NO333522B1

NO333522B1 - Anvendelse av 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid ved terapeutisk behandling

Info

Publication number: NO333522B1
Application number: NO20033546A
Authority: NO
Inventors: Armin Walser; Hartmut Strobel; Alena Safarova; Paulus Wohlfart; Teri Suzuki; Ramalinga M Dharanipragada
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2013-07-01
Also published as: MXPA03006841A; CA2437966A1; IL157208A0; CY1106278T1; IL157208A; US7202278B2; US6617359B2; CA2437966C; CN1496264A; BR0207178A; DE60215919T2; TWI241190B; NZ527469A; ATE344669T1; US20040019114A1; HUP0302845A3; PE20020884A1; ZA200305412B; HUP0302845A2; EP1361882A1

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid med formel (I) og dets anvendelse som legemiddel. Forbindelse (I) kan anvendes ved terapi og profylakse av kardiovaskulære sykdommer slik som stabil og ustabil angina pectoris, Prinzmetal angina (spasmer), akutt koronart syndrom, hjertesvikt, myokardialt infarkt, slag, trombose, perifer arterieokklusiv sykdom (PAOD), aterosklerose, restenose, endotelskade etter PTCA, vesentlig hypertensjon, lungehypertensjon, sekundær hypertensjon, renovaskulær kronisk glomerulonferitt, erektil dysfunksjon, ventrikkelarytmi, og ved reduksjon av kardiovaskulær risiko hos kvinner etter menopause og etter inntak av prevensjonsmidler, og ved terapi og profylakse av diabetes og diabeteskomplikasjoner (nefropati, retinopati), angiogenese, astmabronkial, kronisk nyresvikt, skrumplever, begrenset hukommelsesevne eller en begrenset læringsevne.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører anvendelse av 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid med formel (I)

til fremstilling av et medikament for behandling av diverse sykdommer og forstyrrelser.

Endotelial NO syntase (eNOS, NOS-III) tilhører en gruppe av tre isoenzymer som produserer nitrogenoksid (NO) ved oksidasjon av arginin. Endotelialt frigitt NO er sentralt i et antall nøkkelkardiovaskulære mekanismer. Det har en utvidende effekt på blodkarene og hemmer aggregeringen av blodplater, adhesjon av leukocytter til endotelet og proliferasjonen av leukocytter til endotelet og proliferasjonen av intimale glatte muskelceller.

Endotelial NO syntase utsettes for fysiologisk og patofysiologisk regulering både på det transkripsjonene og på det post-transkripsjonelle nivået. Enzym som allerede foreligger i endotelet kan gjennomgå kalsiumavhengig og kalsiumuavhengig aktivering gjennom fosforylering av spesifikke aminosyrer, men også ved direkte interaksjoner med spesifikke proteiner. Stimulatorer av disse, vanligvis forbigående, NO frigivelse er ekstracellulært arginin, 17|3-østrogen og de mekaniske stimulus som utøves på den luminale overflaten av endotelet med blodstrømmen (skjærkrefter). Det sistnevnte fører i tillegg til regulering av eNOS på det transkripsjonene nivået. Således var for eksempel Sessa med flere (Circ. Research 74 (19949 349-353) i stand til å oppnå en merkbar økning i ecNOS ved hjelp av trening og økningen i skjærkreftene forbundet med dette.

Om regulering på det post-transkripsjonelle nivået er relevant in vivo, er ikke entydig bevist. Således etterfølges for eksempel administrering av en høy arginindose med kun en forbigående forbedring i den endotelavhengige vasorelaksasjonen hos pasienter med koronar hjertesykdom.

På den annen side er signifikansen av oppreguleringen av eNOS-proteinet vitenskapelig akseptert. Således finnes det resultater som viser at de beskyttende egenskapene ved HMB-CoA-reduktaseinhibitoren simvastatin kan, foruten lipidsenkingen, også delvis tilskrives en økning i eNOS-uttrykking in vivo (Endres et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95 (1998) 8880-8885). Det er i tillegg kjent at enkeltpunktmutasjoner i 5'-sideregionen av eNOS-genet ("eNOS promotor"), og reduksjon i hastigheten av eNOS-gentranskripsjonen forbundet med dette, i den japanske befolkningen er forbundet med en økning i risikoen for koronare spasmer (Nakayama et al, Circulation 99 (1999) 2864-2870).

Den gjeldende antagelsen for dette er at de transkripsjonene og post-transkripsjonelle mekanismene for eNOS-regulering er alvorlig forstyrret ved et stort antall sykdommer, spesielt ved kardiovaskulære sykdommer. Selv ved svært tidlige stadier i et bredt mangfold av kardiovaskulære sykdommer, er det mulig for en dysfunksjon av denne typen i endotellaget til blodkarene å føre til et underskudd av bioaktivt NO, hvilket man manifesterer som sykdomsprogresjoner i form av målbare patofysiologiske og morfologiske endringer. Således fremskyndes kritiske trinn ved tidligere aterogeneser ved en reduksjon i endotelial NO-frigivelse, slik som for eksempel oksidasjonen av lavtetthetslipoproteiner, rekrutteringen og avsetningen av monocytter i intimallaget av blodkaret, og proliferasjon av intimalceller. En konsekvens av aterogenese er dannelsen av plakk på innsiden av blodkarene, som i sin tur, via en reduksjon i skjærkreftene, fører til en videre reduksjon i endotelial NO-frigivelse og en ytterligere forringelse ved patologien. Siden endotelialt NO også er et middel for å utvide blodkar, fører en reduksjon derav ofte til hypertensjon, hvilket kan, som en uavhengig risikofaktor, forårsake ytterligere organskade.

Formålet ved en terapeutisk tilnærming for behandling av disse sykdommene må følgelig være å bryte denne kjeden av hendelser ved å øke den endoteliale NO-uttrykkingen. Genoverføringseksperimenter som in vitro fører til overuttrykkelse av NO-syntase i tidligere skadede kar, er faktisk i stand til å motvirke de beskrevne prosessene og er således bevis på dyktigheten av denne tilnærmingen Varenne et al., Hum. Gene Ther. 11 (2000) 3129).

Noen lavmolekylvektforbindelser som, i cellekulturer, kan føre til en direkte effekt på eNOS-transkripsjon og uttrykkelse, er beskrevet i litteraturen. Statinene som allerede er nevnt, er imidlertid de eneste substansene som frem til i dag har vært mulig å vise en slik økning i eNOS for in vivo som en bivirkning. I lys av det kjente området av bivirkninger av denne klassen av substanser, er det imidlertid uklart hvor omfattende denne effekten er tilstede i en toksikologisk uproblematisk dose.

Liao med flere beskriver i WO 99/47153 og WO 00/03746 anvendelse av rhoGTPase-inhibitorer og midler som påvirker organiseringen av aktincytoskjelettet for å øke eNOS i endotelialceller og for terapi av forskjellige sykdommer slik som for eksempel slag eller lungehypertensjon, uten imidlertid å indikere en spesifikk måte for å oppnå dette.

Således eksisterer det et sterkt behov for et medikament som oppregulerer eNOS-uttrykkelsen hos endotelialceller. Formålet ved den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbindelse som viser denne evnen.

Dette formålet oppnås ved anvendelse av 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid med formel (I)

til fremstilling av et medikament for behandling av stabil eller ustabil angina pectoris, koronar hjertesykdom, Prinzmetal angina, akutt koronart syndrom, hjertesvikt, myokardialt infarkt, trombose, perifer arterieokklusiv sykdom, aterosklerose, restenose, endotelskade etter PTCA, hypertensjon, vesentlig hypertensjon, lungehypertensjon, sekundær hypertensjon, renovaskulær hypertensjon, kronisk glomerulonferitt, erektil dysfunksjon, ventrikkelarytmi, diabetes, nefropati, retinopati, angiogenese, astmabronkial, kronisk nyresvikt, skrumplever eller osteoporose, eller for reduksjon av kardiovaskulær risiko hos kvinner etter menopause eller etter inntak av prevensjonsmidler.

Anvendelse av alle solvater av forbindelsen med formel (I), for eksempel hydrater, adukter med alkoholer, aktive metabolitter av forbindelsen med formel (I), og også derivater og prodrugs av forbindelsen med formel (I) som inneholder fysiologisk tolererbare og spaltbare grupper, for eksempel estere, amider og forbindelser der N-H gruppen som er vist i formel (I) erstattes med en N-alkylgruppe, slik som N-metyl, eller med en N-acylgruppe, slik som N-acetyl eller N-argininyl, inkludert farmasøytisk akseptable salter dannet på funksjonelle grupper som er tilstede i N-acylgruppen, kan tenkes.

WO 00/51970 beskriver fremstillingen og anvendelsen av 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid som et medikament. Forbindelsen har sterk innflytelse på den kolinergiske aktiviteten, og er nyttig ved behandling og/eller forebygging av forstyrrelser i sentralnervesystemet hos pattedyr, og mer spesielt for hukommelsestap, demens, for eksempel senildemens, Alzheimers demens, demens forbundet med forskjellige sykdommer slik som cerebral vaskulær demens, cerebral post-traumatisk demens, demens på grunn av hjernesvulst, demens på grunn av kronisk subdural hematom, demens forårsaket av normalt trykk hydrocefalus, post-meningittdemens, Parkinsons sykdom type demens, og lignende. Forbindelsen forventes å være nyttig som terapeutisk og/eller forebyggende middel mot schizofreni, depresjon, slag, hodeskade, ved avslutning av nikotinbruk, ryggmargsskade, angst, pollakiuria, urininkontinens, myotondystrofi, oppmerksomhetsunderskuddshyperaktiv forstyrrelse (ADHD) overdreven tretthet på dagtid (narkolepsi), Parkinsons sykdom eller autisme.

WO 00/51970 verken beskriver eller antyder anvendelse av 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid for oppregulering av uttrykkelsen av endotelial NO-syntase i særdeleshet i behandling av kardiovaskulære sykdommer, stabil eller ustabil angina pectoris, koronar hjertesykdom, Prinzmetal angina, akutt koronart syndrom, hjertesvikt, myokardialt infarkt, slag, trombose, perifer arterieokklusiv sykdom, endotelial dysfunksjon, aterosklerose, restenose, endotelskade etter PTCA, hypertensjon, vesentlig hypertensjon, lungehypertensjon, sekundær hypertensjon, renovaskulær hypertensjon, kronisk glomerulonfritt, erektil dysfunksjon, ventrikkel arytmi, diabetes eller diabeteskomplikasjoner, nefropati, retinopati, angiogenese, astmabronkial, kronisk nyresvikt, skrumplever, osteoporose, begrenset hukommelsesevne og begrenset læringsevne, eller reduksjon av kardiovaskulær risiko hos kvinner etter menopause eller etter inntak av prevensjonsmidler.

Forbindelsen med formel (I) kan fremstilles fra 2-indanylamin som er kjent fra litteraturen. 2-indanylamin kan reageres, i form av fri base eller salt derav, med 4-fluorbenzoylklorid i nærvær av en base som for eksempel trietylamin. Reaksjonen utføres generelt i et løsningsmiddel så som diklormetan, tetrahydrofuran, toluen eller dioksan, og fortrinnsvis ved romtemperatur. Alternativt oppnås forbindelsen med formel (I) ved en koblingsreaksjon av det nevnte 2-indanylaminet med 4-fluorbenzosyre, i nærvær av en base så som for eksempel diisopropyletylamin, og anvendelse av et passende koblingsreagens så som for eksempel karbodiimider, HATU eller TOTU.

Videre reaksjoner for syntese av forbindelsen med formel (I) er åpenbare eller velkjente for en fagmann på området og kan utføres ved standard betingelser i henhold til eller analogt med prosedyrer som er beskrevet i litteraturen, for eksempel i Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie (Methods of Organic Chemistry), Thieme-Verlag, Stuttgart eller Organic Reactions, John Wiley & Sons, New York. Om ønskelig kan forbindelsen med formel (I) renses ved vanlige renseprosedyrer, for eksempel ved omkrystallisering eller kromatografi. Utgangsforbindelsene for fremstillingen av forbindelsen med formel (I) er kommersielt tilgjengelige eller kan fremstilles ifølge eller analogt med prosedyrer som er kjent fra litteraturen.

Forbindelsen med formel (I) kan benyttes for å oppregulere uttrykkelsen av den endoteliale NO-syntasen og er en nyttig farmasøytisk forbindelse ved behandling av forskjellige sykdommer. I sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen inkluderer behandling terapi så vel som profylakse av de respektive sykdommene.

Eksempler på sykdommer som kan behandles med forbindelsen (I) ifølge den foreliggende oppfinnelsen, inkluderer stabil og ustabil angina pectoris, koronar hjertesvikt, Prinzmetal angina (spasm), akutt koronar syndrom, hjertesvikt, myokardialt infarkt, slag, trombose, perifer arterieokklusiv sykdom (PAOD), aterosklerose, restenose, endotelskade etter PTCA, hypertensjon, inkludert vesentlig hypertensjon, lungehypertensjon og sekundær hypertensjon (renovaskulær hypertensjon, kronisk glomerulonefritt), erektil dysfunksjon, ventrikkelarytmi og nedgangen av kardiovaskulær risiko hos kvinner etter menopause eller etter inntak av prevensjonsmiddel.

Forbindelse (I) kan i tillegg anvendes ved terapi og profylakse av diabetes, nefropati, retinopati, angiogenese, astmabronkial, kronisk nyresvikt, skrumplever og osteoporose.

Foretrukne indikasjoner er stabil angina pectoris, koronar hjertesvikt, hypertensjon, endotelial dysfunksjon og aterosklerose.

Forbindelsen med formel (I) kan også benyttes i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive forbindelser, fortrinnsvis forbindelser som er i stand til å øke effekten av forbindelsen med formel (I). Eksempler på slike forbindelser inkluderer: statiner; ACE-inhibitorer; ATI-antagonister; argininase-inhibitorer; PDE V-inhibitorer; Ca-antagonister; alfablokkere; betablokkere; metimazol og analoge forbindelser; arginin; tetrahydrobiopterin; vitaminer, i særdeleshet vitamin C og vitamin B6; niacin. Forbindelsen (I), eventuelt i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive forbindelser, kan administreres til dyr, fortrinnsvis til pattedyr, og i særdeleshet til mennesker, som legemiddel i seg selv, eller i form av farmasøytiske preparater. De farmasøytiske preparatene (eller farmasøytiske sammensetninger) omfatter en effektiv dose av forbindelsen med formel (I) og en farmasøytisk akseptabel bærer, dvs. en eller flere farmasøytisk akseptable bærersubstanser og/eller additiver. Det nevnte farmasøytiske preparatet benyttes for å stimulere uttrykkelsen av endotelial endosyntase og i særdeleshet som et medikament for terapi og profylakse av de ovennevnte syndromene.

Medikamentet som fremstilles kan administreres oralt, for eksempel i form av piller,

tabletter, lakkerte tabletter, sukkerbelagte tabletter, granuler, harde og myke gelatinkapsler, vandige, alkoholiske eller oljeaktige løsninger, siruper, emulsjoner eller suspensjoner, eller rektalt, for eksempel i form av stikkpiller. Administrering kan også utføres parenteralt, for eksempel subkutant, intramuskulært eller intravenøst i form av løsninger for injeksjon eller infusjon. Andre egnede administreringsformer er for eksempel perkutan eller topisk administrering, for eksempel i form av salver, tinkturer, sprayer eller transdermale terapeutiske systemer, eller inhaleringsadministrering i form av nesesprayer eller aerosolblandinger, eller for eksempel mikrokapsler, implantater eller staver. Den foretrukne administreringsformen avhenger for eksempel av sykdommen som skal behandles og dens alvorlighet.

Mengden av forbindelsen (I) i de farmasøytiske preparatene strekker seg normalt fra 0,2 til 800 mg, fortrinnsvis fra 0,5 til 500 mg, spesielt fra 1 til 200 mg, pr. dose, men avhengig av type av det farmasøytiske preparatet kan den også være høyere. De farmasøytiske preparatene omfatter vanligvis 0,5 til 90 vekt-% av forbindelsen med formel (I). Fremstillingen av de farmasøytiske preparatene kan utføres på en måte som er kjent per se. I dette henseende bringes forbindelsen med formel (I), sammen med en eller flere faste eller flytende farmasøytisk værende substanser og/eller additiver (eller hjelpesubstanser) og, om ønskelig, i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive forbindelser med terapeutisk eller profylaktisk virkning, til en egnet administreringsform eller doseringsform som så kan benyttes som et legemiddel i human- eller veterinærmedisin.

For fremstilling av piller, tabletter, sukkerbelagte tabletter og harde gelatinkapsler er det mulig å benytte for eksempel laktose, stivelse, for eksempel maisstivelse, eller stivelsesderivater, talkum, stearinsyre eller dets salter, etc.. Bærere for myke gelatinkapsler og stikkpiller er for eksempel fett, voks, halvfaste og flytende polyoler, naturlige eller herdede oljer, etc.. Egnede bærere til fremstilling av løsninger, for eksempel løsninger for injeksjon, eller emulsjoner eller siruper er for eksempel vann, fysiologisk natriumkloridløsning, alkoholer slik som etanol, glycerol, polyoler, sukrose, invertert sukker, glukose, mannitol, vegetabilske oljer, etc. Det er også mulig å lyofllisere forbindelsen med formel (I) og å anvende de oppnådde lyofilisatene, for eksempel for å fremstille preparater for injeksjon eller infusjon. Egnede bærere for mikrokapsler, implantater og staver er for eksempel kopolymerer av glykonsyre og melkesyre.

Foruten forbindelse (I) og bærere, kan de farmasøytiske preparatene også inneholde additiver, for eksempel fyllstoffer, desintegreringsmidler, bindemidler, smøremidler, fuktemidler, stabilisatorer, emulgatorer, dispersjonsmidler, konserveringsmidler, søtningsmidler, fargestoffer, smaksstoffer, aromastoffer, tykningsmidler, fortynningsmidler, buffersubstanser, løsningsmidler, oppløsende midler, midler for å oppnå en depoteffekt, salter for å endre det osmotiske trykket, beleggingsmidler eller antioksidanter.

Doseringen av forbindelsen med formel (I) som skal administreres avhenger av det individuelle tilfellet og må, hvilket er vanlig, tilpasses til de individuelle forholdene for å oppnå en optimal effekt. Således avhenger det av naturen og alvorligheten av sykdommen som skal behandles, og også av kjønn, alder, vekt og individuell mottakelighet hos mennesket eller dyret som skal behandles, av virkningsvarigheten til forbindelse (I), av om terapien er akutt eller kronisk eller profylaktisk, eller av om andre aktive forbindelser administreres i tillegg til forbindelsen med formel (I). Generelt er en daglig dose på tilnærmet 0,01 til 100 mg/kg, fortrinnsvis 0,1 til 10 mg/kg, særlig 0,3 til 5 mg/kg (i hvert tilfelle mg pr. kg kroppsvekt) passende for administrering til en voksen som veier tilnærmet 75 kg for å oppnå de ønskede resultatene. Den daglige dosen kan administreres i en enkelt dose eller, særlig når større doser administreres, bli oppdelt i flere, for eksempel 2, 3 eller 4 individuelle doser. I noen tilfeller, avhengig av den individuelle responsen, kan det være nødvendig å avvike oppover eller nedover fra den angitte daglige dosen.

Forbindelsen med formel (I) kan også benyttes for andre formål enn de som er angitt i det foregående. Ikke-begrensende eksempler som inkluderer diagnostiske formål, anvendelse som biokjemiske verktøy, og som mellomprodukter for fremstilling av ytterligere forbindelser, for eksempel farmasøytisk aktive forbindelser.

Den foreliggende oppfinnelsen vil nå bli illustrert ved det følgende eksemplet.

Eksempel:

Fremstilling av 4-fluor-N-(indan-2-yl)-benzamid

43,70 g (258 mol) 2-aminoindan hydroklorid og 53,43 g (528 mmol) trietylamin ble blandet med 250 ml tetrahydrofuran, 42,89 g (270 mmol) 4-fluorbenzoylklorid ble tilsatt, og blandingen ble rørt i 2 timer ved romtemperatur.

Den oppnådde blandingen ble deretter helt over i en is/HCl-blanding, det oppnådde bunnfallet ble filtrert, vasket med en NaHC03-løsning og vann og tørket under vakuum. Råproduktet ble krystallisert fra metanol. Det ble oppnådd 47,8 g (73%) av et hvitt, krystallinsk produkt.

Smp.: 167°C

MS:M+H<+>: 256.1

<!>H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): 2,96 (dd, 2H, H1/H3), 3,25 (dd, 2H, H3/H1), 4,70 (sekstett, 1H, H2), 7,12 - 7,19 (m, 2H, H4, 7/5,6), 7,20 - 7,28 (m, 2H, H5, 6/4,7), 7,30 (t, 2H, H3', 5'), 7,95 (dd, 2H, H2', 6'), 8,68 (d, 1H, NH).

Måling av aktivering av eNOS transkripsjon

Aktivering av eNOS transkripsjon ble målt som beskrevet i detalj i Li m.fl. "Activation of protein kinase C alpha and/or epsilon enhances transcription of the human endothelial nitric oxide synthase gene", Mol. Pharmacol. 1998; 53: 630 - 637. Kort fortalt ble et 3,5 kB langt fragment 5' fra startkodonet av eNOS genet klonet, sekvensert og klonet i ildflue luciferaseekspresjonsplasmider for å overvåke aktivering av eNOS promotoren ved reportergenaktiviteten. En human endotelial cellelinje som er stabilt transfektert og uttrykker denne promotor-reporterkonstruksjon ble benyttet for forbindelsestesting. Celler ble inkubert i 18 timer med forbindelse (I).

Oppfinnelsen var på forhånd oppløst i sterilt DMSO. En sluttkonsentrasjon på 0,5% DMSO i ferdig medium ble tillatt. Induksjon av reportergenekspressjon i disse cellene ble målt ved å benytte et standard luciferaseanalysesystem (Promega, Cat. No El50) i henhold til fabrikantens instruksjoner. Luciferaseinduksjon i celler inkubert med forbindelse (I) ble sammenlignet med de som var inkubert med løsningsmiddel alene. Forholdet av begge aktivitetene (transkripsjoninduksjonsforhold, TIR) ble plottet som en funksjon av forbindelseskonsentrasjonen. Typisk startet TIR verdier ved lave konsentrasjoner ved et forhold på 1, hvilket indikerte ingen forbindelseseffekt, og utvidet seg til en maksimum TIR verdi TIR(maks) som indikerer økningen av eNOS transkripsjon. EC50verdier av transkripsjonsinduksjonsforhold som er funksjon av forbindelseskonsentrasjonen ble bestemt grafisk.

Effekten av forbindelse (I) på eNOS-transkripsjon ble bekreftet ved en annen analyse basert på eNOS proteindeteksjon. Primære humane navlestrengsendotelceller (HUVEC) ble isolert og dyrket ifølge standard prosedyrer. Sammenløpende celler ble inkubert med forbindelse (I) i 18 timer og effekten på eNOS proteinekspresjon ble bestemt ved en kvantitativ Westernblott prosedyre. Etter inkubering av forbindelse (I) ble HUVEC lysert i iskald lysisbuffer som inneholdt 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% SDS og proteaseinhibitorer. Lysatet ble underkastet en standard denatureringspolyakrylamid gelelektroforese og overført til nitrocellulosemembraner. Ved å benytte et spesifikt primært monoklonalt antistoff (Transduction Laboratories, UK) og alkalisk fosfatasemerket sekundært antistoff (Jackson Labs), ble et spesifikt eNOS proteinbånd visualisert og kvantifisert basert på en kjemifluorescensdeteksjonsmetode.

For forbindelse (I) var EC50-verdien 0,5 uM, TIR(maks)-verdien var 4,10.

Dyremodeller

Alle dyreeksperimenter ble utført i henhold til den tyske dyrebeskyttelsesloven og retningslinjene for anvendelse av forsøksdyr som er gitt i forskrifter for omsorg og anvendelse av laboratoriedyr av USAs nasjonale helseinstitutt.

Dyr og behandling (Eksperiment A-C)

ApoE og eNOS manglende mus (C57BL/6J bakgrunn, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) ble benyttet. Alle dyr var 10 -12 uker gamle og veide 22 til 28 g. 3 dager før kirurgisk inngrep ble musene delt i 4 grupper (apoE kontroll, n = 10-12; apoE med forbindelse (I), n = 10-12; eNOS kontroll, n = 10-12; eNOS med forbindelse (I), n = 10-12) og mottok enten et standard gnagerfor (som inneholder 4% fett og 0,001% kolesterol; i det følgende angitt som placebogruppe) eller et standard gnagerfor pluss forbindelse (I) (10 eller 30 mg/kg/d p.o.).

A Anti-hypertensiv effekt i ApoE utskillende mus

Blodtrykk ble bestemt hos bevisste mus ved å benytte et datastyrt haleslagsystem.

For forbindelse (I), etter 4 måneders behandling av ApoE manglende mus ble blodtrykk signifikant (p<0,05) redusert i 30 mg/kg/d gruppen sammenlignet med placebobehandling (92 ± 5 mmHg versus 115 ± 2 mmHg). Ingen blodtrykksreduksjon kunne observeres ved lignende dosering hos eNOS manglende mus etter 4 ukers behandling.

B Inhibisjon av neointimal dannelse og aterogenese (lårarterieslag)

Etter 3 dagers behandling av ApoE manglende mus ble forbindelse (I), (10 mg/kg/d trykket inn i foret), dyrene ble bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (60 mg/kg) etterfulgt av den intramuskulære injeksjon av xylazin (2 mg/kg) og et slag/mansjett ble plassert rundt lårarterien som beskrevet i Moroi med flere (J Clin Invest. 101: 1225-32, 1998). Kort fortalt ble den venstre lårarterien dissekert. En ikke-okklusiv (ikke tilsluttende) 2,0 mm polyetylenmansjett fremstilt av PE-50 slange (indre diameter 0,56 mm, ytire diameter 0,965 mm, Becton Dickinson, Mountain View, Ca) ble plassert rundt arterien og bundet på plass med to 7 - 0 sting. Den høyre lårarterien ble isolert fra det omgivende vevet, men en mansjett ble ikke-påmontert. Behandling med forbindelse (I) ble fortsatt i 14 dager etter det kirurgise inngrep. Deretter ble dyrene avlivet. Aorta ble tatt for bestemmelse av vaskulære eNOS ekspresjoner ved kvantitativ Westernblott. Begge lårarteriene ble tatt ut, fiksert i formalin og nedsenket i parafin. 20 tverrsnitt (10 um) ble skjært fra den delen av den venstre lårarterien som er utstyrt med mansjett og fra det tilsvarende segmentet av den høyre arterien. Snittene ble underkastet standard hematoksylin og eosinanløping. Morfometriske analyser ble utført ved å benytte et avbildningsanalysecomputerprogram (LeicaQWin, Leica Imaging Systems, Cambridge, GB). For hvert tverrsnitt ble arealet av lumen, det neointimale laget og mediene bestemt. I dette henseendet ble det neointimale laget definert som arealet mellom lumen og det indre elastiske lamina og mediene ble bestemt som arealet mellom det indre og det ytre elastiske lamina. Forholdet mellom arealene av det neointimale laget og arealet av mediene ble uttrykt som det neointimale/mediaforholdet.

Forbindelse (I) reduserte den feiltilpassede neointimale dannelsen ved en faktor på 2, hvilket reduserte det neointimale til mediaforholdet til 0,39 ± 0,07 i placebogruppen til 0,170 ± 0,04 i forbindelsesgruppen. Parallelt ble vaskulær eNOS ekspresjon økt med en faktor på 2,1. Ingen effekt av forbindelse (I) kunne vises i et lignende oppsett ved å benytte eNOS manglende mus i stedet for ApoE utskillende mus.

C Forebyggelse av aterosklerose plakkdannelse ved kronisk behandling

ApoE manglende mus ble behandlet i 16 uker med forbindelse (I) trykket inn i foret og til slutt avlivet. Aortaene ble fjernet fra hver mus, fiksert i formalin og nedsenket i parafin. Plakkdannelse ble målt via lipidlesjonsdannelse i aortaene (aortisk bue til diafragma) og ble analysert ved olje rød O anløping. For å kvantifisere effekten av den respektive forbindelse på vaskulær eNOS ekspresjon ble lårarteriene benyttet ved dette eksperimentet.

Forbindelse (I) ifølge den foreliggende oppfinnelsen reduserte signifikant plakkdannelse (5,2 ± 1% versus 13,3 ± 2,6 i placebogruppen, verdier i samlet plakkstørrelse i % av total overflate). Vaskulær eNOS ekspresjon ble funnet å være 1,75 ganger oppregulert i behandlingsgruppen.

D Forbedring av koronar funksjon hos syke ApoE manglende mus

Gamle hann villtype C57BL/6J mus (Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld) og apoE manglende mus (C57BL/6J bakgrunn, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) som var 6 måneder gamle og veide 28 til 36 g ble benyttet ved eksperimentene. Mus ble oppdelt i 3 grupper (C57BL/6, n=8; apoE kontroll, n=8; apoE med forbindelse (I), n=8) og mottok i 8 uker enten et standard gnagerfor som inneholdt 4% fett og 0,001% kolesterol) eller et standard gnagerfor + forbindelse (I) (30 mg/kg/d p.o.).

Musene ble bedøvet med natriumpentobarbiton (100 mg/kg i.p.) og hjertene ble hurtig skjært ut og plassert i iskald perfusjonsbuffer. Det ble ført kanyle inn i aorta og denne ble forbundet med perfusjonsapparat (HUGO SACHS ELECTRONICS, Freiburg, Tyskland) hvilket ble startet umiddelbart ved et konstant perfusjonstrykk på 60 mm Hg. Hjertene ble perfundert på en tilbakegående måte med modifisert Krebs bikarbonatbuffer, og brakt til likevekt med 95% 02og 5% C02og holdt ved 37,5°C.

Et konisk lite rør (PE 50) ble ført gjennom en lungevene inn i den venstre ventrikkelen og dratt gjennom ventrikkelveggen, forankret i toppen ved den riflede enden og forbundet til topp-mikromanometer (Millar 1,4 French). Det venstre forkammeret ble utstyrt med kanyle gjennom den samme lungevenen og hjerte penset over til arbeidsmåte med et konstant forbelastningstrykk på 10 mm Hg og et etterbelastningstrykk på 60 mm Hg. Aortautstrømming og arteriell tilstrømning ble kontinuerlig målt ved å benytte ultrasoniske strømningsprober (HSE/Transonic Systems Inc.). Koronar strøm ble beregnet som differansen mellom arteriell strømning og aortisk strømning. Alle hemodynamiske data ble kvantifisert ved en stikkprøvefrekvens på 1000 Hz og registrert med en PC ved å benytte spesialisert programvare (HEM, Notocord).

Hjertene ble stabilisert i 30 minutter. Alle funksjonelle hemodynamiske data ble målt under stabil tilstand, og under volum- og trykkbelastning.

Venstre ventrikkelfunksjonskurver ble konstruert ved å variere forbelastningstrykk. For ervervelse av forhåndsbelastningskurver, ble etterbelastningen satt ved 60 mm Hg og forhåndsbelastningen ble justert i 5 mm Hg trinn i løpet av et område på 5 til 25 mm Hg. Hjertene fikk stabiliseres ved grunnlinjebetingelser mellom trykk- og volumbelastning.

Isolerte hjerter fra ApoE manglende dyr viste en lavere koronar strømning ved dette oppsettet sammenlignet med C57B16 villtypemus (3,6 ml/min. versus 4,95 ml/min.). Behandling av ApoE manglende dyr med forbindelse (I) ifølge den foreliggende oppfinnelsen økte den koronare strømningen til 5 ml/min. sammenlignet med nivåene av ikke-syke villtypemus. Forbindelse (I) forbedret også den forhåndsbelastningsavhengige koronare strømningen og reduserte forekomsten av ventrikkelarytmier som en indikator på anti-iskemisk effektivitet.

Claims

1. Anvendelse av 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamid med formel (I)

2. Anvendelse ifølge krav 1, der medikamentet er til behandling av ustabil angina pectoris, akutt koronart syndrom, hjertesvikt, myokardialt infarkt, trombose, perifer arterieokklusiv sykdom, restenose eller endotelskade etter PTCA, hypertensjon.

3. Anvendelse ifølge krav 1, der medikamentet er til behandling av hypertensjon, koronar hjertesykdom, stabil angina pectoris eller aterosklerose.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 og 3, der medikamentet er til behandling av koronar hjertesykdom.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 og 2, der medikamentet er til behandling av hjertesvikt.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 5, der medikamentet er i form av en pille, tablett, lakkert tablett, sukkerbelagt tablett, granul, hard eller myk gelatinkapsel, vandig, alkoholisk eller oljeaktig løsning, sirup, emulsjon eller suspensjon, stikkpiller, løsning for injeksjon eller infusjon, salve, tinktur, spray, transdermalt terapeutisk system, nesespray, aerosolblanding, mikrokapsel, implantat eller stav.