CZ20032154A3

CZ20032154A3 - @fluor@N@indan@yl@benzamid a jeho použití jako farmaceutického prostředku

Info

Publication number: CZ20032154A3
Application number: CZ20032154A
Authority: CZ
Inventors: Wohlfartápaulus; Suzukiáteri; Dharanipragadaáramalingaám; Safarovaáalena; Walseráarmin; Strobeláhartmut
Original assignee: AventisÁPharmaÁDeutschlandÁGmbH
Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2002-02-12
Publication date: 2004-05-12
Also published as: KR20030074809A; PE20020884A1; ES2274025T3; HRP20030646A2; TWI241190B; BG107994A; KR101017531B1; EP1361882B1; DK1361882T3; NO20033546L; PT1361882E; PL363452A1; RS61703A; CN100553631C; NO20033546D0; MXPA03006841A; NO333522B1; SK10112003A3; US6617359B2; CA2437966C

Description

t-101 G52/ICI-)

4-fluor-N-indan-2-y1-benzami d a jeho použití jako farmaceutického prostředku

Oblast techniky

Vynález se týká 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu vzorce I a jeho použití jako farmaceutického prostředku.

(I)

Podstata vynálezu

Endoteliální NO syntasa (eNOS, NOS-III) patří do skupiny tří izoenzymů, které produkují oxid dusnatý (NO) oxidací argininu. Endoteliálně uvolňovaný NO má centrální důležitost v řadě klíčových kardiovaskulárních mechanismů. Má vazodilatační účinek a potlačuje agregaci plotének, adhezi leukocytů k endotelu a proliferaci buněk intimálního hladkého svalstva.

Dosavadní stav

Endoteliální NO syntasa podléhá fyziologické a patofyziologické regulaci jak na transkripční, tak na post-transkripční úrovni. Enzym již přítomný v endotelu může podléhat aktivaci závislé na kalciu a nezávislé na kalciu fosforylací specifických aninokyselin, ale také přímými interakcemi se specifickými proteiny. Stimulátory tohoto, obvykle přechodného, uvolňování NO jsou extracelulární arginin, 17beta-estrogen a mechanický stimul působící na luminární povrch endotelu ·· krevním průtokem (střihovým napětím). Toto dále vede k regulaci eNOS na transkripční úrovni. Tak například Sessa a spol. (Circ. Research 74 (1994) 349 - 353) se podařilo pomocí trénování cvičení a s tím spojeného zvýšení střihového napětí dosáhnout zřetelného zvýšení v ecNOS.

Je-li regulace na transskripční úrovni relevantní in vivo, nebylo jednoznačně prokázáno. Tak například podání vysoké dávky argininu je následováno u pacientů s koronární srdeční chorobou pouze přechodným zlepšením na endotelu závislé vazorelaxace.

Na druhé straně význam zvýšené regulace eNOS proteinu je vědecky přijatý. Jsou tedy nálezy, které prokazují, že ochranné vlastnosti inhibitoru HMG-CoA reduktasy simvastatinu mohou být přičítány kromě snižování lipidů také zčásti zvýšení exprese eNOS in vivo (Endres a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8880-8885). Je dále známo, že mutace jediného bodu v 5'-oboustranně přiléhající oblasti eNOS genu (eNOS promotor) a s tím spojené snížení rychlosti transkripce eNOS genu v japonské populaci je spojeno s rizikem koronárních spasmů (Nakayama a spol., Circulation 99 (1999) 2864 - 2870) .

Běžný předpoklad pro to je, že transkripční a posttranskripční mechanismy regulace eNOS jsou vážně narušeny při velkém počtu poruch, zejména při kardiovaskulárních poruchách. I ve velmi raných stádiích nejrůznějších kardiovaskulárních poruch je možné, aby porušená funkce tohoto typu v endotelové výstelce cév vedla k nedostatku bioaktivního NO, což se projevuje při rozvoji poruchy ve formě měřitelných patofyziologických a morfologických změn. Tyto kritické stupně v rané aterogenezi jsou urychleny snížením uvolňování endoteliálního NO, jako například oxidací lipoproteinů nízké denzity, doplněním a uložením monocytů v intimě cév a proliferaci intimálních buněk. Důsledkem aterogeneze je tvorba plátů uvnitř cév, což zase může vést v důsledku zmenšení střihového ·· ♦· · · ·· ··« ·

napětí k dalšímu snížení uvolňování endoteliálního NO a dalšímu zhoršení patologie. Protože endoteliální NO je také vazodilatátor, jeho snížení často také vede k hypertenzi, což může jako nezávislý rizikový faktor způsobovat další poškození orgánů.

Cílem terapeutického přístupu k léčbě těchto poruch musí proto být přerušení tohoto řetězce eventualit zvýšením exprese endoteliálního NO. Pokusy s transferem genů, které vedou in vitro k zvýšené expresi syntasy NO v dříve poškozených cévách, jsou de facto schopny čelit popsaným procesům a jsou tedy důkazem správnosti tohoto přístupu (Varenne a spol., Gene Ther. 11 (2000) 1329).

Některé nízkomolekulární sloučeniny, které v buněčných kulturách mohou vést k přímému účinku na transkripci eNOS a na expresi, jsou popsány v literatuře. Statiny, které zde již byly zmíněny, jsou však jediné substance, pro které bylo dosud možno prokázat takové zvýšení v eNOs in vivo jako vedlejší účinek. Vzhledem k známému rozsahu vedlejších účinků této třídy substancí je však nejasné, jak dalece je tento účinek přítomen v toxikologicky neproblematické dávce.

Liao a spol. nárokují ve WO 99/47153 a WO 00/03746 použití inhibitorů rhoGTPasy a prostředků, které ovlivňují organizaci cytoskeletonu aktinu pro zvýšení eNOS v endoteliálních buňkách a pro léčbu různých poruch, například náhlé příhody mozkové nebo pulmonární hypertenze, aniž by však naznačili specifickou cestu pro dosažení tohoto cíle.

Podstata vynálezu

Existuje tedy velká potřeba léčiva, které by vyregulovalo expresi eNOS v endoteliálních buňkách. Cílem vynálezu je získat sloučeninu, která by měla tuto vlastnost.

Tohoto cíle je dosaženo použitím 4-fluor-N-indan-2** ···· ·· ·♦ ·· ··*· » · ···«··· · • · · · 9 9· 9 9 9

9 9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 99 99 99 99

-y1-benzamidu vzorce (I)

k výrobu léčivě pro stimulaci exprese endoteliální NO syntasy.

Tohoto cíle je též dosaženo farmaceutickým přípravkem pro stimulaci exprese endoteliální NO syntase obsahujícím účinnou dávku 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález zahrnuje dále použití všech solvátů sloučeniny vzorce I, například hydrátů, aduktů všech alkoholů, aktivních metabolitů sloučeniny vzorce I a též derivátů a prekurzorů léků sloučeniny vzorce I, které obsahují fyziologicky přijatelné a odštěpitelné skupiny, například estery, amidy a sloučeniny, u nichž N-H skupina, znázorněná ve vzorci (I) je nahražena N-alkylovou skupinou, jako je N-methylová skupina, nebo N-acylovou skupinou, jako N-acetylovou skupinou nebo N-arginylovou skupinou, včetně farmaceuticky přijatelných solí vytvořených na funkčních skupinách přítomných v N-acylové skupině.

WO 00/51970 popisuje výrobu a použití 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu jako léčiva. Tato sloučenina má schopnost silné potenciace cholinergní aktivity a je užitečná pro léčbu nebo/a prevenci poruch centrálního nervového systému pro savce a zejména amnézie, demence, například senilní demence, Alzheimerovy demence, demence ve spojitosti s různými chorobami, jako cerbrální vaskulární demence, cerebrální posttraumatické demence, demence v důsledku nádoru na mozku, demence φφ φφφφ φφ Φ· φφ φφφφ φ φ φ φφφφ φ φ φ • φφ φφφ φ ♦ φφφφ φφφφ φφ ·Φ φφ φφ φφφφ v důsledku chronického suhdurálního hematomu, demence v důsledku normálního tlaku hydrocefalu, postmeningitické demence, demence Parkinsonova typu a podobně. Očekává se, že sloučenina bude užitečná jako terapeutický nebo/a preventivní prostředek pro schizofrenii, depresi, náhlou příhodu mozkovou, poranění hlavy, odvykání nikotinu, poranění míchy, úzkost, polakiurii, inkontinencí moči, myotickou dystrofii, poruchu pozornosti, poruchu hyperaktivity, přílišnou ospalost během dne (narkolepsii), Parkisonovu chorobu nebo autismus. WO 00/51970 nepopisuje nebo nenavrhuje použití 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu pro vyregulování exprese endoteliální N0-syntasy zejména pro léčbu kardiovaskulárních chorob, stabilní nebo nestabilní angíny pectoris, koronární srdeční choroby Prinzmetalovy angíny, akutního koronárního syndromu, selhání srdce, infarktu myokardu, náhlé příhody mozkové, trombózy, okluzního onemocnění periferních tepen, endoteliální dysfunkci, aterosklerózy, restenózy, poškození endotelu po perkutánní transluminární koronární angioplastice (PTCA), hypertenze, esenciální hypertenze, pulmonární hypertenze, sekundární hypertenze, renovaskulámí hypertenze, chronické glomerulonefritidy, erektilní dysfunkce, ventrikulární arytmie, diabetů nebo komplikací diabetů, nefropatie, retinopatie, angiogeneze, astmatu bronchiale, chronického selhání ledvin, cirhózy jater, osteoporózy, omezené schopnosti paměti, omezené schopnosti učení, nebo snížení kardiovaskulárního rizika žen po přechodu nebo po užívání antikoncepce.

Sloučenina vzorce I může být připravena z 2-indanylaminu, který je známý z literatury. 2-indanylamin se může nechat reagovat ve formě volné báze nebo ve formě své soli s 4-fluorbenzoylchloridem v přítomnosti báze, jako například triethylaminu. Reakce se obvykle provádí v rozpouštědle jako dichlormethanu, tetrahydrofuranu, toluenu nebo dioxanu a s výhodou při teplotě místnosti. Nebo se sloučenina vzorce I získává kondenzační reakcí uvedeného 2-indanylaminu s 4-fluorbenzoovou kyselinou za přítomnosti báze, jako například diisopropylethylaminu, a použití vhodného kondenzační·· ···· ·· ··♦· • 9 99

9 9 9

9 99

9 9

9

9 9 9 • 9 99

9 9 9

99 ho reakčního činidla jako například karbodiimidů HATU nebo TOTU (0-((kyano(ethoxykarbonyl(methylidenamino)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát).

Další reakce pro syntézu sloučeniny vzorce I jsou zřejmé nebo dobře známé odborníkovi a mohou být provedeny za standardních podmínek nebo analogicky s postupy popsanými v literatuře, například v Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Thieme-Verlag, Stuttgart nebo Organic Reactions, John Wiley and Sons, New York. Popřípadě může být sloučenina vzorce I vyčištěna standardními čisticími postupy, například překrystalováním nebo chromatografií. Výchozí sloučeniny pro přípravu sloučeniny vzorce I jsou komerčně dostupné nebo mohou být připraveny podobně nebo analogicky s postupy popsanými v literatuře.

Sloučenina vzorce I může být použita k vyregulování exprese endoteliální syntase NO a je užitečnou sloučeninou pro léčbu různých chorob. V souvislosti s vynálezem léčba zahrnuje terapii jakož i profylaxi příslušných chorob.

Příklady chorob, které mohou být léčeny sloučeninou vzorce I podle vynálezu, zahrnují kardiovaskulární choroby jako stabilní a nestabilní angínu pectoris, koronární srdeční chorobu, Prinzmetalovu angínu (spasmus), akutní koronární syndrom, selhání srdce, infarkt myokardu, náhlou příhodu mozkovou, trombózu, okluzní onemocnění periferních tepen (PAOD), endoteliální dysfunkci, aterosklerózu, restenózu, poškození endotelu po perkutánní transluminární koronární angioplastice (PCTA), hypertenzi včetně esenciální hypertenze, pulmonární hypertenzi a sekundární hypertenzi (renovaskulární hypertenzi, chronickou glomerulonefritidu), erektilní dysfunkci, ventrikulární arytmií a snížení kardiovaskulárního rizika žen po přechodu nebo po užívání antikoncepčních prostředků.

Sloučenina vzorce (I) může být kromě toho používána při terapii nebo profylaxi diabetů a komplikacích diabetů (nefro·· ··♦· ·· ·· ·· ···· ·· ··<·#·· « 9 9 9 9 9 99 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 99 99 patii, retinopati i), angiogenezi, při astmatu bronchiale, chronickém selhání ledvin, cirhóze jater, osteoporóze, omezené výkonnosti paměti nebo omezené schopnosti učení.

Výhodnými indikacemi jsou stabilní angina pectoris, koronární srdeční choroba, hypertenze, endotheliální dysfunkce, ateroskleróza a komplikace diabetů.

Sloučenina vzorce I může být rovněž použita v kombinaci s jinými farmaceuticky aktivními sloučeninami, které jsou schopné zvýšit účinek sloučeniny vzorce I. Příklady takových sloučenin zahrmují: statiny, ACE-inhibitory, ATl-antagonisty, inhibitory argininázy, PDE V-inhibitory, Ca-antagonisty, alfa-blokátory, metimazol a analogické sloučeniny, arginin, tetrahydrobiopterin, vitaminy, zejména vitamin C a vitamin B6, niacin.

Sloučenina vzorce I, popřípadě v kombinaci s jinými farmaceuticky aktivními sloučeninami, může být podána živočichům, s výhodou savcům, a zejména lidem, jako farmaceutický prostředek jako takový nebo ve formě farmaceutických přípravků. Dalším předmětem vynálezu jsou farmaceutické přípravky (nebo farmaceutické prostředky), které obsahují účinnou dávku sloučeniny vzorce I a farmaceuticky přijatelný nosič, tj. jeden nebo několik farmaceuticky přijatelných substancí sloužících jako nosiče nebo/a pomocné látky. Tyto farmaceutické přípravky slouží k stimulaci exprese endoteliální syntasy NO a zejména jako léčivo pro terapii a profylaxi shora uvedených syndromů.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu se může podávat orálně, například ve formě prášků, tablet, lakovaných tablet, cukrem potahovaných tablet, granulí, trvrdých a měkkých želatinových tobolek, vodných, alkoholických nebo olejových roztoků, sirupů, emulzí nebo suspenzí, nebo rektálně, například ve formě čípků. Aplikace se může též provádět parenterálně, například subkutánně, intramuskulárně nebo intravenózně ve φφ φφ ·· · φφφφ φφ φ φφ φ φφφφ φφ « — ··» «···**** ·« · «« ·· ·« ·* φφ φφ«· φφ φφφφ formě roztoků pro injekce nebo pro infuzi. Jiné vhodné aplikační formy jsou například perkutánní nebo topická aplikace, například ve formě mastí, tinktur, sprejů nebo transdermálních terapeutických systémů, nebo inhalační aplikace ve formě nazálních sprejů nebo aerosolových směsí, nebo například mikrokapslí, implantátů nebo tyčinek. Výhodná aplikační forma závisí například od choroby, která má být léčena, a na její závažnosti .

Množství sloučeniny vzorce I ve farmaceutických přípravcích se normálně pohybuje od 0,2 do 800 mg, s výhodou od 0,5 do 500 mg, zejména od 1 do 200 mg, na dávku, ale v závislosti na typu farmaceutického přípravku může být i vyšší. Farmaceutické přípravky obvykle obsahují 0,5 až 90 procent hmotnostních sloučeniny vzorce I. Příprava farmaceutických přípravků může být provedena o sobě známým způsobem. Za tímto účelem se sloučenina vzorce I společně s jedním nebo s několika pevnými nebo kapalnými farmaceutickými nosiči nebo/a přísadami (nebo pomocnými látkami) a popřípadě v kombinaci s jinými farmaceuticky aktivními sloučeninami, které mají terapeutický nebo profylaktický účinek, přivedou do vhodné aplikační formy, která může být použita jako léčivo v humánní nebo veterinární medicině.

Pro výrobu prášků, tablet, tablet potažených cukrem a tvrdých želatinových tobolek je možno použít například laktosu, škrob, například kukuřičný škrob, nebo deriváty škrobu, talek, stearovou kyselinu nebo její soli atd. Nosiči pro měkké želatinové tobolky a čípky jsou například tuky, vosky, polotekuté a tekuté polyoly, přírodní nebo tvrzené oleje atd. Vhodné nosiče pro přípravu roztoků, například roztoků pro injekce, nebo emulzí nebo sirupů jsou například voda, fyziologický roztok chloridu sodného, alkoholy jako ethanol, glycerol, polyoly, sacharosa, invertní cukr, glukosa, mannitol, rostlinné oleje atd. Je také možno sloučeninu vzorce I lyofilizovat a použít výsledné lyofilizáty například pro přípravu přípravků pro injekce nebo infuzi. Vhodné nosiče pro mikro- 9 ·· ·· • » · · · · · · · · * t · » · 99 9 9 9

9 9 99 99 999 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 kapsle, implantáty nebo tyčinky jsou například kopolymery glykolové kyseliny a mléčné kyseliny.

Kromě sloučeniny vzorce I a nosičů mohou farmaceutické přípravky obsahovat také přísady, například plniva, dezintegrační prostředky, pojivá, lubrikanty, smáčedla, stabilizátory, emulgátory, dispergační prostředky, konzervační prostředky, sladidla, barviva, ochucovadla, aromatizační prostředky, zahušťovadla, ředidla, pufry, rozpouštědla, solubilizátory, prostředky k dosažení depótního účinku, soli pro změnu osmotického tlaku, povlékací prostředky nebo antioxidační prostředky .

Dávkování sloučeniny vzorce I, která má být aplikována, je odvislé od individuálního případu a musí být, jako obvykle, přizpůsobeno individuálním okolnostem pro docílení optimálního účinku. Závisí tedy na povaze a závažnosti poruchy, která má být léčena, a také na pohlaví, věku, hmotnosti a individuální vnímavosti člověka nebo zvířete, které má být léčeno, na délce působení sloučeniny vzorce I, na tom, zda léčba je akutní nebo chronická nebo profylaktická nebo zda jsou podávány jiné aktivní sloučeniny kromě sloučeniny vzorce I. Obecně je denní dávka přibližně 0,01 až 100 mg/kg, s výhodou 0,1 až 10 mg/kg, zejména 0,3 až 5 mg/kg (v každém případě mg na kg tělesné hmotnosti) vyhovující pro aplikaci dospělému pacientovi o hmotnosti přibližně 75 kg k dosažení žádaných výsledků. Denní dávka může být aplikována v jediné dávce nebo, zejména když jsou aplikována velká množství, může být rozdělena na několik, například dvě, tři nebo čtyři jednotlivé dávky. V některých případech v závislosti na individuální odpovědi může být zapotřebí odchýlit se nahoru nebo dolů od dané denní dávky.

Sloučenina vzorce I může být také použita pro jiné účely, než jaké byly uvedeny v předcházejícím textu. Neomezující příklady zahrnují diagnostické účely, použití jako biochemie- 10 ·· *«·· φ· 999 9 • 4 ·· «· * * · · · » · « 9 · · 9 · · * 9 9 9

9 9 · 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 + Μ ·· ké nástroje a jako meziprodukty pro přípravu dalších sloučenin, např. farmaceuticky aktivních sloučenin.

Vynález bude nyní objasněn následujícím příkladem.

Příklad provedení vynálezu

Příprava 4-fluor-N-(indan-2-yl)-benzamidu

Smíchalo se 43,70 g (258 mol) 2-aminoindanhydrochloridu a 53,43 g (528 mmol) triethylaminu s 250 ml tetrahydrofuranu, přidalo se 42,89 g (270 mmol) 4-fluorbenzoylchloridu a směs se míchala 2 hodiny při teplotě místnosti.

Výsledná směs se pak nalila na směa ledu a HCI, získaná sraženina se sfiltrovala, promyla se roztokem NaHCO3 a vodou a vysušila se ve vakuu. Surový produkt se překrystaloval z methanolu. Získalo se 47,8 g (73 %) bílého, krystalického prášku.

teplota tání: 167 °C

MS: Μ + H⁺ : 256,1 ¹H-NMR (300 MHz, de-DMSO): 2H, H3/H1), 4,70 (sextet,

7/5,6), 7,20 - 7,28 (m, 2H, 7,95 (dd, 2H, H2 6 ), 8,68

2,96 (dd, 1H, H2), 7

H5, 6/4,7) (d, 1H, NH)

2H, H1/H3), 3,25 (dd,

- 7,19 (m, 2H, H4,

7,30 (t, 2H, H3 ,5 ),

Měření aktivace eNOS transkripce

Aktivace eNOS transkripce byla měřena, jak je detailně popsáno v Li a spol. Aktivace proteinkinasy C alfa nebo/a epsilon zvyšuje transkripci lidského genu endoteliální syntasy oxidu dusnatého, Mol. Pharmacol. 1998, 53, 630 - 637. Krátce řečeno, 3,5kB dlouhý fragment 5' startovacího kodonu eNOS genu byl klonován, sekvencován a klonován v plaz• 4 ·· • · * • · • Φ ΦΦ·· φ « ·

ΦΦΦ

midech exprimujících firefly luceferasu za účelem monitorování aktivace eNOS promotoru aktivitou reportergenu. Pro testování sloučeniny byla použita lidská endoteliální buněčná linie se stabilní transfekcí a exprimující tuto konstrukci promotor-reporter. Buňky byly inkubovány na 18 h se sloučeninou vzorce I.

Sloučenina byla předem rozpuštěna v dimethylsulfoxidu (DMSO). Povolena byla konečná koncentrace 0,5 % DMSO v kompletním médiu. Zavedení exprese reportergenu do těchto buněk bylo změřeno použitím systému standardního testu s luciferasou (Promega, Cat. No E150) podle instrukcí výrobce. Buňky se zavedenou luciferasou, inkubované se sloučeninou vzorce I, byly porovnány s buňkami inkubovanými s rozpouštědlem samotným. Poměr obou aktivit (poměr transkripce a zavedení, TIR) byl vynesen jako funkce koncentrace sloučeniny. Typicky začínaly hodnoty TIR při nízkých koncentracích při poměru 1, což naznačuje žádný účinek sloučeniny a postoupily až k maximální hodnotě TIR TIR(max), která naznačuje zvýšení transkripce eNOS. Hodnoty EC50 poměrů transkripce a zavedení jako funkce koncentrace sloučeniny byly stanoveny graficky.

Účinek sloučeniny (I) na transkripci eNOS byl potvrzen při druhém pokusu založeném na detekci eNOS proteinu. Primární lidské endoteliální buňky ze žíly pupeční šňůry (HUVEC) byly izolovány a kultivovány standardními postupy. Buňky souvislé vrstvy byly inkubovány se sloučeninou vzorce I na 18 h a účinek na expresi proteinu eNOS byl stanoven kvantitativním westernovým postupem. Po inkubaci sloučeniny vzorce I byly HUVEC lyžovány v ledovém pufru lýze obsahujícím 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% SDS a inhibitory proteasy. Lyzát byl podroben standardní denaturační elektroforéze polyakrylamidovým gelem a nanesen na nitrocelulosové membrány. Použitím specifické primární monoklonální protilátky (Transduction Laboratories, UK) a alkalickou fosfatasou značené sekundární protilátky (Jackson Labs) byl vizualizován specifický eNOS ···· • · • · • · • · ·· • 4 «· ·· ·«·« • · · · ♦ · · · • · · ·· · · 9 • ········ · • · · · 9 9 9 9 9

99 99 99 99 proteinový pás a kvantifikován na bázi chemifluorescentní detekční metody.

Pro sloučeninu vzorce I hodnota ECso byla 0,8 μιΜ, hodnota TIR(max) byla 4,10.

Zvířecí modely

Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s německým zákonem o ochraně zvířat a se směrnicemi pro použití pokusných zvířat, jak je stanoveno Pravidlem pro péči a použití laboratorních zvířat US National Institutes of Health.

Zvířata a péče o ně (Pokusy A až C)

Byly použity ApoE a eNOS deficitní myši (původ C57BL/6J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me). Všechna zvířata byla stará 10 až 12 týdnů a měla hmotnost 22 až 28 g. Tři dny před operací byly myši rozděleny do 4 skupin (kontrola apoE, n = 10 - 12, apoE se sloučeninou vzorce I, n = 10 - 12, kontrola eNOS, n = 10 až 12, eNOS se sloučeninou vzorce I, n = 10 až 12) a dostaly buď standardní potravu pro hlodavce (obsahující 4 % tuku a 0,001 % cholesterolu, dále uvedena jako placebová skupina) nebo standardní potravu pro hlodavce + sloučeninu vzorce I (10 nebo 30 mg/kg/d p.o.)

A Antihypertenzivní účinek u uspaných myší ApoE

Krevní tlak byl stanoven u myší, které nabývaly vědomí, použitím komputerizovaného systému pomocí manžety na ocásku.

Při použití sloučeniny vzorce I byl po 4 měsících léčby ApoE deficitních myší krevní tlak významně snížen (p<0,05) ve skupině 30 mg/kg/d ve srovnání s působením placebem (12 kPa + 0,67 kPa oproti 15,3 kPa + 0,27 kPa). Žádné snížení

- 13 49 9 944 ·* ·· »· 9444 • · · · 9 · 4 4 4 · • 9 9 4999 44 9 krevního tlaku nebylo možno pozorovat při podobném dávkování u eNOS deficitních myší po 4 týdenní léčbě.

B Inhibice tvorby neointimy a aterogeneze (kroužek na femorální tepně)

Po 3 dnech léčby ApoE deficitních myší sloučeninou vzorce I (10 mg/kg/d slisované v potravě) byla zvířata anestezována intraperítoneální injekcí pentobarbitalu (60 mg/kg), následované intramuskulární injekcí xylazinu (2 mg/kg) a kolem femorální tepny byl umístěn kroužek, jak je popsáno v Moroi a spol. (J Clin Invest. 101:1225-32, 1998). Ve stručnosti řečeno, femorální tepna byla vypreparována, kolem tepny byl umístěn neokludující 2,0 mm polyethylenový kroužek vyrobený z PE-50 trubičky (vnitřní průměr 0,56 mm, vnější průměr 0,965 mm, Becton Dickinson, Moutain View, Ca) a zakotven na místě dvěma stehy 7-0. Pravá femorální tepna byla izolována od okolních tkání, ale kroužek na ní nebyl umístěn. V podávání sloučeniny vzorce I bylo pokračováno 14 dní po operaci. Pak byla zvířata uhubena. Aorty byly odebrány pro stanovení vaskulárních eNOS expresí kvantitativním westernovým přenosem. Obě femorální tepny byly odebrány, fixovány ve formalinu a zabudovány do parafinu. 20 příčných vzorků v rozsahu obvodu tepny (10 ji m) bylo odebráno z části levé femorální tepny opatřené kroužkem a z odpovídajícího segmentu pravé tepny. Vzorky byly podrobeny standardnímu obarvení hematoxylinem a eosinem. Byly provedeny morfometrické analýzy použitím počítačového programu analýzy obrazu (LeicaQffin, Leica Imaging Systems, Cambridge, GB). Pro každý vzorek byla stanovena plocha lumenu, neointimy a médie. Za tímto účelem byla definována neointima jako plocha mezi lumenem a vnitřní elastickou laminou a media byla definována jako plocha mezi vnitřní a vnější elastickou laminou. Poměr mezi plochou neointimy a plochou médie byl vyjádřen jako poměr neointima/media.

Sloučenina vzorce I snížila tvorbu špatně přizpůsobivé neointimy o faktor 2 snížením poměru neointimy k medii z φφ φφφφ φφ φφ φφ

0,39 i 0,07 v placebové skupině na 0,170 + 0,04 ve skupině se sloučeninou. Paralelně byla zvýšena exprese vaskulární eNOS o faktor 2,1. Žádný účinek sloučeniny vzorce I nebyl prokázán v podobném seskupení při použití eNOS deficitních myší místo uspaných ApoE myší.

C Prevence tvorby aterosklerotického plátu při chronické léčbě

ApoE deficitní myši byly léčeny 16 týdnů sloučeninou vzorce I slisovanou v potravě pro hlodavce a nakonec byly uhubeny. Z každé myši byla vyňata aorta, která byla fixována ve formalinu a zabudována do parafinu. Tvorba plátu byla změřena cestou tvorby lipidových leží v aortách (od oblouku aorty k bránici) a byla analyzována barvením olejovou červení 0. Pro kvantifikaci účinku příslušné sloučeniny na expresi vaskulárního eNOS byly při tomto pokusu použity femorální tepny.

Sloučenina vzorce I podle vynálezu významně snížila tvorbu plátu (5,2 ± 1 % oproti 13,3 ± 2,6 v placebové skupině, hodnoty celkového rozměru plátu v % celkového povrchu). Bylo zjištěno, že exprese vaskulárního eNOS je 1,75 krát vyšší v léčené skupině.

D Zlepšení koronární funkce u uhynulých ApoE deficitních myší

Při pokusech byly použity staří samci myší divokého typu (Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld) a apoE deficitní myši (původ C57BL/6J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me), ve stáří 6 měsíců, a o hmotnosti 28 až 36 g. Myši byly rozděleny do 3 skupin (C57BL/6, n = 8, apoE kontrola, n = 8, apoE se sloučeninou vzorce I, n = 8) a dostávaly po dobu 8 týdnů bučí standardní potravu pro hlodavce (obsahující 4 % tuku a 0,001 % cholesterolu) nebo standardní potravu pro hlodavce + sloučenina vzorce I (30 mg/kg/d p.o.).

• · · ·

- 15 • · · ···· · · * • · · ···· · · ·

Myši byly uspány pentobarbitonem sodným (100 mg/kg

i.p.) a rychle byla excidována srdce, která byla umístěna do ledem chlazeného perfúzního pufru. Aorta byla kanylována a připojena k perfuznímu přístroji (HUGO SACHS ELECTRONICS, Freiburg, Německo), který byl ihned nastartován při konstantním perfuzním tlaku 7,9 kPa. Srdce byla perfundována retrográdním způsobem s modifikovaným Krebsovým bikarbonátovým pufrem, ekvi1ibrovaným s 95 % Oa a 5 % CO2 a udržovaným na 37,5 °C.

Úzká trubička (PE 50) byla zavedena plicní žilou do levé srdeční komory a protažena stěnou komory, byla zakotvena rýhovaným koncemv hrotu srdce a byla připojena k mikromanometru (Millar 1,4 French). Levá síň byla kanylována stejnou plicní žílou a srdce bylo nastaveno na pracovní rytmus s konstantním předzatížením tlaku 1,33 kPa a následném zatížení tlaku 7,9 kPa. Výtok z aorty a přítok do síně byly měřeny kontinuálně použitím ultrazvukových sond průtoku (HSE/Transonic Systems lne.) Koronární průtok byl vypočítán jako rozdíl mezi průtokem v síni a průtokem v aortě. Všechna hemodynamická data byla digitalizována vzorkovací rychlostí 1000 Hz a zaznamenána počítačem za použití speciálizovanoho programu (HEM, Notocord).

Srdce se nechala stabilizovat po dobu 30 minut. Všechna hemodynamická data byla změřena během rovnovážného stavu a během zatížení objemem a tlakem.

Křivky funkce levé síně byly sestrojeny při měnícím se předzatížení. Pro získání křivek předzatížení bylo následné zatížení nastaveno na 7,9 kPa a předzatížení bylo upraveno v stupních po 0,67 kPa v rozmezí 0,67 až 3,33 kPa. Srdce byla ponechána, aby se stabilizovala na výchozích podmínkách mezi zatížením tlakem a objemem.

V izolovaných srdcích z ApoE deficitních zvířat došlo v této sestavě k nižšímu koronárnímu průtoku ve srovnání s divokým typem myší C57B16 (3,6 ml/min oproti 4,95 ml/min). Léčba ApoE deficitních myší sloučeninou vzorce I podle vynálezu zvýšila koronární průtok na 5 ml/min ve srovnání s hladinami neuhubených myší divokého typu. Sloučenina vzorce I také zlepšila na předzatížení závislý koronární průtok a snížila výskyt ventrikulárních arytmií jako průkaz antiischemické účinnosti.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu vzorce I (I) pro výrobu léčiva k stimulaci exprese endotheliální NO syntasy.
2. Použití 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu k výrobě léčiva pro léčbu kardiovaskulárních chorob, jako stabilní nebo nestabilní angíny pectoris, koronární srdeční choroby, Prinzmetalovy angíny, akutního koronárního syndromu, selhání srdce, infarktu myokardu, trombózy, okluzního onemocnění periferních tepen, endoteliální dysfunkce, aterosklerózy, restenózy, poškození endotelu po perkutánní transluminální koronární angioplastice, hypertenze, esenciální hypertenze, pulmonární hypertenze, sekundární hypertenze, renovaskulární hypertenze, chronické glomerulonefritidy, erektilní dysfunkce, ventrikulární arytmie, diabetů nebo komplikací diabetů, nefropatie, retinopatie, angiogeneze, astmatu bronchiale, chronického selhání ledvin, cirhózy jater, osteoporózy nebo snížení kardiovaskulárního rizika žen po přechodu nebo po užívání antikoncepčních prostředků.
3. Použití podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím ,že léčivo je pro léčbu endoteliální dysfunkce, hypertenze, koronární srdeční choroby, stabilní angíny pectoris, komplikací diabetů nebo aterosklerózy.

• · · ·

- 18
4. Farmaceutický přípravek pro stimulaci exprese endoteliální NO syntasy, vyznačující setím ,že obsahuje účinnou dávku 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu a farmaceuticky přijatelný nosič.
5. Farmaceutický přípravek pro léčbu kaerdiovaskulárních chorob, stabilní nebo nestabilní anginy pectoris, koronární srdeční choroby, Prinzmetalovy anginy, akutního koronárního syndromu, selhání srdce, infarktu myokardu, trombózy, okluzního onemocnění periferních tepen, endoteliální dysfunkce, aterosklerózy, restenózy, poškození endotelu po perkutánní transluminální koronární angioplastice, hypertenze, esenciální hypertenze, pulmonární hypertenze, sekundární hypertenze, renovaskulární hypertenze, chronické glomerulonefritidy, erektilní dysfunkce, ventrikulární arytmie, diabetů nebo komplikací diabetů, nefropatie, retinopatie, angiogeneze, astmatu bronchiale, chronického selhání ledvin, cirhózy jater, osteoporózy nebo snížení kardiovaskulárního rizika žen po přechodu nebo po užívání antikoncepčních prostředků, přičemž tento přípravek obsahuje účinnou dávku 4-fluor-N-indan-2-yl-benzamidu a farmaceuticky přijatelný nosič.
6. Farmaceutický přípravek podle nároků 4 nebo 5, vyznačující se tím , že farmaceutický přípravek je ve formě prášku, tablety, lakované tablety, tablety potažené cukrem, granule, tvrdé nebo měkké želatinové tobolky, vodného, alkoholického nebo olejového roztoku, sirupu, emulze nebo suspenze, čípku, roztoku pro injekce nebo infuzi, masti, tinktury, spreje nebo transdermálního terapeutického systému, nazálního spreje, aerosolové směsi, mikrokapsle, implantátu nebo tyčinky.