NO338417B1 - Ikke-kompetitiv immunoassay for små analytter. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår immunoassayer og spesielt ikke-kompetitive immunoassayer for små analytter. Reagenspar som er nyttige i assayene er tilveiebrakt. Oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for deres fremstilling. Nye reagenser og midler for deres fremstilling er også tilveiebragt.

I et kompetitivt immunoassay må ytre reagens som konkurrerer med analytten tilsettes, noe som ikke er tilfelle i det ikke-kompetitive assayformatet. Den valgte fremgangsmåte til deteksjon av analytter ved immunokjemi er nå for tiden en ikke-kompetitiv immunoassay, hvor to antistoffer bindes til to forskjellige epitoper på analytten og danner således en såkalt sandwichtype assay. Et slikt assay er godt egnet for analytter med høy molekylvekt og den tilveiebringer forbedret hastighet, sensitivitet og spesifisitet, som er nødvendig i moderne immunoassayer. Det har imidlertid vært en vanskelig oppgave å utvikle ikke-kompetitive assayer for små analytter, fordi molekyler med lav molekylvekt ikke er store nok til å bindes samtidig til mer enn ett uavhengig antistoff. Derfor på tross av mange fundamentale problemer med hensyn på spesifisitet og sensivitet har det kompetitive immunoassayformatet nesten fullstendig blitt brukt for deteksjon av små analytter.

Det er imidlertid noen få publikasjoner hvor utvikling av et ikke-kompetitivt immunoassay for små analytter er blitt rapportert. I disse publikasjonene har et sekundært antiimmunkompleks (anti-IC) antistoff, som binder primært antianalytt antistoff som er kombinert med analytten, men som ikke binder det primære antistoffet eller analytten alene, blitt utviklet (Ullman et al., 1993; Seif et al., 1994; Towbin et al., 1995). Ullman et al., 1993 beskriver et antistoff som gjenkjenner et immunkompleks til et antistoff til tetrahydrokanabinol (THC). Anti-IC-antistoffet ble oppnådd ved å bruke et affinitetsmerket anti-THC-antistoff som immunogen og å velge ut et anti-IC-antistoff viss binding ble forsterket ved nærvær av A<9>THC. Seif et al., 1994, brukte det samme prinsippet for å fremstille anti-IC-antistoffer for å bestemme digoksin. Towbin et al., 1995, rapporterer et sandwich immunoassay for haptenet angiotensin II, hvori immuniseringen innbefatter at det toleriseres med ukomplekst primært antistoff før immuniseringen med anti-immunkomplekset for å oppnå anti-IC-antistoffer. Anti-IC-antistoffene brukt i ikke-kompetitive immunoassayer for små analytter har så langt vært konvensjonelle polyklonale eller monoklonale antistoffer oppnådd ved immunisering, og assayene beskrevet her inkluderer merking av de primære antistoffene og immobilisering av de sekundære eller vice versa.

US 6,326,159 tilveiebringer deteksjon av små analytter som morfin eller cannabinol ved å bruke homogen sandwich-assay, hvori et at antistoffene er et anti-IC antistoff som spesifikt binder til kompleks som er dannet mellom analytten og det primære anti-analytt antistoffet. Anti-ic-antistoffet blir oppnådd ved konvensjonell immunisering av et dyr med et immunkompleks (IC), noe som er svært vanskelig på grunn av ustabiliteten til IC.

Brennan J. et al 2003, Journal of chrommotography B, vil. 786, 1-2, 327-342 tilveiebringer et enkeltkjedet antigenbindende protein (scFv) som er oppnådd fra et pre-immunisert antistoff variabelt domene fag display bibliotek. ScFv-fragmentet er kapabelt til spesifikt å binde til fritt morfin. Det er derimot ikke beskrevet hvordan man skal oppnå eller bruke et anti-IC antistoff fragment eller problemer relatert til dette.

Såkalte "idiometriske" ikke-kompetitive immunoassay for små analytter er blitt utviklet av Mares et al., 1995. De brukte to typer av anti-idiotypiske antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper innenfor den hypervariable region av østradiol spesifikke primære antistoff. Det første anti-idiotypiske antistoff (betatype) har kapasiteten til å konkurrere med analytten om en epitop på bindingssetet til det primære antistoffet. Den andre anti-idiotypiske (alfatype) gjenkjenner en epitop i den variable region til det primære antistoff og bindingen er ikke følsom for nærvær av analytt. Alfatypen er imidlertid sterisk forhindret fra å bindes til det primære antistoffet i nærvær av betatypen. Disse tre typene av antistoffer tillater utvikling av et ikke-kompetitivt assay for små analytter.

Såkalte åpne sandwich-immunoassayer er blitt utviklet for deteksjon av haptener (Suzuki et al., 2000; Suzuki et al., 1999; Yokozeki et al., 2002). De er ikke-kompetitive assayer basert på et fenomen i henhold til hvilket assosiering av adskilte Vr- og Vl-kjeder i noen antistoffer er sterkt favorisert i nærvær av antigen (Uedaetal., 1996).

På tross av de signifikante fordelene med ikke-kompetitiv immunoassayformatet, har bare noen få eksempler av denne type assayer for små analytter blitt rapportert. Grunnen til dette er mest sannsynlig vanskeligheten med å produsere sekundære (anti-immunokompleks, eller anti-idiotypiske) antistoffer ved å immunisere dyret. F.eks. er anti-hapten monoklonale antistoffer, som er blitt utviklet ved hybridomteknologi (Kohler og Milstein, 1975), selvantigener for mus, og aktivering av immunoresponsen mot disse er vanskelig (Maruyama et al., 2002; Ullman et al., 1993; Kobayashi et al., 2000). Et ytterligere problem er at immunkomplekset brukt for immunisering har en tendens til å bryte sammen før responsen til immunokompleket blir oppnådd (Ullman et al., 1993; Kobayashi et al., 2000).

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nå en ikke-kompetitiv immunoassayprotokoll for små analytter, som omgår immunisering av dyr med immunkomplekset, som så langt har vært den mest utfordrende oppgaven når anti-IC-antistoffer skulle utvikles. Oppfinnelsen fasiliterer også et homogent immunoassay som videre forbedrer hastigheten, sensitiviteten og enkeltheten av assayet.

Sammendrag av oppfinnelsen

Vanskeligheten assosiert med å danne anti-IC-antistoffer for anvendelse i immunoassayer for små analytter kan nå bli unngått ved å tilveiebringe de nødvendige anti-IC-antistoffer fra et utvalg av rekombinante bindingspartnerbibliotek istedenfor fra immuniserte dyr. Et fag presentasjonsantistoffbibliotek kan konstrueres, som inneholder et stort antall kloner, fra hvilke de som koder de ønskede bindingspartnere, så som antistoffragmenter, kan bli anriket og selektert gjennom sekvensiell panning (panning). Denne protokollen åpner nye muligheter til å utvikle hurtige, troverdige og enkle immunoassayer for små analytter på en kosteffektiv og gjennomførbar måte.

Følgelig, er én hensikt med foreliggende oppfinnelse et ikke-kompetitivt immunoassay for små analytter som er mindre enn 5000 Da som omfatter å omsette en prøve som inneholder nevnte analytt med et reagenspar som omfatter en første bindingspartner som bindes til nevnte analytt, og en andre bindingspartner som bindes til komplekset av nevnte analytt og nevnte første bindingspartner. Immunoassayet er kjennetegnet ved oppnåelse av den andre bindingspartner og bestemme bindingen av den andre bindingspartner som således angir nærvær av analytten i prøven fra en naiv presentasjon av rekombinante bindingspartnerbibliotek ved å selektere en bindingspartner som bindes til nevnte kompleks av analytten og første bindingspartner.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til å fremstille et reagenspar for et ikke-kompetitivt immunoassay for en liten analytt på mindre enn 500 Da som omfatter å tilveiebringe en første bindingspartner som bindes til nevnte analytt, og en andre bindingspartner som bindes til komplekset av nevnte analytt og nevnte første bindingspartner, kjennetegnet ved oppnåelse av den andre bindingspartner fra et naivt presentasjonsbibliotek av rekombinante bindingspartnere ved å selektere en bindingspartner som bindes til nevnte kompleks av analytten og første bindingspartner.

Nye rekombinante bindingsproteiner, kjennetegnet ved at de omfatter den ligandbindende del av Ml Fab som omfatter SEKV. ID nr. 1 og SEKV. ID nr. 2; M2 Fab som omfatter SEKV. ID nr. 3 og SEKV. ID nr. 4; eller Kil scFv som omfatter SEKV. ID nr. 5 kan benyttes i assay'et..

DNA som koder de nye bindingsproteinene så vel som vertscelle som uttrykker dem er også tilveiebrakt.

Fordelaktige utforminger av oppfinnelsen er fremsatt i de avhengige krav.

Andre hensikter, detaljer og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil være klart fra de medfølgende tegninger, detaljerte beskrivelse og eksempler.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1. Et kompetitivt ELISA ved å bruke Ml Fab. Urin+ er urin tilsatt 1 ug/ml morfin. Fig. 2. Et ikke-kompetitivt tidsoppløst fluorescensimmunoassay (TR-FIA) med det Eu-merkede anti-Ml+morfin immunkompleks scFv-fragment Kil. a) Kryssreaktivitet og sensitivitet til assayet. b) Sensitivitet til assayet med Sl urinkontrollfortynninger som prøver.

Fig. 3. Et homogent TR-FRET immunoassay for morfin.

Fig. 4. Analyse av kryssreaktivitet av Ml anti-morfin Fab-fragment med kodein, heroin, noskapin og papaverin med et kompetitivt ELISA. Fig. 5. Et komparativt TR-FRET-basert homogent immunoassay for morfin.

Detaljert beskrivelse

Reagensparet for det ikke-kompetitive immunoassay i henhold til oppfinnelsen omfatter en første bindingspartner og en andre bindingspartner. Den første bindingspartner bindes til analytten for å danne et kompleks mellom den første bindingspartner og analytten. Den andre bindingspartner bindes til komplekset dannet ved første bindingspartner og analytten. Bindingspartnerne er vanligvis proteiner, så som antistoffer som inkluderer antistoffragmenter som har de ønskede bindingsegenskaper. Et antistoff er et immunoglobulinmolekyl og det kan tilhøre enhver av klassene i IgG, IgM, IgE, lg A eller IgD; hvor IgG og IgM er de oftest brukte. Fortrinnsvis er bindingspartnerne antistoffragmenter som omfatter det ligandbindende setet, så som Fab, eller scFV-fragmenter. Fragment kjent som Fab-fragmentet (fragment antigenbinding) består av det variable og konstante domenet til en immunoglobulin lett kjede, kovalent festet med en disulfidbro til det variable og første konstante domenet i en immunoglobulin tung kjede. Fv (variabelt domene) betyr de variable regioner i immunoglobulinmolekylet som er ansvarlig for ligandbindingen. ScFv (singel kjede Fv) betyr et molekyl hvori de variable domenene til den tunge og lette kjeden til et antistoff er koblet med et peptid for å danne en enkel polypeptidkjede syntetisert fra et enkelt mRNA-molekyl. De variable regioner i et immunoglobulin tung kjede og lett kjede er sammen ansvarlig for ligandbindingen. Ligand er substansen til hvilke bindingspartneren bindes, i sammenheng med antistoffer er det et antigen eller et hapten.

Den første bindingspartner kan være et konvensjonelt polyklonalt eller monoklonalt antistoff eller fragment derav, men fortrinnsvis er det rekombinant, som også den andre bindingspartner. Når den første bindingspartner er blitt selektert blir den kompleksert med sin ligand og komplekset blir brukt for å selektere den andre bindingspartner fra et naivt rekombinant bibliotek. Den første bindingspartner uten liganden blir brukt som kontraseleksjon. Den andre bindingspartner skulle bare gjenkjenne kompleksene, ikke fri første bindingspartner, ei heller fritt antigen i noe betydelig grad.

Rekombinante bindingspartnerbibliotek er egnet et ekspresjonsbibliotek, som er typisk et utvalgsbibliotek. Det generelle prinsipp for utvalgsrekombinante bindingspartnerbibliotek er at de presenterer bindingspartneren som et fusjonsprotein på overflaten, som kan være overflaten til en mikrobiell celle så som en gjær- eller bakteriell celle, eller en fag. Det rekombinante bindingspartnerutvalgsbiblioteket kan også være et utvalgsbibliotek hvor stabile komplekser av voksende protein og mRNA blir produsert i et in vitro ekspresjonssystem. Fag-presentasjonsbiblioteker er de som oftest benyttes. Antistoff-fag-presentasjonsteknologi og dens applikasjoner er beskrevet f.eks. i Hoogenboom et al., 1998.

Et fag-presentasjonsantistoffbibliotek kan konstrueres ved å klone immunoglobulinkodende cDNA inn i en egnet fag-presentasjonsvektor. DNA som koder for millioner av varianter av antistoffragmenter er porsjonsklonet inn i vektoren som del av fag-kappeproteinet. Store bibliotek som inneholder millioner av antistoffragmenter med forskjellige spesifikasjoner kan oppnås ved å transformere vektorene i bakteriene. Dyrking av bakteriene fører til ekspresjon av fag-utvalgsantistoffragmentene på deres overflate. Genet for det utvalgte antistoff blir båret i fag-genomet, og kobler således genotypen med fenotypen. Den fysiske kobling mellom utgangsproteinet og dets DNA tillater screening av et uhyre stort antall av varianter av proteiner, hvor hver er koblet til sitt tilsvarende DNA, med en enkel in vitro seleksjonsprosedyre kalt panning (panning). I sin enkleste form blir panning utført ved å inkubere en samling av fag-presentasjonsvarianter med liganden av interesse som er blitt immobilisert på en bærer, vaske vekk ubundet fag, og eluere spesifikt bundet fag ved å ødelegge bindingen til liganden. Den eluerte fag blir deretter amplifisert in vivo. Prosessen blir gjentatt flere ganger, noe som resulterer i trinnvis anriking av fag-samlingen med hensyn på de tettest bindende sekvenser. Etter ca. 3-6 seleksjonsrunder og amplifikasjon er de beste klonene sekvensert og transformert inn i en vertscelle for ytterligere ekspresjon. Vertscellen kan være en eukaryotisk eller prokaryotisk celle, f.eks. en gjær-, dyre-, plante-, eller innsektscelle eller bakteriell celle. Det kan til og med være en hybridom celle, som etter transformering produserer et rekombinant monoklonalt antistoff. Den rekombinante bindingspartner eller minst del av den kan også fremstilles syntetisk.

Konseptet å anvende rekombinante antistoffbibliotek gjør det ikke-kompetitive sandwich-assayet for små analytter mulig. Sandwichen kan detekteres ved alle standard immunoassay. Vanligvis blir en partner immobilisert på en bærer, så som en mikrotiterbrønn eller en kule. En sandwich blir dannet i nærvær av analytten og den andre bindingspartneren. Sandwichen kan detekteres f. eks. ved å bruke sekundære antistoffer eller ved merking av minst én av bindingspartnerne. Merket kan være ethvert konvensjonelt merke, så som et radioaktivt merke, et enzym eller en fluorescerende forbindelse. Assayet kan være feks. ELISA eller FIA.

En stor fordel med reagensparet i henhold til foreliggende oppfinnelse er at det gjør mulig et homogent ikke-kompetitivt immunoassay, dvs. et immunoassay som blir utført i oppløsning. At man unngår trinnene med immobilisering og vasking gjør assayet ekstremt enkelt. En slik test er også egnet for testing på stedet, f.eks. på andre steder enn laboratoriet.

Et foretrukket homogent immunoassay er et basert på fluorescensresonnans-energioverføring (FRET), for gjennomgang, se Szollosi et al., 1998. I FRET blir energi fra en molekylær fluorofor (donor) eksitert til en høyenergitilstand og overført til en annen fluorofor (akseptor) via intermolekylær dipol-dipolkobling. Dette er mulig bare hvis avstanden mellom donoren og akseptoren er kort (10-100 Å) og fluorescensspekteret til donoren og absorpsjonsspekteret til akseptoren delvis overlapper. Energioverføringen blir deretter detektert som en forandring i fluorescens. Ofte tidsoppløst fluorescens blir utnyttet (Hemmilå et al., 1988).

FRET er applisert til foreliggende oppfinnelse ved merking av de to bindingspartnerne, som fortrinnsvis er antistoffragmenter, med fluoroforer som danner et FRET donor-akseptorpar. Når bindingspartnerne og analytten er liten kommer fluoroforene i meget tett nærhet og et målbart FRET-signal oppnås.

Oppfinnelsen tilveiebringer et egnet og hurtig analytisk verksted for analytter med lav molekylvekt, så som terapeutiske og misbrukslegemidler, steroider, hormoner, metabolitter og miljøforurensningsmidler og toksiner. Et vanlig trekk ved disse små analyttene er at de er altfor små for konvensjonelle sandwich-assayer hvor to antistoffer gjenkjenner forskjellige epitoper på antigenet blir anvendt. Molekylvekten til disse små analyttene er normalt mindre enn 5000, men grensene er ikke absolutte.

Immunoassayet kan anvendes i alle typer av undersøkelser, så som å detektere miljøproblemer, toksiske forbindelser i mat og næringsmidler, kjemikalier som er indiserende på pågående prosesser, f.eks. mikrobielle prosesser i bygninger, metabolske prosesser i levende organismer, og i kliniske tester, legemiddelovervåkning og farmakologisk forskning. Assayene er ekstremt egnet til å detektere misbrukslegemidler, så som opiater (f. eks. morfin, amfetaminer, kanabinoider (f.eks. tetrahydrokanabinol (THC)), barbiturater, benzodiazepiner, kokain, LSD, metadon, metaqualon, fencyklidin, propoksyfen, trisykliske antidepressive midler. Det homogene assayet tilveiebringer et utmerket og egnet verktøy for på-stedet tester, f. eks. til å bli anvendt av politiet ved oppbringing av sjåfører etc. Prøven som skal analyseres for f.eks. legemidler og misbrukslegemidler kan være enhver kroppsvæskeprøve, så som blod, serum, urin eller spytt.

Reagensparet som benyttes i oppfinnelsen kan inkluderes i et testsett. Dette testsettet kan ytterligere omfatte enhver annen reagens som er nødvendig for assayet, så som reaksjonsoppløsninger, buffere, vaskeoppløsninger og deteksjonsmidler, så som merker og eventuelt et fluorometer. Fortrinnsvis omfatter testsettet et flertall av reagenspar fysisk separert fra hverandre, f.eks. mange i form av et mikroarray, hvorved feks. mange forskjellige misbrukslegemidler kan testes samtidig fra en enkel spyttprøve.

I en spesiell utforming av oppfinnelsen blir et reagenspar for å detektere morfin produsert og anvendt i et homogent immunoassay for nevnte stoff. Den første bindingspartner er et Fab-fragment oppnådd fra et fag-utvalgsantistoffbibliotek fremstilt fra cDNA fra en mus immunisert med morfin konjugert til en immunobærer BSA. Morfin spesifikk antistoffaget ble anriket ved å selektere de som bindes til morfinkonjugert BSA og å sortere ut de som bindes til BSA alene. Etter flere panningrunder blir to høyt bindende kloner sekvensert og uttrykt. De uttrykte Fab-fragmenter blir kalt Ml Fab og M2 Fab.

Den andre bindingspartner blir oppnådd fra et naivt scFv-antistoffragment fag-presentasjonsbibliotek ved å selektere antistoffer som bindes til et kompleks av morfin og Ml Fab. Først blir fagene preinkubert til bundet Ml Fab for å sortere ut de som bindes til Ml Fab som sådan. De ubundne fagene blir separert og inkubert med en blanding av morfin og immobilisert Ml Fab for å selektere fagene som bindes til immunokomplekset dannet mellom de immobiliserte Ml Fab og morfin. Ubundne fager blir vasket vekk og deretter blir de bundet til komplekset eluert. Bakgrunnen blir overvåket ved å sjekke bindingen til Ml Fab i fravær av morfin. Etter flere panningrunder blir et antall kloner plukket opp, sekvensert og uttrykt, noe som resulterer i scFv-fragment Kl 1.

Et fluorescensbasert immunoassay blir utført ved å bruke Ml Fab merket med europium som en første bindingspartner og scFv-fragment Kil merket med Cy5 som en andre bindingspartner. Bindingspartnerne blir inkubert med spytt eller urinprøver som inneholder morfin og deretter blir fluorescensen målt etter en forutbestemt tid. Assayet er fullstendig homogent og signalet lesbart etter ca. 5 min. Sensitiviteten for både urin og spytt er klart høyere enn den krevet av autoritetene når det gjelder morfin som modellanalytt. Utførelsen av testen er således at reagensene er i brønnen til en mikrotiterplate og fortynningsserier av enten spytt eller urin blir tilsatt. I en foretrukket utforming feks. for policefeltanvendelse er reagensene i tørr form i et kar. Spytt blir tilsatt som oppløser reagensene og resultatet kan leses uten ytterligere bearbeidelse.

De nye rekombinante bindingsproteinene omfatter enhver ligandbindende del av Ml Fab, M2 Fab eller Kl 1 scFv. Med "ligandbindende del" er det ment den del av molekylet som er ansvarlig for bindingen. Små variasjoner eller modifikasjoner av sekvensene fremsatt i beskrivelsen og kravene er fremdeles innenfor oppfinnelsens område forutsatt at de ikke påvirker bindingsaktiviteten til proteinene.

Oppfinnelsen blir illustrert av følgende ikke-begrensende eksempler. Det skal imidlertid forstås at utformingen gitt i beskrivelsen ovenfor og eksemplene er bare for illustrerende hensikter og at forskjellige forandringer og modifikasjoner er mulig innenfor kravenes område.

Eksempel 1

Utvikling av et anti-morfin-antistoff

Immunisering av mus

Fire seks uker gamle hun Balb/c-mus blir immunisert i tre ukers intervaller med morfinkonjugert BSA (Fitzgerald) i Freunds adjuvans. Serumprøvene ble testet etter andre booster og musen som viste den beste responsen mot antigenet i direkte ELISA ble selektert til å bli kilden til antistoff-fag-presentasjonsbiblioteket.

Konstruksjon av antistoff- fag- utvalgsbiblioteket

Alle basiske rekombinante DNA-metoder ble utført essensielt som beskrevet (Sambrook et al., 1990). Musen med den høyeste antistoffresponsen til morfin-BSA-konjugat ble ofret og det totale RNA ble isolert fra miltcellene ved å bruke RNagents<®>total RNA Isolation System (Promega Co., WI, USA). mRNA-samlingen av det totale RNA ble isolert med Oligotex mRNA Kit (QIAGEN Inc., Tyskland). cDNA ble syntetisert fra mRNA med oligo-dT-priming. Genene som koder antistoff Fab-fragment blir amplifisert med PCR ved å bruke antistoff kappa lett kjede og tung kjede variabel region og konstant region spesifikt primere. Antistoff lett kjede PCR-produkter ble oppsamlet og fordøyd med Nhel og Ascl restriksjonsenzymer, renset ved preparerende agarosegeler i kombinasjon med QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Tyskland). Agarosegelrensede antistoff lette kjede DNA ble ligert inn i Fab fagmid-vektor fagemid9 avledet fra pComb3 (Barbas et al., 1991) og transformert inn i E. coli XLl-Blue strain (Stratagene) ved elektroporering. Plasmid DNA ble isolert med QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc., Tyskland) fra natten over kulturen. PCR-produkter som koder Fd-regionen (variable og første konstante region) av den tunge kjeden ble oppsamlet og fordøyd med Sfil og Noti restriksjonsenzymer, renset ved preparerende agarosegelisolering og ligert til fagemidvektoren som inneholder den lette kjede DNA. Fagemidvektoren som koder både tung og lett kjede til Fab-fragmentet blir transformert inn i E. coli TOP10F' bakterie (Invitrogen Inc., CA, USA) ved elektroporering. Transformert bakterie ble inkubert natten over ved +37°C på en risteanordning og plasmid DNA ble isolert med QIAGEN Plasmid Midi Kit. Diversiteten av antistoffbiblioteket blir sikret ved å sekvensere delvis Vl-eller Vn-genregioner av de individuelle kloner.

Et fag-presentasjonsantistoffbibliotek ble fremstilt som følger: 4 \ ig av antistoffbibliotekplasmid DNA ble transformert inn i E. coli TOP10F' ved elektroporering i to parallelle transformasjoner. Etter transformasjoner ble cellene suspendert i 2,8 ml SOC-medium og inkubert i 1 time ved +35°C på en rister. 7 ml av forvarmet (+37°C) SP-medium, ble 20 ug/ml karbensilin og 10 ug/ml tetrasyklin tilsatt. Etter 1 times inkubasjon ved +35°C på en risteanordning, ble 30 ug/ml karbensilin tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 1 time etter hvilken 1 ml (~10u pfu) av hjelpefag VCS-M13 (Stratagene) ble tilsatt og fagene latt infisere bakteriene i 20 min. ved +35°C under langsom risting. De parallelle transformasjoner ble sammenført og 80 ml forvarmet (+ 37°C) SB-medium med 50 ug/ml karbensilin og 10 ug/ml tetrasyklin ble tilsatt. Etter 2 timers inkubasjon ved +35°C på en rister, ble

70 ug/ml kanamycin tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt natten over.

Celler ble sentrifugert i 15 min. ved 4000 g på +4°C. 20 ml av 20 % PEG, 2,5 M NaCl (PEG/NaCl) ble tilsatt supernatanten og den ble inkubert i 30 min. på is. PEG-utfelte fager ble sentrifugert i 20 min. ved 13000 g ved +4°C. Pelletten ble suspendert i 2 ml PBS og 1 ml ble overført i to eppendorfrør. Etter sentrifugering i 5 min. ved +4°C ble fagene utfelt ved å tilsette 200 ul PEG/NaCl til supernatanten. Oppløsningen ble blandet og sentrifugert i 5 min. ved +4°C. Pelletten ble suspendert i 1 ml PBS eller PBS + 1 % BSA. 1 ul av 20 % Na-azid ble tilsatt som preserveringsmiddel. Fag-utvalgsantistoffbiblioteket ble lagret ved +4°C.

Seleksjon av anti- morfinbibliotek

Morfinspesifikke antistoffer ble valgt fra fag-presentasjonsantistoffbiblioteket ved følgende seleksjonsprosedyrer: en mikrotiterbrønn ble belagt natten over ved +4°C med 1 [ ig morfinkonjugert BSA (morfin-BSA; Fitzgerald Industries International, Inc., MA, USA) i 100 ul av 100 mM Na-bikarbonatbuffer, pH 9,8. Brønnen ble vasket to ganger med PBS og blokkert med 1 % BSA i PBS i 1 time ved +37°C. 100 ul av fagbiblioteket ble inkubert i brønnen i 1 time ved RT under risting, ved hvilke de ubundne fagene ble fjernet og brønnen ble vasket 22 ganger med PBS. Bundne fager ble eluert med 100 ul av 100 mM HC1 (pH 2,2) i 15 min. Eluerte fager ble fjernet fra brønnen, nøytralisert med 1 M Tris. 3 ml av fersk E.coli XLI -Blue cells (ODeoo^l) dyrket i SB supplementert med 10 ug/ml tetrasyklin ble infisert med eluerte fager ved +35°C i 15 min. 7 ml av forvarmet SB (+37°C) med 20 ug/ml karbencillin og 10 ug/ml tetrasyklin ble tilsatt og kulturen inkubert i 1 time ved +35°C på en risteanordning. 30 ug/ml av karbencillin ble tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt i 1 time. 1 ml av hjelpefag VCS-M13 ble tilsatt til kulturen og inkubert ved +35°C i 15 min. under langsom risting. Kulturen ble fortynnet med 90 ml forvarmet (+37°C) SB med 50 ug/ml karbencillin og 10 ug/ml tetrasyklin. Etter 2 timers inkubasjon ved +35°C på en rister, ble 70 ug/ml kanamycin tilsatt og inkubasjonen ble fortsatt natten over. Rensing av de amplifiserte fager ble utført ved PEG-utfelling som beskrevet ovenfor.

De rensede fagene ble brukt i videre anrikingsrunder. Etter fire seleksjonsrunder hadde morfinspesifikke antistoffager blitt anriket over 1000 ganger sammenlignet med bakgrunnen. Bakgrunnsbindingen til fagene ble overvåket i parallell i hver seleksjonsrunde ved å inkubere fagbiblioteket i en BSA-belagt mikrotiterbrønn. Brønnen ble vasket og fagene ble eluert som i den morfin-BSA-belagte brønn. Anriking av morfinspesifikke fager ble overvåket ved å sammenligne mengden av eluerte fager fra den morfin-B SA-belagte brønn til mengden av eluerte fager fra bakgrunnsbr ønnen.

Karakterisering av individuelle kloner

Etter den fjerde panningsrunde ble fagemid DNA isolert med QIAGEN Plasmid Midi Kit. Plasmidet ble fordøyt med Nhel og Noti restriksjonsenzymer for å isolere Fab-genfragmentet. Agarosegelisolert DNA ble ligert til ekspresjonsvektoren pKKtac. Ligeringsreaksjonen ble transformert inn i E. coli XLl-Blue celler.

Individuelle kloner ble plukket ut og miniprep DNA ble ekstrahert med QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN Inc., Tyskland). I henhold til sekvensering av miniprepene, ble to forskjellige Fab-kloner funnet. Disse kloner ble kalt Ml og M2. Aminosyresekvensene til Ml Fab-fragmentet var SEKV. ID nr. 1 (lett kjede) og SEKV. ID nr. 2 (tung kjede). Aminosyrer nr. 3-108 representerer den variable regionen og nr. 109-215 den konstante regionen til Ml lett kjede (SEKV. ID nr. 1). Aminosyrer nr. 4-123 representerer den variable regionen og nr. 124-206 den konstante regionen av Ml tung kjede (SEKV. ID nr. 2). Aminosyresekvensene til M2 Fab-fragmentet var SEKV. ID nr. 3 (lett kjede) og SEKV. ID nr. 4 (tung kjede). Aminosyrer nr. 3-108 representerer den variable region og nr. 109-215 den konstante regionen av M2 lett kjede (SEKV. ID nr. 3). Aminosyre nr. 4-123 representerer den variable region og nr. 124-226 den konstante regionen av M2 tung kjede (SEKV. ID nr. 4). Resten av aminosyrene avledes fra kloningsteknikken, og noen av de C-terminale aminosyrene fasiliterer isolering og rensing av proteinet. Fab-ekspresjonskulturer i liten skala (3 ml) ble også fremstilt. Periplasmiske fraksjoner av cellene ble isolert ved frysing og tining av cellene tre ganger i PBS.

Bindingen av individuelle Fab-kloner til morfin ble testet ved ELISA i morfin-BSA-belagte mikrotiterbrønner: Mikrotiterbrønner ble belagt med 200 ng morfin-BSA i 0,1 M Na-bikarbonatbuffer, pH 9,8 natten over ved +4°C. Kontrollbrønner ble fylt med bare bufferen. Etter belegging ble brønnene vasket tre ganger med PBS og blokkert med 0,5 % BSA i PBS (BSA/PBS) i 1 time ved RT. Brønnene ble vasket tre ganger med PBS og 1:10 fortynning av de periplasmiske fraksjoner ble tilsatt brønnene i 100fal av BSA/PBS. Etter 1 times inkubasjon ved RT på en rister, ble brønnene vasket tre ganger med PBS og 1:2000 fortynnet alkalisk fosfatasekonjugert anti-mus Fab spesifikt antistoff (Sigma, A-1293) ble tilsatt i 100 fil av BSA/PBS. Brønnene ble inkubert i 1 time ved RT på en rister og vasket tre ganger med PBS. 100 fil av alkalisk fosfatasesubstratoppløsning (2 mg/ml av p-nitrofenylfosfat di-Na-salt i dietanolamin-MgCl-buffer) ble tilsatt brønnene og absorbansen ble målt. I henhold til preliminære resultater viste Ml Fab bedre yteevne i assayet og ble derfor valgt i fortsettelsen.

Fermentering og rensing

Anti-morfin Fab-fragment Ml i ekspresjonsvektoren pKKtac ble transformert i E. coli ekspresjonsstamme RV308. Fab ble uttrykt med "fed-batch" fermentering i en

Bio-Flow IV fermenter (New Brunswick) og renset med sefarose SP ionebytting og protein G kromatografi (Pharmacia).

Yteevne av det primære antistoffet i et kompetitivt immunoassay

Yteevnen til Ml Fab-fragment ble testet i et kompetitivt ELISA-assay ved å bruke de kommersielle urintoksilogikontrollene Sl og S3 (Bio-Rad). Sl urintoksikologikontroll inneholder legemidler og legemiddelmetabolitter (inkludert morfin) i konsentrasjoner på 20-25 % under immunoassay "cut-off' nivåer som anbefalt av U.S. Substance Abuse and Mental Health Services Administration

(SAMSHA) og andre kontorer. S3 urinteknologikontrollen inneholder legemidler og legemiddelmetabolitter i konsentrasjon tilnærmet tre ganger immunoassay "cut-off nivåer. Mikrotiterbølger ble belagt natten over ved +4°C med 500 ng morfin-BS A i 100 ul av Na-bikarbonatbuffer, pH 9,8. Brønnene ble vasket tre ganger med PBS og blokkert med BSA/PBS i 1 time ved RT. Etter tre vaskinger med PBS ble Sl, S3 (Bio-Rad), positiv kontroll, eller negativ kontroll urinfortynninger tilsatt til brønnene i 100 ul av BSA/PBS tilsatt 1 ng av Ml Fab. Brønner ble inkubert i 2 timer ved RT på en rister og vasket tre ganger med PBS. 1:2000 fortynnet alkalisk fosfatasekonjugert anti-Fab-antistoff (Sigma, A-1293) ble tilsatt brønnene i 100 fxl av BSA/PBS og inkubert i 1 time ved RT på en rister. Brønnene ble vasket tre ganger med PBS, 100 ul alkalisk fosfatasesubstratoppløsning ble tilsatt og A405ble målt. Resultatene er vist i fig. 1. Et positivt resultat kunne oppnås med 1:64 fortynning av prøven.

Utvikling av et anti-immunkompleks antistoff spesifikt til immunkomplekset av Ml Fab og morfin

Seleksjon av immunkompleks spesifikt antistoff fra et naivt humant scFv fag-presentasjonsbibliotek

Ml Fab-fragment ble biotinylert med ImmunoPure Sulfo-NHS-LC-Biotin Kit (Pierce). Biotinylerte antistoff ble renset og buffer ble utvekslet med PBS med Econo-Pac 10DG kolonner (Bio-Rad, CA, USA). 200 ul av et naivt humant scFv fag-upresentasjonsbibliotek (kappe eller lambda lett kjede( i BSA/PBS ble preinkubert med 10 ul av streptavidinbelagte magnetiske kuler (Dynal, M-280) og 0,5 ug av biotinylert Ml Fab natten over ved +4°C. Det naive humane scFv fag-presentasjonsbibliotek ble konstruert fra oppsamlede lymfocytter til 50 friske individer. Størrelsen på biblioteket ble estimert til å være lxl08 kloner. Det naive humane scFv fag-presentasjonsbiblioteket inneholder IgM spesifikke Vn-gener kombinert med enten kappa eller lambda spesifikke VL-gener. Ubundne fager ble adskilt fra kulene og 10 ul av dem ble inkubert med 100 ng morfin, 500 ng biotinylert Ml Fab og 5 ul av streptavidinbelagte magnetiske kuler i 1 time ved RT på en rister. Bakgrunnen for seleksjonsprosedyren var implementert på en lignende måte, men ved å unngå morfinet fra bindingsreaksjonen. Magnetiske kuler ble vasket 5 ganger med 0,5 ml PBS og bundne fager ble eluert med 100 ul HC1 (pH 2,2) i 30 min. De eluerte fager ble nøytralisert med 1 M Tris og E. coli XLI -Blue cells ble infiserte. Celler ble dyrket og fagene ble renset som beskrevet tidligere. Etter 5 panningsrunder ble anriking sett med scFv-biblioteket som har kappa lette kjeder, når mengden av eluerte fager ble sammenlignet med mengden av eluerte fager fra bakgrunnskontrollbrønnen. Anrikingen av spesifikke bindere til immunkomplekset, dannet av Ml Fab og morfin var også klart sett i et fag ELISA når de eluerte fag-oppsamlingene fra seleksjonsrundene ble testet.

Karakterisering av individuelle kloner

Individuelle fag-kloner ble plukket og sekvensert. Alle klonene hadde den samme sekvens (SEKV. ID nr. 5). Aminosyresekvensen til anti-Ml + morfinimmunkompleks scFv-fragment ble kalt Kil scFv. Aminosyrer nr. 3-120 representerer den variable regionen i den tunge kjeden, nr. 140-246 representerer den variable regionen i den lette kjede, og nr. 121 -139 representerer koblingen til Kl 1 scFv (SEKV. ID nr. 5). Resten av aminosyrene avledes fra kloningsteknikker, og noen av de C-terminale aminosyrene fasiliterer isolering og rensing av proteinet.

Ekspresjon og rensing

Genet som koder scFv-fragmentet Kil ble innskutt i ekspresjonsvektor pKKtac og transformert inn i E. coli RV308-stammen. Celler ble innokkulert i 20 ml av LB med 100 ug/ml ampicillin og ble inkubert natten over ved +37°C på en rister. Fra natten over kulturen ble en 10 ml innokkulat tilsatt i 2 erlenmeyerflasker som inneholdt 500 ml LB med 100 ug/ml ampicillin. Cellene ble inkubert ved +37°C på en rister inntil OD600var 1 etter hvilke 0,5 ml av IM IPTG og 100 ug/ml ampicillin ble tilsatt i kulturen og inkubasjonen ble fortsatt natten over ved +30°C på en ristemaskin. Både supernatanten i kulturmediet og den periplasmatiske fraksjon av cellene ble brukt for rensing av Kl 1 scFv. Celler ble sentrifugert ved 4000 g i 15 min. og supernatanten ble helt i en ren flaske. Cellene ble resuspendert i 20 ml PBS. Den periplasmatiske fraksjon av cellene ble isolert ved frysing (-70°C) og tining (+37°C) av cellene tre ganger. Etter sentrifugering ved 12000 g i 30 min. ble den klare periplasmatiske supernatant tatt. Kulturmediet og den periplasmatiske fraksjon ble behandlet med 2 mg/ml av DNasel for å fjerne restkromosomalt DNA i 2 timer ved +37°C. Siden den uttrykte Kl 1 scFv har et 6xHis-merke på sin C-terminus kunne den renses ved immobilisert metall affinisert kromatografi (IMAC). Kl 1 scFv ble renset ved ekspandert seng kromatografi ved å bruke STREAMLINE Chelating (Amershampharmacia biotech) som en matriks og kopper som metallgelatet. Renheten til Kl 1 scFv ble kontrollert med SDS-PAGE.

Utvikling av et ikke-kompetitivt immunoassay for morfin

Merking av antiimmunkompleks- antistoff Kil scFv med europium Den rensede anti-Ml og morfinimmunkompleks scFv-fragment Kl 1 ble merket med europiumgelat ved DELFIA Eu-Labelling Kit (Wallac) som beskrevet av fabrikkanten. Buffer til den merkede Kl 1 scFv ble forandret til 50 mM Tris pH 7,8, 0,9 % NaCl. Merkingsutbyttet var 0,4 Eu/scFv.

Et ikke- kompetitivt immunoassay for morfin

Sensitiviteten og kryssreaktiviteten til Kil scFv ble undersøkt av et ikke-kompetitivt immunoassay. Transparente Streptawell (Roche) streptavidinbelagte mikrotiterbrønner ble vasket tre ganger med PBS. 500 ng biotinylert anti-morfin Ml Fab ble tilsatt brønnene i 100 ul av BSA/PBS og brønnene ble inkubert i 30 min. ved RT på en rister. Etter tre PBS-vasker ble prøvefortynninger tilsatt morfin, amfetamin, tetrahydrokanabinol (THC) eller Sl urinkontroll tilsatt i brønnene i 50 ul av BSA/PBS. 1:100 fortynnet europium merket Kl 1 scFv ble tilsatt i brønnene i 50 ul av BSA/PBS og inkubasjonen ble fortsatt i 1 time. Brønnene ble vasket tre ganger med PBS og 100 ul Enhancement-oppløsning (Wallac) ble tilsatt i brønnene. Etter 15 min. risting ved RT ble fluorescens detektert av VictorV-fluorometer (Wallac). Resultatene er vist i fig. 2. Det er en signifikant forskjell i affinitet mellom binding av Kl 1 scFv til primære antistoffragment Ml og til det Ml og morfin-immunkomplekset. Dette tillater deteksjon av 1 ng/ml morfin i en prøve. Ingen krossreaktivitet med amfetamin eller THC ble detektert.

Et homogent tidsoppløst fluorescensresonansenergioverføring ( TR- FRET) Anti-morfin Fab-fragment Ml ble merket med europium ved LANCE Eu-W1024 ITC chelate Kit (Wallac). Bufferen til det merkede Ml ble forandret til 50 mM Tris, pH 7,8, 0,9 % NaCl. Merkingsutbyttet var 1,1 Eu/Fab. Anti-Ml + morfinimmunkompleks scFv-fragmentet Kl 1 scFv ble merket med Cy5 ved FluoroLink-ab Cy5 labelling kit (Amershampharmacia biotech). Utbyttet av merkingen var 2 Cy5/scFv.

Spytt ble tilsatt forskjellige fortynninger av morfin og disse prøvene ble filtrert gjennom bomull før tilsetting i de sorte mikrotiterbrønnene (Nunc). 1 \ ig europium merket Ml Fab og 1 \ ig av Cy5 merket Kl 1 scFv ble tilsatt brønnene i 50 ul av BSA/PBS. TR-FRET ble lest etter 5, 15, 30 eller 60 min. inkubasjon ved RT med VictorV-fluorometer (Wallac). Resultatene er vist i fig. 3. Etter fem min. inkubasjon ble 1 ng/ml morfin i spytt oppdaget.

Mens én strategi for å tilveiebringe reagenser og assayer i henhold til oppfinnelsen er blitt beskrevet vil tallrike variasjoner og modifikasjoner være klart for en person med kunnskap på området.

Eksempel 2

Kryssreaktivitet av Ml Fab-fragment med kodein, heroin, noskapin og papaverin

Kryssreaktivitet av Ml anti-morfin Fab-fragment med kodein, heroin, noskapin og papaverin ble testet i et kompetitivt ELISA. Mikrotiterplatebrønner ble belagt o/n ved +4°C med 500 ng morfin-BSA i 100 (j,l av natriumbikarbonatbuffer, pH 9,8. Brønnene ble vasket tre ganger med PBS og blokkert med 0,5 % BSA/PBS i 1 time ved RT og vasket igjen tre ganger med PBS. To parallelle 100 ul prøver som inneholder morfin, kodein, heroin, naskapin eller papaverin (39, 78, 156, 313, 625, 1250, 2500 eller 5000 ng/ml) i PBS med 5 ng av renset Ml Fab ble tilsatt i brønnene og inkubert i 30 min. ved RT på en rister og vasket tre ganger med PBS. 1:2000 fortynnet alkalisk fosfatasekonjugert anti-Fab-antistoff (Sigma, A-1293) ble tilsatt brønnene i 100 ul av 0,5 % BSA/PBS og inkubert i 30 min. ved RT på en rister. Brønnene ble vasket tre ganger med PBS, 100 ul av alkalisk fosfatasesubstratoppløsning ble tilsatt og A405ble målt. Resultatene er vist i fig. 4.1 henhold til det kompetitive ELIS A-resultatet har Ml antistoff høy kryssreaktivitet til kodein og heroin, som er strukturelt meget like morfin.

Et homogent tidsoppløsende fluorescensresonansenergioverførings (TR-FRET) immunoassay for morfin

Anti-morfin Fab-fragment Ml ble merket med europium ved hjelp av LANCE Eu-W1024 ITC-gelatsett (Wallac). Bufferen til det merkede Ml ble forandret til 50 mM Tris, pH 7,8, 0,9 % NaCl. Merkingsutbyttet var 1,1 Eu/Fab. Anti-Ml + morfin immunkompleks scFv-fragment Kil ble merket med Cy5 ved FluoroLink-Ab Cy5 merkingssett (Amersham Pharmacia Biotech). Merkingsutbyttet var 2 Cy5/scFv.

Spytt ble forsterket med en høy konsentrasjon (10 ug/ml) av følgende legemidler: morfin, heroin, kodein, papaverin og noskapin. Prøvene ble filtrert gjennom bomull før tilsetting i sorte mikrotiterbrønner (Nunc). 1 \ ig av europium-merket Ml Fab og 1 ug av Cy5-merket Kl 1 scFv ble tilsatt i brønnene i 50 ul av BSA/PBS. Som kontroll ble bakgrunnsfluorescensen fra Ml og Kl 1 antistoffpar uten noe tilsatt legemiddel målt. TR-FRET ble lest etter 5 min. inkubasjon ved RT med VictorV fluorometer (Wallac). Resultatene er vist i fig. 5.

Spyttprøven forsterket med morfin gir en høy fluorescerende verdi, mens de andre legemidlene gir fluorescerende verdier som er lik bakgrunnsfluorescensen detektert fra kontrollen (merket Ml og Kl 1 scFv-fragmenter uten tilsatt legemiddel). Kl 1 scFv binder immunkomplekset dannet mellom Ml og morfin med ekstremt høy spesifisitet. Kil er i stand til å diskriminere fullstendig Ml og morfinimmunkompleks fra immunkompleksene mellom Ml og heroin eller Ml og kodein, som ga fluorescensverdier som tilsvarer bakgrunnsnivået.

Referanser

Barbas, CF, NI, Kang, AS., Lemer, RA, Bentovic, SJ. (1991) Assembly of combinatonal antibody ilbraries on phage surfaces: the gene 111 sfte. Proe. Nati. Acaci. Sd. USA 88:7978-7982.

Hemmilå, I., Malminen, O., Mflcofa, H., Lovgren, T. (1988) Homogeneotis time-resoived fluoroimmunoassay of thyroxin in serum. Ctin. Chem. 34:2320-2322.

Hoogenboom H.R., de Bntfne, A.P., Hufton»S.E.rHoet, R.M., Arends, J.-W.,

and Roovers, R.C. (1998) Review articte: Antibody phage display tech-nology and Its application». Immunotechnofogy 4,1-20.

Kobayashi, N., Oiwa, H., Kubota, KL, Sakoda, S„ Goto, J. (2000) Monodonai antibodfes generated against an affinfty-JabeJed immune complex of an antJ-btle add metabolite antibody: an approach to noncompetrtive hapten immunoassays based on anti-idiotype or anti-metatype antibodies. J Immunol Methods, 245,95-108.

Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Contlnuous cultures of fijsed cefis secreting

antibody of predefmed spedficlty. Nature, 256,495-7.

Mares, A., De Boever, J., Osher, J.. Quiroga, &., Barnard, G. and Kohen, F.

(1995) A direct non-competitive idiometric enzyma immunoassay for serum oestradbt. J Immunol Methods, 181, 83-90.

Maruyama, H„ Speriagh, M., Zaloudik, J., Liang, S., Mlzukf, K., Mofthoff, C,

and Herlyn, D. (2002) Immunteation procedures for anti-fdiotypic antibody induction in mlce and rats, J ImtnunalMethods, 264,121.

Sambrook, J., FriEsch, E.F., and Maniatis, T. (1990) Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Coid Spring Korbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Seif, C.H., Dessi, J.L. and Winger, LA (1994) Hlgrv^erfbrmance assays of small molectiles: enhanced sensftfvity, rapidity, and convenience dem-onstrated with a noncompetitive immunometric anti-immune complex assay system for digoxin, Ctin Chem, 40,2035-41.

Suzuki, C, Ueda, H.( Mahoney, W. and Nagamune, T. (2000) Open sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of small haptens. AnalBhchem, 286,238-46.

Suzuki, C, Ueda, H„ Tsumoto, K., Mahoney, W.C., Kumagai, t. and Nagamune, T. (1999) Open sandwich EUSA wtth V(H>-A/(LHikalme phos-phatasø fusion proteins. J Immunol Methods, 224,171-84.

Szollosl, J., Damjanovich, S., Måtyua, L {1998) Application of FluoreBcen<c>e Resonance Energy Transfer in me Cilnical Laboratory: Rautine and Re-aaarch. Communications ln Clinicsl Cytometry, 34:159-179.

Towbin, H., Mbfe, J., OroszJan, R and Zin<g>eLO. (1995) Sandwich immunoassay for fhe hapten angiotensin il. A novel assay princlple based on antibodies against immune complexes. J Immunol Methods, 181,167-76. Ueda, H., Tsumoto, K., Kubota. K„ Suzuki, E., Nagamune, T., Nishimura, R,

Schueier, PA, Winter. G., Kumagai, I. and Mohoney, W.C. (1996) Open sandwich ELISA: e novel immunoassay based on the interchain

interactlon of antibody variable region. NstBbtechnol, 14,1714-8.

Ullman, BF., MUburn, G., Jeiesko, J., Radika, K., PJrlo, M., Kernpe, T. and Skold, C. (1993) Anti-»mmune complex antibodfes enhance atHnity and

speciflcity of primary antibodies. Proe Nstl Acad Sti U S A, BO, 1184-6. YoteozekL T.. Ueda, H., Arai, R., Manoney, W. and Nagamune, T. (2002) A

homogeneous noncompetitive Immunoassay tor the detecfion of smal! haptens. Aml Chem, 74,2500-4.

Claims (13)

1. Ikke-kompetitiv immunoassay for liten analytt på mindre enn 5000 Da, omfattende å omsette en prøve som inneholder nevnte analytt med et reagenspar som omfatter en første bindingspartner som binder til nevnte analytt og en andre bindingspartner som binder til komplekset av nevnte analytt og nevnte første bindingspartner, og å bestemme bindingen til den andre bindingspartner for således å angi nærvær av analytten i prøven,karakterisert vedat nevnte andre bindingspartner oppnås fra et naivt presentasjonsrekombinant bindingspartnersbibliotek ved å selektere en bindingspartner som binder til nevnte kompleks mellom analytten og første bindingspartner.

2. Assay som angitt i krav 1, karakterisert vedat den første og andre bindingspartner er valgt fra antistoffragmenter Fab og scFv.

3. Assay som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert vedat det er et homogent assay.

4. Assay som angitt i krav 3, karakterisert vedat det er basert på fluorescensresonansenergioverføring (FRET).

5. Assay som angitt i ethvert av de foregående krav, karakterisert vedat analytten er et misbrukslegemiddel.

6. Assay som angitt i krav 5, karakterisert vedat analytten er morfin, tetrahydrokanabinol (THC) eller amfetamin.

7. Assay som angitt i krav 1,karakterisert vedat den andre bindingspartneren omfatter en ligandbindende del av Kl 1 scFv omfattende SEKV. ID nr. 5.

8. Assay som angitt i krav 1 eller 7,karakterisert vedat den første bindingspartneren omfatter en ligandbindende del av Ml Fab som omfatter SEKV. ID nr. 1 og SEKV. ID nr. 2, eller av M2 Fab som omfatter SEKV. ID nr. 3 og SEKV. ID nr. 4.

9. Assay som angitt i krav 8,karakterisert vedat den ligandbindende delen til den første bindingspartneren er dannet av aminosyrene nr.

3-108 i SEKV. ID nr. 1 og aminosyrer nr. 4-123 i SEKV. ID nr. 2; eller av aminosyre nr. 3-108 i SEKV. ID nr. 3 og aminosyre nr. 4-123 i SEKV. ID nr. 4; og at den ligandbindende delen til den andre bindingspartneren er dannet av aminosyre nr. 3-120 og nr. 140-246 i SEKV. ID nr. 5.

10. Fremgangsmåte for å fremstille et reagenspar for et ikke-kompetitivt immunoassay for en liten analytt på mindre enn 5000 Da, omfattende å tilveiebringe en første bindingspartner som bindes til nevnte analytt, og en andre bindingspartner som bindes til komplekset mellom nevnte analytt og nevnte første bindingspartner,karakterisert vedat nevnte andre bindingspartner er oppnådd fra et naivt presentasjonsrekombinant bindingspartnerbibliotek ved å selektere en bindingspartner som binder til nevnte kompleks mellom analytten og første bindingspartner.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert vedat de rekombinante antistoffragmentene er fremstilt fra et fag-utvalgsbibliotek.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert vedat den første bindingspartneren uten liganden blir brukt som en kontraseleksjon for å selektere en andre bindingspartner som gjenkjenner immunkomplekser men ikke fri bindingspartner og fri analytt.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 11,karakterisert vedat presentasjonsfagene først blir preinkubert med bundet første bindingspartner omfattende en ligandbindende del av Ml Fab omfattende SEKV. ID nr. 1 og SEKV. ID nr. 2 for å sortere ut de som binder til den første bindingspartneren som sådan, hvoretter ikke-bundede fag blir separert og inkubert med en blanding av morfin og immobilisert første bindingspartner for å selektere fag som binder til immunkomplekset dannet mellom den immobiliserte første bindingspartneren og morfin, men ikke til den første bindingspartneren som sådan.