SFC/10<6>splenocytter). Tilsvarende hadde plasmid pVU/hCEA-LTA også en forsterkende effekt på den CEA-spesifikke immunresponsen sammenlignet med pVU/hCEA. Økningen i immunrespons ble likevel kun observert med peptid-poolene C og D (henholdsvis 925 og 528 SFC/10<6>splenocytter), mens immunresponsen som ble målt med peptid-pool B var lav (15 SFC/10<6>splenocytter). I tillegg hadde samtidig injeksjon av plasmidene pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB ingen vesentlig synergistisk effekt på immunresponsen ovenfor CEA sammenlignet med immunresponsen målt i den pVU/hCEA-LTB-behandlede gruppen, og den resulterte heller i en nedgang i SFC-verdiene som ble påvist med peptid-pool B og D (henholdsvis 210 og 528 SFC/10<6>splenocytter).
For å definere T-celle spesifisiteten som ble utløst ved vaksinering med de ulike CEA-konstruksjonene ble intracellulær IFNy-farging utført på poolede splenocytter fra injiserte mus ved å benytte peptid-pool D. En CD8<+->spesifikk respons ble påvist hos mus injisert med pVU/hCEA-LTB (4,5 %) og var overlegen i forhold til den som ble påvist med pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA (henholdsvis 0,14 % og 0,8 %, Figur 10B). I motsetning til dette utløste pVU/CEA-LTA en sterk CD4<+->spesifikk respons (1,21 %), sterkere enn den som ble observert med pVU/hCEA-LTB og pVU/hCEA (henholdsvis 0,55 % og 0,58 %).
Induksjonen av den humorale immunresponsen mot CEA ble undersøkt ved å måle antigenspesifikke antistoffer (Figur 11). Både plasmid pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB utløste en større antistoffrespons enn pVU/hCEA, noe som bekrefter adjuvanseffekten utøvd av LT-subenhetene på den CEA-spesifikke immunresponsen. Slik viser disse dataene at fusjon av den CEA-kodende sekvensen med LTA- eller LTB-cDNA fører til en økning i den CEA-spesifikke immunresponsen. Likevel ser det ut til at LTB har en større forsterkende effekt på immunresponsen med en kraftig induksjon av CD8<+->T-celler, mens LTA utløser en dominerende CD4<+->respons.
Eksempel 12
Immunogenisitet for CEA-LTB-fusjoner i forskjellige musestammer
For å bestemme hvorvidt den forsterkende effekten til LT-subenhetene på den CEA-spesifikke immunresponsen ikke var begrenset til en enkel musegenetisk bakgrunn ble DNA-baserte immuniseringer utført hos BALB/c-, C57/DR4- og HLA-A2.1-(HHD)-mus. BALB/c-musene ble valgt i lys av deres immunkompetanse, fordi dette er en musestamme som er ekstremt reaktiv i forhold til immuniseringsregimer av ulike typer. De transgene HDD-musene uttrykker de humane MHC-klasse-I-genene. Tilsvarende bærer transgene C57/DR4-mus de humane MHC-klasse-II-genene. Slik kan disse to transgene muse-stammene tilveiebringe informasjon når det gjelder immunreaktiviteten til CEA-LT-fusjonene i konteksten av humane MHC-klasse-I- og II-haplotyper.
Den CEA-spesifikke immunresponsen hos BALB/c-mus ble først undersøkt ved ELISPOT-analyse. Forsterkning av den antigenspesifikke immunresponsen ved immunisering med plasmid pVU/hCEA-LTB ble påvist med peptid-poolene A, B, C, D (pVU/hCEA-LTB: henholdsvis 166, 1353, 796, 899 SFC/10<6>splenocytter, pVU/hCEA: henholdsvis 57, 312, 327, 318 SFC/10<6>splenocytter, Figur 12). Som observert hos C57BL/6-musene så ser den N-terminale regionen hos CEA-proteinet ut til å være den minst immunogene sammenlignet med andre deler av tumorantigenet. pVU/hCEA-LTA-immunisering ga også en økning i den antigenspesifikke immunresponsen sammenlignet med pVU/hCEA. Økningen i immunresposen ble påvist med peptid-poolene B, C og D (henholdsvis 936, 727 og 650 SFC/10<6>splenocytter). I tillegg ga samtidig injeksjon av de to plasmidene pVU/hCEA-LTA og pVU/hCEA-LTB en vesentlig additiv effekt som ble påvist i hovedsak med peptid-poolen B og D (henholdsvis 1783 og 2141 SFC/10<6>splenocytter).
Den CEA-spesifikke immunresponsen hos C57/DR4-mus ble vesentlig forsterket ved immuniseringen med pVU/hCEA-LTB, og ble kun påvist med peptid-pool D (Figur 13). Intracellulær IFNy-farging utført på poolede PBMC fra immuniserte mus viste at CD8<+->responsen ovenfor CEA var høyest hos mus immunisert med pVU/hCEA-LTB (15,32 %), mens den var svært svak i den pVU/hCEA-behandlede gruppen (0,5 %). pVU/CEA-LTA-immunisering økte den antigenspesifikke immunresponsen kun moderat
(0,43 %), og forsterket ikke ytterligere CEA-immunogenisiten når den ble injisert sammen med konstruksjonen som koder for CEA-LTB-fusjonen (13,44 %). Det var interessant at det var ingen signifikant CD4<+->T-celle respons påvist hos de immuniserte musene (data ikke vist).
Immunresponsen som ble utløst av de ulike CEA-kodende plasmidene ble undersøkt i HHD-mus ved å utføre intracellulær IFNy-farging på sammenslått PBMC. Immunresponsen ble kun påvist med peptid-poolene B og D, og som vist i Figur 14, førte immunisering med pVU/hCEA-LTB til mer enn 10 ganger økning i CD8<+->responsen ovenfor målantigener. I motsetning til dette ble ingen økning i immunresponsen påvist ved å benytte pVU/hCEA-LTA enten alene eller ved samtidig injeksjon med pVU/hCEA-LTB. Ingen CD4<+->T-cellerespons ble påvist hos de immuniserte musene (data ikke vist).
Sett sammen bekrefter disse dataene at fusjon av den LTB-kodende sekvensen med CEA fører til en vesentlig økning i den antigenspesifikke immunresponsen. Interessant nok er denne responsen i hovedsak CD8<+->spesifikk og kan bli observert hos ulike musestammer, for slik å indikere at den forsterkende effekten som blir utøvd ved LT-subenheten ikke er genotype begrenset.
Eksempel 13
Toleranse for human CEA hos transgene mus
For å bestemme hvorvidt de forsterkede immungene egenskapene til hCEA-LTB-fusjonen ville bryte toleranse mer effektivt ovenfor human CEA, ble transgene hCEA-mus immunisert med vektorer som bærer enten det fullt kodonoptimaliserte cDNA for hCEA eller CEA-LTB. Disse transgene musene bærer hele det humane CEA-genet og flankerende sekvenser og uttrykker hCEA-proteinet i tarmen, i hovedsak i blindtarm og tykktarm. Slik er denne muselinjen en nyttig modell for å undersøke tryggheten og effektiviteten ved immunterapi strategier som er rettet mot dette tumor-selv-antigenet (Clarke et al., Cancer Research 58: 1469-1477 (1998)).
Immunisering med pVU/hCEA-LTBopt resulterte i en signifikant økning i den CEA-spesifikke immunresponsen målt med intracelluær IFNy-farging av PBMC fra de injiserte musene (Figur 15A). Forsterkningen av T-celleresponsen ble påvist med peptid-pool D og var i hovedsak CD8<+>. I tillegg ble også den CEA-spesifikke humorale responsen økt hos de CEA-LTD-behandlede musene som vist ved den 47-gangers økning i de geometriske middelverdiene av Ab-titre sammenlignet med den pVU/hCEAopt-behandlede gruppen (Figur 15B).
For å bestemme hvorvidt den forsterkende effekten utøves ved LTB på den CEA-spesifikke immunresponsen også kunne bli observert ved immunisering med vektorer forskjellig fra plasmid-DNA, ble grupper på 12 CEA-tg-mus immunisert med Ad5/hCEAopt-LTB og Ad/hCEAopt ved en dose på 1 x IO<7>, 1 x IO<8>og 1 x IO<9>vp. Mus ble utsatt for to injeksjoner med to ukers mellomrom og immunresponsen ble målt ved hjelp av intracellulær IFNy-farging på PBMC to uker etter den siste injeksjonen. Immunresponsen ble undersøkt ved å benyttet peptid-pool D. Ad/hCEAopt-LTB var mer immunogen enn Ad/hCEAopt siden vesentlig immunrespons ovenfor CEA kunne bli påvist med dosen på 1 x IO<8>vp, mens 1 x IO<9>vp av Ad/hCEAopt var nødvendig for å bryte toleranse for målantigenet (Figur 16). Ingen CD4<+->respons kunne bli påvist i noen av de immuniserte musene (data ikke vist).
Disse dataene bekrefter at toleranse for dette selvantigenet kan bli brutt mer effektivt på grunn av de økte immunogene egenskapene til CEA-LTB-fusjonen. Den forsterkende effekten av LTB på de immunogene egenskapene til CEA er videre også mulig å observere ved injeksjon av plasmid som bærer det fullt kodonoptimaliserte cDNA for CEA-LTB-fusjonen. Til slutt tyder disse resultatene på at den forsterkede immunogensiteten til CEA-LTB ikke er begrenset til plasmid-DNA-immunisering.
Eksempel 14
Tumorvekst kinetikk hos CEA transgene mus immunisert med CEA-LTB-fusjoner
Det ble ansett som hensiktsmessig å forvisse seg om hvorvidt den økte immunogensiteten til CEA-LTB-fusjonen også kunne føre til en forsterket terapeutisk effekt som er i stand til å interferere med tumorprogresjon. Til dette formålet ble en gruppe på 10 CEA-tg-mus utsatt for 5 ukentlige injeksjoner med plasmider pVU/hCEAopt eller pV 1 J/CEAopt-LTB etterfulgt av en siste boost med 1 x 10<10>vp med den tilsvarende Ad-vektoren. I lys av nyere rapporter som indikerer at høye nivåer av cellulær immunitet kan bli indusert mot virus- og bakterieantigener ved å benytte plasmid-DNA-prime-Ad-boost modalitet ble den samme immuniseringsprotokollen benyttet i denne undersøkelsen. To uker etter den siste immuniseringen ble CEA-tg-musene utfordret med en subkutan injeksjon med 5 x IO<5>MC38-CEA-tumorceller. Denne syngene cellelinjen var avledet fra en kjemisk indusert tykktarmskreft og uttrykker CEA. Tumorutvikling i liksom-behandlede mus ble påvist ved 28 dager etter utfordring siden alle de behandlede musene ikke lenger var tumorfrie (Figur 17A). I tillegg var det en samtidig økning i den gjennomsnittlige størrelsen til tumormassen som nådde vesentlig volum ved 34 dager etter utfordring. Mus vaksinert med vektorer som koder for pVU/hCEAopt viste en delvis resistens ovenfor tumorutvikling siden 2 av 10 behandlede mus forble tumorfrie på dag 34 etter utfordring. Den gjennomsnittlige størrelsen til tumorene i denne gruppen var mindre enn den som ble observert hos de liksom-behandlede musene. Immunisering med vektorer som koder for CEAopt-LTB-fusjonen førte til en vesentlig beskyttende effekt fra tumorutvikling. 5 av 10 behandlede mus ble tumorfrie på dag 34 etter utfordring, og den gjennomsnittlige størrelsen for tumormassen i denne gruppen var vesentlig mindre enn den som ble observert i de liksom-behandlede musene eller pVU/hCEAopt-behandlede mus. Disse resultatene tyder således på at den forsterkede CEA-spesifikke immunresponsen assosiert med vektorer som koder for CEA- LTB-fusjonen korrelerer med en vesentlig antitumoreffekt som fører til delvis beskyttelse fra tumorvekst og redusert vekstkinetikk for tumormassen.
Eksempel 15
CEA-DOM- og CEA-FcIgG-fusjoner forsterker immunogenisiteten til CEA-proteinet
For å undersøke immunresponsene som ble indusert av plasmidene som koder for CEA-FRC-, CEA-DOM-, CEA-VSV-G-, CEA-FcIgG-, CEA-HSP70- og CEA-LAMP-fusjonene ble grupper på 9 C57BL/6-mus immunisert med to i.m.-injeksjoner med 50 eller 5 ug med hvert plasmid. Immuniseringene var med tre ukers mellomrom. I lys av den forsterkede transduksjonen og immunogenisiteten som er rapportert med elektroporering (Zucchelli et al., J. Virology 74: 11598 (2000), Widera et al., J. Immunol. 164: 4635
(2000)), ble plasmid-DNA rutinemessig elektroporert (DNA-EP) inn i muse skjelett muskel.
Immunresponsen som ble utløst ved forskjellige plasmider ble målt ved IFNy-ELISPOT-analyse, 2 uker etter den siste injeksjonen. Antigenspesifikk IFNy-sekresjon fra stimulerte splenocytter ble målt ved å benytte en pool av 15mer peptider overlappende med 11 aa og omfattende den C-terminale regionen til CEA (pool D, aa 497-703)
(Zucchelli et al., ovenfor). Analysen av immunresponsen ovenfor CEA ble utført med peptid-pool D siden den cellulære immunresponsen mot CEA hos C57BL/6-mus var først og fremst ensidig rettet mot den C-terminale regionen til dette proteinet (Zuccelli et al, ovenfor). Som en negativ kontroll ble cytokinproduksjon også målt ved stimulering av splenocyttene med DMSO ved den samme konsentrasjon som ble benyttet for å solubilisere CEA-peptidene.
Injeksjon av pVU/CEA-DOM eller pVU/CEA-Fc utløste en større immunrespons mot CEA sammenlignet med pVU/CEA. Den høyere immunogenisiteten for disse to fusjonsproteinene resulterte i høyere geometriske middelverdier av flekkdannende celler (SFC) per 10<6>splenocytter (Figur 20A). Plasmidene pVU/CEA-DOM og pVlJ/CEA-FcIgG hadde tilsvarende immunogene egenskaper og utøvde en 3- til 4-gangers økning i CEA-spesifikke immunresponser ved injeksjon av 5 eller 50 ug plasmid-DNA (p VI J/CE A-DOM: 590 og 1098 SFC/10<6>splenocytter, pVlJ/CEA-FcIgG: 510 og 1160, pVU/CEA: 146 og 264 SFC/10<6>splenocytter). Ingen vesentlige forskjeller ble påvist mellom SFC-verdiene som ble utløst av pVU/CEA-FrC, pVU/CEA-LAMP, pVU/CEA-HSP70 og pVU/CEA. Ingen CEA-spesifikke immunresponser ble påvist i negativ kontrollprøver.
For å bestemme effekten av CEA-fusjonene på den humorale responsen ovenfor CEA ble serum fra immuniserte mus testet i ELISA ved å benytte renset CEA-protein som substrat (Figur 20B). En økning i CEA-spesifikt antistofftiter ble observert ved injeksjon av 50 ug plasmider pVU/CEA-DOM, pVlJ/CEA-FcIgG, pVU/CEA-FrC og pVU/CEA-HSP70. I motsetning til dette førte injeksjon av pVU/CEA-LAMP og pVU/CEA-VSV-G til en CEA- spesifikk antistoffrespons som var tilsvarende den som ble observert ved immunisert med pVU/CEA. Holdt sammen viser disse dataene at fusjon av den CEA-kodende sekvensen med DOM- eller FcIgG-cDNA fører til en økning i den CEA-spesifikke cellemedierte og humorale immunresponsen.
Eksempel 16 (referanse, ikke i henhold til oppfinnelsen)
CEA-DOM- og CEA-FcIgG-fusjoner bryter toleranse for målantigen hos CEA transgene mus
Toleranse ovenfor målantigenet er en av hindringene som en kreftvaksine må overkomme for å utløse en immunrespons og for å utøve en effektiv antitumoreffekt. Det var derfor nødvendig å bestemme hvorvidt de forsterkede immunogene egenskapene til CEA-DOM og CEA-FcIgG-fusjonene ville bryte toleranse ovenfor CEA mer effektivt enn CEA-proteinet. I så henseende ble CEA transgene mus benyttet til å utføre sammenlignende immuniseringsstudier. Disse transgene musene bærer hele det humane CEA-genet og flankerende sekvenser og uttrykker CEA-proteinet i tarmen, i hovedsak i blindtarm og tykktarm. Denne muselinjen er en nyttig modell for å undersøke tryggheten og effektiviteten ved immunoterapistrategier som er rettet mot dette tumor-selvantigenet (Clarke et al., ovenfor).
I lys av de forbedrede immunogene egenskapene til vektorer som bærer det kodonanvendelses optimaliserte cDNA (cDNAopt) for CEA, ble både plasmid- og adenovirus-vektorer fremstilt for å bære cDNAopt for CEA-DOM- (CEA-DOMopt)- eller CEA-FcIgG- (CEA-FcIgGopt)-fusjonene. Som observert for CEA ble CEA-DOMopt- og CEA-FcIgGopt-cDNA vist å bli uttrykt med en større effektivitet enn det tilsvarende villtype-cDNA noe som førte til en forsterket immunrespons mot CEA (data ikke vist).
Immunogenisiteten til disse to fusjonsproteinene ble sammenlignet med den for CEA ved hjelp av en serie immuniseringsstudier basert på anvendelsen av plasmid-DNA og Ad-vektorer administrert enten alene eller i kombinasjon. Grupper av CEA transgene mus ble immunisert med de følgende varierende regimene:
i) 5 injeksjoner ved ukentlige intervaller på 50 ug plasmid-DNA (DNA/DNA),
ii) 2 biukentlige injeksjoner med adenovirus i doser fra 1 x IO<7>til 1 x IO<9>viruspartikler (vp) med adenovirus (Ad/Ad), eller
iii) 5 ukentlige injeksjoner med plasmid-DNA etterfulgt av en sluttinjeksjon med 1 x IO<9>vp med adenovirus (DNA/Ad). Immunresponser ble analysert ved intracelluær IFNy-farging på PBMC eller splenocytter fra hver immuniserte mus ved å benytte peptider fra pool D. I tillegg ble induksjon av CEA-spesifikke antistoffer monitorert med ELISA.
DNA/DNA-immunisering av de CEA transgene musene avslørte at CEA-DOMopt- og CEA-FcIgGopt-vektorene utøvet en målbar CD8<+->T-cellerespons på målantigenet (Figur 21A). Slik var begge konstruksjoner i stand til å bryte toleranse ovenfor CEA i disse musene. Den antigenspesifikke responsen utløst av CEA-DOM- og CEA-FcIgG-fusjons- proteiner var sammenlignbar som angitt ved gjennomsnittsverdiene for intracelluær IFNy-farging (henholdsvis 0,22 og 0,34 %). Likevel var immunresponsen som ble utløst av disse to konstruksjonene større enn den som ble observert ved vaksinering med pVU/CEAopt (0,07 %). Tilsvarende var også humoral anti-CEA-respons større ved vaksinering med fusjonsproteinene. CEA-spesifikt antistofftiter ble påvist hos alle mus immunisert med pVU/CEA-DOMopt og pVlJ/CEA-FcIgGopt og det gjennomsnittlige antistofftitret var henholdsvis 56 136 og 24 725. I motsetning til dette viste den pVU/CEAopt-immuniserte gruppen en minst 77-ganger lavere gjennomsnittlig titer for CEA-spesifikt antistoff (318) (Figur 21B).
CEA transgene mus behandlet med Ad/Ad-vaksineringsregimet viste også en bedre effektivitet i å bryte toleranse for CEA ved vaksinering med CEA-DOMopt- og CEA-FcIgGopt-Ad-vektorer enn med Ad-CEAopt. En CEA-spesifikk CD8<+->T-cellerespons kunne bli observert i de vaksinerte musene ved injeksjon av så lite som IO<7>vp med Ad-CEA-DOM eller Ad-CEA-FcIgG, og den CEA-spesifikke respons var sammenlignbar mellom de to antigenene og økte ved injeksjon av IO<9>vp (henholdsvis 1,55 % og 1,15 %). I motsetning til dette var IO<9>vp med Ad-CEAopt nødvendig for å utløse vesentlige CD8<+->T-celleforløper frekvenser (2,1 %) (Figur 21C). CEA-spesifikke antistoffer ble påvist hos alle mus immunisert med Ad-CEA-DOMopt og Ad-CEA-FcIgGopt. Gjennomsnittene av antistofftiter var henholdsvis 10 600 og 33 000. Injeksjon av Ad-CEAopt resulterte i en målbar CEA-spesifikk respons hos kun 2 av de behandlede musene, og antistofftitre var vesentlig lavere (Zucchelli et al, ovenfor) (figur 21D). Interessant å bemerke viste DNA/Ad-immuniseringen reduserte forskjeller i de CD8<+->T-celleforløper frekvensene utløst av CEA-, CEA-DOM- og CEA-FcIgG-vektorene (Figur 22A). Likevel var gjennomsnittlige CEA-spesifikke antistofftitre høyere ved vaksinering med vektorer som uttrykker CEA-DOM og CEA-FcIgG enn CEA (henholdsvis 31 200, 26 120 og 412) (Figur 22B).
Uavhengig av antigenet ble interessant nok ingen åpenbar CD4<+->celle-Thl-respons ovenfor CEA påvist i noen av de tre vaksineringsregimene (data ikke vist). Likevel ble signifikant CD4<+->celle-Th-l-respons mot hjelperepitopen p30, som er tilstede innenfor DOM-sekvensene (Rice et al., J. Immunol. 167: 1558-65 (2001)) påvist etter DNA/DNA-vaksinering (0,4 %) (Figur 23).
På det vis viser disse dataene at CEA-DOM og CEA-FcIgG-fusjonsproteinene kan bryte toleranse mot CEA hos transgene mus med større effektivitet enn CEA-proteinet. De forbedrede immunogene egenskapene for disse fusjonsproteinene kan bli observert ved immunisering med DNA- eller Ad-vektorer. Likevel kan den større evnen for disse to fusjonsproteinene i å utløse CD8<+->T-celler for CEA bli overvunnet, i det minste delvis, ved DNA/Ad-vaksineringsregimer.
Eksempel 17
T-celledeplesjons studier
Immuniserte dyr ble depletert for CD4<+->T-celler, CD8<+->T-celler, NK-celler, ved hjelp av i.p.-injeksjon med anti-CD4 (GK1.5-hybridom), anti-CD7\8 (Lyt 2.2-hybridom) eller anti-asialo-GMl (Wako Chemicals, Richmond, VA) som beskrevet (Perricone et al., J. Immunother, 27(4):273-81 (2004); Yoon et al., J. Ethnopharmacol. 93(2-3):247-53
(2004)). Antistoffer (100 ul fortynnet ascitesvæske/dose) ble injisert på dag -7 i forhold til tumorutfordringen og deretter injisert hver uke i 3 uker etter injeksjon av 5 x IO<5>MC38-CEA-celler. Deplesjonsbetingelser ble validert ved hjelp av flowcytometri analyse av perifert blod ved å benytte fykoerytrinkonjugert MAbs-anti-CD4, -anti-CD8- og -anti-NK (PharMingen, San Diego, CA), der 99 % av den relevante celleundergruppen ble depletert, mens alle andre undergrupper forble innfor normale nivåer.
Eksempel 18 (referanse, ikke i henhold til oppfinnelsen)
CEA-DOM-immunisering utøver en antitumoreffekt hos CEA transgene mus
Deretter forsikret vi oss om hvorvidt den økte immunogenisiteten til CEA-DOM-eller CEA-FcIgG-fusjonene også ville føre til en forsterket terapeutisk effekt, som er i stand til å interferere med tumorprogresjon. Til dette formålet ble grupper på 10 CEA transgene mus utsatt for DNA/DNA-, Ad/Ad- eller DNA/Ad-immuniseringsregimene med CEA-DOM-, CEA-FcIgG- eller CEA-vektorene. To uker etter den siste immuniseringen ble de CEA transgene musene utfordret med en subkutan injeksjon på 5 x IO<5>MC38-CEA-celler, som er en syngen tumorcellelinje som uttrykker CEA (Clarke et al., ovenfor). Immunisering med DNA/DNA- eller Ad/Ad-modalitetene førte ikke til noen signifikant antitumor effekt, uavhengig av proteinet som ble uttrykt av de injiserte vektorene (Figur 24). I motsetning til dette førte DNA-Ep/Ad-immunisering med vektorer som koder for CEA-DOM-fusjons-proteinet til en signifikant anti-tumor effekt der 7 av 10 behandlede mus ble tumorfrie på dag 34 etter utfordring. På det vis indikerer disse resultatene at den forsterkede CEA-spesifikke immunresponsen som er assosiert med CEA-DOMopt-cDNA og DNA/Ad-vaksineringsregimet korrelerer med en signifikant antitumoreffekt hos CEA transgene mus.
Eksempel 19 (referanse, ikke i henhold til oppfinnelsen)
CEA-DOM-antitumoreffekten er avhengig av CD4<+->T-celler, CD8<+->T-celler og NK-celler
Effektorcellene som er involvert i antitumor effekten som ble observert ved DNA-EP- og Ad-immunisering med vektorene som koder for CEA-DOM-fusjon blekarakterisert. Etter DNA/Ad-immunisering, men før tumorutfordring, ble mus depletert for CD4<+->, CD8<+->T-celler eller NK-celler ved hjelp av MAbs. Antistoffer ble gitt i løpet av tumorutfordringen for å sikre fortsatt depletering av de relevante NK- og T-celle undergruppene. Depleterinen av alle tre celletyper ble overvåket ved hjelp av flowcytometri analyse ved å benytte antistoffer som er spesifikke for celleoverflatemarkører (data ikke vist). Depletering av CD4<+->, CD8<+->T-celler eller NK-celler hadde en negativ effekt på overlevelse av de immuniserte musene som førte til den drastiske reduksjonen av tumorfrie mus sammenlignet med den vaksinerte gruppen (Figur 25). På det vis indikerer disse dataene på at NK-, CD4<+->og CD8<+->T-celler spiller en viktig rolle i antitumoreffekten som blir utøvd ved CEA-DOM-vaksinering.
Eksempel 20
Statistisk analyse
Der det er angitt ble resultater analysert ved hjelp av log-rank-test eller tohalet-Student-t-test. En p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som signifikant.
Claims (20)
1. Nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et CEA-fusjonsprotein, der CEA-fusjonsproteinet omfatter et C-terminalt trunkert humant CEA-protein som mangler aminosyre 679-702 av Sekv. Id. Nr.: 20, fusjonert til et immunforsterkende element som er B enheten av det varmelabile enterotoksinet fra E.coli (LTB) som eventuelt har fått fjernet sin signalsekvens, og der fusjonsproteinet er i stand til å frembringe en immunrespons hos et pattedyr.
2. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 1, hvor LT-subenhet-B har fått fjernet sin signalsekvens.
3. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 2, hvor sekvensen av nukleotider omfatter en sekvens av nukleotider som fremlagt ifølge Sekv. Id. Nr. 9, Sekv. Id. Nr. 11 eller Sekv. Id. Nr. 12.
4. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 3, der sekvensen av nukleotider er som fremlagt ifølge Sekv. Id. Nr. 12.
5. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 2, der den C-terminale enden til CEA-proteinet er fusjonert til den N-terminale enden på LT-subenhet-B.
6. Vektor,karakterisert vedat den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
7. Vektor ifølge krav 6, hvor vektoren er en adenovirusvektor eller en plasmidvektor.
8. Vektor ifølge krav 7, hvor vektoren er en Ad-5-vektor.
9. Vektor ifølge krav 7, hvor vektoren er en Ad-6-vektor eller en Ad-24-vektor.
10. Vektor ifølge krav 7, hvor vektoren er en sjimpanse-Ad-vektor.
11. Vektor ifølge krav 7, hvor vektoren er pVUnsB.
12. Vertscelle,karakterisert vedat den omfatter vektoren ifølge krav 7.
13. Fremgangsmåte for å uttrykke et CEA-fusjonsprotein i en rekombinant vertscelle,karakterisert vedat den omfatter å: (a) introdusere en vektor som omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1 inn i en egnet vertscelle, og (b) dyrke vertscellen ved betingelser som tillater ekspresjon av nevnte humane CEA-fusjonsprotein.
14. Renset CEA-fusjonsprotein,
karakterisert vedat det er kodet for av nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
15. Renset CEA-fusjonsprotein ifølge krav 14, hvor fusjonsproteinet omfatter en sekvens av aminosyrer som er valgt fra gruppen bestående av: Sekv. Id. Nr. 10 og 13.
16. En adenovirusvektor som omfatter et adenovirusgenom med en delesjon i El-regionen, og en insersjon i El-regionen, der insersjonen omfatter en ekspresjonskassett som omfatter: (a) et polynukleotid som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et CEA-fusjonsprotein, der CEA-fusjonsproteinet omfatter et C-terminalt trunkert humant CEA-protein som mangler aminosyre 679-702 av Sekv. Id. Nr.: 20, fusjonert til et immunforsterkende element som er B enheten av det varmelabile enterotoksinet fra E.coli (LTB) som eventuelt har fått fjernet sin signalsekvens, og der fusjonsproteinet er i stand til å frembringe en immunrespons hos et pattedyr, og (b) en promotor opererbart bundet til polynukleotidet.
17. Adenovirusvektor ifølge krav 16, hvor den er en Ad-4-vektor, en Ad-6-vektor, eller en Ad-24-vektor.
18. Vaksineplasmid som omfatter en plasmiddel og en ekspresjonskassettdel, der ekspresjonskassettdelen omfatter: (a) et polynukleotid som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et CEA-fusjonsprotein, der CEA-fusjonsproteinet omfatter et C-terminalt trunkert humant CEA-protein som mangler aminosyre 679-702 av Sekv. Id. Nr.: 20, fusjonert til et immunforsterkende element som er B enheten av det varmelabile enterotoksinet fra E.coli (LTB) som eventuelt har fått fjernet sin signalsekvens, og der fusjonsproteinet er i stand til å frembringe en immunrespons hos et pattedyr, og (b) en promotor opererbart bundet til polynukleotidet.
19. Vaksinevektor omfattende nukleinsyremolekylet ifølge krav 1, for anvendelse ved forebygging eller behandling av kreft i et pattedyr.
20. Vaksinevektor ifølge krav 19, hvor vektoren er ifølge et hvilket som helst av kravene 16-18.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US54364904P | 2004-02-11 | 2004-02-11 | |
US63579104P | 2004-12-14 | 2004-12-14 | |
PCT/EP2005/001114 WO2005077977A2 (en) | 2004-02-11 | 2005-02-03 | Carcinoembryonic antigen fusions proteins and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20064044L NO20064044L (no) | 2006-09-08 |
NO340715B1 true NO340715B1 (no) | 2017-06-06 |
Family
ID=34864529
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20064044A NO340715B1 (no) | 2004-02-11 | 2006-09-08 | Nukleinsyremolekyl som koder for et karsinoembryonalt antigen (CEA)-fusjonsprotein, vektor som omfatter nukleinsyremolekylet, vertcelle som omfatter vektoren, fremgangsmåte for å uttrykke fusjonsproteinet i en rekombinant vertscelle, renset CEA-fusjonsprotein, adenovirusvektor og vaksineplasmid som omfatter nukleotider som koder for CEA-fusjonsproteinet, samt en vaksinevektor som omfatter nukleinsyremolekylet for anvendelse ved forebygging eller behandling av kreft i et pattedyr. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8188244B2 (no) |
EP (1) | EP1716173B8 (no) |
JP (1) | JP5148116B2 (no) |
KR (1) | KR101195400B1 (no) |
AT (1) | ATE555127T1 (no) |
AU (1) | AU2005212479B2 (no) |
BR (1) | BRPI0507579A (no) |
CA (1) | CA2555013C (no) |
ES (1) | ES2387850T3 (no) |
IL (1) | IL177277A (no) |
NO (1) | NO340715B1 (no) |
NZ (1) | NZ549048A (no) |
RU (1) | RU2380375C2 (no) |
WO (1) | WO2005077977A2 (no) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101365715B (zh) | 2005-10-07 | 2013-03-27 | P·安杰莱蒂分子生物学研究所 | 基质金属蛋白酶11疫苗 |
KR20090079938A (ko) * | 2006-10-12 | 2009-07-22 | 이스티투토 디 리세르쉐 디 비올로지아 몰레콜라레 피. 안젤레티에스.피.에이. | 텔로머라제 역전사효소 융합 단백질, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드, 및 이들의 용도 |
EP3539567A1 (en) | 2007-07-02 | 2019-09-18 | Etubics Corporation | Methods and compositions for producing an adenovirus vector for use with multiple vaccinations |
EP2324057B1 (en) * | 2008-08-12 | 2018-03-21 | MSD Italia S.r.l. | Minigene comprising htpa signal peptide, t-cell epitopes, e. coli ltb and furin sensitive linkers |
EP2342334A4 (en) | 2008-09-29 | 2012-03-14 | Univ Pennsylvania | TARGETED VACCINES ON A TUMOR VASCULAR MARKER |
CA2798932C (en) * | 2010-05-11 | 2023-04-04 | Governing Council Of The University Of Toronto | The n-domain of carcinoembryonic antigen and compositions, methods and uses thereof |
WO2014031178A1 (en) * | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Etubics Corporation | Replication defective adenovirus vector in vaccination |
EA031234B1 (ru) * | 2012-10-29 | 2018-12-28 | Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Арканзас | Вакцина с адъювантом на основе маннозилированного хитозана |
CA2904506A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Bioven 3 Limited | Self-assembling synthetic proteins |
US9753036B2 (en) | 2014-04-29 | 2017-09-05 | Edp Biotech Corporation | Methods and compositions for screening and detecting biomarkers |
AU2016205208A1 (en) | 2015-01-09 | 2017-07-06 | Etubics Corporation | Methods and compositions for ebola virus vaccination |
US11352642B2 (en) | 2015-01-09 | 2022-06-07 | Etubics Corporation | Methods and compositions for combination immunotherapy |
DE202016009167U1 (de) * | 2015-04-10 | 2023-11-30 | Preclinics Gesellschaft Für Präklinische Forschung Mbh | VHH-Konstrukte zur Umleitung einer Immunantwort |
EP3286213B1 (en) | 2015-04-20 | 2021-08-04 | Etubics Corporation | Methods and compositions for combination immunotherapy |
US10751398B2 (en) * | 2016-10-07 | 2020-08-25 | Loyola University Chicago | Inflammasome activators and methods of use to treat tumors |
WO2018187260A1 (en) * | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Heat Biologics, Inc. | Intratumoral vaccination |
US11773187B2 (en) | 2018-01-17 | 2023-10-03 | Nantbio, Inc. | Enhanced immunogenicity for GPI-anchored antigens |
EP3864169A4 (en) * | 2018-10-12 | 2022-07-06 | Children's Hospital Medical Center | MODULAR EXPRESSION SYSTEMS FOR GENE EXPRESSION AND METHODS FOR THEIR USE |
IT201900016736A1 (it) * | 2019-09-19 | 2021-03-19 | Takis S R L | Antigeni fusi alla proteina Profilin-like di Toxoplasma Gondii (PFTG) e loro uso nella vaccinazione preventiva e terapeutica. |
US20240165213A1 (en) * | 2022-11-21 | 2024-05-23 | Avstera Therapeutics Corp. | mRNA COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING CANCER |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004099247A2 (en) * | 2003-05-05 | 2004-11-18 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5122599A (en) | 1986-08-13 | 1992-06-16 | Molecular Diagnostics, Inc. | CDNAS coding for members of the carcinoembryonic antigen family |
US5274087A (en) * | 1986-08-13 | 1993-12-28 | Molecular Diagnostics, Inc. | cDNA coding for carcinoembryonic antigen (CEA) |
AU674492B2 (en) * | 1991-05-06 | 1997-01-02 | United States of America, as represented by the Department of Health and Human Services, The | Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof |
DE69429723T2 (de) * | 1993-06-04 | 2002-09-26 | Whitehead Institute For Biomedical Research, Cambridge | Stressproteine und ihre verwendung |
US5736524A (en) * | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
AU3923000A (en) | 1999-04-16 | 2000-11-02 | Amgen, Inc. | Agp-1 fusion protein compositions and methods |
PT1212358E (pt) * | 1999-08-25 | 2005-04-29 | Merck & Co Inc | Genes sinteticos de papilomavirus humano |
WO2001024832A2 (de) | 1999-09-27 | 2001-04-12 | Gabriele Pecher | Pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung und prophylaxe von humanen tumoren, die das tumorantigen muzin und/oder das carcinoembryonale antigen (cea) exprimieren und ihre verwendung |
ES2306670T3 (es) | 1999-10-22 | 2008-11-16 | Sanofi Pasteur Limited | Procedimiento de induccion y/o intensificacion de la respuesta inmunitaria frente a antigenos tumorales. |
JP5118798B2 (ja) * | 2000-03-07 | 2013-01-16 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | アデノウイルス製剤 |
AU2001271268A1 (en) | 2000-05-19 | 2001-12-03 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Hybrid lt-a/ct-b holotoxin for use as an adjuvant |
CA2422882A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications |
DE10055545A1 (de) | 2000-11-09 | 2002-07-25 | Deutsches Krebsforsch | Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV 16-L1 und HPV 16-L2 kodierende DNA Sequenzen |
AU2001297988B2 (en) | 2000-11-27 | 2006-10-26 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid adjuvants |
GB0030067D0 (en) | 2000-12-11 | 2001-01-24 | Univ Bristol | Therapeutic agent |
CA2447585A1 (en) | 2001-05-14 | 2003-01-23 | Duotol Ab | Methods for promoting antigen presentation and modulating immune responses using cholera toxin and its b subunit |
AU2003203140A1 (en) * | 2002-01-17 | 2003-07-30 | Pharmexa A/S | Immunogenic carcinoembryonic antigen (cea) |
CA2514969A1 (en) * | 2003-02-13 | 2004-08-26 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Rhesus carcino embryonic antigen, nucleotides encoding same, and uses thereof |
WO2004092216A1 (en) | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Trangene S.A. | Carcinoembryonic antigen (cea) lacking a signal peptide, nucleic acid encoding it and fusion of cea with a t cell epitope and their use for the treatment and/or prophylaxis of cancer |
US20060286114A1 (en) * | 2003-08-22 | 2006-12-21 | Luigi Aurisicchio | Synthetic gene encoding rhesus monkey carcinoembryonic antigen and uses thereof |
-
2005
- 2005-02-03 RU RU2006132340/13A patent/RU2380375C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-02-03 BR BRPI0507579-3A patent/BRPI0507579A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-02-03 AU AU2005212479A patent/AU2005212479B2/en not_active Ceased
- 2005-02-03 ES ES05707188T patent/ES2387850T3/es active Active
- 2005-02-03 US US10/589,180 patent/US8188244B2/en active Active
- 2005-02-03 EP EP05707188A patent/EP1716173B8/en active Active
- 2005-02-03 CA CA2555013A patent/CA2555013C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-03 NZ NZ549048A patent/NZ549048A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-02-03 WO PCT/EP2005/001114 patent/WO2005077977A2/en active Application Filing
- 2005-02-03 AT AT05707188T patent/ATE555127T1/de active
- 2005-02-03 JP JP2006552512A patent/JP5148116B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-03 KR KR1020067018595A patent/KR101195400B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-08-03 IL IL177277A patent/IL177277A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-09-08 NO NO20064044A patent/NO340715B1/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004099247A2 (en) * | 2003-05-05 | 2004-11-18 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LUND L.H. et al., Signal sequence deletion and fusion to tetanus toxoid epitope augment antitumor immune responses to a human carcinoembryonic antigen (CEA) plasmid DNA vaccine in a murine test system, Cancer Gene Therapy, 2003, vol. 10, side 365-376, Dated: 01.01.0001 * |
RICE J. et al., DNA Fusion Vaccine Designed to Induce Cytotoxic T Cell Responses Against Defined Peptide Motifs: Implications for Cancer Vaccines, The Journal of Immunology, 2001, vol. 167 (3), side 1558-1565, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2006132340A (ru) | 2008-03-20 |
NO20064044L (no) | 2006-09-08 |
CA2555013A1 (en) | 2005-08-25 |
KR101195400B1 (ko) | 2012-10-29 |
AU2005212479A1 (en) | 2005-08-25 |
EP1716173B8 (en) | 2012-06-27 |
JP2007537722A (ja) | 2007-12-27 |
BRPI0507579A (pt) | 2007-07-03 |
WO2005077977A2 (en) | 2005-08-25 |
JP5148116B2 (ja) | 2013-02-20 |
EP1716173B1 (en) | 2012-04-25 |
KR20060129456A (ko) | 2006-12-15 |
US8188244B2 (en) | 2012-05-29 |
IL177277A0 (en) | 2006-12-10 |
AU2005212479B2 (en) | 2009-09-10 |
CA2555013C (en) | 2013-10-15 |
ATE555127T1 (de) | 2012-05-15 |
IL177277A (en) | 2014-08-31 |
NZ549048A (en) | 2009-04-30 |
RU2380375C2 (ru) | 2010-01-27 |
EP1716173A2 (en) | 2006-11-02 |
US20080311137A1 (en) | 2008-12-18 |
ES2387850T3 (es) | 2012-10-02 |
WO2005077977A3 (en) | 2005-10-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO340715B1 (no) | Nukleinsyremolekyl som koder for et karsinoembryonalt antigen (CEA)-fusjonsprotein, vektor som omfatter nukleinsyremolekylet, vertcelle som omfatter vektoren, fremgangsmåte for å uttrykke fusjonsproteinet i en rekombinant vertscelle, renset CEA-fusjonsprotein, adenovirusvektor og vaksineplasmid som omfatter nukleotider som koder for CEA-fusjonsproteinet, samt en vaksinevektor som omfatter nukleinsyremolekylet for anvendelse ved forebygging eller behandling av kreft i et pattedyr. | |
RU2473691C2 (ru) | Слитый белок теломеразной обратной транскриптазы, кодирующие его нуклеотиды и их применение | |
US7446185B2 (en) | Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response | |
US20070104685A1 (en) | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof | |
CA2532460C (en) | Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof | |
WO2008012237A1 (en) | Multi-antigen construct and uses thereof | |
ZA200606358B (en) | Carcinoembryonic antigen fusions and uses thereof | |
MXPA06009202A (en) | Carcinoembryonic antigen fusions proteins and uses thereof | |
US20060228335A1 (en) | Rhesus carcino embryonic antigen, nucleotides encoding same, and uses thereof | |
ZA200508013B (en) | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and use thereof | |
WO2004015098A2 (en) | Rhesus epithelial cell adhesion molecule, nucleic acid encoding the same, and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: MSD ITALIA SRL, IT |
|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |