NO331779B1 - Fremgangsmater for a bestemme hvorvidt en testforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjonen mellom LIPG polypeptidet og HDL kolesterol og apolipoprotein A1 eller fremme den enzymatiske reaksjonen mellom LIPG polypeptidet og VLDL kolesterol eller LDL kolesterol - Google Patents
Fremgangsmater for a bestemme hvorvidt en testforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjonen mellom LIPG polypeptidet og HDL kolesterol og apolipoprotein A1 eller fremme den enzymatiske reaksjonen mellom LIPG polypeptidet og VLDL kolesterol eller LDL kolesterol Download PDFInfo
- Publication number
- NO331779B1 NO331779B1 NO20014657A NO20014657A NO331779B1 NO 331779 B1 NO331779 B1 NO 331779B1 NO 20014657 A NO20014657 A NO 20014657A NO 20014657 A NO20014657 A NO 20014657A NO 331779 B1 NO331779 B1 NO 331779B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- lipg
- cholesterol
- cells
- polypeptide
- lipase
- Prior art date
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 130
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 108010069201 VLDL Cholesterol Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 title claims description 332
- 101000941275 Homo sapiens Endothelial lipase Proteins 0.000 title claims description 282
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 177
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 156
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 150
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 51
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 title claims description 27
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 title claims description 27
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 103
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 93
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 abstract description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 33
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 24
- 102000039013 Triacylglycerol lipase family Human genes 0.000 abstract description 10
- 108091063501 Triacylglycerol lipase family Proteins 0.000 abstract description 9
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 131
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 81
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 80
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 67
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 66
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 65
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 65
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 64
- 102000017055 Lipoprotein Lipase Human genes 0.000 description 61
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 61
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 59
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 59
- 101710087274 Endothelial lipase Proteins 0.000 description 58
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 51
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 50
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 49
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 49
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 48
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 47
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 46
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 43
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 43
- 239000000047 product Substances 0.000 description 43
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 43
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 37
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 31
- 102000019267 Hepatic lipases Human genes 0.000 description 30
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 30
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 30
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 30
- 108050006747 Hepatic lipases Proteins 0.000 description 29
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 29
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 29
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 29
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 27
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 26
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 26
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 26
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 26
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 25
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 24
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 23
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 23
- 201000008752 progressive muscular atrophy Diseases 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 22
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 21
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 21
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 20
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 101150107380 LIPG gene Proteins 0.000 description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 17
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 16
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 15
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 15
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 14
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 11
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 10
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 101000619884 Homo sapiens Lipoprotein lipase Proteins 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 9
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 9
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 9
- 229940117972 triolein Drugs 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 8
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- -1 glycerol phospholipid Chemical class 0.000 description 8
- 102000045333 human LIPG Human genes 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N Triolein Natural products O([C@H](OCC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)C(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N 0.000 description 7
- PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N Trioleoylglycerol Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 102000045312 human LPL Human genes 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 6
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 6
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 6
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 5
- 101000941289 Homo sapiens Hepatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 5
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 5
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 5
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 4
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001134456 Homo sapiens Pancreatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 4
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101150102415 Apob gene Proteins 0.000 description 3
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 3
- 101001066129 Homo sapiens Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 3
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 3
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 3
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 3
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 3
- 102000047486 human GAPDH Human genes 0.000 description 3
- 102000057438 human LIPC Human genes 0.000 description 3
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 3
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 3
- 108010022197 lipoprotein cholesterol Proteins 0.000 description 3
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000002805 secondary assay Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 description 2
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108700039553 Lipase-like Proteins 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- YFUAMNHCERJFPS-UHFFFAOYSA-N [K+].OB(O)[O-].OC(O)=O Chemical compound [K+].OB(O)[O-].OC(O)=O YFUAMNHCERJFPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- KMRSOJFYKZALJY-UHFFFAOYSA-N chloroform;heptane;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl.CCCCCCC KMRSOJFYKZALJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 2
- 230000003081 coactivator Effects 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 2
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064060 high density lipoprotein receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000054823 high-density lipoprotein particle receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000046759 human PNLIP Human genes 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- 101150025032 13 gene Proteins 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 4,4'-dipyridyl disulfide Chemical compound C=1C=NC=CC=1SSC1=CC=NC=C1 UHBAPGWWRFVTFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108010024284 Apolipoprotein C-II Proteins 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030009 Azurocidin Human genes 0.000 description 1
- 101710154607 Azurocidin Proteins 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- GMZAPVBINHQBQD-UHFFFAOYSA-N COCCO[S+]=P([O-])(O)O Chemical class COCCO[S+]=P([O-])(O)O GMZAPVBINHQBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710104316 Cell surface-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N Glycerol-phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(O)CO XYZZKVRWGOWVGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000932 Gonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108091027874 Group I catalytic intron Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000733802 Homo sapiens Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 101500026183 Homo sapiens Gonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001134442 Homo sapiens Pancreatic lipase-related protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001096022 Homo sapiens Phospholipase B1, membrane-associated Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000053002 Lipase-like Human genes 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067385 Myosin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 239000012570 Opti-MEM I medium Substances 0.000 description 1
- 208000003076 Osteolysis Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 239000004107 Penicillin G sodium Substances 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101100310691 Rattus norvegicus Spata6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005487 SCARB1 Proteins 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037118 Scavenger receptor class B member 1 Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- CESGKXMBHGUQTB-VONOSFMSSA-N [(1S,2S,6R,10S,11R,13S,14R,15R)-1,6,14-trihydroxy-8-(hydroxymethyl)-4,12,12,15-tetramethyl-5-oxo-13-tetracyclo[8.5.0.02,6.011,13]pentadeca-3,8-dienyl] tetradecanoate Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 CESGKXMBHGUQTB-VONOSFMSSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000489 anti-atherogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 102000005311 colipase Human genes 0.000 description 1
- 108020002632 colipase Proteins 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 210000000497 foam cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229960001442 gonadorelin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009716 hepatic expression Effects 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 208000006575 hypertriglyceridemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 208000001024 intrahepatic cholestasis Diseases 0.000 description 1
- 230000007872 intrahepatic cholestasis Effects 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 208000029791 lytic metastatic bone lesion Diseases 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000028 nontoxic concentration Toxicity 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 108010059531 pancreatic lipase-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019369 penicillin G sodium Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 108010024226 placental ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 208000030683 polygenic disease Diseases 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002810 primary assay Methods 0.000 description 1
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004141 reverse cholesterol transport Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 1
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000002966 stenotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 125000004354 sulfur functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- XQTLDIFVVHJORV-UHFFFAOYSA-N tecnazene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=C(Cl)C(Cl)=CC(Cl)=C1Cl XQTLDIFVVHJORV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Preparater og fremgangsmåter for å forhøye nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AJ i en pasient og for reduksjon av nivået av VLDL-kolesterol og LDL-kolesterol i en pasient, innbefattet preparater og fremgangsmåter som påvirker ekspresjonen av et gen, LJPG, som koder for et lipaseenzym som er et medlem av triacylglyserollipasefamilien, eller som påvirker enzymets enzymatiske aktivitet.
Description
OPPFINNELSENS OMRÅDE
Foreliggende oppfinnelse gjelder fremgangsmåter for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og HDL-kolesterol og apolipoprotein AI og hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og VLDL-kolesterol eller LDL-kolesterol.
Lipider
Lipider er vannuløselige organiske biomolekyler som er essensielle komponenter i forskjellige biologiske funksjoner, innbefattet lagring, transport og metabolisme av energi, og membranstruktur og -fluiditet. Lipider er avledet fra to kilder i mennesker og andre dyr: Noen lipider inntas som fett og oljer i kosten, mens andre lipider biosyntetiseres av mennesker eller dyr. I pattedyr er minst 10 % av kroppsvekten lipid, av hvilket hovedmengden foreligger som triacylglyseroler.
Triacylglyseroler, også betegnet triglyserider og triacylglyserider, er bygget opp av tre fettsyrer foresteret til glyserol. Triacylglyseroler i kosten lagres i fettvev som en energikilde eller hydrolyseres i fordøyelseskanalen ved triacylglyserol lipaser, av hvilke den viktigste er pancreatisk lipase. Triacylglyseroler transporteres mellom vev i form av lipoproteiner.
Lipoproteiner er micelleliknende aggregater som finnes i plasma og som inneholder forskjellige andeler av forskjellige typer av lipider og proteiner (betegnet apoproteiner). Det finnes fem hovedklasser av plasma lipoproteiner, som har som hovedfunksjon lipidtransport. Disse klassene er, opplistet med økende tetthet: chylomikroner; very low density-lipoprotein (VLDL); intermediate-density-lipoproteiner (IDL); low density-lipoproteiner(LDL); og high density-lipoproteiner (HDL). Selv om mange lipidtyper finnes forbundet med hver lipoproteinklasse transporterer hver klasse hovedsakelig en type lipid: triacylglyserolene beskrevet ovenfor transporteres i chylomikroner, VLDL og IDL, mens fosfolipider og kolesterolestere transporteres i HDL henholdsvis LDL.
Fosfolipider er di-fettsyreestere av glyserolfosfat som inneholder en polar gruppe koblet til fosfat. Fosfolipider er viktige strukturelle bestanddeler av cellemembraner. Fosfolipider hydrolyseres av enzymer som kalles fosfolipaser. Fosfatidylkolin, et eksempel på et fosfolipid, er en hovedbestanddel av de fleste cellemembraner i eukaryoter.
Kolesterol er den metabolske forløper for steroidhormoner og gallesyrer, så vel som en essensiell bestanddel av cellemembraner. Hos menneske og andre dyr inntas kolesterol i kosten, og syntetiseres også av lever og andre vev. Kolesterol fra kosten transporteres fra tarmen til leveren av store lipoproteinmolekyler i blodet. Leveren utskiller Very Low Density-Lipoprotein (VLDL), som transporterer kolesterol og kolesterolester og forskjellige andre forbindelser inn i blodomløpet. VLDL overføres delvis i fettvev til Low Density-Lipoprotein (LDL). LDL transporterer både fritt og foresteret kolesterol til kroppsvevene. High Density-Lipoprotein (HDL) transporterer kolesterol til leveren for nedbrytning og utskilling.
Membraner omgir alle levende celler og fungerer som en barriere mellom den intracellulære og den ekstracellulære avdeling. Membraner omslutter også den eukaryote cellekjerne, utgjør det endoplasmatiske reticulum og fyller spesialiserte funksjoner, for eksempel i myelinlaget som omgir aksoner. En typisk membran inneholder tilnærmet 40 % lipid og 60 % protein, men det er betydelig variasjon. De viktigste lipidbestanddelene er fosfolipider, nærmere bestemt fosfatidylkolin og fosfatidyletanolamin, og kolesterol. Membranenes biokjemiske egenskaper, for eksempel deres fiuiditet, kan endres ved å modifisere enten fosfolipidenes fettsyreprofil eller kolesterolinnholdet. Modulering av sammensetningen og organiseringen av membranlipidene modulerer også membranavhengige cellefunksjoner, for eksempel reseptoraktivitet, endocytose og kolesterolfluks.
Enzymer
WO 1998024888 A2 beskriver lipoprotein lipaselignende (LLG) polypeptider, samt fremgangsmåter og sammensetninger for behandling av sykdommer i lipidmetabolismen. Triacylglyserol lipaser er en enzymfamilie som spiller flere viktige roller i lipidmetabolismen i kroppen. Tre medlemmer av den humane triacylglyserol lipase familie har blitt beskrevet: pancreatis lipase, lipoprotein lipase og hepatisk lipase (Goldberg, I. J., Le, N.-A., Ginsberg, H.N., Krauss, R.M., og Lindgren, F. eks. T.
(1988) J. Clin. Invest. 81, 561-568; Goldberg, I. J., Le, N., Paterniti J.R., Ginsberg, H.N., Lindgren, F.T. og Brown, W.V. (1982) J. Clin. Invest. 70, 1184-1192; Hide, W.A., Chan, L., og Li, W.-H. (1992) J. Lipid. Res. 33,167-178). Pancreatisk lipase er først og fremst ansvarlig for hydrolyse av lipider fra kosten. Varianter av pancreatisk lipase er beskrevet, men disses fysiologiske rolle har ikke blitt bestemt (Giller, T., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D„ og Hunziker, W. (1992) J. Biol Chem. 267,16509-16516). Lipoprotein lipase er hovedenzymet som er ansvarlig for fordeling og utnyttelse av triglyserider i kroppen. Lipoprotein lipase hydrolyserer triglyserider i både chylomikroner og VLDL. Hepatisk lipase hydrolyserer triglyserider i IDL og HDL og er ansvarlig for lipoproteinremoduleringen. Hepatisk lipase fungerer også som en fosfolipase og hydrolyserer fosfolipider i HDL.
Fosfolipaser spiller viktige roller i katabolisme og remodulering av fosfolipidbestanddelen av lipoproteiner og fosfolipidene i membraner. Fosfolipaser spiller også en rolle i frigjørelse av arachidonsyre og påfølgende dannelse av prostaglandiner, leukotriener og andre lipider som deltar i en rekke inflammatoriske prosesser.
De ovenfor nevnte lipasene er tilnærmet 450 aminosyrer lange og har ledersignalpeptider for å lette utskillelsen. Lipasene består av to hoveddomener (Winkler, K., D'Arcy, A., og Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-774). Det aminoterminale domene inneholder det katalytiske sete, mens karboksyldomenet antas å være ansvarlig for subtratbinding, tilkobling av kofaktor og interaksjon med cellereseptorer (Wong, H., Davis, R.C., Nikazy, J., Seebart, K.E.„ og Schotz, M.C.
(1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88,11290-11294; van Tilbeurgh, H., Roussel, A., Lalouel, J.-M., og Cambillau, C. (1994) J. Biol. Chem. 269,4626-4633; Wong, H., Davis, R.C., Thuren, T., Goers, J.W., Nikazy, J., Waite, M., og Schotz, M.C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10319-10323; Chappell, D.A., Inoue, I., Fry, G.L., Pladet, M.W., Bowen, S.L., Iverius, P.-H., Lalouel, J.-M., og Strickland, D.K. (1994) J. Biol. Chem. 269, 18001-18006). Det totale nivå av aminosyrehomologi mellom familiemedlemmene er 22-65 %, med lokale områder med høy homologi som tilsvarer strukturelle homologier som er koblet til den enzymatiske funksjon.
Den naturlig forekommende lipoprotein lipase er glykosylert. Glykosylering er nødvendig for den enzymatiske LPL-aktivitet (Semenkovich, CF. eks., Luo, C-C, Nakanishi, M.K., Chen, S.-H., Smith, L.C, og Chan L. (1990) J. Biol. Chem. 265, 5429-5433). Det er to seter for N-koblet glykosylering i hepatisk lipase og lipoprotein lipase og ett i pancreatisk lipase. I tillegg danner fire cysteinsett de sulfidbroer som er avgjørende for opprettholdelse av den strukturelle integritet for enzymatisk aktivitet (Lo, J.-Y., Smith, L.C, og Chan, L. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 266-271; Brady, L., Brzozowski, A.M., Derewenda, Z.S., Dodson, E., Dodson G., Tolley, S., Turkenburg, J.P., Christiansen, L., Huge-Jensen B., Norskov, L., Thim, L., og Menge, U. (1990) Nature 343, 767-770).
Medlemmer av triacylglyserol lipase familien har felles et antall konserverte, strukturelle egenskaper. En slik egenskap er "GXSXG"-motivet, i hvilket den sentrale serinrest er en av de tre aminosyrerestene som utgjør den "katalytiske triade" (Winkler, K., D'Arcy, A., og Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-774; Faustinella, F. eks., Smith, L.C, og Chan, L. (1992) Biochemistry 31, 7219-7223). Konserverte aspartat- og histidinrester utgjør resten av den katalytiske triade. Et kort strekk på 19-23 aminosyrer ("lokk-området") danner en amfipatisk helix struktur og dekker enzymets katalytiske lomme (Winkler, K., D'Arcy, A., og Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-77'4). Dette område viser signifikant divergens mellom familiemedlemmene. Det har nylig blitt vist at dette aminosyrestrekket gir enzymene substratspesifisitet (Dugi, K.A., Dichek H.L., og Santamarina-Fojo, S. (1995) J. Biol. Chem. 270, 25396-25401). Sammenlikninger mellom hepatisk lipase og lipoprotein lipase har vist at forskjeller mellom enzymenes triacylglyserol lipaseaktivitet og fosfolipaseaktivitet delvis formidles av dette lokk-området (Dugi, K.A., Dichek H.L., og Santamarina-Fojo, S. (1995) J. Biol. Chem. 270, 25396-25401).
Triacylglyserol lipasene besitter varierende grad av heparinbindende aktivitet. Lipoprotein lipase har den høysete heparin affiniteten. Denne bindingsaktiviteten har blitt kartlagt til strekk med positivt ladete aminosyrerester i det aminoterminale domene (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.-S., Zhang, H., Forsythe, I.J., Clarke-Lewis, L, Hayden, M.R., og Brunzell, J.D. J. Lipid Res. 35,2049-2059). Lokaliseringen av lipoprotein lipase til endoteloverflaten (Cheng, CF. eks., Oosta, G.M., Bensadoun, A., og Rosenberg, R.D. (1981) J. Biol. Chem. 256, 12893-12896) formidles hovedsakelig via binding til proteoglykaner på overflaten (Shimada K., Gill, P.J., Silbert, J.E., Douglas, W.H.J., og Fanburg, B.L. (1981) J. Clin. Invest. 68, 995-1002; Saxena, U., Klein, M.G., og Goldberg, I.J. (1991)7. Biol. Chem. 266,17516-17521; Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., og Vlodavsky, I. (1992) J. Clin Invest. 90, 2013-2021). Det er denne bindingsaktiviteten som tillater enzymet å forhøye LDL-opptaket ved å fungere som en bro mellom LDL og celleoverflaten (Mulder, M., Lombardi, P., Jansen, H., vanBerkel T.J., Frants R.R., og Havekes, L.M. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185, 582-587; Rutledge, J.C, og Goldberg, I.J., (1994)7 Lipid Res. 35, 1152-1160; Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, T., Kobayashi, Y., Konno, T., og Tada, K. (1980) Int. J. Cancer 26,171-176).
Lipoprotein lipase og pancreatisk lipase vites begge å fungere sammen med koaktivatorproteiner: apolipoprotein CII for lipoprotein lipase; og colipase for pancreatisk lipase.
De genetiske sekvensene som koder for human pancreatisk lipase, hepatisk lipase og lipoprotein lipase har blitt rapportert (Genbank-aksessjonsbetegnelsene M93285, J03540 henholdsvis Ml5856). Budbringer-RNA for human hepatisk lipase og pancreatisk lipase er tilnærmet 1,7 henholdsvis 1,8 kilobaser langt. To mRNA-transkripter på 3,6 og 3,2 kilobaser dannes fra det humane lipoprotein lipasegen. Disse to transkriptene anvender alternative polyadenyleringssignaler og har forskjellig translasjonseffektivitet (Ranganathan, G., Ong, J.M., Yukht, A., Saghizadeh, M., Simsolo, R.B., Pauer, A., og Kern, P.A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7149-7155).
Fysiologiske prosesser
Lipidmetabolismen omfatter interaksjoner mellom lipider, apoproteiner, lipoproteiner og enzymer.
Hepatisk lipase og lipoprotein lipase er multifunksjonelle proteiner som formidler binding, opptak, katabolisme og remodulering av lipoproteiner og fosfolipider. Lipoprotein lipase og hepatisk lipase fungerer mens de er bundet til endotelcellers luminale overflate i perifert vev henholdsvis lever. Begge enzymer deltar i revers kolesteroltransport, som er bevegelse av kolesterol fra perifere vev til leveren, enten for utskillelse fra kroppen eller for resirkulering. Genetiske defekter i både hepatisk lipase og lipoprotein lipase vites å være årsaken til familiære forstyrrelser i lipoproteinmetabolisme. Defekter i metabolismen av lipoproteiner fører til alvorlige metabolske forstyrrelser, innbefattet hyperkolesterolemi, hyperlipidemi og aterosklerose.
RAPPORTERTE UTVIKLINGER
Aterosklerose er en komplisert, polygenisk sykdom defineres histologisk sett ved deponering (lipid- eller fibrolipidplakk) av lipider og andre blodderivater i blodkarvegger, særlig i de store arteriene (aorta, kransarterier, halsarterier). Disse plakk, som er mer eller mindre forkalket avhengig av utviklingsgraden av den aterosklerotiske prosess, kan være koblet til lesjoner og er forbundet med akkumulering i karene av fettdepoter som i det vesentlige består av kolesterolestere. Disse plakk er ledsaget av en fortykning av karveggen, hypertrofi av den glatte muskulatur, forekomst av skumceller (lipidfylte celler som dannes ved ukontrollert opptak av kolesterol fra rekrutterte makrofager) og akkumulering av fibrøst vev. Den ateromatøse plakk stikker markant ut fra karveggen, noe som gir den en stenoserende egenskap som er ansvarlig for vasculære okklusjoner ved atherom, trombose eller embolisme, som forekommer i de pasientene som er mest angrepet. Disse lesjonene kan føre til alvorlige kardiovasculære sykdomstilstander, for eksempel infarkt, plutselig død, hjertesvikt og slag.
High density lipoprotein ( HDL)- kolesterolnivå og aterosklerotiske sykdommer
High density lipoprotein (HDL)-kolesterolnivået er omvendt forbundet med faren for aterosklerotisk kardiovasculær sykdom (Gordon et al., N. Engl. J. Med., 321, 1311-1316
(1989)). Minst 50 % av variasjonen i HDL-kolesterolnivået er genetisk bestemt (Breslow, J.L., The Metabolic Basis of InhereitedDisease, 2031-2052, McGraw-Hill, New York (1995); Heller et al, N. Engl. J. Med., 328, 1150-1156 (1993)), men genene som er ansvarlige for variasjonen i HDL-nivået har ennå ikke blitt fullt ut identifisert. Lipoprotein lipase (LPL) og hepatisk lipase (HL), to medlemmer av triacylglyserol (TG) lipasefamilien, påvirker begge HDL-metabolismen (Breslow, supra; Murthy et al., Pharmacol. Ther., 70, 101-135 (1996); Goldberg, J. I., J. Lipid Res., 37, 693-707 (1996); Bensadoun et al, Curr. Opin. Lipidol, 7, 77-81 (1996)) og HL (LIPC)-locus har blitt assosiert med variasjon i HDL-kolesterolnivået hos mennesker (Cohen et al., J. Clin. Invest., 94, 2377-2384 (1994); Guerra et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94,4523-4537
(1997)). Det normale område for HDL-kolesterol er fra tilnærmet 35 til 65 mg/dL, og HDL-nivået bør utgjøre mer enn 25 % av det totale kolesterolnivå.
Very low density lipoprotein ( VLDL)- og low density lipoprotein ( LDL)-kolesterolnivået og aterosklerotiske sykdommer
Høyt nivå av LDL- og VLDL-kolesterol i sirkulasjonen er forbundet med forhøyet risiko for aterosklerose.
VLDL er forløperen til LDL. Terapeutiske midler som reduserer VLDL- og LDL - kolesterolnivået i plasma er svært ønskede grunnet den kjente, sterke assosiasjonen mellom disse lipidparametre og coronar hjertesykdom.
Epidemiologiske undersøkelser har vist et nært forhold mellom forhøyet LDL-kolesterol og coronar hjertesykdom (CHD) og andre aterosklerotiske vasculære sykdommer
(Kannell, WB., Am. J. Cardiol, 76, 69C-77C (1995)). Tre viktige, sekundære forhindringsforsøk utført med statiner har vist at en reduksjon av LDL-kolesterolnivået fører til signifikant reduksjon av CHD-begivenheter og totaldødelighet (Scandinavian Simvastatin Survival Study Group, Lancet, 344,1383-1389 (1994); Sacks et al, N. Engl. J. Med, 335,1001-1009 (1996); Tonkin et al, N. Engl. J. Med, 339,1349-1357
(1998); Grundy, S.M., Circulation, 1436-1439 (1998)). To store, primære forhindringsforsøk med statiner har også vist signifikant gunstig virkning av LDL-kolesterolreduksjon med statiner når det gjelder reduksjon av kardiovasculære begivenheter (Grundy, supra; Shepherd et al, N. Engl. J. Med, 333,1301-1307 (1995); Downs et al., JAMA, 279,1615-1622 (1998)). Imidlertid reduserer dagens behandlingsmåter ikke kolesterolnivået i tilstrekkelig grad hos alle personer. VLDL-kolesterolnivået vites også å være assosiert med forhøyet risiko for CHD (Kannell, supra). Dagens behandlingsformer har ikke så mye virkning når det gjelder reduksjon av VLDL-kolesterol som de har på LDL-kolesterol. Det er derfor fortsatt behov for nye tilnærminger for reduksjon av både LDL-kolesterol og VLDL-kolesterol.
Det ideelle område for VLDL-kolesterol er fra tilnærmet 1 til 30 mg/dL og området for LDL-kolesterol er fra tilnærmet 60 til 160 mg/dL. Det ideelle forhold mellom LDL og HDL er lavere enn 3,5.
Triacylglyserol lipasers rolle i aterosklerotiske sykdommer
Triacylglyserol lipasers rolle i vasculære sykdomstilstander, for eksempel aterosklerose, har vært et grundig undersøkt område (se oversikt i Olivecrona, G., og Olivecrona, T.
(1995) Curr. Opin. Lipid. 6,291-305). Generelt antas virkningen av lipoprotein lipase å være antiaterogen, siden dette enzym reduserer triacylglyserolnivået i serum og fremmer dannelse av HDL. Transgene dyr som uttrykker humant lipoprotein lipase har redusert nivå av triglyserider i plasma og forhøyet nivå av high density lipoprotein (HDL) (Shimada, M, Shimano, H., Gotoda, T., Yamamoto, K., Kawamura, M, Inaba, T., Yazaki, T., og Yamada, N. (1993)7 Biol. Chem. 268, 17924-17929; Liu, M.-S., Jirik, F.R., LeBoeuf, R.C., Henderson, H., Castellani, L.W., Lusis, A.J., ma, Y., Forsythe, I.J., Zhang, H., Kirk, E., Brunzell, J.D., og Hayden, M.R. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11417-11424). Mennesker med genetiske defekter som fører til redusert nivå av lipoprotein lipase aktivitet har blitt vist å ha hypertriglyseridemi, men ingen forhøyet risiko for coronar hjertesykdom. Dette rapporteres å skyldes manglende produksjon av aterogene lipoproteiner av intermediær størrelse som kan akkumulere i subendotelrommet (Zilversmit, D.B. (1973) Circ. Res. 33, 633-638). I motsetning til lipoprotein lipase (LPL) ser den fysiologiske funksjon til HL ut til å være forbundet med metabolisme av lipoproteinrester og HDL (Bensadoun et al., Curr. Opin. Lipidol, 7, 77-81 (1996)). Genetisk mangel på HL er forbundet med et moderat forhøyet nivå av lipoproteinrester og HDL-kolesterol i mennesker (Hegele et al, Arterioscler, Thromb., 13, 720-728 (1993)) og mutante mus (Homanics et al, J. Biol. Chem., 270, 2974-2980 (1995)). Trass i forhøyet kolesterolnivå i plasma er HL-mangel forbundet med redusert aterosklerose i apoE-mutante mus (Mezdour et al, J. Biol. Chem., 272, 13570-13575 (1997)). Transgene dyr som overuttrykker HL har redusert HDL (Busch et al, J. Biol. Chem., 269,16376-16382 (1994); Fan et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 91, 8724-8728 (1994)). Forhøyet HL-aktivitet hos mennesker er forbundet med lavt HDL-kolesterol. HL-locus på kromosom 15q21 har blitt forbundet med variasjon i HDL-kolesterolnivået i plasma hos mennesker (Cohen et al., J. Clin. Invest., 94, 2377-2384 (1994); Guerra et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94,4532-4537
(1997)), men utgjør bare en del av det genetiske bidrag til variasjon i HDL-kolesterolnivået. Det er minst ett hovedlocus som påvirker HDL-kolesterolnivået hos mennesker som er forskjellig fra HL-locus (Mahaney et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol, 15, 1730-1739(1995)).
I det lokaliserte sete for en aterosklerotisk lesjon antas det forhøyede lipaseaktivitetsnivå å akselerere den aterogene prosess (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C, Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden, M.R., og Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341, 1119-11212). Dette kan skyldes øket binding og opptak av lipoproteiner ved vasculært vev, formidlet av lipaser (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90, 2013-2021; Tabas, I., Li, I., Brocia R.W., Xu, S.W., Swenson T.L. Williams, KJ.
(1993) J. Biol. Chem. 268, 20419-20432; Nordestgaard, B.G., og Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5, 252-257; Williams, K.J., og Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vase. Biol. 15, 551-561). I tillegg kan et fritt lokalt lipaseaktivitetsnivå føre til dannelse av cytotoksisk nivå av fettsyrer og lysofosfatidylkolin i forstadiene til de aterosklerotiske lesjoner.
Trass i den forståelse som har blitt utviklet vedrørende lipaseenzymaktivitetens rolle for regulering av lipidnivået, og nivået av de forskjellige plasmalipoproteinene, er det behov for identifisering og utvikling av behandlingsformer som kan øke nivået av HDL-kolesterol, samt redusere nivået av VLDL- og LDL-kolesterol, slik at faren for utvikling av aterosklerotiske kardiovasculære sykdommer reduseres.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og HDL-kolesterol og apolipoprotein AI og hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og VLDL-kolesterol og å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og LDL-kolesterol.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, kjennetegnet ved at den omfatter: (A) måling av nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI i en første prøve som omfatter: (1) HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, (2) LIPG-polypeptid, og (3) analyseforbindelsen, med nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI i en annen prøve som omfatter: (4) HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, og (5) LIPG-polypeptid; og (B) fastsettelse av hvorvidt analyseforbindelsen effektivt inhiberer den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og HDL-kolesterol og apolipoprotein AI ved å observere hvorvidt den første prøve har et høyere nivå av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI enn den andre prøven.
Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og VLDL-kolesterol, kjennetegnet ved at den omfatter: (A) sammenlikning av VLDL-kolesterolnivået i en første prøve som omfatter: (1) VLDL-kolesterol, (2) LIPG-polypeptid, og (3) analyseforbindelsen, med VLDL-kolesterolnivået i en annen prøve som omfatter: (4) VLDL-kolesterol, og (5) LIPG-polypeptid; og (B) bestemmelse av hvorvidt analyseforbindelsen effektivt fremmer den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og VLDL-kolesterol ved å observere hvorvidt den første prøve har et lavere VLDL-kolesterolnivå enn den andre prøven.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og LDL-kolesterol, kjennetegnet ved at den omfatter: (A) sammenlikning av LDL-kolesterolnivået i en første prøve som omfatter: (1) LDL-kolesterol, (2) LIPG-polypeptid, og (3) analyseforbindelsen, med LDL-kolesterolnivået i en annen prøve som omfatter: (4) LDL-kolesterol, og (5) LIPG-polypeptid; og (B) bestemmelse av hvorvidt analyseforbindelsen effektivt fremmer den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og LDL-kolesterol ved å observere hvorvidt den første prøve har et lavere LDL-kolesterolnivå enn den andre prøven.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser sekvensen (SEKV. ID. NR.: 17-31) til primerne som anvendes i PCR-amplifiseringene i eksemplene. Figur 2 viser nukleinsyresekvensen (SEKV. ID. NR.: 1) og den utledete aminosyresekvensen (SEKV. ID. NR.: 2) til differensiell fremvisnings-RT-PCR-produktet som inneholder LIPG-gen-cDNA. Sekvensene som tilsvarer de to primere som ble anvendt i amplifiseringen er understreket. Termineringskodon og polyadenyleringssignal er innrammet. GAATTC-motivene og den flankerende sekvens er fra vektoren pCRII, i hvilken produktet ble klonet. Figur 3 viser nukleinsyresekvensen (SEKV. ID. NR.: 3) og den utledete aminosyresekvensen (SEKV. ID. NR.: 4) til 5' RACE-forlengelsen av LIPG-cDNA. Sekvensene som tilsvarer de to primere som ble anvendt i amplifiseringen er understreket. GAATTC-motivene og den flankerende sekvens er fra vektoren pCRII, i hvilken produktet ble klonet. Figur 4 viser sekvensen (SEKV. ID. NR.: 7) til cDNA som inneholder den fullstendige åpne leseramme for LIPG-genet, LLGXL. Startkodonet (ATG) og termineringskodonet (TGA) er innrammet. Dral-setet (TTTAAA) og Srfl-setet (GCCCGGGC) som ble anvendt ved konstruksjonen av ekspresjonsvektorene er understreket. Figur 5 viser den utledete aminosyresekvensen (SEKV. ID. NR.: 8) til LLGXL-proteinet. Den formodete signalsekvens er understreket. Figur 6 viser en proteinsekvenssammenstilling mellom medlemmene av triacylglyserollipasegenfamilien (SEKV. ID. NR.: 13-15). Skraverte aminosyrerester er identiske med LLGXL-proteinet (SEKV. ID. NR.: 8). Den utledete aminosyresekvens for human LIPG (EL) gis som øverste linje og sammenliknes med de andre hovedmedlemmene av TG-lipasefamilien: LPL, HL og PL. EL-aminosyrerester som er identiske med aminosyreresten i minst ett annet medlem av familien er skraverte, likeså den tilsvarende aminosyrerest i det andre familiemedlemmet. Aminosyrene er nummerert på konvensjonell måte, med begynnelse ved den første aminosyrerest i det utskilte protein. De utledete signalpeptidkløyvingssetene er markert med en heltrukket linje mellom aminosyrerestene. GXSXG-lipasemotivet som inneholder den aktive serin er innrammet. Aminosyrene i den katalytiske triade er markert med en stjerne. De konserverte systeinrestene er markert med fylte sirkler. Mulige seter for N-koblet glykosylering er markert med pilhoder. Lokkområdet er angitt med en tykk linje. Gap ble innført i sekvensene for maksimalisering av sammenstillingsverdien ved anvendelse av programmet CLUSTAL. Figur 7 viser en Northern-analyse av LIPG-mRNA i THP-1 -celler. Cellene ble stimulert med enten PMA eller PMA og oksidert LDL (PMA + oxLDL). Tallene til venstre angir posisjonen for RNA-standarder (i kilobaser). Figur 8 viser en Northern-blot analyse av ekspresjonen av LIPG-mRNA, sammenliknet med LPL i humane vev. Et blot som inneholdt mRNA fra de angitte humane vev ble inkubert med radioaktivt LPL- og P-aktin (ACTB)-probe som beskrevet. Figur 9 viser en Northern-blot analyse av dyrkede cellelinjer. Feltet til venstre (sporene 1-6) ble hybridisert med LIPG (EL)-proben, og feltet til høyre (sporene 7-12) med LPL-proben. Sporene 1 og 7: ikke-stimulerte HUVEC; sporene 2 og 8: HUVEC stimulert med PMA; sporene 3 og 9: HUVEC stimulert med thrombin; sporene 4 og 10: ikke-stimulerte HCAEC; sporene 5 og 11: HCAEC stimulert med PMA; sporene 6 og 12: THP-1 stimulert med PMA. Figur 10 viser sekvensen til immuniseringspeptidet (SEKV. ID. NR.: 16) og dens slektskap med LLGXL-proteinsekvensen. Peptidet er vist i den skraverte boksen. Den terminale systein ble innført for å lette kobling av peptidet til bærerproteinet. Figur 11 viser resultatene erholdt ved immunblotanalyse av kondisjonert medium fra HUVEC og HCAEC med anti-EL-peptidantiserum fra kanin. Spor 1: ikke-kondisjonert medium; spor 2: ikke-stimulerte HUVEC; spor 3: HUVEC stimulert med PMA; spor 4: ikke-stimulerte HCAEC; spor 5: HCAEC stimulert med PMA. Figur 12 viser en Western-analyse av heparin-sefarose-bundne proteiner i kondisjonert medium fra COS-7-celler som er forbigående transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder et cDNA for LLGN eller LLGXL eller uten DNA (narretransfeksjon). Proteiner fra PMA-stimulerte endotelceller (HCAEC + PMA) inngikk som størrelsesreferanser.
Tallene til venstre angir den tilsynelatende molekylvekt for de viktigste immunreaktive proteinene, bestemt ved sammenlikning med proteinstandardene. Figur 13 viser sekvensen til LIPG-PCR-produktet fra kanin (RLLG.SEK. SEKV. ID. NR.: 12) og en sekvenssammenstilling mellom LIPG-PCR-produktet fra kanin og den tilsvarende sekvens i det humane cDNA (LLG7742A). Identiske nukleotider er skraverte. Figur 14 viser fosfolipase A-aktiviteten til human EL-AS, EL og LPL ved anvendelse av et fosfatidylkolinsubstrat. For utførelse av analysen ble 700^1 kondisjonert medium høstet fra COS-7-celler forbigående transfektert med ekspresjonskonstruksjoner for enten pcDNA3.0/LIPG-AS, LIPG eller LPL analysert i triplikat for fosfolipaseaktivitet som beskrevet nedenfor. Etter 2 timers inkubering ved 37 °C ble reaksjonene stanset, og 14C-merket fri fettsyre ble ekstrahert og radioaktiviteten målt for bestemmelse av mengden dannet fri fettsyre. Figur 15 viser triacylglyserid lipaseaktiviteten til human EL-AS, EL og LPL ved anvendelse av et trioleinsubstrat. For utførelse av analysen ble 700^1 kondisjonert medium høstet fra COS-7-celler forbigående transfektert ved ekspresjonskonstruksjoner for enten pcDNA3.0/LIPG-AS, LIPG eller LPL analysert i triplikat for triglyseridaktivitet som beskrevet nedenfor. Etter to timers inkubering ved 37 °C ble reaksjonene stanset, og 14C-merket fri fettsyre ble ekstrahert og radioaktiviteten målt for bestemmelse av mengde dannet fri fettsyre. Figur 16 viser hybridisering av LIPG- og LPL-prober til genomisk DNA fra forskjellige arter. Figur 17 viser ekspresjon av LIPG i lever hos villtypemus 5 dager etter injeksjon av AdhEL. Spor 1: lever fra mus injisert med Adnull; spor 2: lever fra mus injisert med AdhEL. Figur 18 viser nivået i plasma av HDL-kolesterol i AdhEL- og Adnull-injiserte villtypemus. Figur 19 viser lipoproteinprofilen i villtypemus injisert med AdhEL og Adnull ved basallinjen før injeksjon (venstre) og 14 dager etter injeksjonen (høyre). Figur 20 viser HDL-kolesterol nivået hos mus transgene for humant ApoA-I etter injeksjon av AdhEL eller Adnull. Figur 21 viser ApoA-I-nivået i mus transgene for humant apoA-1 etter injeksjon med AdhEL eller Adnull. Figur 22 viser virkningen av injeksjon av AdhEL i LDL-reseptormanglende mus på VLDL/LDL-kolesterolnivået. Figur 23 viser virkningen av AdhEL i HDL-reseptormanglende mus på HDL-kolesterol nivået. Figur 24 er en Western-blot analyse av LIPG (EL) som viser virkningen av glykosidase og tunicamycin på EL. Fra venstre mot høyre er sporene: ubehandlet EL-kontroll, EndoF-behandlet EL, EndoH-behandlet EL, neuraminidasebehandlet EL, markør, plasmaprøve, ubehandlet EL-lysat, tunicamycinbehandlet EL-lysat, ubehandlet nedsentrifugert EL, tunicamycinbehandlet nedsentrifugert EL, ubehandlet EL-medium, tunicamycinbehandlet EL-medium, markør, plasma. Figur 25 er et Western-blot som viser virkningen på EL av heparintilførsel. "Pre"-sporene er blodprøver tatt fra mus før heparininjeksjon, "post"-sporene er blodprøver tatt etter heparininjeksjonen. "Kontrollvirus" inneholdt ikke EL, "EL-virus" var en adenovirusvektor som uttrykte EL. Figurene 26A og 26B er stolpediagrammer som viser triglyseridaktiviteten (fig. 26A) og fosfolipaseaktiviteten (fig. 26B) av LPL (lipoprotein lipase), HL (hepatisk lipase) og EL (endotelial-lipase). Figurene 27A og 27B er kurver som viser virkningen av humant serum på triglyseridaseaktiviteten av lipoprotein lipase (fig. 27A) og triglyseridaseaktiviteten til endotel-lipase (fig. 27B). Figurene 28A og 28B viser EL-ekspresjonen ved forskjellige virusdoser. Figur 28A er et Western-blot som viser det foreliggende EL ved de forskjellige virusdosene. Figur 28B viser fosfolipaseaktiviteten ved de forskjellige virusdosene.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Enzymatisk aktivitet av LIPG- genprodiiktet
Regulering av nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, VLDL-kolesterol og LDL-kolesterol kan utføres ved anvendelse av fremgangsmåter og preparater som reduserer eller øker aktiviteten av LIPG-lipase enzymet. Foreliggende oppfinnelse erdelvis basert på oppdagelsen av den enzymatiske aktivitet til polypeptidproduktene fra LIPG-genet på HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, VLDL-kolesterol og LDL-kolesterol. Polypeptidproduktene fra LIPG er medlemmer av triacylglyserollipasefamilien og omfatter et katalytisk domene på tilnærmet 39 kD fra triacylglyserollipasefamilien, for eksempel med sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 10. Siden denne nyoppdagede lipase ble funnet og syntetiseres av endotelceller, og siden dette er en unik egenskap sammenliknet med andre medlemmer av triacylglyserollipasefamilien, har denne lipasen blitt kalt "endotel-lipase" (EL). Siden LIPG-genet vil bli diskutert omfattende i seksjonene som følger vil EL i det påfølgende betegnes LIPG-polypeptid, for klarhetens skyld. Generelt finnes LIPG-polypeptidet i to hovedformer som i det påfølgende betegnes "LLGN-polypeptidet" og "LLGXL-polypeptidet". LLGN-polypeptidet har 354 aminosyrer. LLGXL-polypeptidet har 500 aminosyrer og viser 43 % likhet med human lipoprotein lipase og 37 % likhet med human hepatisk lipase. Som anvendt heri omfatter begrepet "LIPG-polypeptid" eller "LIPG-protein" både LLGN og LLGXL.
Sekvensen til LIPG-polypeptidet omfatter det karakteristiske lipasemotiv GXSXG, en konservert katalytisk triade, et lokkområde på 19 aminosyrerester, konserverte bindingsseter for heparin og lipoprotein, og 5 mulige seter for N-koblet glykocylering. Området med den største sekvensdivergens i triacylglyserollipasefamilien er lokkdomenet, som danner en amfipatisk helix som dekker enzymets katalytiske lomme Winkler et al, Nature, 343,771-774 (1990); van Tilbeurgh et al, J. Biol. Chem., 269, 4626-4633 (1994)) og gir enzymene i denne familie deres substratspesifisitet (Dugi et al.,./. Biol. Chem., 270, 25396-25401 (1995)). Lokkområdet på 19 aminosyrerester i LIPG er tre aminosyrerester kortere og mindre amfipatisk enn de tilsvarende områder i lipoproteinlipase og hepatisk lipase, noe som er i samsvar med en forskjellig enzymatisk profil. Den utledete molekylvekt for det modne protein er tilnærmet 55 kD, en form på 68 kD er sannsynligvis en glykocylert form, mens en form på 40 kD kan være produktet av en spesifikk proteolytisk kløyving.
LIPG-polypeptidet har evnen til å redusere nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, så vel som nivået av VLDL-kolesterol og LDL-kolesterol. Det er vel etablert at et redusert HDL-kolesterol nivå fører til øket fare for aterosklerose og at et forhøyet HDL-kolesterol nivå i dramatisk grad kan redusere faren for aterosklerose.
En fysiologisk rolle for LIPG kan være å hydrolysere HDL-fosfolipid i perifere vev og i lever for å lette selektivt opptak av HDL-kolesterylester via HDL-reseptoren SR-BI (Kozarsky et al, Nature, 387, 414-417 (1997)). En annen mulig rolle er stimulering av opptaket av apoB-holdige lipoproteinrester, på tilsvarende måte som hepatisk lipase (Mahley et al, J. Lipid Res., 40, 1-16 (1999)). I tillegg uttrykkes LIPG i stor grad i placenta, og en rolle for dette enzym i utviklingsprosessen er mulig, tatt i betraktning lipidtransportens betydning for fosterutviklingen (Farese et al., Trends Genet., 14, 115-120 (1998)).
Basert på de fordelaktige egenskaper til HDL-kolesterol er det ønskelig å forhøye HDL-kolesterol nivået ved å redusere den enzymatiske aktivitet av LIPG.
Med utgangspunkt i LIPG-polypeptidets evne til å redusere nivået av VLDL-kolesterol og LDL-kolesterol og undersøkelsene som viser en sammenheng mellom høyt nivå av disse forbindelser og aterosklerotiske sykdommer, er det ønskelig å redusere nivået av disse forbindelsene i en pasient.
Definisjoner
De påfølgende definerte begreper anvendes gjennomgående i den foreliggende beskrivelse og vil være til hjelp for å forstå og utføre foreliggende oppfinnelse.
Et "polypeptid" er en polymer forbindelse som består av kovalent sammenbundete aminosyrerester. Aminosyrer kan inndeles i syv grupper basert på sidekjeden: (1) alifatiske sidekjeder, (2) sidekjeder som inneholder en hydroksylgruppe (OH-gruppe), (3) sidekjeder som inneholder svovelatomer, (4) sidekjeder som inneholder en sur gruppe eller en amidgruppe, (5) sidekjeder som inneholder en basisk gruppe, (6) sidekjeder som inneholder en aromatisk ring, og (7) prolin, en aminosyre i hvilken sidekjeden er fusjonert til aminogruppen.
Et "protein" er et polypeptid som spiller en strukturell eller funksjonell rolle i en levende celle.
Polypeptidene og proteinene kan være glykocylerte eller ikke-glykocylerte.
"Homologi" betyr en sekvenslikhet som reflekterer et felles evolusjonært opphav. Polypeptider eller proteiner sies å være homologe eller vise likhet dersom et vesentlig antall av aminosyrene enten (1) er identiske, eller (2) har sidekjeder som likner hverandre kjemisk. Nukleinsyrer sies å vise homologi dersom en vesentlig andel av nukleotidene er identiske.
"Isolert polypeptid" eller "isolert protein" er et polypeptid eller protein som i det vesentlige er fritt for forbindelser som det er forbundet med i sin naturlige tilstand (for
eksempel andre proteiner eller polypeptider, nukleinsyrer, karbohydrater, lipider). "Isolert" er ikke ment å ekskludere kunstige eller syntetiske blandinger med andre forbindelser eller nærvær av urenheter som ikke forstyrrer den biologiske aktivitet, og som for eksempel kan foreligge grunnet ufullstendig rensing, tilsetting av stabilisatorer eller urforming til et farmasøytisk aksepterbart preparat.
Et molekyl er "antigent" dersom det kan interagere spesifikt med et antigengjenkjenningsmolekyl i immunsystemet, for eksempel et immunoglobulin (antistoff) eller en T-celle-antigenreseptor. Et antigent polypeptid inneholder minst tilnærmet 5, og mer foretrukket minst tilnærmet 10, aminosyrer. En antigen del av et molekyl kan være den delene som er immundominant for gjenkjenning av antistoff eller T-cellereseptor, eller det kan være en del som anvendes for å frembringe et antistoff mot molekylet ved å konjugere den antigene delen til et bærermolekyl for immunisering. Et molekyl som er antigent er ikke nødvendigvis selv immunogent, det vil si i stand til å utløse en immunrespons uten en bærer.
"LLGN-polypeptid" og "LLGN-protein" betyr et polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 6, hvor polypeptidet er glykocylert eller ikke glykocylert.
"LLGXL-polypeptid" og "LLGXL-protein" betyr et polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 8, hvor polypeptidet er glykocylert eller ikke glykocylert.
"LIPG-polypeptid" og "LIPG-protein" beskriver lipaseenzymet som kodes av LIPG-genet, og beskriver generisk både LLGN-polypeptidet og LLGXL-polypeptidet.
"Endotel-lipase" eller "EL" viser til lipaseenzymet som kodes av LIPG-genet og er ekvivalent med begrepet LIPG-polypeptid.
LIPG-polypeptidet eller -proteinet omfatter enhver analog, ethvert fragment, ethvert derivat eller enhver mutant som er avledet fra et LIPG-polypeptid og som bibeholder minst en biologisk egenskap forbundet med LIPG-polypeptidet. Forskjellige varianter av LIPG-polypeptidet finnes i naturen. Disse variantene kan være alleliske varianter, som særpreges ved forskjeller i nukleotidsekvensene i det strukturelle gen som koder for proteinet, eller de kan omfatte differensiell spleising eller posttranslasjonell modifisering. Fagpersonen kan fremstille varianter med en eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner, -addisjoner eller erstatninger. Disse variantene kan blant annet omfatte: (a) varianter hvor en eller flere aminosyrerester er utbyttet med konservative eller ikke-konservative aminosyrer, (b) varianter hvor en eller flere aminosyrer er innført i LIPG-polypeptidet, (c) varianter hvor en eller flere av aminosyrene omfatter en substituentgruppe, og (d) varianter i hvilke LIPG-polypeptidet er fusjonert til et annet polypeptid, for eksempel serumalbumin. Andre LIPG-polypeptider ifølge oppfinnelsen omfatter varianter i hvilke aminosyrerestene fra en art er innsatt i stedet for de tilsvarende aminosyrerestene i en annen art, enten i konserverte eller ikke-konserverte posisjoner. I en annen utførelse erstattes aminosyrerester i ikke-konserverte posisjoner med konservative eller ikke-konservative aminosyrerester. Teknikkene for erholdelse av disse variantene, innbefattet genetiske (supresjoner, delesjoner, mutasjoner og så videre), kjemiske og enzymatiske teknikker, er kjente blant gjennomsnittsfagfolk.
Dersom slike alleliske varianter, analoger, fragmenter, derivater, mutanter og modifikasjoner, innbefattet alternative mRNA-spleiseformer og former med alternativ posttranslasjonell modifisering, fører til derivater av LIPG-polypeptidet som bibeholder en eller flere av LIPG-polypeptidets biologiske egenskaper omfattes de av foreliggende oppfinnelse.
En "nukleinsyre" er en polymer forbindelse som består av kovalent sammenbundete subenheter betegnet nukleotider. Nukleinsyre omfatter polyribonukleinsyre (RNA) og polydeoksyribonukleinsyre (DNA), som begge kan være enkelttrådete eller dobelttrådete. DNA omfatter cDNA, genomisk DNA, syntetisk DNA og semisyntetisk DNA. Nukleotidsekvensen som koder for et protein betegnes "sense"-sekvensen.
En ""antisense"-nukleinsyre" er en nukleotidsekvens som er komplementær til "sense"-sekvensen. "Antisense"-nukleinsyrer kan anvendes for nedregulering eller blokkering av ekspresjonen av polypeptidet som kodes av "sense"-tråden.
"Isolert nukleinsyre" betyr en nukleinsyre som i det vesentlige er fri for forbindelser som den normalt er forbundet med i sin naturlige tilstand. "Isolert" er ikke ment å ekskludere kunstige eller syntetiske blandinger med andre forbindelser eller nærvær av urenheter som ikke forstyrrer den biologiske aktivitet, og som for eksempel kan foreligge grunnet ufullstendig rensing, tilsetting av stabilisatorer eller utforming til et farmasøytisk aksepterbart preparat.
Begrepet "en nukleinsyre som hybridiserer ved høy stringens" betyr at de hybridiserte nukleinsyrene kan tåle vask under betingelser med høy stringens. Et eksempel på vaskebetingelser med høy stringens for DNA-DNA-hybrider er 0,1 X SSC, 0,5 % SDS ved 68 °C. Andre vaskebetingelser med høy stringens er kjente blant gj ennomsnittsfagfolk.
"Regulatorisk område" betyr en nukleinsyresekvens som regulerer ekspresjonen av en nukleinsyre. Et regulatorisk område kan omfatte sekvenser som naturlig er ansvarlige for ekspresjon av en gitt nukleinsyre (homologt område), eller det kan omfatte sekvenser med et annet opphav (ansvarlige for ekspresjon av andre proteiner eller til og med syntetiske proteiner). Nærmere bestemt kan sekvensene være sekvenser fra eukaryote eller virale gener eller avledede sekvenser som stimulerer eller undertrykker transkripsjonen av et gen på en spesifikk eller uspesifikk måte, og på en induserbar eller ikke-induserbar måte. Regulatoriske områder omfatter replikasjonsorigi, RNA-spleiseseter, enhancere, transkripsjonstermineringssekvenser, signalsekvenser som styrer polypeptidet inn i målcellens sekretoriske reaksjonsveier, og promotere.
Et regulatorisk område fra en "heterolog kilde" er et regulatorisk område som ikke er naturlig forbundet med den uttrykte nukleinsyren. Innbefattet blant de heterologe regulatoriske områdene er regulatoriske områder fra en annen art, regulatoriske områder fra et annet gen, hybride regulatoriske sekvenser og regulatoriske sekvenser som ikke forekommer i naturen, men som har blitt utformet av en gjennomsnittsfagperson.
En "vektor" er ethvert middel for innføring av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i en vertscelle. Begrepet "vektor" omfatter både virale og ikke-virale midler for innføring av nukleinsyren i en prokaryot eller en eukaryot celle in vitro, ex vivo eller in vivo. Ikke- virale vektorer omfatter plasmider, liposomer, elektrisk ladete lipider (cytofektiner), DNA-proteinkomplekser og biopolymerer. Virale vektorer omfatter retrovirusvektorer, adenoassosiert virusvektorer, koppevirusvektorer, baculovirusvektorer, kukoppevirusvektorer, herpes simplex-virusvektorer, Epstein-Barr-virusvektorer og adenovirusvektorer. I tillegg til nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan en vektor også inneholde ett eller flere regulatoriske områder og/eller seleksjonsmarkører som er anvendbare for seleksjon, måling og analyse av nukleinsyreoverføringsresultater (overføring til hvilke vev, ekspresjonens varighet og så videre).
En "rekombinant celle" er en celle som inneholder en nukleinsyre som ikke naturlig foreligger i cellen. "Rekombinant celle" omfatter høyere eukaryote celler som pattedyrceller, lavere eukaryote celler som gjærceller, prokaryote celler og arkebakterielle celler.
"Farmasøytisk aksepterbart bærestoff" omfatter fortynningsmidler og fyllstoffer som er farmasøytisk aksepterbare for forskjellige tilførselsfremgangsmåter, er sterile og kan være vandige eller oljeaktige suspensjoner dannet ved anvendelse av egnede dispersjonsmidler, fuktningsmidler og suspensjonsmidler. Det gitte farmasøytisk aksepterbare bærestoff og forholdet mellom aktiv forbindelse og bærestoff bestemmes ut fra preparatets løselighet og kjemiske egenskaper, den valgte tilførselsvei og standard farmasøytisk praksis.
En "lipase" er et protein som kan kløyve et lipidsubstrat enzymatisk.
En "fofsfolipase" er et protein som kan kløyve et fosfolipidsubstrat enzymatisk.
En "triacylglyserollipase" er et protein som kan kløyve et triacylglyserid substrat enzymatisk.
"Fosfatidylkolin" er et glyserolfosfolipid. Fosfatidylkolin betegnes også lesitin.
"Lipidprofil" betyr settet bestående av konsentrasjonen av kolesterol, triglyserid, lipoproteinkolesterol og andre lipider i kroppen til et menneske eller et annet dyr.
En "uønsket lipidprofil" er den tilstand hvori konsentrasjonen av kolesterol, triglyserid eller lipoproteinkolesterol ligger utenfor det alders- og kjønnsjusterte referanseområde. Generelt anses en konsentrasjon av totalkolesterol >200 mg/dl, av plasmatriglyserider >200 mg/dl, av LDL-kolesterol >130 mg/dl, av HDL-kolesterol <39 mg/dl eller et forhold mellom totalkolesterol og HDL-kolesterol >4,0 som en uønsket lipidprofil. En uønsket lipidprofil er forbundet med en rekke patologiske tilstander, innbefattet hyperlipidemi, diabetes, hyperkolesterolemi, aterosklerose og andre former for krans arteriesykdommer.
Et "ribozym" er et RNA-molekyl som kan fungere som et enzym.
Et "nøytraliserende antistoff" er et antistoff som kan bindes til et LIPG-polypeptid og redusere eller fjerne LIPG-polypeptidets enzymatiske aktivitet. Disse antistoffene kan være monoklonale antistoffer eller polyklonale antistoffer.
Et "inhibitorisk molekyl" eller en "inhibitor" er et molekyl som reduserer eller fjerner ekspresjonen av LIPG-polypeptidet eller som reduserer eller fjerner LIPG-polypeptidets enzymatiske aktivitet.
Et "enhancermolekyl" eller en "enhancer" er et molekyl som forhøyer ekspresjonen av LIPG-polypeptidet eller som øker LIPG-polypeptidets enzymatiske aktivitet.
Et "liposom" er en kunstig eller naturlig forekommende fosfolipidvesikkel.
Et "kationisk liposom" er et liposom med positiv elektrisk netto ladning.
Seksjonene som følger diskuterer elementene som anvendes i fremgangsmåtene og preparatene ifølge kravene og de foretrukne utførelser av disse elementene.
Polypeptider
Foreliggende oppfinnelse anvender polypeptider som kodes av LIPG, som er medlemmer av triacylglyserollipasefamilien og som omfatter et katalytisk domene på 39 kD fra triacylglyserollipasefamilien, for eksempel med sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 10.1 visse utførelser av foreliggende oppfinnelse anvendes et isolert LIPG-polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 6 og som har en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 40 kD i en 10 % SDS-PAGE-gel. I en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse anvendes et isolert LIPG-polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 8 og som har en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 55 kD eller 68 kD i en 10 % SDS-PAGE-gel. Videre kan polypeptidene som anvendes være subfragmenter av disse polypeptidene også antistoffer som kan bindes til et LIPG-polypeptid kan anvendes.
Polypeptidene og proteinene som anvendes kan være rekombinante polypeptider, naturlige polypeptider eller syntetiske polypeptider, og de kan ha opphav i menneske, kanin eller andre dyr. Polypeptidene særpreges ved en reproduserbar, enkelt molekylvekt og/eller et sett av flere molekylvekter, en kromatografisk responsprofil og elueringsprofil, aminosyresammensetning og -sekvens, samt biologisk aktivitet.
Polypeptidene kan være isolert fra naturlige kilder, for eksempel placentaekstrakter, humant plasma eller kondisjonert medium fra dyrkede celler, for eksempel makrofager eller endotelceller, ved anvendelse av rensefremgangsmåtene som er kjente blant fagfolk.
Alternativt kan polypeptidene som anvendes være fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, som omfatter å kombinere en nukleinsyre som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen i en egnet vektor, innsette den resulterende vektor i en egnet vertscelle, gjenvinne polypeptidet som produseres av den resulterende vertscelle, og rensing av det gjenvunnete polypeptid.
Nukleinsyrer
Foreliggende oppfinnelse anvender isolerte nukleinsyrer som koder for LIPG-polypeptider.
Også "antisense"-nukleinsyrer som kan anvendes for nedregulering eller blokkering av LIPG-polypeptidekspresjonen in vitro, ex vivo eller in vivo.
Teknikkene innen rekombinant DNA-teknologi er kjente blant gjennomsnittsfagfolk. Generelle fremgangsmåter for kloning og ekspresjon av rekombinante molekyler beskrives i Maniatis ( Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), og i Ausubel ( Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987).
Nukleinsyrene kan være koblet til ett eller flere regulatoriske områder. Seleksjon av et egnet regulatorisk område eller egnede områder er et rutinespørsmål som ligger innenfor gjennomsnittsfagpersonens kunnskapsnivå. Regulatoriske områder omfatter promoterer og kan omfatte enhancere, supressorer og så videre.
Promotere som kan anvendes omfatter både konstitutive promotere og regulerte (induserbare) promotere. Promoterene kan være prokaryote eller eukaryote, avhengig av verten. Blant de prokaryote promotere (innbefattet bakteriofagpromotere) som er anvendbare er promoterene lad, lacZ, T3, T7, lambda Pr, Pi og trp. Blant de eukaryote promotere (innbefattet virale promotere) som er anvendbare er en rekke forskjellige promotere (for eksempel fra HPRT, vimentin, actin, tubulin), intermediert filament-promotere (for eksempel desmin, neurofilamenter, keratin, GFAP), promotere fra terapeutiske gener (for eksempel MDR-type, CFTR, faktor VIII), vevsspesifikke promotere (for eksempel actinpromoteren i glatte muskelceller, eller Fit- og Flk-promotere, som er aktive i endotelceller), innbefattet transkripsjonskontrollområder fra dyr, som viser vevsspesifisitet og som har blitt anvendt i transgene dyr: kontrollområdet fra elastase I, som er aktivt i pancreatiske acinarceller (Swift et al, 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al, 1968, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); kontrollområdet fra insulingenet, som er aktivt i pancreatiske beta-celler (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), kontrollområdet fra immunglobulingenet, som er aktivt i lymfoide celler (Grosschedl et al, 1984, Cell 38: 647-658; Adams et al, 1985 Nature 318: 533-538; Alexander et al, 1987, Mol Cell. Biol, 7: 1436-1444), kontrollområdet fra musebryst tumorvirus, som er aktivt i testikkelceller, brystceller, lymfoide celler og mastceller (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), kontrollområdet fra albumingenet som er aktivt i lever (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), kontrollområdet fra alfa-fetoproteingenet som er aktivt i lever (Krumlauf et al, 1985, Mol. Cell. Biol, 5: 1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235: 53-58), kontrollområdet fra alfa-l-antitrypsingenet som er aktivt i lever (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel, 1: 161-171), kontrollområdet fra beta-globingenet, som er aktivt i myeloide celler (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94, kontrollområdet fra myelinbasisk protein som er aktivt i oligodendrocytceller i hjerne (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712), kontrollområdet fra myosinlettkjedegenet, som er aktivt i skjelettmuskel (Sani, 1985, Nature 314: 283-286), og kontrollområdet fra gonadorelingenet, som er aktivt i hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).
Andre promotere som kan anvendes omfatter promotere som aktiveres preferensielt i celler som deler seg, promotere som responderer på et stimulus (for eksempel steroidhormonreseptor, retinsyrereseptor), tetracyklinregulerte
transkripsjonsmodulatorer, umiddelbart tidlig promoter fra cytomegalovirus, LTR fra retrovirus, metallotioneinpromoteren, SV-40-promoteren, Ela-promoteren og MLP-
promoteren. Tetracyklinregulerte transkripsjonsmodulatorer og CMV-promotere beskrives i WO 96/01313 og US patentskrifter 5 168 062 og 5 385 839.
" Antisense"- imkleinsyrer
Nedregulering av genekspresjonen ved anvendelse av "antisense"-nukleinsyrer kan oppnås på translasjonsnivå eller transkripsjonsnivå. "Antisense"-nukleinsyrer er for fortrinnsvis nukleinsyrefragmenter som spesifikt kan hybridisere med hele eller en del av en nukleinsyre som koder for LIPG eller det tilsvarende budbringer-RNA. I tillegg kan "antisense"-nukleinsyrer som reduserer ekspresjonen av LIPG-genet ved å inhibere spleising av primærtranskriptet utformes eller identifiseres. Med kjennskap til strukturen av og en delsekvens fra LIPG-genet kan slike "antisense"-nukleinsyrer utformes og analyseres for virkning.
"Antisense"-nukleinsyrene er fortrinnsvis oligonukleotider og kan bestå utelukkende av deoksyribonukleotider, modifiserte deoksyribonukleotider eller en kombinasjon av disse. "Antisense"-nukleinsyrene kan være syntetiske oligonukleotider. Oligonukleotidene kan om ønskelig være kjemisk modifiserte for å forbedre stabiliteten og/eller selektiviteten. Siden oligonukleotider er utsatt for degradering ved intracellulære nukleaser kan modifikasjonene for eksempel omfatte anvendelse av en svovelgruppe som erstatning for det frie oksygen i fosfodiesterbindingen. Denne modifikasjonen kalles en fosforotioatbinding. Fosforotioat-"antisense"-oligonukleotider er vannløselige, polyanioniske og resistente overfor endogene nukleaser. Dersom et fosforotioat-"antisense"-oligonukleotid hybridiseres til sitt målsete, aktiverer i tillegg RNA-DNA-dupleksen det endogene enzym ribonuklease (Rnase) H, som kutter mRNA-komponenten i hybridmolekylet.
I tillegg kan "antisense"-oligonukleotider med fosforoamidit- og polyamid (peptid)-bindinger syntetiseres. Disse molekylene bør være svært resistente overfor nukleasedegradering. Videre kan kjemiske grupper adderes til det 2' karbon i sukkergruppen og 5-karbonet (C-5) i pyrimidiner for å øke stabiliteten og lette binding av "antisense"-oligonukleotidet til sitt målsete. Modifikasjonene kan omfatte 2'-deoksy, O-pentoksy, O-propoksy, O-metoksy, fluor, metoksyetoksy, fosforotioater og modifiserte baser, så vel som andre modifikasjoner som er kjente blant fagfolk.
"Antisense"-nukleinsyrene kan også være DNA-sekvenser hvis ekspresjon i cellen danner RNA som er komplementært til hele eller deler av LIPG-mRNA. "Antisense"-nukleinsyrer
kan fremstilles ved ekspresjon av hele eller en del av en sekvens utvalgt fra gruppen som består av SEKV. ID. NR. 3, SEKV. ID. NR. 7 og SEKV. ID. NR. 11, i motsatt orientering, som beskrevet i EP 140308. En "antisense"-sekvens av enhver lengde er egnet så lenge som den kan nedregulere eller blokkere ekspresjonen av LIPG. "Antisense"-sekvensen er fortrinnsvis minst 20 nukleotider lang. Fremstilling og anvendelse av "antisense"-nukleinsyrer, DNA som koder for "antisense"-RNA og anvendelse av oligo- og genetisk-"antisense" beskrives i WO92/15680. hvis innhold innkorporeres heri ved referanse.
En tilnærming for å finne det optimale LIPG-fragment for anvendelse i en behandlingsfremgangsmåte med "antisense"-nukleinsyre omfatter fremstilling av tilfeldige fragmenter av LIPG-cDNA ved mekanisk oppbryting, enzymatisk behandling og kloning av fragmentet i ethvert av vektorsystemene som beskrives heri. Enkeltkloner eller blandinger av kloner anvendes for infeksjon av LIPG-uttrykkende celler, og effektive "antisense"-LIPG-cDNA-fragmenter identifiseres ved å måle LIPG-ekspresjonen på RNA-nivå eller proteinnivå.
Retrovirus-adenoassosiert virus- og adenovirusvektorsystemene som beskrives heri overfor kan alle anvendes for innføring og ekspresjon av "antisense"-nukleinsyrer i celler. Syntetiske "antisense"-oligonukleotider kan innføres på en rekke måter, innbefattet fremgangsmåtene beskrevet heri nedenfor.
Ribozymer
Reduksjon av nivået av LIPG-polypeptid kan oppnås ved anvendelse av ribozymer. Ribozymer er katalytiske RNA-molekyler (RNA-enzymer) som har atskilte katalytiske domener og substratbindende domener. Den substratbindende sekvens binder basert på nukleotidkomplementaritet og, muligens ikke-hydrogenbindingsinteraksjoner med målsekvensen. Den katalytiske del kutter mål-RNA i et spesifikt sete. Substratdomenet i et ribozym kan utformes slik at det styres til en spesifikk mRNA-sekvens. Ribozymet gjenkjenner og bindes til et mål- mRNA via komplementær baseparing. Når det først er bundet til det korrekte målsete virker ribozymet enzymatisk og kutter mål- mRNA. Kutting av LIPG-mRNA med et ribozym ødelegger evnen til å styre syntesen av LIPG-polypeptid. Når ribozymet først har kuttet sin målsekvens frigjøres det og kan bindes og kutte gjentatte ganger i andre LIPG-mRNA.
Ribozymet kan være utformet som et hammerhodemotiv. Andre former omfatter et hårnålsmotiv, et hepatitt delta-virusmotiv, et gruppe I-intronmotiv, et RnaseP-RNA- motiv (forbundet med en RNA-styringssekvens) eller et Neurospora VS-RNA-motiv. Hammerhodemotiver beskrives av Rossi et al, 1992, Aids Research and Human Retroviruses, 8, 183. Hårnålsmotiver beskrives i Hampel og Tritz, 1989, Biochemistry, 28, 4929, og Hampel et al, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 299. Hepatitt delta-motivet beskrives av Perrotta og Been, 1992, Biochemistry, 31,16, RnaseP-motivet beskrives av Guerrier-Takada et al., 1983, Cell, 35, 849, Neurospora VS-RNA-ribozymmotivet beskrives av Collins (Saville and Collins, 1990, Cell, 61, 685-696; Saville og Collins, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 8826-8830; Collins og Olive, 1993, Biochemistry, 32,2795-2799) mens gruppe I-intronmotivet beskrives av Cech et al., U.S. Patentskrift nr. 4 987 071.
En tilnærming for fremstilling av et ribozym er å syntetisere kjemisk et oligodeoksyirbonukleotid med et katalytisk ribozymdoméne (tilnærmet 20 nukleotider), flankert av sekvenser som hybridiserer til mål-LIPG-mRNA etter transkripsjonen. Oligodeoksyribonukleotidet amplifiseres ved anvendelse av de substratbindende sekvensene som primere. Amplifikasjonsproduktet klones inn i en eukaryot ekspresj onsvektor.
Ribozymer som besitter en hammerhodestruktur eller en hårnålsstruktur kan lett fremstilles, siden disse katalytiske RNA-molekylene kan uttrykkes i celler fra eukaryote promotere (se for eksempel Scanlon et al, 1991, Proe. Nati. Acad, Sei. USA, 88,10591-5; Kashani-Sabet et al, 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al, 1992, J. Virol, 66, 1432-41; Weerasinghe et al, 1991,7. Virol, 65, 5531-4; Ojwang et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89, 10802-6; Chen et al, 1990, Science, 247, 1222-1225). Et ribozym kan uttrykkes i eukaryote celler fra en egnet DNA-vektor. Om ønskelig kan ribozymets aktivitet forsterkes ved at det frigjøres fra primærtranskriptet ved hjelp av et annet ribozym (Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6: Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55).
I en tilnærming for fremstilling av ribozymer uttrykkes ribozymene fra transkripsjonsenheter innsatt i DNA-vektorer, RNA-vektorer eller virale vektorer. Transkripsjon av ribozymsekvensene styres av en promoter for eukaryot RNA polymerase I (pol I), RNA polymerase II (pol II) eller RNA polymerase III (pol III). Transkripter fra pol II- eller pol III-promotere vil uttrykkes i høyt nivå i alle celler, nivået for en gitt pol II-promoter i en gitt celletype vil avhenge av nærliggende genregulatoriske sekvenser. Prokaryotiske RNA-polymerasepromotere anvendes også, forutsatt at det prokaryote RNA polymeraseenzym uttrykkes i de angjeldende celler (Elroy-Stein og Moss, 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87, 6743-7; Gao og Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al, 1993, Methods Enzymol, 217,47-66; Zhou et al, 1990, Mol. Cell. Biol, 10, 4529-37). Det har blitt vist at ribozymer uttrykket fra disse promotere kan fungere i pattedyrceller (Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992, Proe. Natil. Acad. Sei. USA, 89, 10802-6; Chen et al, 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90, 6340-4; UHuillier et al, 1992, EMBOJ., 11,4411-8; Lisziewicz et al, 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90, 8000-4).
Det er mulig å sette inn en transkripsjonsenhet som uttrykker et ribozym som kutter LIPG-RNA i en plasmid-DNA-vektor, en retrovirusvektor, en adenovirus-DNA-vektor eller en adenoassosiert virusvektor. De rekombinante vektorene er fortrinnsvis DNA-plasmider eller adenovirusvektorer. Imidlertid kan andre pattedyrcellevektorer som styrer ekspresjonen av RNA anvendes for dette formål. Vektorene tilføres som rekombinante viruspartikler. DNA kan tilføres alene eller i kompleks med forskjellige bærestoffer. DNA, DNA^ærestoffkompleksene eller de rekombinante viruspartiklene tilføres lokalt til behandlingssetet som diskutert nedenfor. Rekombinante vektorer som kan uttrykke ribozymene tilføres fortrinnsvis lokalt som beskrevet nedenfor, og forblir i målcellene. Når de først er uttrykt kutter ribozymene sitt mål, LIPG-mRNA.
Ribozymer kan tilføres til en pasient på en rekke forskjellige måter. De kan tilsettes direkte til målvev, i kompleks med kationiske lipider, pakket i liposomer eller tilført til målceller ved andre fremgangsmåter som er kjente innen faget. Lokal tilførsel til de ønskede vev kan utføres med et kateter, en infusjonspumpe eller et stent, med eller uten innføring av ribozymet i biopolymerer som diskutert heri nedenfor. Alternative tilførselsveier kan være intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, subkutan injeksjon, aerosolinhalering, oral tilførsel (som tablett eller pille), topisk, systemisk, okular, intraperitonial og/eller intratekal tilførsel. Mer detaljerte beskrivelser av tilførsel av ribozymer gis i Sullivan et al, PCT WO94/02595 og Draper et al, PCT W093/23569.
Antistoffer
Antistoffer mot LIPG-polypeptidet kan være monoklonale antistoffer eller polyklonale antistoffer eller omfatte kimære antistoffer, enkeltkjedeantistoffer og humaniserte antistoffer, så vel som Fab-fragmenter og produktene fra et Fab-ekspresjonsbibliotek, og Fv-fragmenter og produktene fra et Fv-ekspresjonsbibliotek.
Polyklonale antistoffer som fremstilles mot et antigent fragment av et LIPG-polypeptid som beskrevet i eksempelseksjonen heri nedenfor. Antistoffer kan også frembringes mot det intakte LIPG-protein eller .polypeptid, eller mot et fragment, et derivat, eller en epitop fra proteinet eller polypeptidet. Antistoffer kan erholdes etter tilførsel av proteinet, polypeptidet, fragmentet, derivatet eller epitopen til et dyr ved anvendelse av teknikker og fremgangsmåter som er kjente innen faget.
Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåten til Mishell, B.B. et al., Selcted Methods In Cellular Immunology, (W.H. Freeman, red.) San Francisco (1980). Kort beskrevet anvendes et polypeptid for irnmunisering av miltceller fra Balb/C-mus. De immuniserte miltcellene fusjoneres med myelomceller. Fusjonerte celler som omfatter egenskaper fira miltceller og myelomceller isoleres ved dyrking i HAT-medium, et medium som dreper begge utgangscelletypene, men tillater overlevelse og vekst av fusjonsproduktene.
De monoklonale antistoffene kan "humaniseres" for å forhindre at verten frembringer en immunrespons mot antistoffene. Et "humanisert antistoff' er et antistoff i hvilket de komplemetaritetsbestemmende områder (CDR) og/eller andre deler av rammeverket i lettkjedens og/eller tungkjedens variable domene er avledet fra et ikkehumant immunglobulin, mens de gjenværende deler av molekylet er avledet fira ett eller flere humane immunglobuliner. Humaniserte antistoffer kan også omfatte antistoffer som særpreges ved en humanisert tungkjede forbundet med en ikkemodifisert donor- eller akseptor-lettkjede eller en kimær lettkjede, eller omvendt. Humanisering av antistoffer kan oppnås med fremgangsmåter som er kjente innen faget (se for eksempel G.E.Mark og E.A.Padlan, "Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology bind 113, Springer-Verlag, New York, 1994). Transgene dyr kan anvendes for ekspresjon av humaniserte antistoffer.
Teknikker som er kjente innen faget for fremstilling av enkeltkjedeantistoffer kan tilpasses fremstilling av enkeltkjedeantistoffer mot de immunogene polypeptider og proteiner.
Anti-LIPG-antistoffene er også anvendbare i analyser for påvisning eller kvantitering av nivået av LIPG. I en utførelse tilveiebringer disse analysene en klinisk diagnose og estimering av LIPG i forskjellige sykdomstilstander, samt en fremgangsmåte for å måle virkningen av en behandling. Disse anti-LIPG-antistoffene kan i tillegg anvendes for kvantitering av LIPG i en vevsprøve for å kunne forutsi ytterligere følsomhet for et redusert nivå av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI.
Fremgangsmåter for identifisering og anvendelse av inhiberende molekyler og enhancermolekyler
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for gjennomsøking av biblioteker over små molekyler eller naturlige produktkilder for enhancere (agonister) eller koaktivatorer, innbefattet koaktivatorer eller inhibitorer (antagonister) av proteinnatur, av LIPG-aktiviteten. En mulig enhancer eller inhibitor settes i forbindelse med LIPG-protein og et LIPG-substrat, og den mulige enhancer eller inhibitors evne til å fremme eller inhibere LIPG-aktiviteten måles.
Disse gjennomsøkingsfremgangsmåtene kan også anvendes for å bestemme hvorvidt en forbindelse kan fungere som en substratspesifikk enhancer eller inhibitor, det vil si hvorvidt en forbindelse kan fremme den enzymatiske aktivitet av LIPG mot et substrat samtidig som enzymaktiviteten overfor et annet substrat reduseres eller opprettholdes, for eksempel anvender LIPG-polypeptidet HDL-kolesterol som substrat, og anvender også LDL-kolesterol og VLDL-kolesterol som substrater. I visse utførelser er det ønskelig å isolere å identifisere substratspesifikke enhancere eller inhibitorer som fremmer den enzymatiske aktivitet av LIPG-polypeptidet mot LDL-kolesterol eller VLDL-kolesterol, samtidig som den enzymatiske aktivitet overfor HDL-kolesterol reduseres eller opprettholdes i normalt nivå.
LIPG-proteinet som anvendes i disse fremgangsmåtene kan fremstilles rekombinant i en rekke vertsceller, innbefattet pattedyrceller, bakulovirusinfiserte insektceller, gjær og bakterier. LIPG-ekspresjonen i stabilt transfekterte CHO-celler kan optimaliseres ved metotreksatamplifisering av cellene. LIPG-protein kan også renses fra naturlige kilder, for eksempel humant plasma, placentaekstrakter eller kondisjonert medium fra dyrkede endotelceller, THP-1-celler eller makrofager.
Optimalisering av analyseparametre som pH, ionekonsentrasjoner, temperatur, substratkonsentrasjon og emulgeringsbetingelser utføres empirisk av en gj ennomsnittsfagperson.
Fettsyresubstituentene i substratene kan variere i kjedelengde så vel som i grad av og posisjoner for umettethet. Substratene kan merkes radioaktivt i flere posisjoner. Fosfolipidsubstrater som fosfatidylkolin kan for eksempel være radioaktivt merket i fettsyreposisjon Sn-1 eller Sn-2, eller i glyserolgruppen, fosfatgruppen eller den polare hodegruppe (kolin når det gjelder fosfatidylkolin).
Som et alternativ til radioaktivt merkete substrater kan andre merkete substratklasser, for eksempel fluorescerende substrater eller tioholdige substrater, anvendes i analysefremgangsmåtene.
Fluorescerende substrater er spesielt anvendbare i gjennomsøkingsanalyser siden den enzymatiske katalyse kan måles kontinuerlig ved å måle fluorescenseintensiteten, uten fysisk separasjon (ekstraksjon) av produktene fra substartene. Et eksempel på et fluorescerende fosfatidylkolinsubstrat er C6NBD-PC{l-acyl-2-[6-(nitro-2,l,3-benzoksadiazol-4-yi)amino] kaproylfosfatidylkolin.
De tioholdige substratene omfatter l,2-bis(heksanoyltio)-l,2-dideoksy-sn-glycero-3-fosforylkolin (L. J. Reynolds, W. N. Washburn, R. A. Deems og E. A. Dennis, 1991. Methods in Enzymology 197: 3-23; L. Yu og E. A. Dennis, 1991. Methods in Enzymology 197: 65-75; L. A. Wittenauer, K. Shirai, R. L. Jackson og J. D. Johnson, 1984. Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 894-901).
I tillegg til inhiberende molekyler og enhancermolekyler som virker på det enzymatiske aktivitetsnivå finnes det inhiberende molekyler og enhancer molekyler som virker på ekspresjonsnivået av LIPG-genet. En fremgangsmåte for identifisering av forbindelser som kan fremme eller inhibere ekspresjonen av LIPG er å anvende et rapportørgensystem. Disse systemene anvender rapportørgenekspresjonsvektorer som omfatter et kloningssete i hvilket en gitt promoter kan klones oppstrøms for et "rapportørgen" som lett kan påvises og kvantiteres. En gjennomsnittsfagperson kan lett identifisere og subklone promoteren for LIPG-genet, så vel som andre kontrollsekvenser, i en kommersielt tilgjengelig rapportørgenekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren overføres til vertsceller, og cellene behandles med en analyseforbindelse (et mulig inhibitor- eller enhancermolekyl) for å bestemme virkningen av analyseforbindelsen på ekspresjonen av rapportørgenproduktet. Nærmere bestemt analyseres cellene for nærvær av rapportørgenproduktet ved direkte måling av mengden rapportør-mRNA, rapportørproteinet selv eller den enzymatiske aktivitet til rapportørproteinet. Ideelt sett vil rapportørgenet ikke uttrykkes endogent i celletypen av interesse, og den egner seg for sensitiv, kvantitativ og hurtig analyse. En rekke rapportøranalysekonstruksjoner er kommersielt tilgjengelige, og flere rapportørgener og -analyser har blitt utviklet og kan lett fremstilles av fagfolk. De mest populære systemene for måling av genetisk aktivitet i eukaryote celler omfatter kloramfenikol acetyltransferase (CAT), P-galaktosidase, ildflueluciferase, veksthormon (GH), P-glukurorudase (GUS), alkalisk fosfatase (AP), grønt fluorescerende protein (GFP) og Æew7/a-luciferase. Rapportøranalysekonstruksjoner kan erholdes fra en rekke kommersielle kilder, for eksempel Promega og Invitrogen.
Som nevnt ovenfor kan rapportørgenaktiviteten påvises ved å analysere for rapportør-mRNA eller rapportørproteinet. Rapportør-mRNA kan påvises ved Northern-blot analyse, ribonukleasebeskyttelsesanalyse eller RT-PCR. Selv om disse analysene er mer direkte enn måling av proteinekspresjonen har det blitt utviklet mange analyser for måling av nærvær av rapportørproteinet, snarere enn det mRNA som foreligger i en celle. Rapportørproteiner kan analyseres spektrofotometrisk eller ved påvisning av enzymatisk aktivitet. Rapportørproteinnivået kan også måles med antistoffbaserte analyser. Generelt er de enzymatiske analysene svært sensitive, og utgjør en foretrukket fremgangsmåte for måling av rapportørgenekspresjon.
Preparater
Biologisk kompatibel (biokompatibel) løsning som omfatter polypeptidene, nukleinsyrene, vektorene og antistoffene er mulig å fremstille. En biologisk kompatibel løsning er en løsning i hvilken polypeptidet, nukleinsyren, vektoren eller antistoffet ifølge oppfinnelsen opprettholdes i aktiv form, for eksempel i en form som kan utøve en biologisk aktivitet. Et polypeptid vil for eksempel ha fosfolipaseaktivitet, en nukleinsyre vil være i stand til å replikere, translatere et budskap eller hybridisere til en komplementær nukleinsyre, en vektor vil være i stand til å transfektere en målcelle, et antistoff vil bindes til et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Generelt vil en slik biologisk kompatibel løsning være en vandig buffer, for eksempel triss-, fosfat- eller HEPES-buffer, som inneholder saltioner. Vanligvis vil konsentrasjonen av saltioner tilsvare det fysiologiske nivå. I en spesifikk utførelse er den biokompatible løsning et farmasøytisk aksepterbart preparat. Biologisk kompatible løsninger kan omfatte stabiliseringsmidler og konserveringsmidler.
Slike preparater kan utformes for topisk, oral, parenteral, intranasal, subkutan og intraokular tilførsel. Parenteral tilførsel er ment å omfatte intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, intraarteriell injeksjon eller infusjonsteknikker. Preparatet kan tilføres parenteralt i doseringenhetspreparater som inneholder standard, velkjente ikke-toksiske, fysiologisk aksepterbare bærere, adjuvanser og bærestoffer etter ønske.
De sterile, injiserbare preparatene kan være løsninger eller suspensjoner i et ikke-toksisk, parenteralt aksepterbart løsemiddel eller fortynningsmiddel. Eksempler på farmasøytisk aksepterbare bærere er saltvann, bufret saltvann, isotont saltvann (for eksempel mononatrium- eller dinatriumfosfat, natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumklorid eller blandinger av slike salter), ringers løsning, dekstrose, vann, sterilt vann, glyserol, etanol og kombinasjoner av disse. 1,3-butandiol og sterile fettoljer kan med fordel anvendes som løsemidler eller suspensjonsmidler. Enhver smakløs fettolje kan anvendes, innbefattet syntetiske mono- eller diglyserider. Fettsyrer som oljesyre kan også anvendes ved fremstilling av injiserbare preparater.
Mediet i preparatet kan også være en hydrogel fremstilt av enhver biokompatibel eller ikke-cytotoksisk (homo eller hetero)-polymer, for eksempel en hydrofil polyacrylsyrepolymer, som kan virke som medikamentabsorberende svamp. Slike polymerer beskrives for eksempel i patentsøknad WO93/08845. Visse av disse, for eksempel de erholdt fra etylen- og/eller propylenoksid, er kommersielt tilgjengelige. En hydrogel kan deponeres direkte på overflaten av vevet som skal behandles, for eksempel under et kirurgisk inngrep.
Et farmasøytisk preparat kan også omfatte et replikasjonsdefekt rekombinant virus og poloksamer. Nærmere bestemt gjelder oppfinnelsen et preparat som omfatter et replikasjonsdefekt rekombinant virus som inneholder en nukleinsyre som koder for et LIPG-polypeptid, og poloksamer. En foretrukket poloksamer er poloksamer 407, som er kommersielt tilgjengelig (BASF, Parsippany, NJ) og er en ikke-toksisk, biokompatibel polyol, og som er mest foretrukket. En poloksamer impregnert med rekombinant virus kan deponeres direkte på overflaten av vevet som skal behandles, for eksempel under et kirurgisk inngrep. Poloksamer besitter i det vesentlige de samme fordeler som hydrogel, samtidig som viskositeten er lavere.
Fremgangsmåter og preparater for reduksjon av nivået av LIPG-polypeptidaktiviteten
Fremgangsmåter for å redusere ekspresjonen av LIPG-polypeptid for å øke nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, og korrigere de tilstander hvor LIPG-polypeptidaktiviteten bidrar til en sykdom eller forstyrrelse forbundet med en uønsket lipidprofil kan omfatte tilførsel av et preparat som omfatter en "antisense"-nukleinsyre, tilførsel av et preparat som omfatter et intracellulært bindingsprotein, for eksempel et antistoff, tilførsel av et inhiberende molekyl som inhiberer den enzymatiske aktivitet av LIPG, for eksempel et preparat som omfatter en ekspresjonsvektor som koder for et fragment av LIPG, for eksempel LLGN-polypeptid eller et lavmolekylært molekyl, innbefattet tilførsel av en forbindelse med lav molekylvekt som nedregulerer LIPG-ekspresjonen på transkripsjonsnivå, translasjonsnivå eller posttranslasjonsnivå og tilførsel av et ribozym som kutter mRNA som koder for LIPG.
Fremgangsmåter som anvender " antisense"- nukleinsyrer
Preparat som omfatter en "antisense"-nukleinsyre for nedregulering eller blokkering av ekspresjonen av LIPG kan anvendes. Nukleinsyren kan kode for "antisense"-RNA-molekyler, da er nukleinsyren operativt koblet til signaler som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen og innføres i en celle, fortrinnsvis ved anvendelse av rekombinante vektorkonstruksjoner, som vil uttrykke "antisense"-nukleinsyren når vektoren først er innført i cellen. Eksempler på egnede vektorer omfatter plasmider, adenovirus, adenoassosierte virus, retrovirus og herpes-virus. Vektoren er fortrinnsvis et adenovirus. Mest foretrukket er vektoren et replikasjonsdefekt adenovirus som inneholder en delesjon i El- og/eller E3-området i viruset.
"Antisense"-nukleinsyren kan være syntetisk, og kan være kjemisk modifisert for å kunne motstå degradering ved intracellulære nukleaser som diskutert ovenfor. Syntetiske "antisense"-oligonukleotider kan innføres i en celle ved anvendelse av liposomer. Cellulært opptak foregår når et "antisense"-oligonukleotid er innkapslet i et liposom. Med et effektivt tilførselssystem kan lave, ikke-toksiske konsentrasjoner av "antisense"-molekylet anvendes for å inhibere translasjonen av mål-mRNA. Videre vil liposomet som er konjugert til cellespesifikke bindingsseter styre et "antisense"-oligonukleotid til et vev.
Fremgangsmåter som anvender nøytraliserende antistoffer og andre bindingsproteiner
Nedregulering eller blokkering ekspresjonen av LIPG ved ekspresjon av en nukleinsyresekvens som koder for et intracellulært bindingsprotein som selektivt kan interagere med LIPG kan anvendes. W094/29446 og WO94/02610, beskriver cellulær transfeksjon med gener som koder for et intracellulært bindingsprotein. Et intracellulært bindingsprotein omfatter ethvert protein som selektivt kan interagere med eller bindes til LIPG i cellen det uttrykkes i, og som kan nøytralisere funksjonen av bundet LLG. Det intracellulære bindingsprotein er fortrinnsvis et nøytraliserende antistoff eller et fragment av et nøytraliserende antistoff.
WO94/02610 beskriver fremstilling av antistoffer og identifisering av nukleinsyren som koder for et gitt antistoff. Med anvendelse av LIPG eller et fragmenter av dette fremstilles et spesifikt monoklonalt antistoff ved teknikker som er kjente blant fagfolk. En vektor som omfatter nukleinsyren som koder for et intracellulært bindingsprotein eller en del av dette, og som kan uttrykkes i en vertscelle, fremstilles så for anvendelse i fremgangsmåten.
Alternativt kan LIPG-aktiviteten blokkeres ved tilførsel av et nøytraliserende antistoff i blodomløpet. Et slikt nøytraliserende antistoff kan tilføres direkte som et protein, eller det kan uttrykkes fra en vektor (med et sekresjonssignal).
Fremgangsmåter som anvender et inhiberende molekyl som inhiberer den enzymatiske aktivitet av LIPG
Inhibering av LIPG-aktiviteten ved tilførsel av et preparat som omfatter et subfragment av LIPG-polypeptidet, for eksempel LLGN er mulig. Dette preparatet kan tilføres på konvensjonell måte, for eksempel oralt, topisk, intravenøst, intraperitonialt, intramuskulært, subkutant, intranasalt eller intradermalt. Preparatet kan tilføres direkte, eller det kan innkapsles (for eksempel i et lipidsystem, i aminosyre-mikrokuler eller i globulære dendrimerer). Polypeptidet kan i noen tilfeller være koblet til en annen polymer, for eksempel serumalbumin eller polyvinylpyrrolidon.
Videre kan LIPG-aktiviteten inhiberes ved anvendelse av genterapi, det vil si ved tilførsel av et preparat som omfatter en nukleinsyre som koder for og styrer ekspresjonen av et subfragment av LIPG, for eksempel LLGN.
LIPG-aktiviteten kan også inhiberes ved anvendelse av inhiberende molekyler. Disse lavmolekylære forbindelsene interfererer med de enzymatiske egenskapen til LIPG eller forhindrer at cellulære bindingsseter gjenkjenner LIPG.
LIPG-polypeptidet har også affinitet for heparin. LIPG-polypeptidbinding til ekstracellulært heparin i blodkarenes lumen vil tillate binding av LIPG til LDL og forhøyet opptak av LDL ved at LIPG fungerer som en bro mellom LDL og det ekstracellulære heparin. I det lokaliserte sete for en aterosklerotisk lesjon antas det at et forhøyet lipaseaktivitetsnivå vil akselerere den aterogene prosess (Zilversmit, D. B.
(1995) Clin. Chem. 41,153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C, Moojani, S., Lupien, P. J., Hayden M. R., og Brunzell, J. D. (1993) Lancet 341,1119-1121). Dette kan skyldes øket binding av lipoproteiner til det vasculære vev og øket opptak i vevet, formidlet av lipaser (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. Vlodavsky, 1.(1992) J. Clin. Invest. 90, 2013-2021; Tabas, I., Li, L, Brocia R.W., Xu, S. W., Swenson T. L. Williams, K. J. (1993) J. Biol. Chem. 268,20419-20432; Nordestgaard, B. G., og Nielsen, A. G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5, 252-257; Williams, K. J., og Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vase. Biol. 15, 551-561). I tillegg kan et høyt, lokalt lipaseaktivitetsnivå føre til at det dannes et cytotoksisk nivå av fettsyrer og lysofosfatidylkolin i forstadier av aterosklerotiske lesjoner. Denne spesielle aktiviteten til LLG kan bidra til utvikling eller progresjon av aterosklerose, særlig i forbindelse med for høyt lipidnivå i et individ grunnet kostfaktorer eller genetiske faktorer. Således inhiberes lipoproteinakkumuleringen ved inhibering av LIPG-polypeptidekspresjonen eller binding av LIPG til lipoprotein (for eksempel LDL).
Fremgangsmåter som anvender et inhiberende molekyl som forhindrer LIPG-genekspresjonen
Inhiberende molekyler kan anvendes som innbefatter lavmolekylære forbindelser, nedregulere LIPG-ekspresjonen på transkripsjonsnivå, translasjonsnivå eller posttranslasjonsnivå. For identifisering av slike inhiberende molekyler kan rapportørgensystemene beskrevet ovenfor anvendes. Disse inhiberende molekylene kombineres med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff og tilføres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter som er kjente innen faget.
Fremgangsmåter som anvender ribozymer
Ribozymer kan tilføres celler ved innkapsling i liposomer, ved iontoforese, ved inkorporering i hydrogeler, syklodextriner, biodegraderbare nanokapsler og bioadhesive mikrokuler, eller ved en rekke andre fremgangsmåter som er diskutert ovenfor. Ribozymet kan tilføres et målvev ved direkte injeksjon eller ved anvendelse av et kateter, en infusjonspumpe eller et stent. Alternative tilførselsveier omfatter intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, subkutan injeksjon, aerosolinnhalering, oral (tablett eller pille), topisk, systemisk, okular, intraperitonial og/eller intratekal tilførsel.
Det er mulig å klone en ribozymkodende sekvens i en DNA-ekspresjonsvektor. Transkripsjon av ribozymsekvensen styres av en eukaryot RNA polymerase II (pol II)-eller RNA polymerase III (pol III)-promoter. Ekspresjonsvektoren kan innføres i en rekke vektorer, innbefattet virus-DNA-vektorer som adenovirusvektorene og adenoassosiert virusvektorene diskutert ovenfor.
En transkripsjonsenhet kan innsettes som uttrykker et ribozym som kutter LIPG-RNA i en adenovirus-DNA-vektor. Vektoren tilføres som rekombinante viruspartikler og tilføres lokalt til behandlingssetet ved anvendelse av et kateter, et stent eller en infusjonspumpe.
Tilførsel av apolipoprotein AI
I fremgangsmåtene beskrevet ovenfor anvendes for reduksjon av LIPG-polypeptidaktivitetsnivået i kombinasjon med tilførsel av apolipoprotein AI eller et ekspresjonssystem som kan uttrykke apolipoprotein AI i en pasient (se for eksempel U.S. patentskrift nr. 5 866 551).
Fremgangsmåter og preparater for å forhøye LIPG- polypeptidaktivitetsnivået
Fremgangsmåter for å forhøye ekspresjonen eller aktiviteten av LIPG-polypeptid for å redusere nivået av VLDL- og LDL-kolesterol kan omfatte, tilførsel av et preparat som omfatter LIPG-polypeptidet, tilførsel av et preparat som omfatter en ekspresjonsvektor som koder for LIPG-polypeptidet, tilførsel av et preparat som omfatter et enhancermolekyl som forsterker den enzymatiske aktivitet av LIPG-polypeptidet, og tilførsel av et enhancermolekyl som forhøyer ekspresjonen av LIPG-genet.
Fremgangsmåter som anvender LIPG- polypeptider
LIPG-aktivitetsnivået kan forhøyes ved tilførsel av et preparat som omfatter LIPG-polypeptidet. Dette preparatet kan tilføres på konvensjonell måte, for eksempel oralt, topisk, intravenøst, intraperitonialt, intramuskulært, subkutant, intranasalt eller intradermalt. Preparatet kan tilføres direkte, eller det kan være innkapslet (for eksempel i et lipidsystem, i aminosyre-mikrokuler eller i globulære dendrimerer). Polypeptidet kan i noen tilfeller være koblet til en annen polymer, for eksempel serumalbumin eller polyvinylpyrrolidon.
Fremgangsmåter som anvender vektorer som uttrykker LIPG
Det er mulig å forhøye LIPG-nivået ved å anvende genterapi, det vil si ved tilførsel av
et preparat som omfatter en nukleinsyre som koder for og styrer ekspresjonen av LIPG-polypeptidet. I denne utførelsen klones LIPG-polypeptidet i en egnet ekspresjonsvektor. Mulige vektorsystemer og promotere er diskutert i detalj ovenfor. Ekspresjonsvektoren overføres til målvevet ved anvendelse av et av vektortilføringssystemene diskutert ovenfor. Denne overføringen utføres enten ex vivo, i en fremgangsmåte hvor nukleinsyren overføres til celler i laboratoriet og de modifiserte cellene så tilføres til mennesket eller et annet dyr, eller in vivo, i en fremgangsmåte hvor nukleinsyren overføres direkte til celler i mennesket eller det andre dyret. I foretrukne utførelser anvendes et adenovirusvektorsystem for tilførsel av ekspresjonsvektoren. Om ønskelig anvendes en vevsspesifikk promoter i ekspresjonsvektoren som beskrevet ovenfor.
Ikke-virale vektorer kan innføres i celler ved enhver av fremgangsmåtene som er kjente innen faget, innbefattet kalsiumfosfat-koutfelling, lipofeksjon (syntetiske anioniske og kationiske liposomer), reseptorformidlet gentilførsel, injeksjon av nakent DNA, elektroporering og bioballistisk tilførsel eller partikkelakselerasjon.
Fremgangsmåter som anvender et enhancermolekyl som forsterker den enzymatiske aktivitet av LIPG
Idet er mulig å forsterke LIPG-aktiviteten ved enhancermolekyler som øker den enzymatiske aktivitet av LIPG eller forbedrer cellulære bindingsseters gjenkjenning av LIPG. Disse enhancermolekylene kan tilføres ved de samme fremgangsmåtene som er diskutert ovenfor for tilførsel av polypeptider.
Fremgangsmåter som anvender et enhancermolekyl som forhøyer LIPG-genekspresjonen
LIPG-nivået kan forhøyes ved anvendelse av lavmolekylære forbindelser som kan oppregulere LIPG-ekspresjonen på transkripsjonsnivå, translasjonsnivå eller posttranslasjonsnivå. Disse forbindelsene kan tilføres ved de samme fremgangsmåtene som er diskutert ovenfor for tilførsel av polypeptider.
EKSEMPLER
De påfølgende eksempler og referanse eksempler illustrerer oppfinnelsen.
Eksempel 1 - Identifisering av et differensielt uttrykt cDNA
Fremstilling av RNA
Humane monocytiske THP-l-celler (Smith, P. K., Krohn, R. L, Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H. Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M, Olson, B. J., og Klenk, D. C. (1985) Anal. Biochem. 150, 76-85) ble dyrket i RPMI-1640-medium (GIBCO) med 25 mM HEPES, 10 % føtalt bovint serum, 100 enheter/ml penicillin G-natrium og 100 enheter/ml streptomycinsulfat. Cellene ble utsådd i 15 cm vevdyrkingsskåler med l,5xl0<7>celler/skål og behandlet med 40 ng/ml forbol-12-myristate 13-acetat (Sigma) i 48 timer for induksjon av celledifferensiering. Humane low density lipoproteiner (LDL) ble erholdt fra Calbiochem, og ble dialysert grundig mot PBS ved 4 °C. LDL ble så fortynnet til 500 ug/ml og dialysert mot 5^M CuS04i PBS ved 37 °C i 16 timer. For å stanse oksidasjonen ble LDL dialysert grundig mot 150 mM NaCl, 0,3 mM EDTA, og så sterilfiltrert. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-fremgangsmåten (Schuh, J. Fairclough, G. F., og Haschemeyer, R. H. (1978) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 3173-3177) (Pierce). Oksidasjonsgraden ble bestemt ved TB ARS (Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15, 532-537), og var mellom 25 og 30 nmol MDA-ekvivalenter/mg protein. De differensierte THP-1-cellene ble behandlet i 24 timer med enten 50^g/ml oksidert LDL eller NaCl-EDTA-buffer i RPMI-medium tilsatt 10 % lipoproteinmanglende føtalt bovint serum (Sigma). For høsting av RNA ble platene vasket med 10 ml PBS, hvoretter 14 ml TRIZOL (Liang, P. og Pardee, A. B.
(1992) Science 257, 967-971) (GIBCO) ble tilsatt til hver skål. Løsningen ble opp-pipettert flere ganger for sammenblanding, hvoretter like prøver ble slått sammen i sentrifugerør, og 3 ml kloroform pr. skål ble tilsatt og innblandet. Rørene ble sentrifugert i 15 minutter ved 12000 x g. Etter sentrifugeringen ble det øvre sjikt overført til et nytt rør, og 7,5 ml isopropanol pr. skål ble tilsatt og innblandet. Rørene ble sentrifugert ved 12000 x g i 20 minutter. Nedsentrifugert materiale ble vasket med iskald 70 % etanol og tørket ved romtemperatur. Nedsentrifugert materiale ble suspendert i 500^1 TE (Tris-EDTA) og behandlet med 200 enheter RNase-fri DNAse I og 200 enheter av placenta RNase-inhibitoren RNasin (Promega) i 30 minutter ved 37 °C. RNA ble renset ved påhverandre følgende ekstraksjon med fenol, fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1), og kloroform/isoamylalkohol (24:1), fulgt av utfelling med etanol.
cDNA-syntese
cDNA-syntese og PCR-amplifisering ble oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåter fra Differential Display Kit, versjon 1.0 (display Systems Biotechnology, Inc.). Dette systemet er baseert på teknikken som opprinnelig ble beskrevet av Liang og Pardee (Mead, D. A., Pey, N. K., Hermstadt, C, Marcil, R.A. og Smith, L. M., (1991) Bio/Technology 9, 657-663). Primerparet som gav cDNA-fragmentet som inneholdt den første informasjon om det lipaseliknende gen var nedstrømsprimer 7 og oppstrømsprimer 15. cDNA for amplifiseringen ble syntetisert som følger ved anvendelse av RNA avledet fra PMA-behandlete THP-1-celler behandlet enten med buffer eller oksidert LDL: 3^125 nedstrømsprimer 7 og 7,5^1 dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann ble tilsatt til 300 ng (3,0^1) RNA fra en av THP-1-RNA-prøvene. Dette ble oppvarmet til 70 °C i 10 minutter og så avkjølt på is. Røret ble tilsatt 3 ul 5 x PCR-buffer (250 mM Tris-HCL pH 8,3, 375 mM KC1) (GIBCO), 3^125mM MgCl2, 3 ul 0,1 M DTT, 1,2^1500^M dNTP, 0,7^1 RNasin og 5,6^1DEPC-behandlet vann. Rørene ble inkubert i 2 minutter ved romtemperatur, hvoretter 1,5^1 (300 enheter Superscript II RNase H-revers transkriptase (GIBCO) ble tilsatt. Rørene ble inkubert, først i romtemperatur i 2 minutter, så i 60 minutter ved 37 °C og 5 minutter ved 95 °C, fulgt av avkjøling på is. PCR-amplifiseringen ble utført ved anvendelse av en hovedblanding som inneholdt 117^110x PCR-buffer (500 mM KC1,100 mM Tris-Hcl pH 8,3 15 mM MgCl2, og 0,01 % (w/v) gelatin), 70,2^125 mM MgCl2, 5,9 ^1 alfa-33P dATP (lOm Ci/ml, DuPontNEN), 4,7^1500^M dNTP-blanding, 11 ^1 AmpliTaq DNA polymerase (5 enheter/^1, Perkin-Elmer), og 493,3^1 DEPC-behandlet vann. For hver reaksjon ble 12^1 av hovedblandingen tilsatt til 2^1 nedstrømsprimer 7, 1 ^1 cDNA og 5^1 oppstrømsprimer 15. Reaksjonsblandingene ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt og så behandlet med 40 sykluser bestående av et denatureringstrinn ved 94 °C i 15 sekunder, et hybridiseringstrinn på 40 °C i 1 minutt og et forlengelsestrinn på 72 °C i
30 sekunder. Etter de 40 syklusene ble reaksjonsblandingene inkubert ved 72 °C i 5 minutter og lagret ved 10 °C. PCR-reaksjonene ble utført i en Perkin-Elmer GeneAmp System 9600 programmerbar varmeblokk. 4^1 av amplifikasjonsreaksjonen ble blandet med et likt volum påsettingsbuffer (0,2 % bromfenolblått, 0,2 % xylencyanol, 10 mM EDTA pH 8,0 og 20 % glyserol). 4 ^1 av denne blandingen ble fraksjonert i en 6 % ikke-denaturerende polyacrylamidgel i sekvensformat i 3 timer ved 1200 volt (konstant spenning). Gelen ble tørket ved 80 °C i 1,5 timer og pålagt Kodak XAR-film. Et amplifiseirngsprodukt som kun ble påvist i reaksjonen som inneholdt cDNA fra THP-l-celler behandlet med oksidert LDL ble påvist og kuttet ut fra gelen. 100^1 DEPC-behandlet vann ble tilsatt til et mikrosentrifugerør som inneholdt det utkuttete gelfragment og ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, fulgt av 15 minutter ved 95 °C.
For reamplifisering av PCR-produktet ble 26,5^1 av det eluerte DNA anvendt i en amplifiseringsreaksjon som også omfattet 5^110x PCR-buffer, 3^125 mM MgCl2, 5^1 500^M dNTP-blanding, 5^12^M nedstrømsprimer 7, 7,5^1 oppstrømsprimer 15 og 0,5^1 Amplitaq polymerase. PCR-syklusparametrene og instrumentet var som beskrevet ovenfor. Etter amplifiseringen ble 20^1 av amplifiseringsblandingen analysert på en agarosegel, og 4^1 ble anvendt for subkloning av PCR-produktene i vektoren PCRII ved anvendelse av TA-kloningssystemet (Frohman, M. A., Dush, M. K., og Martin, G. R. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85, 8998-9002) (Invitrogen). Etter ligering over natten ved 14 °C ble ligeringsproduktene anvendt for transformasjon av K coli. De resulterende transformantene ble plukket, og 3 ml overnattskulturer ble anvendt til fremstilling av plasmid-minipreparater. Innskuddsstørrelsen ble bestemt ved anvendelse av EcoRI-kutting av plasmidene, og kloner som inneholdt innskudd med tilnærmet samme størrelse som det opprinnelige PCR-produkt ble sekvensert ved anvendelse av fluorescensemerkede terminatorreagenser (Prism, Applied Biosystems) og et Applied Biosystems 373 DNA-sekvenseringsinstrument. Sekvensen til PCR-produktet er vist i figur 2. Sekvensen til amplifiseringsprimerene er understreket.
5f RACE-reaksjon
Utvidelse av cDNA identifisert ved RT-PCR ble oppnådd ved anvendelse av 5' RACE-system (Loh, E. Y., Eliot, J. F., Cwirla, S., Lanier, L. L., og davis, M. M. (1989) Science 243, 217-219; Simms, D., Guan, N., og Sitaraman, K., (1991) Focus 13, 99-100) (GIBCO). 1 ug THP-1-RNA (Behandlet med oksidert LDL), opprinnelig anvendt i differensiell fremvisnings-reaksjonene, ble anvendt i 5' RACE-fremgangsmåten: 1^1(1 ^g) RNA ble blandet med 3^1 (3 pmol) primer 2a og 11^1 DEPC-behandlet vann og oppvarmet til 70 °C i 10 minutter, fulgt av 1 minutt på is. 2,5^110x reaksjonsbuffer (200 mM Tris-HCl pH 8,4,500 mM KC1), 3^125 mM MgCl2,1 ^110 mM dNTP-blanding, og 2,5^10,1 M DTT ble tilsatt. Blandingen ble inkubert ved 42 °C i 2 minutter hvoretter 1^1 Superscript II revers transkriptase ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert i ytterligere 30 minutter ved 42 °C, 15 minutter ved 70 °C og på is i 1 minutt. 1 ^1 RNase H (2 enheter) ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 55 °C i 10 minutter. cDNA ble renset ved anvendelse av GlassMax-kolonnene (Sambrook, J. Fritsch, E. F., og Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) som inngikk i settet. cDNA ble eluert fra kolonnen med 50 ^1 dH20, frysetørket og resuspendert i 21 fal dH20. cDNA ble påsatt haler i følgende reaksjon: 7,5 ^1 dH20,2,5 Hl reaksjonsbuffer (200 mM Tris-HCl pH 8,4, 500 mM KC1), 1,5^125 mM MgCl2,2,5^12 mM dCTP, og 10 ^1 cDNA ble inkubert ved 94 °C i 3 minutter, og så i 1 minutt på is. 1 ^1 (10 enheter) terminal deoksynukleotidyl transferase ble tilsatt, og blandingen ble inkubert i 10 minutter ved 37 °C. Enzymet ble varmeinaktivert ved inkubering ved 70 °C i 10 minutter, og blandingen ble plassert på is. PCR-amplifisering av cDNA ble
utført i følgende trinn: 5 ^1 cDNA med hale inngikk i en reaksjon som også inneholdt 5 Hl 10x PCR-buffer (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 15 mM MgCl2, og 0,01 %
(w/v) gelatin), 1 ^110 mM dNTP-blanding, 2 ^1 (10 pmol) ankerprimer, 1 ^1 (20 pmol) primer 3a, og 35 ^1 dH20. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 95 °C i ett minutt, hvoretter 0,9 ^1 (4,5 enheter) Amplitaq polymerase ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble behandlet med 40 varmesykluser under følgende betingelser: 94 °C i 5 sekunder, 50 °C i 20 sekunder og 72 °C i 30 sekunder. 1 ^1 av denne reaksjonsblandingen ble anvendt i en nestet reamplifisering for å forhøye nivået av spesifikt produkt for påfølgende isolering. Reamplifiseringen omfattet: 1 ^1 primær amplifisering, 5^110x PCR-buffer, 1 |o,l 10 mM dNTP-blanding, 2 ^1 (20 pmol) universell amplifiseringsprimer, 2 ^1 (20 pmol) primer 4a, og 38 ^1 dH20. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 95 °C i 1 minutt hvoretter 0,7 ^1 (3,5 enheter) Amplitaq polymerase ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble behandlet med 40 temperatursykluser under disse betingelsene: 94 °C i 5 sekunder, 50 °C i 20 sekunder og 72 °C i 30 sekunder. Amplifiseringsproduktene ble analysert ved elektroforese i en 0,8 % agarosegel. Et dominerende produkt på tilnærmet 1,2 kilobasepar ble påvist. 2 ^1 av reaksjonsproduktene ble klonet inn i vektoren PCRII fra TA-kloningssettet (Invitrogen) og inkubert ved 14 °C over natten. Ligeringsproduktene ble anvendt for transformasjon av K coli. Innskuddsstørrelsen i de resulterende transformantene ble bestemt etter EcoRI-kutting. Kloner som inneholdt innskudd av tilnærmet samme størrelse som PCR-produktene ble sekvensert ved anvendelse av fluorescensemerkede terminatorreagenser (Prism, Applied Biosystems) og et Applied Biosystems 373 DNA-sekvenseringsinstrument. Sekvensen til RACE-produktet, innbefattet EcoRI-setene fra TA-vektoren, er vist i figur 3. Sekvensen til amplimerene (universell amplifiseirngsprimer og den komplementære sekvens til 5' RACE-primer 4a) er understreket.
Eksempel 2 - Kloning og kromosomal lokalisering av LIPG- genet
Gjennomsøking av cDNA-bibliotek
Et humant placenta-cDNA-bibliotek (Oligo dT- og tilfeldig primet, katalog nr. 5014b, parti nr. 52033) ble erholdt fra Clontech (Palo Alto, CA.). En radioaktivt merket probe ble dannet ved å kutte ut innskuddet fra et plasmid som inneholdt PCR-produktet fra 5' RACE-reaksjonen beskrevet ovenfor. Proben ble radioaktivt merket ved anvendelse av den tilfeldige primerteknikk: DNA-fragmentet (50-100 ng) ble inkubert med 1 ^g tilfeldige heksamerer (GIBCO) ved 95 °C i 10 minutter, fulgt av ett minutt på is. Ved romtemperatur ble følgende tilsatt: 3^110x Klenow-buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5,50 mM MgCl2,57 mM ditiotreitol; New England Biolabs), 3^10,5 mM dATP, dGTP, dTTP), 100^Ci a -<32>PdCTP (3000 Ci/mmol, New England Nuclear), og 1 ^1 Klenow-fragment av DNA polymerase I (5 enheter, Gibco). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 2-3 timer ved romtemperatur, og reaksjonen ble så stanset ved å øke volumet til 100^1 med TE pH 8,0 og tilsetting av EDTA til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Ikke-inkorporerte nukleotider ble fjernet ved å øke volumet av reaksjonsblandingen til 100^1 og sende den gjennom en G-50 sentrifugeringskolonne (Boehringer Mannheim). De resulterende probene hadde en spesifikk aktivitet som var høyere enn 5xl0<8>cpm/^g DNA.
Biblioteket ble gjennomsøkt ved anvendelse av etablerte fremgangsmåter (Walter, P., Gilmore, R., og Blobel, G. (1984) Cell 38, 5-8). Kort beskrevet ble filtrene hybridisert i 24 timer ved 65 °C i 4,8x SSPE (20x SSPE = 3,6 M NaCl, 0,2 M NaH2P04,0,02 M EDTA, pH 7,7), 20 mM Tris-HCl pH 7,6, lx Denhardfs løsning (100x = 2 % Ficoll 400,2 % polyvinylpyrrolidon, 2 % BSA), 10 % dekstransulfat, 0,1 % SDS, 100 ug/ml laksemelke-DNA og lxlO<6>cpm/ml radioaktivt merket probe. Filtrene ble så vasket 3 ganger i 15 minutter ved romtemperatur med 2x SSC (lx SSC =150 mM NaCl, 15 mM natriumsitrat pH 7,0), 0,1 % natrium dodecylsulfat (SDS), fulgt av tre ganger 15 minutters vask ved 65 °C i 0,5x SSC, 0,1 % SDS. Bakteriofag som hybridiserte til proben ble isolert og amplifisert. DNA ble renset fra den amplifiserte bakteriofag ved anvendelse av LambdaSorb-reagens (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Innskuddet ble utkuttet fra bakteriofag-DNA ved kutting med EcoRI. Innskuddene ble subklonet i EcoRI-setet i en plasmidvektor (Bluescript II SK, Stratagene). Sekvensen til den åpne leseramme som inngikk i EcoRI-fragmentet på 2,6 kb fra cDNA ble bestemt ved automatisk sekvensering som beskrevet ovenfor. Sekvensen er vist i figur 4. Aminosyresekvensen til det utledete protein som kodes av den åpne leserammen er vist i figur 5 og har blitt kalt LLGXL. Den første metionin antas å kodes av nukleotidparene 252-254. Det utledete protein er 500 aminosyrer langt. De første 18 aminosyrene danner en sekvens som er karakteristisk for et sekretorisk signalpeptid (Higgins, D. G., og Sharp, P. M. (1988) Gene 73,237-244). Propeptidet forventes å ha en molekylvekt på 56800 Dalton. Antas kløyving av signalpeptidet i posisjon 18, har det umodifiserte, modne protein en molekylvekt på 54724 Dalton.
De generelle likhetene mellom dette proteinet og de andre kjente medlemmer av triacylglyserollipasefamilien er vist i figur 6 og tabell 1.1 sammenstillingen vist i figur 6 er LIPG-polypeptidet (SEKV. ID. NR. 6) som kodes av cDNA (SEKV. ID. NR. 5) beskrevet i eksempel 1, og i det påfølgende betegnet LLGN. Dette proteinet er identisk med LLGXL-proteinet i de 345 aminoterminale aminosyrerestene. Ni unike aminosyrerester følges av et termineringskodon, noe som gir et propolypeptid på 39,3 kD og et modent protein på 37,3 kD. Sekvensene som er felles for LLGN og LLGXL er nukleinsyresekvensen ifølge SEKV. UD. NR. 9 og aminosyresekvensen ifølge SEKV. UD. NR. 10.
Det er av interesse at posisjonen hvor LLGN- og LLGXL-proteinet skiller lag er i et område som ut fra strukturen til de andre lipasene vites å ligge mellom proteinenes aminodoméne og karboksydoméne. LLGN-proteinet ser derfor ut til å bestå av bare et av de to triacylglyserollipasedoménene. Denne sekvensen inneholder det karakteristiske "GXSXG"-lipasemotivet i posisjonene 167-171, så vel som konservasjon av de katalytiske triadeaminosyrerestene i Ser 169, Asp 193, og His 274. Konservasjon av systeinrestene (posisjonene 64,77,252,272,297,308,311,316,463 og 483) som man tror inngår i disulfidbindinger i de andre lipasene tyder på at LLGXL-proteinet har strukturell likhet med de andre enzymene. Det er fem mulige seter for N-koblet glykocylering, i aminosyreposisjonene 80,136, 393,469 og 491. Proteinsekvensene som anvendes i sammenlikningene er human lipoprotein lipase (LPL; Genbank aksesjonsbetegnelse Ml5856, SEKV. UD. NR. 13), human hepatisk lipase (HL; Genbank aksesjonsbetegnelse J03540, SEKV. UD. NR. 14), human pancreatisk lipase (PL; Genbank aksesjonsbetegnelse M93285, SEKV. ID. NR. 15), humant pancreatisk lipasebeslektet protein-1 (PLRP-1; Genbank aksesjonsbetegnelse M93283), og humant pancreatisk lipasebeslektet protein-2 (PLRP-2; Genbank aksesjonsbetegnelse M93284).
Prosentlikhet er basert på parvis sammenstilling ved anvendelse av Clustal-algoritmen (Camps, L., Reina, M, Llobera, M, Vilaro, S., og Olivecrona, T. (1990) Am. J. Physiol. 258, C673-C681) i programmet Megalign i Lasergene Biocomputing Software Suite (Dnastar).
Kromosomal lokalisering
DNA fra en Pl-klon (Sternberg, N., Ruether, J. og DeRiel, K. The New Biologist 2: 151-62,1990) som inneholder genomisk LLG-DNA ble merket med digoksigenin-UTP ved "nick"-translasjon. Den merkete probe ble blandet med oppbrutt humant DNA og hybridisert til PHA-stimulerte lymfocyter fra perifert blod fra en mannlig donor i en løsning som inneholdt 50 % formamid, 10 % dekstransulfat og 2x SSC. Spesifikke hybridiseringssignaler ble påvist ved å inkubere de hybridiserte cellene i fluoresceinmerket anti-digoksigeninantistoff, fulgt av motfarging med DAPU. Dette innledende eksperimentet førte til spesifikk merking av et gruppe E-kromosom, som basert på DAPI-fargingen ble antatt å være kromosom 18.
Et andre eksperiment ble utført der en biotinmerket probe, spesifikk for centromeren i kromosom 18 ble kohybridisert med LLG-proben. Dette eksperimentet førte til spesifikk merking av kromosom 18-centromeren i rødt og den lange arm av kromosom 18 i grønt. Målinger utført på 11 spesifikt merkete hybridiserte kromosom 18, viste at LLG har en Fiter-verdi på 0,67 (Franke-måling på 0,38), noe som tilsvarer bånd 18q21. Flere genetiske sykdommer, innbefattet intrahepatisk kolestase, stav-tapp-dystrofi og familiær ekspansil osteolyse, antas å omfatte defekter i dette kromosomale område.
EKSEMPEL 3 - LIPG- RNA- analyse
Ekspresjon av LIPG-RNA i THP-l-celler
Analyse av det mRNA som cDNA var avledet fra ble utført ved northern-analyse av THP-1-RNA. RNA fira disse cellene ble fremstilt som beskrevet ovenfor. mRNA ble renset fra total-RNA ved anvendelse av et poly-dT-magnetisk kulesystem (Polyattract system, Promega). Tre^g poly (A)-holdig mRNA ble fraksjonert ved elektroforese i en 1 % agarose-formaldehydgel. Gelen ble vasket i 30 minutter med dH20. RNA ble overført med vakuum til en nylonmembran ved anvendelse av alkalisk overføringsbuffer (3 M NaCl, 8 mM NaOH, 2 mM sarkosyl). Etter overføringen ble blotet nøytralisert ved inkubering i 5 minutter i 200 mM fosfatbuffer pH 6,8. RNA ble kryssbundet til membranen ved anvendelse av et apparat for ultrafiolett kryssbinding (Stratagene).
En probe ble fremstilt ved å kutte ut innskuddet i et plasmid som inneholdt PCR-produktet fra 5' RACE-reaksjonen beskrevet ovenfor. Proben ble radioaktivt merket ved anvendelse av tilfeldig-primingsteknikken beskrevet i eksempel 2.
Filtrene ble dehybridisert i QuikHyb hurtig hybridiseirngsLøsning (Stratagene) i 30 minutter ved 65 °C. Den radioaktivt merkete probe (1-2 x IO6 cpm/ml) og ultralydbehandlet laksemelke-DNA (sluttkonsentrasjon 100^g/ml) ble denaturert ved oppvarming til 95 °C i 10 minutter og hurtig avkjøling på is før tilsetting til filteret i QuikHyb. Hybridiseringen foregikk i 3 timer ved 65 °C. Ikke-hybridisert probe ble fjernet ved 2 gangers vask av filtrene, hver gang i 15 minutter, med 2x SSC, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved romtemperatur, fulgt av to ganger 15 minutters vask i 0,1 x SSC, 0,1 % SDS ved 62 °C. etter vask ble filtrene tørket i kort tid og så pålagt Kodak XAR-2-film med intensiveringsfolie ved -80 °C. Resultatene er vist i figur 7, som viser et hoved-mRNA-molekyl på tilnærmet 4,5 kilobaser. Mindre molekyler på 4,3 og 1,6 kilobaser foreligger også. Den forventete størrelse av LLGN-cDNA er 1,6 kilobaser. LLGXL-sekvensen kodes sannsynligvis av den påviste hovedtype av mRNA.
Ekspresjon av LIPG-RN A i forskjellige humane vev.
Et kommersielt fremstilt filter som inneholdt 3^g hver av mRNA fra humane vev (hjerte, hjerne, placenta, lunge, lever, skjelettmuskel, nyre og bukspyttkjertel) ble erholdt fra Clontech (katalog nr. 7760-1). Dette filteret ble analysert og prosessert som beskrevet ovenfor. Etter analyse med det radioaktivt merkete LLG-fragment og autoradiografi ble proben fjernet ved vask i kokende 0,1 x SSC, 0,1 % SDS i 2x 15 minutter i en 65 °C inkubator. Membranene ble så analysert med et DNA-fragment på 1,4 kilobasepar som kodet for human lipoproteinlipase. Dette fragmentet ble erholdt ved RT-PCR av THP-1-RNA (behandlet med PMA og oksidert LDL) ved anvendelse av 5' LPL- og 3' LPL-primerene beskrevet i figur 1 og RT-PCR-betingelsene beskrevet ovenfor. Etter autoradiografi ble membranene igjen befridd for probe og analysert med et radioaktivt fragment av humant beta-actin-cDNA for normalisering av RNA-innholdet. Resultatene fra disse analysene er vist i figur 8. Det høyeste nivå av LIPG- mRNA ble påvist i placenta-RNA, med lavere nivåer påvist i RNA avledet fra lunge-, lever- og nyrevev. I samsvar med tidligere undersøkelser av andre (Verhoeven, A. J. M, Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211,121-124), ble lipoprotein lipase-mRNA påvist i mange vev, med det høyeste nivå funnet i hjertevev og skjelettmuskelvev. Resultatene fra denne analyse tyder på at vevsforbedringen for LIPG-ekspresjon er svært forskjellig fra vevsfordelingen for ekspresjon av LPL. Mønsteret for LIPG-ekspresjon er også forskjellig fra mønsteret for hepatisk lipase eller pancreatisk lipase, som rapportert av andre (Wang , C. -S., og Hartsuck, J. A. (1993) Biochem. Biophys. Acta. 1166, 1-19; Semenkovich, C. F., Chen, S. -W., Wims, M., Luo C. -C, Li, W. -FL, og Chan, L. (1989) J. Lipid Res. 30, 423-431; Adams, M. D., Kerlavage, A. R., Fields, C, og Venter, C. (1993) Nature Genet. 4, 256-265).
For å bestemme ekspresjonsmønsteret i ytterligere humane vev ble en annen kommersielt fremstilt membran analysert med LLGXL-cDNA. Dette dot-blotet (Human RNA Master Blot, Clontech katalog nr. 7770-1) inneholder 100-500 ng mRNA fra 50 forskjellige vev og er normalisert for ekvivalent ekspresjon av husholdningsgener (Chen, L., og Morin, R. (1971) Biochim. Biophys. Acta 231,194-197). Et Dral-Srfl-fragment på 1, 6 kb fra LLGXL-cDNA ble merket med<32>P dCTP ved anvendelse av et tilfeldig oligonukleotid primingssystem (Prime It II, Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner. Etter 30 minutters prehybridisering ved 65 °C ble proben tilsatt til QuikHyb hybridiseirngsløsning ved l,3xl0<6>cpm/ml. Hybridiseringen foregikk i 2 timer ved 65 °C. Ikke-hybridisert probe ble fjernet ved 2 gangers vask av filtrene, hver gang i 15 minutter, med 2x SSC, 0,1 % natriumdodecylsulfat ved romtemperatur, fulgt av to ganger 15 minutters vask i 0,1 x SSC, 0,1 % SDS ved 62 °C. Etter vask ble filtrene tørket i kort tid og så pålagt Kodak XAR-2-film med intensiveirngsfolie ved -80 °C i forskjellige tidsrom. De resulterende bildene ble kvantifisert ved densitometrisk analyse. Resultatene er vist i tabell 2. Det relative ekspresjonsnivået i vevene som foreligger både i northern-blotet fra flere vev og dot-blotet fra flere vev tilsvarer hverandre med høyest nivå i placenta og lavere nivåer i lunge, lever og nyre. Føtal lever, nyre og lunge har stort sett samme ekspresjonsnivå som de voksne vev. Overraskende nok var ekspresjonsnivået i skjoldkjertelvev det høyeste i de undersøkte vev, med en ekspresjon som var 122 % av ekspresjonen i placentavev. Mens lipaseekspresjonen i placenta tidligere er blitt påvist (Rothwell, J. E., Elphick, M. C. (1982) J. Dev. Physiol. 4, 153-159; Verhoeven, A. J. M., Carling D. og Jansen, H. (1994) J. Lipid Res. 35, 966-975; Burton, B. K., Mueller, H. W. (1980) Biocim. Biophys. Acta 618, 449-460), var det ikke tidligere kjent at skjoldkjertelen uttrykker en lipase. Disse resultatene tyder på at LIPG-ekspresjonen kan inngå i opprettholdelse av placenta, hvor LIPG kan bidra til å frigjøre frie fettsyrer fra substrater som fosfolipider, som energikilde. LIPG som uttrykkes i skjoldkjertelen kan tenkes å tilveiebringe forløpere for syntese av bioaktive molekyler i denne kjertelen.
De gitte verdier er prosent ekspresjon, hvor ekspresjonsnivået i placentavev er satt til 100 %. Verdiene er gjennomsnittet fra densitometriske målinger fra to autoradiografi fremkallinger. N.D. = ikke påvisbart.
Ekspresjon av LIPG-RN A i dyrkede endotelceller
Humane endotelceller fra navlesnorvenen (HUVEC) og humane endotelceller fira kransarterie (HCAEC) ble erholdt fra Clonetics. HUVEC S ble dyrket i et kommersielt fremstilt endotelcelledyrkingsmedium (EGM, Clonetics) tilsatt 3 mg/ml storfehjerneekstrakt (Maciag, T., Cerundolo, J., Ilsley, S., Kelley, P. R. og Forand, R.
(1979) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 5674-5678), Clonetics), mens HCAEC ble dyrket i EGM tilsatt 3 mg/ml storfehjerneekstrakt og 3 % føtalt bovint serum (5 % sluttkonsentrasjon). Cellene ble dyrket til konfluens, hvoretter mediet ble endret til EGM uten storfehjerneekstrakt. Kulturene ble stimulert ved tilsetting av 100 ng/ml forbolmyristat (Sigma). Etter 24 timers inkubering ble RNA ekstrahert fira cellene ved Trizol-fremgangsmåten beskrevet ovenfor. 20^g total-RNA ble fraksjonert ved elektroforese og overført til en membran for analyse. Membranene ble analysert med LIPG- LPL-prober som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i figur 9. 20^g total-RNA fra THP-1-celler stimulert med PMA ble analysert i blotet for sammenlikningens skyld. RNA som hybridiserte til LIPG-proben ble påvist i ikke-stimulerte og PMA-stimulerte HUVEC-celler. I motsetning til dette ble påvisbart nivå av LIPG-mRNA kun funnet i HCAEC-kulturer etter stimulering med PMA. I samsvar med tidligere undersøkelser av andre, ble intet påvisbart lipoprotein lipase-mRNA påvist i RNA fra noen av endotelcellene (Verhoeven, A. J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211,121-1224).
EKSEMPEL 4 - LIPG- proteinanalyse
Fremstilling av antistoff
Antiserum ble frembrakt mot peptider med sekvenser som tilsvarte et område i det utledete protein som kodes av den åpne leseramme i LIPG-cDNA. Dette peptidet ble valgt grunnet dets høye utledete antigenisitetsindeks (Jameson, B. A., og Wolf, H.
(1988) Comput. Applic. in the Biosciences 4,181-186). Sekvensen til det immuniserende peptid ble ikke funnet i noe protein eller noen translatert DNA-sekvens i databasen Genbank. Den tilsvarende posisjon i LIPG-proteinet er vist i figur 10. Den karboksyterminale systein i peptidet tilsvarer ikke aminosyreresten i det utledete LIPG-protein, men ble innført for å forenkle kobling til bærerproteinet. Peptidet ble syntetisert i et Applied Biosystems Model 433A peptidsynteseinstrument. 2 mg peptid ble koblet til 2 mg maleimidaktivert "keyhole limpef-hemocyanin ifølge fremgangsmåtene som inngår i Imject Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce Chemical). Etter avsalting ble halvparten av konjugatet emulgert med et likt volum Freund's komplette adjuvans (Pierce). Dette emulgatet ble injisert i en New Zealand White-kanin. Fire uker etter første inokulering ble en forsterkerinokulering utført med et emulgat fremstilt nøyaktig som beskrevet ovenfor, bortsett fra at Freund's ukomplette adjuvans (Pierce) ble anvendt. To uker etter forsterkeirnjeksjonen ble blod tappet og titeret av spesifikke antistoffer bestemt ved ELISA, ved anvendelse av immobilisert peptid. En påfølgende forsterkerinjeksjon ble utført en måned etter første forsterkerinjeksjon.
Western-analyse av medium fra endotelcellekulturer
HUVEC- og HCEAC-celler ble dyrket og stimulert med PMA som beskrevet i eksempel 3C, bortsett fra at cellene ble stimulert med PMA i 48 timer. Uttak av kondisjonert medium (9 ml) ble inkubert med 500^1 av en 50 % suspensjon av heparin- Sepharose CL-6B i fosfatbufret saltvann (PBS, 150 mM natriumklorid, 100 mM natriumfosfat, pH 7,2). Heparin- Sepharose ble valgt for delvis rensing og oppkonsentrering av LIPG-proteinene, grunnet konservering av aminosyrerester i LLGXL-sekvensen som har blitt vist å være avgjørende for den heparinbindende aktivitet av LPL (Ma, Y., Henderson, H. E., Liu, M. -S., Zhang, H., Forsythe, I. J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M. R., og Brunzell, J. D., J. Lipid Res. 35, 2049-2059; og Fig. 6.). Etter rotasjon ved 4 °C i 1 time ble prøvene sentrifugert i 5 min. ved 150 x g. Mediet ble avsugd og sefarose-gelen vasket med 14 ml PBS. Etter sentrifugering og avsuging ble nedsentrifugert heparin-Sehparose suspendert i 200^12x SDS-påsettingsbuffer (4 % SDS, 20 % glyserol, 2 % p-merkaptoetanol, 0,002 % bromfenolblått og 120 mM Tris pH 6,8). Prøvene ble oppvarmet til 95 °C i 5 minutter og 40^1 ble satt på en 10 % Tris-Glycin-SDS-gel. Etter elektroforese ved 140 V i tilnærmet 90 minutter ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner ved hjelp av et Novex elektroblottingsapparat (210 V, 1 time). Membranene ble blokkert i 30 minutter i blokkeringsbuffer (5 % fettfri tørrmelk, 0,1 % Tween 20,150 mM natriumklorid, 25 mM Tris pH 7,2). Anti-peptidantiserum og normalt kaninserum ble fortynnet 1:5000 i blokkeringsbuffer og inkubert med membranene over natten ved 4 °C under forsiktig omrysting. Membranene ble så vasket 4x 15 minutter med TB ST (0,1 % Tween 20, 150 mM natriumklorid, 25 mM Tris pH 7,2). Peroksydasekonjugert anti-kaninantiserum fra geit (Boehringer Mannheim) ble fortynnet 1:5000 med blokkeringsbuffer og inkubert med membranen i 1 time under omrysting. Membranene ble vasket som ovenfor, fikk reagere med Renaissance chemiluminescent reagens (DuPont NEN), og ble pålagt Kodak XAR-2-film. Resultatene er vist i figur 11. To typer immunreaktivt protein foreligger i prøvene fra ikke-stimulerte HUVEC- og HCAEC-celler. Nivået av immunreaktivt protein i de ikke-stimulerte HCAEC-prøvene er mye lavere enn i den tilsvarende HUVEC-prøve. Etter stimulering med PMA utskilles tre immunreaktive proteiner av endotelcellekulturene. PMA-behandling ga en kraftig økning av nivået av LIPG-proteiner som dannes av HCAEC-kulturene. PMA induksjon av LLG-proteiner var ikke like dramatisk i HUVEC-kulturene.
EKSEMPEL 5 - Fremstilling av rekombinant LIPG- protein LIPG-ekspresj onskonstruksj oner
cDNA som koder for LLGN- og LLGXL-proteinet ble klonet inn i pattedyrekspresjonsvektoren pCDNA3 (Invitrogen). Denne vektor tillater ekspresjon av fremmede gener i mange pattedyrceller ved anvendelse av den sene hovedpromoter fra cytomegalovirus. LLGN-5' RACE-produktet ble klonet i EcoRI-setet i pCDNA3.
LLGXL-cDNA ble kuttet med Dral og Srfl for dannelse av et cDNA på 1,55 kb (se figur 4). Vektoren ble kuttet med restriksjonsenzymet EcoRV, og vektor og innskudd ble ligert ved anvendelse av T4 DNA ligase og reagenser fra Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim) ifølge produsentens instruksjoner. Ligeringsproduktene ble anvendt for transformasjon av kompetente E. coli.-celler. De resulterende kolonier ble analysert ved restriksjonsanalyse og sekvensering for nærvær og orientering av innskuddet i ekspresjonsvektoren.
Forbigående transfeksjon med LIPG av COS-7-celler
LIPG-ekspresjonsvektorene ble innført i COS-7-celler ved anvendelse av det kationiske lipidreagens Lipofektamin (GIBCO). 24 timer før transfeksjonen ble COS-7-celler utsådd i 60 mM vevdyrkingsskåler ved en tetthet på 2x 10<5>celler/skål. Cellene ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM; GIBCO) tilsatt 10 % føtalt kalveserum, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin. 1^g plasmid-DNA ble tilsatt til 300^1 Optimem I serumfritt medium (GIBCO). 10 ^1 lipofektamin-reagens ble fortynnet med 300^1 Optimem I-medium, og dette ble blandet med DNA-løsningen og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Mediet ble fjernet fra skålene, og cellene ble vasket med 2 ml Optimem-medium. DNA-lipofektamin-Løsningen ble tilsatt til skålene sammen med 2,7 ml Optimem-medium, og skålene ble inkubert i 5 timer ved 37 °C. Etter inkubasjonen ble det serumfrie medium fjernet og erstattet med DMEM tilsatt 2 % FBS og antibiotika. 12 timer etter transfeksjonen ble noen av kulturene behandlet med enten 0,25 mM Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), en proteaseinhibitor, eller 10 U/ml heparin. 30 minutter før cellene ble høstet ble de heparinbehandlete prøvene behandlet med ytterligere 40 U/ml heparin. Mediet ble fjernet fra cellene 60 timer etter transfeksjonen. Heparin.Sepharose CL-4B (200 ul av en 50 % suspensjon i PBS pH 7,2) ble tilsatt til 1 ml medium og blandet ved 4 °C i en time. Sefarose-gelen ble nedsentrifugert ved lav hastighet og vasket 3 ganger med 1 ml kald PBS. Sefarose-gelen ble nedsentrifugert og suspendert i 100^12x påsettingsbuffer. Prøvene ble oppvarmet til 95 °C i 5 minutter. 40^1 av hver prøve ble satt på en 10 % SDS-PAGE-gel. Elektroforesen og western-analysen ble utført ved anvendelse av anti-LIPG-antiserum som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i figur 12. Proteiner fra HCAEC-kondisjonert medium inngikk som størrelsesreferanser. LLGN vandrer tilsvarende tilnærmet 40 kD, noe som tilsvarer det laveste bånd i HCAEC. Medium fra COS-celler transfektert med LLGXL-cDNA inneholder molekyler på både 68 kD og 40 kD. Ved behandling av disse cellene med heparin økte mengden dramatisk av både 68 kD-protein og 40 kD-protein gjenvunnet fra mediet, noe som tyder på enten frigjøring av proteoglykanbundet protein fra celleoverflaten eller stabilisering av proteinene ved heparin. Ved behandling av cellene med proteaseinhibitoren Pefabloc, økte mengden 68 kD-protein relativt til molekylet på 40 kD. Dette tyder på at proteinet med den laveste molekylvekt som dannes av disse cellene er et proteolyseprodukt av den større formen på 68 kD. Rollen til mRNA identifisert ved differensiell fremvisning som koder for et kortere protein på 40 kD er ikke kjent. Det har imidlertid blitt rapportert en alternativt spleiset form av hepatisk lipase som tilsynelatende uttrykkes på vevsspesifikk måte og som vil gi et avkortet protein.
EKSEMPEL 6 - LIPG i dyrearter
Kloning av kaninhomologen til LIPG
Et kommersielt tilgjengelig lamda-cDNA-bibliotekene avledet fira kaninlungevev (Clontech, kat. nr. TLlOIOb) ble anvendt for isolering av et fragment av kaninhomologen til LIPG-genet. 5^1 av biblioteklageret ble tilsatt til 45^1 vann og oppvarmet til 95 °C i 10 minutter. Følgende ble tilsatt til et sluttvolum på 100 |jl: 200 \ M dNTP, 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 100^M av hver av primerene DLIP774 og LLGgen2a, og 2,5 U Taq polymerase (GIBCO). Reaksjonsblandingen ble behandlet med 35 temperatursykluser med parametrene : 15 sekunder ved 94 °C, 20 sekunder ved 50 °C og 30 sekunder ved 72 °C. 10^1 av reaksjonsblandingen ble analysert ved agarosegelelektroforese. Et produkt på tilnærmet 300 basepar ble påvist. Et uttak (4^1) av reaksjonsblandingen ble anvendt for kloning av produktet ved hjelp av TA kloningssystemet. Innskuddet i en resulterende klon ble sekvensert (SEKV. ID. NR. 11). En sammenstilling mellom den utledete aminosyresekvens fra kanin (SEKV. ID. NR. 12) og den tilsvarende sekvens utledet fra det humane cDNA, også vist i figur 14. Av nukleotidene som ikke inngår i noen av amplifiseringsprimerene er det 85,8 % identitet mellom kaninsekvensen og den humane LLG-sekvens. Det utledete protein som kodes av dette kanin-cDNA viser 94,6 % identitet med det humane protein, hvor de fleste av nukleotidsubstitusjonene foreligger i tredje posisjon eller "slarke"-posisjonen i kodonene. Det er verdt å merke seg at dette området spenner over "lokk"-sekvensen i de utledete LLG-proteinene og er et variabelt domene i lipasegenfamilien. Dette viser at det er høy grad av konservasjon av dette genet mellom artene.
LIPG i andre arter
For å vise nærvær av LLG-gener i andre arter ble genomisk DNA fira forskjellige arter restriksjonskuttet med EcoRI, separert ved elektroforese i agarosegeler og blottet over på nitrocellulosemembraner.
Membranene ble hybridisert over natten ved 65 °C med 2,5 x IO6 cpm/ml tilfeldig primet<32>P-LLG- eller32P-LPL (lipoprotein lipase)-probe i en hybridiseringsløsning bestående av 6x SSC, 10 % dekstransulfat, 5x Dendarfs løsning, 1 % SDS, og 5 ug/ml laksemelke-DNA. Membranene ble vasket med 0,lx SSC, 0,5 % SDS i 10 minutter ved romtemperatur, og så i 10 minutter ved 40 °C, 50 °C og 55 °C. Autoradiogrammer av blottene er vist i figur 16.
Figur 16 viser nærvær av LLG- og LPL-gener i alle de undersøkte arter, bortsett fra at ingen hybridisering ble observert med LLG-proben mot rotte-DNA. Disse uvanlige resultatene for rotte kan representere en artefakt som skyldes dannelse av restriksjonsfragmenter med unormal størrelse som inneholder LLG-sekvensene. Slike fragmenter kan ligge utenfor fraksjoneirngsområdet for agarosegelen eller blottes lite effektivt. De forskjellige båndene som påvises med de to probene viser at LPL og LIPG er separate, evolusjonært konserverte gener.
EKSEMPEL 7 - Enzymatisk aktivitet av LLGXL
Fosfolipaseaktivitet
Kondisjonert medium fra COS-7-celler som forbigående uttrykker human lipoprotein lipase (LPL), LLGN eller LLGXL ble analysert for fosfolipaseaktivitet. MEM tilsatt 10 % FBS (MEM) ble anvendt som blindprøve, mens kondisjonert medium fra COS-7-celler transfektert med et "antisense"-LLGXL-plasmid (AS) ble anvendt som negativ kontroll.
En fosfatidylkolin (PC)-emulsjon ble fremstilt ved anvendelse av 10^1 fosfatidylkolin (10 mM), 40^1<14>C-fosfatidylkolin, dipalmitoyl (2^Ci), merket i sn 1- og -2-posisjon, og 100 n Tris-TCNB (100 mM Tris, 1 % Triton, 5 mM CaCL2, 200 mM NaCl, 0,1 % BSA). Emulsjonen ble inndampet i 10 minutter og så justert til et endelig volum på 1 ml i Tris-TCNB: Reaksjonen ble utført i duplikat og inneholdt 50^1 PC-emulsjon og 950^1 medium. Prøvene ble inkubert i et vannbad under omrysting i 2-4 timer ved 37 °C. Reaksjonene ble stanset ved tilsetting av 1 ml IN HC1, og så ekstrahert med 4 ml 2-propanol:heksan (1:1). Det øvre heksanlag på 1,8 ml fikk passere gjennom en kiselgelkolonne, og de frigjorte<14>C-merkete frie fettsyrer som inngikk i den ubundete fraksjon ble kvantitert i en scintillasjonsteller. Resultatene fra disse analysene er vist i figur 14.
Triacylglyserol lipaseaktivitet
Kondisjonert medium fra COS-7-celler som forbigående uttrykker human lipoprotein lipase (LPL), LLGN eller LLGXL ble analysert for triglyserol lipaseaktivitet. MEM
tilsatt 10 % FBS ble anvendt som blindprøve, og kondisjonert medium fra COS-7-celler transfektert med et "antisense" LLGXL-plasmid (AS) ble anvendt som negativ kontroll.
Et konsentrert substrat ble fremstilt som en vannfri emulsjon av merket triolein, [9,10-<3>H(N)] og umerket triolein (endelig totalkonsentrasjon av triolein =150 mg med 6,25x 10<8>cpm), som ble stabilisert ved tilsetting av 9 mg lecitin i 100 % glyserol. 0,56 ml<3>H-triolein, (0,28 mCi) ble blandet med 0,17 ml umerket triolein og 90 ^1 lecitin (9 mg). Blandingen ble inndampet under en nitrogenstrøm. Den tørkete lipidblanding ble emulgert i 2,5 ml 100 % glyserol ved ultralydbehandling (30 sekunders puls på nivå 2, fulgt av 2 sekunders pulser med avkjøling i mellom over et tidsrom på 5 minutter).
Analysesubstratet ble fremstilt ved fortynning av et volum konsentrert substrat med 4 volumer 0,2 M Tris-HCl-buffer (pH 8,0) tilsatt 3 % (vekt/volum) fettsyrefritt bovint serumalbumin. Det fortynnete substrat ble vortex behandlet kraftig i 5 sekunder.
Reaksjonene ble utført i duplikat i et totalvolum på 0,2 ml, inneholdende 0,1 ml analysesubstrat og 0,1 ml av det angitte kondisjonerte medium. Reaksjonene ble inkubert i 90 minutter ved 37 °C. Reaksjonene ble stanset ved tilsetting av 3,25 ml metanol-kloroform-heptan 1,41:1,25:1 (vol/vol/vol), fulgt av 1,05 ml 0,1 M kaliumkarbonat-boratbuffer (pH 10,5). Etter kraftig omrysting i 15 sekunder ble prøvene sentrifugert i 5 minutter ved 1000 rpm. Et uttak på 1,0 ml av den øvre vannfase ble målt i en scintillasjonsteller. Resultatene fra disse analysene er vist i figur 15.
EKSEMPEL 8 - Anvendelse av LIPG- polypeptid for søk etter enhancere eller
inhibitorer
Rekombinant LIPG fremstilles fra baculovirusinfiserte insektceller, stabilt transfekterte CHO-celler eller andre aksepterbare pattedyrvertsceller. Rekombinant LIPG renses fra det serumholdige eller serumfrie kondisjonerte medium ved kromatografi på heparin-sefarose, fulgt av kromatografi på et kationbytterresin. Et tredje kromatografitrinn eller ytterligere kromatografitrinn, for eksempel molekylfiltrering, anvendes i rensingen av LIPG om nødvendig. Under rensingen anvendes anti-peptidantistoffer for å måle LIPG-protein , mens fosfolipaseanalysen anvendes for å følge LIPG-aktiviteten.
I fluorescenseanalysen er de endelige analysebetingelser tilnærmet 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), lOOmM KC1, 2 mM CaCLj, 5 \ M C6NBD-PC{l-acyl-2-[6-(nitro-2,l,3-benzoksadiazol-4-yl)amino] kaproylfosfatidylkolin, og LIPG-protein (tilnærmet 1-100 ng). Reaksjonsblandingen utsettes for fluorescenseeksitasjon ved 470 nm, og enzymaktiviteten, målt ved fluorescenseemisjon ved 540 nm, måles kontinuerlig. Forbindelser og/eller substanser som analyseres for stimulering og/eller inhibering av LIPG-aktiviteten tilsettes som 10-200 mM løsninger i dimetylsulfoksid. Forbindelser som stimulerer eller inhiberer LIPG-aktiviteten identifiseres ved at de gir forhøyet eller redusert fluorescenseemisjon ved 540 nm.
I tioanalysen er de endelige analysebetingelser tilnærmet 25 mM Tris_HCl (pH 8,5), 100 mM KC1,10 mM CaCl2, 4,24 mM Triton X-100, 0,5 mM l,2-bis(heksanoylthio)-l,2-dideoksy-sn-glysero-3-fosforylkolin, 5 mM 4,4'-dithiobispyridin (fra en 50 mM lagerløsning i etanol), og 1-100 ng rekombinant LIPG: Fosfolipaseaktiviteten bestemmes ved å måle økningen i absorbsjon ved 342 nm. Forbindelser og/eller substanser som skal analyseres for stimulering og/eller inhibering av LIPG-aktiviteten tilsettes som 10-200 mM løsninger i dimetylsulfoksid. Forbindelser som stimulerer eller inhiberer LIPG-aktiviteten identifiseres ved at de gir forhøyet eller redusert absorpsjon ved 342 nm.
EKSEMPEL 9 - Transgene mus som uttrykker human LIPG
For ytterligere å undersøke den fysiologiske rolle til LIPG frembringes transgene mus som uttrykker human LIPG.
Dral/Srfl-restriksjonsfragmentet på 1,53 kb som koder for LLGXL (se figur 4) ble klonet inn i en plasmidvektor (pHMG) nedstrøms for promoteren for det generelt uttrykte 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A (HMG CoA) reduktasegenet. Transgene mus som uttrykker forskjellig nivå av human LLGXL frembringes ved anvendelse av standard fremgangsmåter (se for eksempel G. L. Tremp et al., Gene 156: 199-205,1995). De transgene musene anvendes for å bestemme virkningen av LLGXL-overekspresjon på lipidprofilen, vasculære sykdomstilstander, utviklingshastighet og omfang av aterosklerose, samt andre fysiologiske parametere.
EKSEMPEL 10 - Ekspresjon av LIPG i aterosklerotiske vev
LLGXL-ekspresjon i aterosklerose ble undersøkt ved å utføre en revers transkripsjon-polymerase-kjedereaksjon (RT-PCR) ved anvendelse av mRNA isolert fra karbiopsier fra fire pasienter med aterosklerose. Vevsprøvene var fra aortaveggen (en prøve), bekkenarterie (to prøver) og halsarterien (en prøve).
Aterosklerosebiopsier ble mottatt fra Gloucestershire Royal Hospital, England og polyA+-mRNA ble fremstilt og resuspendert i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann i en konsentrasjon på 0,5^g mRNA/^1. Revers transkriptasereaksjoner ble utført ifølge Gibco-BRL-fremgangsmåten for Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis. Kort beskrevet ble cDNA syntetisert som følger: 2^1 av hvert mRNA ble tilsatt til 1 ^1 oligo (dT)i2-is primer og 9^1 DEPC-vann. Rørene ble inkubert ved 70 °C i 10 minutter og satt på is i ett minutt. Hvert rør ble tilsatt følgende bestanddeler: 2 ^110x PCR-buffer, 2^125 mM MgCl2, 1 ^110 mM dNTP-blanding og 2 ul 0,1 M DTT. Etter 5 minutter ved 42 °C ble 1 ^1 (200 enheter) Super Script II revers transkriptase tilsatt. Reaksjonsblandingene ble forsiktig sammenblandet og inkubert ved 42 °C i 50 minutter. Reaksjonene ble stanset ved inkubering ved 70 °C i 15 minutter, og så satt på is. Gjenværende mRNA ble ødelagt ved tilsetting av 1 ^1 RNase H til hvert rør, og inkubert i 20 minutter ved 37 °C.
PCR-amplifiseringer ble utført ved anvendelse av 2myl av cDNA-reaksjonene. Hvert rør ble tilsatt følgende: 5^110x PCR-buffer, 5^12 mM dNTP-blanding, 1^1 hllg-gspl-primer (20 pmol/ml, se figur 1), 1 mul hllg-gsp2a-primer (20 pmol/ml, se figur 1), 1,5^150 mM MgCl2,0,5^1 Taq polymerase (%U/ml) og 34^1 vann. Etter inkubering av reaksjonsblandingene ved 35 °C i 2 minutter ble 30 PCR-sykluser utført som følger: 15 sekunder ved 94 °C, 20 sekunder ved 52 °C og 30 sekunder ved 72 °C. De ferdige reaksjonene ble inkubert i 10 minutter ved 72 °C før analyse ved agarosegelelektroforese. hllg-gsp-primerene er spesifikke for LIPG og gir et forventet produkt på 300 bp. I en parallell PCR som ble kjørt for å vise at cDNA-syntesereaksjonene hadde vært vellykkete ble primere spesifikke for husholdningsgenet G3PDH (human glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase) anvendt (1 ^1 av en løsning på 20 pmol/ml av hver primer).
G3PDH-primerene (se figur 1) ga det forventete produkt på 983 bp i alle fire karbiopsiprøver. LIPG-ekspresjonen ble påvist i tre av de fire prøvene, mens ingen ekspresjon ble påvist i halsarterieprøven.
EKSEMPEL 11 - Differensiell fremvisning, RT- PCR og cDNA- biblioteksøk
For å utføre eksperimentene diskutert i eksemplene 12 til 16 ble følgende fremgangsmåte (basert på fremgangsmåten skissert i eksempel 1) anvendt for erholdelse av cDNA for LIPG. THP-1-celler ble utsådd i nærvær av forbol-12-myristat-13-acetat (PMA, 40 ng/ml; Sigma) i 48 timer. De differensierte THP-1-cellene ble behandlet i 24 timer med enten oksidert LDL (50 ug/ml) eller kontrollmedium. Total-RNA ble oppsamlet og renset ved anvendelse av standard fremgangsmåter. Poly(A)<+->RNA ble renset fra total-RNA ved anvendelse av et poly-dT-magnetisk kulesystem (Promega). cDNA-syntese og PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av fremgangsmåter fra Differential Display-settet, versjon 1,0 (Display Systems Biotechnology). Primerparet som ga det opprinnelige cDNA. fragment av EL var nedstrømsprimer 7 (5'-TTTTTTTTTTTGA-3') og oppstrømsprimer 15 (5'-GATCCAATCGC-3'). Amplifisringsreaksjonen ble fraksjonert i en 6 % ikke-denaturerende polyacrylamidgel i sekvenseringsformat, og et amplifiseringsprodukt som kun ble funnet i reaksjonen som inneholdt cDNA fira THP-1-celler behandlet med oksidert LDL ble påvist og kuttet ut fira gelen. En reamplifisering ved anvendelse av de samme primere ble utført, og produktet ble kuttet ut og subklonet i vektoren pCRII ved anvendelse av TA-kloningssystemet (Invitrogen). Innskuddsstørrelsen ble bestemt ved EcoRI-kutting av plasmidene og kloner som inneholdt innskudd med tilnærmet samme innskudd som det opprinnelige PCR-produkt ble sekvensert ved anvendelse av fluorescensemerkede terminatorreagenser (Prism, Applied Biosystems) og et Applied Biosystems 373 DNA-sekvenseringsinstrument. Vi utvidet cDNA-sekvensen til det opprinnelige, gelutkuttete cDNA ved anvendelse av 5'-RACE systemet (GIBCO). RNA (1 ^g fra THP-l-cellene som opprinnelig ble anvendt i differensiell fremvisningsreaksjonene ble anvendt i 5'-RACE-fremgangsmåten ved anvendelse av en genspesifikk primer (5'-TAGGACATGCACAGTGTAATCTG-3') for førstetråds cDNA-syntese. Vi utførte PCR-amplifisering av cDNA ved anvendelse av en ankerprimer og den genspesifikke primer 2 (5'- GATTGTGCTGGCCACTTCTC-3'). Denne reaksjonblandingen (1 ^1) ble anvendt i en nestet reamplifisering ved anvendelse av den universelle amplifiseirngsprimer (5'-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC-3<r>) og den genspesifikke primer 3 (5 '-GACACTCCAGGGACTGAAG-3') for å forhøye nivået av spesifikt produkt for påfølgende isolering. Reaksjonsproduktene ble klonet i vektoren pCRII fra TA-kloningssettet, og sekvensen ble bestemt. Et cDNA-bibliotek fra human placenta (oligo dT- og tilfeldig primet) ble erholdt fra Clontech og analysert med PCR-produktet fira 5'-RACE-reaksjonen. DNA fra hybridiserende kloner ble renset ved anvendelse av LambdaSorb-reagens (Promega). Innskuddene ble utkuttet fra bakteriofag-DNA ved kutting med EcoRl, subklonet i EcoRI- setet i plasmidvektoren Bluescript II SK (Stratagene) og sekvensert.
EKSEMPEL 12 - Fremstilling av antistoff
Et peptid på 17 aminosyrerester (GPEGRLEDKLHKPKATC), tilsvarende aminosyrerestene 8-23 i det utskilte LIPG-genprodukt, ble syntetisert i et Modell 433A peptid synteseinstrument (Applied Biosystems). 2 mg peptid ble koplet til maleimidaktivert "Keyhole limpef-haemocyanin (2 mg) ifølge fremgangsmåtene som inngår i Imject Activated Immunogen Conjugation kit (Pierce Chemical), etter avsalting ble halvparten av konjugatet emulgert med ett likt volum Freund's komplette adjuvans (Pierce) og injisert i en New Zealand White-kanin. Fire uker den innledende inokulering ble en forsterkerinokulering tilført med en emulsjon fremstilt nøyaktig som beskrevet ovenfor bortsett fra at Freunds ukomplette adjuvans (Pierce) ble anvendt. To uker etter forsterker injeksjonen ble titeren av spesifikke antistoffer bestemt i tappet blod ved hjelp av ELISA med immobilisert peptid.
EKSEMPEL 13 - Genekspresi onsundersøkelser
HUVEC ble dyrket i et kommersielt fremstilt endotelcellevekstmedium (EGM, Clonetics), tilsatt storfehjerneekstrakt (3 mg/ml; Clonetics), mens HCAEC ble dyrket i EGM tilsatt storfehjerneekstrakt (3 mg/ml) og 5 % føtalt bovint serum. Kulturene ble stimulert ved tilsetting av PMA (100 ng/ml). Etter 24 timers inkubering ble RNA ekstrahert fra cellene ved Trizolfremgangsmåten, fraksjonert ved elektroforese i en 1 % agarose-formaldehydgel, overført til en Nytran-membran med et turboblotter-apparat (Schleicher & Schuell) og kryssbundet til membranen ved anvendelse av en Stratalinker ultrafiolett kryssbinder (Stratagene). PCR-produktet fra 5' RACE-reaksjonen ble radioaktivt merket ved anvendelse av tilfeldig-primer-teknikken. Den radioaktivt merkete probe (l-2xl0<6>cpm/ml) ble denaturert ved oppvarming til 95 °C i 10 minutter og hurtig avkjøling på is før den ble tilsatt til filteret i QuikHyb. Hybridiseringen fikk forløpe i 3 timer ved 65 °C. Filtrene ble pålagt Kodak XAR-2-film med intensiveringsfolie ved -80 °C. Vi inkuberte HUVEC- og HCEAC-kondisjonert medium med heparin-Sepharose CL-6B ved 4 °C i en time. Etter sentrifugering ble nedsentrifugert heparin-sefarose suspendert i SDS-påsettingsbuffer, oppvarmet til 95 °C i 5 minutter og satt på en 10 % Tris-Glysin-SDS-gel (NOVEX). Etter elektroforese ved 140 V i 90 minutter ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner og påvist med anti-LIPG-peptidantiserum fra kanin (1:5000), med peroksidasekonjugert anti-kaninantiserum fra geit (1:5000; Boehringer) som sekundært antistoff. Membranene fikk reagere med Renaissance kjemiluminescensreagens (duPont NEN) og ble pålagt Kodak XAR-2-film. Et kommersielt fremstilt filter som inneholdt poly(A)<+->RNA (3^g av hvert) fra humant hjerte, hjerne, placenta, lunge, lever, skjelettmuskel, nyre og bukspyttkjertel (Clontech) ble hybridisert med et radioaktivt merket fragment og viderebehandlet som beskrevet ovenfor. Etter autoradiografien ble blottet befridd for probe ved vask i kokende 0,1 x SSC, 0,1 % SDS i 2x 25 minutter ved 65 °C, og så analysert som beskrevet ovenfor med et cDNA-fragment på 1,4 kb som kodet for human LPL. Dette fragmentet ble erholdt ved RT-PCR av THP-1-RNA (behandlet med PMA og oksidert LDL) ved anvendelse av 5' LPL- og 3' LPL-primerene 5' - ACCACCATGGAGAGCAAAGCCCTG-3' og 5'-CCAGTTTCAGCCTGACTTCTTATTC-3'. Etter eksponering mot film ble membranene igjen befridd for probe og reanalysert med et radioaktivt merket fragment av humant P-actin-cDNA for normalisering av RNA-innholdet.
Endotelceller fra human navlesnorvene (HUVEC) var som forventet negative for LPL-mRNA-ekspresjon, men ble funnet å konstitutivt uttrykke et høyt nivå av mRNA for LIPG-genet (figur 9).
Endotelceller fira human kransarterie (HCAEC) ble også funnet å uttrykke dette mRNA, som ble ytterligere oppregulert ved behandling av cellene med forbolester (figur 9).
Kondisjonert medium fra stimulerte HUVEC og HCAEC inneholdt immunreaktive proteiner på tilnærmet 68 kD og 40 kD, så vel som et mindre fremtredene bånd ved 55 kD (figur 11).
For å bestemme vevssetene for LIPG-produksjon in vivo ble analyse av et northern -blot med flere humane vev og prober for både LIPG og LPL utført. Høyt nivå av LIPG-mRNA ble funnet i vev fra lunge, lever og nyre (figur 8), som viste lavt LPL-ekspresjonsnivå. LIPG ble også uttrykt i høyt nivå i placenta (figur 8), noe som tyder på en mulig rolle i fosterutviklingen.
I vev som hjerte og skjelettmuskel, som uttrykte den høyeste mengde av LPL (noe som bekrefter tidligere rapporter, Goldberg, J. I., J. Lipid Res., 37, 693-707 (1996)), fant vi ingen LIPG-ekspresjon. Denne analyse tydet på at vevsfordelingen av LIPG-ekspresjonen er svært forskjellig fira LPL-ekspresjonsfordelingen, så vel som fordelingen rapportert for HL og PL. Vi fant intet LIPG-mRNA i binyre og ovarier, men fant et svært lavt LIPG-mRNA-nivå i testis (resultater ikke vist). Vi fant også at HepG2-celler uttrykker LIPG-mRNA og -protein in vitro (resultater ikke vist), men i et nivå som er mindre enn 10 % av nivået som uttrykkes i HUVEC.
EKSEMPEL 14 - Lipaseanalyser
cDNA og LPL-cDNA på 1,4 kD ble klonet i EcoRY- setet i pattedyrekspresjonsvektoren pCDNA3 (Invitrogen). En "antisense"-pCDNA3-vektor ble anvendt som negativ kontroll. De rekombinante ekspresjonsvektorene (3^g) ble blandet med lipofectamin (Life Technologies) og transfektert i kvadruplikat i semikonfluente COS7-celler i 60 mm skåler. Etablerte fremgangsmåter ble anvendt for analyse av prøver av kondisjonert medium fra de transfekterte COS7-cellene for TG-lipaseaktivitat og fosfolipaseaktivitet (Goldberg, J. I., J. Lipid Res., 37, 693-707 (1996)). For TG-lipaseaktiviteten ble 9,10-<3>H(N)-triolein (250^Ci; NEN) blandet med umerket triolein (150 mg) og type IV-S-a lecitin (9 mg; Sigma) i glyserol. Blandingen ble inndampet under nitrogen og emulgert i glyserol (2,5 ml) ved sonikering i en Branson Sonifier 450. Analysesubstratet ble fremstilt ved å blande ett volum emulgert substrat, 4 volumer Tris-HCl (0,2 M, pH 8,0) tilsatt 3 % (vekt/volum) fettsyrefritt bovint serumalbumin (BSA) og ett volum varmeinaktivert bovint serum. Reaksjonene ble utført i triplikat i et totalvolum (0,2 ml) som inneholdt analysesubstrat (0,1 ml) og kondisjonert medium (0,1 ml). Reaksjonene ble inkubert i 2 timer ved 37 °C og stanset ved tilsetting av metanol-kloroform-heptan (1,41:1,25:1; 3,25 ml), fulgt av kaliumkarbonat-boratbuffer (1,05 ml; 0,1 M, pH 10,5). Etter kraftig sammenblanding i 15 sekunder ble prøvene sentrifugert i 5 minutter ved 1000 rpm, og den øvre vannfase (1,0 ml) ble målt i en scintillasjonsteller. For fosfolipaseanalysen ble en fosfatidylkolin (PC)-emulsjon fremstilt ved å sammenblande<14>C-dipalmitoyl PC (2^Ci; NEN og lecitin (10^1) med Tris-TCNB (100 yl; 100 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 % Triton x-100, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl, 0,1 % BSA). Blandingen ble vortexbehandlet i 2 minutter og så inndampet under nitrogen. Det tørkete lipid ble rekonstituert med TCNB (1 ml) og vortexbehandlet i 10 sekunder. Reaksjonene ble utført i triplikat og inneholdt PC-emulsjon (50^1), kondisjonert medium (600^1) og MEM (350^1). Prøvene ble inkubert ved 37 °C i 2 timer, stanset ved tilsetting av HC1 (1 ml) og ekstrahert med 2-propanol:heksan (1:1; 4 ml). Et uttak (1,8 ml) av det øvre heksansjikt fikk passere gjennom en kiselgelkolonne, og de frigjorte<14>C-fettsyrene som inngikk i den ubundende fraksjon ble kvantitert i en scintillasjonsteller. For begge analyser ble MEM tilsatt 10 % FBS anvendt som
blindprøve, mens kondisjonert medium fra C0S7-celler transfektert med et "antisense"-plasmid (AS) ble anvendt som negativ kontroll.
EKSEMPEL 15 - Konstruksjon av rekombinant adenovirus og undersøkelser i dyr
Et rekombinant adenovirus som kodet for human LIPG ble konstruert som beskrevet (Tsukamoto et al., J. Clin. Invest., 100, 107-114 (1997); Tsukamoto et al., J. Lipid Res., 38, 1869-1876 (1997)). Kort beskrevet ble fulllengde humant cDNA subklonet i skyttelplasmidvektoren pAdCMVLinkl. Etter analyse av korrekt orientering ved restriksjonsanalyse ble plasmidet linearisert med Nhel og kotransfektert inn i 293-celler sammen med adenovirus-DNA kuttet med Cldl. Cellene ble dekket med et agarsjikt og inkubert ved 37 °C i 15 dager. 6 plakk ble plukket og analysert ved PCR, 2 plakk som var positive for cDNA ble behandlet med en andre runde med plakkrensing. Etter bekreftelse av nærvær av cDNA ble det rekombinante adenovirus ekspandert i 293-celler ved 37 °C. Cellelysater ble anvendt for infeksjon av HeLa-celler for å bekrefte ekspresjon av human LIPG ved western-blot av kondisjonert medium. Det rekombinante adenovirus (AdhEL) ble ekspandert videre i 293-celler og renset ved cesiumklorid ultrasentrifugering. Kontroll-adenovirus som ikke inneholdt cDNA-innskudd (Adnull) ble også plakk-renset og renset som beskrevet ovenfor. De rensete virus ble lagret i 10 % glyserol/PBX ved -80 °C. Villtype C57BL/6-mus, mus transgene for humant apoA-I og mus med mutant LDL-reseptor ble erholdt fra Jackson Laboratory. Alle musene ble foret med kafeteriafor. Villtype mus og mus transgene for humant apoA-I ble injisert intravenøst via halevenen med lx 10<11>AdhEL- eller Adnull-partikler (tilnærmet 2x IO<9>pfu), mens LDLR-defisiente mus ble injisert med lx 10<10>partikler. I alle eksperimenter ble blod erholdt fra den retroorbitale plexus en dag før injeksjonen og ved flere tidspunkt etter injeksjonen.
Intravenøs injeksjon av AdhEL i villtype C57BL/6-mus førte til ekspresjon i lever (figur 17) og en reduksjon av plasmanivået av HDL-kolesterol som forble signifikant lavere enn hos mus injisert med kontrollvirus i minst 41 dager etter injeksjonen (figur 18). Lipoproteiner ble separert ved FPLC-gelfiltrering, noe som viste at HDL ikke kunne påvises 14 dager etter adenovirusinjeksjonen (figur 19). Injeksjon av rekombinant LIPG-adenovirus i mus transgene for apoA-I (som har mye høyere nivå av HDL-kolesterol og apoA-I) reduserte nivået av både HDL-kolesterol (figur 20) og apoA-I (figur 21). For å bestemme de relative virkninger av LIPG-ekspresjonen på HDL, sammenliknet med de apoB-holdige lipoproteinene VLDL og LDL, injiserte vi en lavere dose av LIPG-adenoviruset i kafeteriaforede LDL-reseptordefisiente mus, som har tilnærmet 70 % av kolesterolet i VLDL/LDL og tilnærmet 30 % i HDL. Som før reduserte ekspresjon av LIPG HDL-kolesterolnivået (figur 23). Selv om LIPG-ekspresjonen reduserte VLDL/LDL-kolesterolnivået i de samme musene (figur 24) var virkningen proporsjonalt mindre. Overekspresjon av LIPG reduserte VLDL/LDL-kolesterol, følgelig kan en rolle for LIPG i modulering av apoB-holdige lipoproteiner ikke utelukkes.
EKSEMPEL 16 - Lipid/ lipoproteinanalyser
Totalnivået av kolesterol og HDL-kolesterol i plasma ble målt enzymatisk i en Cobas Fara (Roche Diagnostic Systems) ved anvendelse av reagenser fra Sigma. ApoA-I ble kvantitert ved anvendelse av en turbidometrisk analyse (Sigma) i en Cobas Fara. oppsamlede plasmaprøver ble analysert ved hurtig protein-væske kromatografi (FPLC)-gelfiltrering (Pharmacia LKB Biotechnology) ved anvendelse av to Superose 6-kolonner i serie, som beskrevet (Tsukamoto et al., J. Clin. Invest., supra). Fraksjoner (0,5 ml) ble oppsamlet og kolesterolkonsentrasjonen målt ved anvendelse av enzymatisk analyse (Wako Pure Chemical Industries).
EKSEMPEL 17 - Identifisering av LIPG- inhibitorer
Modulatorer av EL-aktiviteten kan finnes ved anvendelse av følgende fremgangsmåte: Rekombinant LIPG kan renses fra kondisjonert medium fra stabilt transfekterte kinahamster-ovarieceller, fra baculovirusinfiserte insektceller, gjær (Pichia pastoris, Kluveromyces Lactis) eller andre kilder. Ikke-rekombinante LIPG-kilder (for eksempel humant plasma, kondisjonert medium fira endotelceller, og så videre) kan også anvendes. Et eksempel på en primæranalyse for søk etter modulatorer av LIPG-aktiviteten kunne anvende det løselige fluorescerende substrat 4-metylumberiferyl-hepatanoat. Denne analysen er kontinuerlig og homogen. Hydrolyse av dette substrat ved LIPG fører til dannelse av svært fluorescerende 4-metylumbelliferon, som kan måles i et mikroplatefluorimeter. Andre analyseformater for primærsøket som kan anvendes er en scintillasjonsproksimitetsanalyse (Amersham) som måler fosfolipaseaktivitet, den radioaktive fosfolipaseanalysen med lavere kapasitet som beskrives i eksempel 7 (og som foreslåes nedenfor som sekundær analyse), eller de alternative fosfolipaseanalyser som beskrives i eksempel 8.
Det katalytiske senter i LIPG består som hos andre TG-lipaser av den samme katalytiske triade (ser, his, asp) som finnes i serine proteaser. Faktisk inhiberes andre TG-lipaser, for eksempel lipoproteinlipase, av serinproteaseinhibitorer som PMSF og DFP. Hvilken som helst av disse forbindelsene kan fungere som positiv kontroll for inhibitorer av LIPG-aktiviteten.
Sekundæranalyse:
Forbindelser som er aktive i esteraseaktiviteten eller de alternative søkemåtene som beskrives ovenfor kan analyseres i en standard radioaktiv fosfolipase A-analyse. Denne analysen måler frigjøring av radioaktivt merket palmitinsyre fra blandete miceller som inneholder [14C]-dipalmitoyl-fosfatidylkolin. Andre analyseformater som anvender fluorescerende substrater og som kan tilpasses høyere kapasitet kan tenkes utformet.
Selektivitetsanalyser:
Forbindelser kan analyseres for inhibering av de beslektede enzymene lipoprotein lipase (LPL) og pancreatisk lipase (PL). Human PL og LPL fira storfe er kommersielt tilgjengelig, og analysene kan lett implementeres. Fosfolipaseaktiviteten til PL måles på nøyaktig samme måte som beskrevet ovenfor for sekundæranalysen av LIPG. Siden LPL primært er en TG-lipase kunne sekundæranalysen måle frigjøring av radioaktivt merket fettsyre (oleinsyre) fira radioaktivt merket TG (triolein)-substrat (beskrevet i eksempel 7). Denne analysen har tilsvarende kapasitet og kan tilpasses andre analyseformater som benytter fluorescerende substrater og som kan tilpasses høyere kapasitet.
Fosfolipaseaktiviteten til LIPG kan analyseres på in v/vo-substratet, HDL, i en in vitro-analyse. Radioaktivt merket HDL kan dannes ved utbytting med et radioaktivt merket fosfolipid og så anvendes for måling av fosfolipaseaktiviteten til LIPG og aktiviteten av forbindelser som identifiseres ved søkene.
Ytterligere en analyse kan måle virkningen av preinkubering av LIPG eller HDL, +/forbindelser, på utskillelse av radioaktivt merket kolesterol fira dyrkede celler, for eksempel rottehepatomcellelinjen Fu5AH.
In v/vo-analyser for vurdering av forbindelser kan analyseres i villtypemus, mus som overuttrykker LIPG, og som kontroll, LIPG-null-mus. Dersom de transgene musene viser redusert HDL sammenliknet med kontrollmusene, noe som er tilfelle for adenoEL-ekspresjon, vil behandling av transgene mus med LIPG-inhiberende forbindelser forventes å øke HDL til samme nivå som i kontrollmusene. Det er også mulig at forbindelser kan analyseres for LIPG-inhiberende aktivitet (økning av HDL) i andre mus, for eksempel LDLR -/- -musen eller apoAI-transgene mus, hamstere eller kaniner, forbindelser som gir forhøyet LIPG eller LIPG-aktivitet vil forventes å gi øket HDL i disse eller andre dyremodeller.
EKSEMPEL 18 - Fremgangsmåte for behandling med inhiberende Ute molekyl
Et lite molekyl (i det påfølgende et "inhiberende lite molekyl"), identifisert i søket skissert i eksempel 17 som er i stand til å inhibere LIPG-polypeptidet in vitro, analyseres for evne til å inhibere LIPG-polypeptidet in vivo. Villtypemus og LIPG-transgene mus vil undersøkes ved å tilføre det lille molekyl oralt (dersom det er biotilgjengelig ved oral tilførsel) eller ved intravenøs injeksjon. Aktiviteten av LIPG-polypeptidet vil måles i plasma før og etter heparininjeksjon (for å frigjøre enzymet fra bindingsseter). I tillegg vil nivået av kolesterol, VLDL-, LDL- og HDL-kolesterol og apoA-I måles i dyr som gis det inhiberende lille molekyl. Endelig vil LDL-reseptordefisiente mus fores med en aterogen kost og tilføres det inhiberende lille molekyl eller placebo over et tidsrom på 8 uker. Aterosklerosen vil kvantiteres i musenes aorta for å bestemme hvorvidt tilførsel av det inhiberende lille molekyl svekker utviklingen eller induserer regresjon av aterosklerosen. Basert på disse prekliniske resultater vil ytterligere dyremodeller, for eksempel hamstere, kaniner eller svin, undersøkes for det inhiberende lille molekyls evne til å forhøye HDL-kolesterolnivåer, redusere VLDL- og LDL-kolesterolnivåer og/eller inhibere utvikling av aterosklerose.
De inhiberende små molekyler som er funnet å ha de ønskete egenskaper vil tilføres til pasienter i kombinasjon med farmasøytisk aksepterbare bærestoffer. De inhiberende små molekylene kan tilføres på en rekke måter, innbefattet oral tilførsel og intravenøs injeksjon. Nivået av HDL-, VLDL- og LDL-kolesterol hos pasientene vil måles for å bestemme virkningen av det inhiberende lille molekyl og for optimalisering av dosering og tilførselsfremgangsmåter.
EKSEMPEL 19 - Fremgangsmåte for behandling med inhiberende peptid
Terapeutiske peptider identifiseres ved analyse av LIPG-polypeptidets fragmenter for å bestemme hvilke av disse fragmenter som inhiberer LIPG-polypeptidaktiviteten in vitro. Når det "inhiberende peptid" er identifisert blir det analysert for dets evne til å inhibere LIPG-polypeptidet in vivo. Inhiberende peptider fremstilles rekombinant i E. coli og renses ved kjente fremgangsmåter innen faget. Det inhiberende peptids virkning undersøkes i villtypemus og LIPG-transgene mus ved å tilføre det inhiberende peptid ved intravenøs injeksjon. Aktiviteten av LIPG-polypeptidet vil måles i plasma før og etter heparininjeksjon (for å frigjøre enzymet fra bindingsseter). I tillegg vil nivået av kolesterol, VLDL-, LDL- og HDL-kolesterol og apoA-I måles i dyr som gis det inhiberende peptid. Endelig vil LDL-reseptordefisiente mus fores med en aterogen kost og tilføres det inhiberende peptid eller placebo over et tidsrom på 8 uker. Aterosklerose vil kvantiteres i musenes aorta for å bestemme hvorvidt tilførsel av det inhiberende peptid svekker utviklingen eller induserer regresjon av aterosklerose. Basert på disse prekliniske resultater vil ytterligere dyremodeller, for eksempel hamstere, kaniner eller svin, undersøkes for det inhiberende lille molekyls evne til å forhøye HDL-kolesterolnivåer, redusere VLDL- og LDL-kolesterolnivåer og/eller inhibere utvikling av aterosklerose.
De inhiberende peptider som er funnet å ha de ønskete egenskaper vil tilføres til pasienter i kombinasjon med farmasøytisk aksepterbare bærestoffer. De inhiberende peptider kan tilføres på en rekke måter, innbefattet oral tilførsel og intravenøs injeksjon. Nivået av HDL-, VLDL- og LDL-kolesterol hos pasientene vil måles for å bestemme virkningen av de inhiberende peptider og for optimalisering av dosering og tilførselsfremgangsmåter.
EKSEMPEL 20 - Fremgangsmåte for " antisense"- behandling
En serie med "antisense"-oligonukleotider, hvert komplementært til tilnærmet 20 baser fra LIPG-cDNA-sekvensen, syntetiseres kjemisk ved standard teknikker. For å identifisere det mest effektive oligonukleotid for terapeutisk anvendelse transfekteres hvert oligonukleotid for seg inn i celler som uttrykker LIPG-genet ved anvendelse av standard transfeksj onfremgangsmåter.
Tilnærmet 24-48 timer etter transfeksjon av oligonukleotidene bestemmes LIPG-mRNA-nivået i cellene ved kvantitativ PCR, northern-blot, RNAse-beskyttelse eller andre egnede fremgangsmåter. Alternativt kan LIPG-ekspresjonen måles med spesifikke antistoffer, som kan anvendes for å søke etter effektive "antisense"- oligonukleotider. Oligonukleotider som effektivt reduserer LIPG-mRNA-nivået utformes så for in vz'vø-tilførsel som terapeutiske midler.
"Antisense"-LIPG-sekvenser kan tilføres i en genterapivektor, for eksempel adenovirus, adenoassosiert virus, retrovirus, nakent DNA eller andre systemer som diskuteres i den detaljerte beskrivelse. Slike fragmenter kan anvendes terapeutisk ved tilførsel via genterapivektorer. Hepatisk ekspresjon av slike rekombinante vektorer er en foretrukket tilnærming. Alternativt kan syntetiske "antisense"-oligonukleotider utformes for irt vivo-tilførsel som terapeutiske midler, som beskrevet ovenfor.
"Antisense"-oligonukleotider kan tilføres på følgende måter: Intravenøst, subkutant, intradermalt, pulmonart, oralt, intraventrikulært, intratekalt og topisk. Tilførselsveien kan omfatte direkte tilførsel til karveggene (dvs. endotel eller vasculær glatt muskel). Som et eksempel kan pasienter med lav HDL-C gis en dose på 0,5-2 mg/kg av et effektivt "antisense"-oligonukleotid, infusert intravenøst annenhver dag i opptil 2-3 uker. Siden LIPG uttrykkes i leveren kan det være ønskelig å tilføre "antisense"-reagenser til portasirkulasjonen. Dette kan oppnås ved å konjugere eller kompleksbinde oligonukleotidet til en gruppe som styres til leveren, for eksempel asialoglykoprotein. Behandlingsdosen og behandlingstidspunktene vil avhenge av hvor effektivt "antisense"-medikamentet tilføres, så vel som av parametere som "antisense"-oligonukleotidets halveringstid, spesifisitet og toksikologi.
En økning i HDL-C kan måles ved anvendelse av standard kliniske laboratoriefremgangsmåter. Det opprinnelige doseringsskjema (for eksempel det beskrevet ovenfor) gjentas etter behov for opprettholdelse av HDL-C over 35 mg/dl.
EKSEMPEL 21 - Fremgangsmåte for ribozymbehandling
Basert på LIPG-cDNA-sekvensen fremstilles hammerhoderibozymer som effektivt reduserer LIPG-mRNA-nivået. Disse består av to "armer", hver på 6-7 baser, med nukleotidsekvens som er komplementær til LIPG-mRNA, separert av ribozymets katalytiske gruppe. Eksempler på slike hammerhodemotiver beskrives av Rossi et al., 1992, Aids Research and Human Retroviruses, 8,183. Ribozymene uttrykkes i eukaryote celler fra en egnet DNA-vektor.
Ribozymene kan tilføres innkapslet i liposomer, som diskutert ovenfor.
Ribozym/liposompreparatet tilføres til leveren ved direkte injeksjon eller ved anvendelse av et kateter, en infusjonspumpe eller et stent Tilførselsveien kan omfatte direkte tilførsel til karvegger (dvs. endotel og/eller vasculær glatt muskel). Pasientene behandles i opptil 2 uker med 5-50 mg/kg/dag ribozym i et farmasøytisk, effektivt bærestoff. Økningen i HDL-C og doseringsskjemaet måles og fastsettes som for "antisense"-oligonukleotider.
EKSEMPEL 22 - Fremgangsmåte for behandling med nøytraliserende antistoff
Anti-LIPG-antistoffer, -antistofffragmenter eller -kimære antistoffer som består av minst en LIPG-bindende gruppe, fremstilt som beskrevet i eksempel 12, anvendes for inhibering av LIPG-aktiviteten in vivo. Antistoffene kan tilføres som en bolusinjeksjon, infiseres over tid eller begge deler. Typisk gis en dose på o,2-0,6 mg/kg som en bolusinjeksjon, fulgt av en infusjon over 2 til 12 timer. Alternativt tilføres bolusinjeksjoner annenhver dag, eller hver tredje eller fjerde dag etter behov, for å redusere LIPG og heve HDL-C. Gjentatt dosering utføres ut fra målingen av HDL-C-nivået. Antistoffer mot LIPG kan også tilføres i en genterapibærer for å lette ekspresjonen in vivo. Ekspresjonsnivået for antistoffet bestemmes indirekte ved å måle HDL-C-nivået, og ytterligere vektorer kan tilføres etter behov.
EKSEMPEL 23 - Anvendelse av inhiberende molekyler eller enhancermolekyler
Fragmenter av LIPG-protein som kan inhibere LIPG-aktiviteten ved å konkurrere med intakt LIPG om binding, påkrevde koaktivatormolekyler, celleoverflatereseptorer eller bindende proteiner, kan tilføres som terapeutiske rekombinante proteiner eller fra genterapivektorer.
Som et eksempel klones LLGN-polypeptidet, som er basert på LIPG, inn i et rekombinant adenovirus som beskrevet (Tsukamoto et al, J. Clin. Invest., 100,107-114
(1997); Tsukamoto et al, J. Lipid Res., 38,1869-1876 (1997)). LLGN-cDNA klones i skyttelplasmidvektoren pAdCMVLinkl. Etter kontroll av korrekt orientering ved restriksjonsanalyse liniariseres plasmidet med Nhel og kotransfekteres inn i 293-celler sammen med adenovirus-DNA kuttet med Clal. Cellene dekkes så med agar og inkuberes ved 37 °C i 15 dager. Plakk plukkes og analyseres ved PCR, plakk som er positive for cDNA behandles med ytterligere en runde med plakkrensing. Etter bekreftelse av nærvær av cDNA ekspanderes det rekombinante adenovirus i 293-celler ved 37 °C. Cellelysater anvendes for infeksjon av HeLa-celler for å bekrefte ekspresjonen av human EL ved western-blot av kondisjonert medium. Det rekombinante adenovirus ekspanderes videre i 293-celler og renses ved cesiumklorid-ultrasentrifugering. Det rensete virus lagres i 10 % glyserol/PBX ved -80 °C. Pasienten injiseres intravenøst med lx 10<11>partikler av det rekombinante adenovirus (tilnærmet 2x IO<9>pfu).
EKSEMPEL 24 - Fremgangsmåter for å forhøye nivået av LIPG i en pasient ved
ekspresjon av LIPG fra en ekspresjonsvektor
Fulllengde LIPG-cDNA klones i et rekombinant adenovirus (Tsukamoto et al., J. Clin. Invest., 100, 107-114 (1997); Tsukamoto et al, J. Lipid Res:; 38, 1869-1876 (1997)) som koder for human LIPG. Fullengde humant LIPG-cDNA klones i skyttelplasmidvektoren pAdCMVLinkl. etter kontroll av korrekt orientering ved restriksjonsanalyse liniariseres plasmidet med Nhel og kotransfekteres inn i 293-celler sammen med adenovirus-DNA kuttet med Cldl. Cellene dekkes med agar og inkuberes ved 37 °C i 15 dager. Plakk plukkes og analyseres ved PCR, plakk som er positive for cDNA behandles med ytterligere en runde med plakkrensing. Etter bekreftelse av nærvær av cDNA ekspanderes det rekombinante adenovirus i 293-celler ved 37 °C. Cellelysater anvendes for infeksjon av HeLa-celler for å bekrefte ekspresjon av humant LIPG-polypeptid ved western-blottting av kondisjonert medium. Det rekombinante adenovirus (AdhEL) ekspanderes videre i 293-celler og renses ved cesiumklorid-ultrasentrifugering. Det rensete virus lagres i 10 % glyserol/PBX ved -80 °C. Pasienter injiseres intravenøst med lx 10<11>AdhEL- eller Adnull-partikler (tilnærmet 2x IO<9>pfu).
EKSEMPEL 25 - Fremgangsmåter for å øke nivået av LIPG- aktivitet ved tilførsel av et fullengde villtype eller modifisert rekombinant LIPG-protein
Villtype LIPG-protein reduserer VLDL- og LDL-kolesterolnivået, og LIPG kunne modifiseres til åvirke spesifikt på VLDL- og LDL-kolesterol uten virkninger på HDL-kolesterol. Tilførsel av villtype eller modifisert rekombinant LIPG kan i visse situasjoner anvendes som behandlingsform for reduksjon av VLDL- og/eller LDL-kolesterolnivået. Villtype og/eller modifisert LIPG-protein ("rekombinant LIPG-protein") vil fremstilles rekombinant i E. coli. og renses ved anvendelse av fremgangsmåter som erkjente innen faget. Villtype-mus vil undersøkes ved å tilføre det rekombinante LIPG-protein ved intravenøs injeksjon. Aktiviteten av LIPG vil måles i plasma. I tillegg vil nivået av kolesterol, VLDL-, LDL- og HDL-kolesterol og apoA-I måles i dyr som gis det rekombinante LIPG-protein. Endelig vil LDL-reseptordefisiente mus fores med en aterogen kost og tilføres det rekombinante LIPG-protein eller placebo over et tidsrom på 8 uker. Aterosklerose vil kvantiteres i aorta hos musene for å fastslå hvorvidt tilførsel av det rekombinante LIPG-protein reduserer utviklingen eller induserer regresjon av aterosklerosen. Basert på disse prekliniske resultatene vil ytterligere dyremodeller, for eksempel hamstere, kaniner eller svin undersøkes for det rekombinante LIPG-proteins evne til å redusere VLDL- og LDL-kolesterolnivået og/eller inhibere utviklingen av aterosklerose. De rekombinante LIPG-proteiner som finnes å ha den ønskede evne til å redusere VLDL- og LDL-kolesterolnivået og /eller inhibere utviklingen av aterosklerose vil blandes med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff og tilføres til pasienter. De rekombinante LIPG-polypeptidene kan tilføres på en rekke måter, innbefattet oral tilførsel og intravenøs injeksjon.
EKSEMPEL 26 - Påvisning av glykocylering og biologisk aktivitet av LIPG
En rekke eksperimenter ble utført for ytterligere å karakterisere LIPG. Eksperimentene som følger definerer ytterligere den biologiske aktivitet av LIPG (i disse eksperimenter og i figurene betegnet "endotel-lipase" eller "EL"). Figur 24 viser at endotel-lipase er et glykoprotein. EL ble behandlet med glykosidasene EndoF, EndoH og neuraminidase. Dette førte til reduksjon av størrelsen av EL-båndet ved western-blotting, i samsvar med fjerning av karbohydrat fira polypeptidkjeden. Glykocyleringen ble også inhibert med tunicamycin i EL-uttrykkende celler. Dette førte til en vesentlig reduksjon av størrelsen av EL-båndet. Eksperimentene med glykosidase og tunicamycin viser at EL er et glykoprotein. Figur 25 viser at endotel-lipase er et heparinbindende protein. En adenovirusvektor som uttrykker EL, AdhEL (se eksempel 15), ble injisert i mus. Blod ble tappet før (pre) og etter (post) heparininjeksjonen. Intensiteten av fullengde EL-båndet på 68 kD ble svært mye kraftigere etter heparininjeksjonen, noe som er i samsvar med at EL foreligger bundet til heparinsulfat-proteoglykaner og frigjøres ved tilførsel av heparin. Figurene 26A, 26B, 27A og 27B illustrerer den lipolytiske aktivitet av endotel- lipase, sammenliknet med lipoprotein lipase (LPL) og hepatisk lipase (HL). Dette eksperimentet ble utført for å fastslå hvorvidt endotel-lipase har triglyserid (TG) lipaseaktivitet (figur 27A). I flere undersøkelser av forskjellige kondisjonerte medier ble entydig bevis for TG lipaseaktivitet funnet gjentatte ganger. Fosfolipaseaktiviteten av endotel-lipase ble analysert i de samme prøvene med kondisjonert medium (figur 27). Forholdet mellom fosfolipaseaktivitet og TG lipaseaktivitet var svært konsistent ved analyse av forskjellige porsjoner av kondisjonert medium. Absolutt sett var antall mol fettsyre dannet pr. volum kondisjonert medium signifikant høyere for fosfolipaseaktiviteten enn for TG lipase.
Serums evne til å påvirke endotel-lipaseaktiviteten ble så analysert (figurene 27A og 27B). Som forventet ga tilsetting av serum signifikant høyere lipoproteinlipase TG lipaseaktivitet i fravær av andre apoC-H-kilder. Det er av interesse at serum reproduserbart og i vesentlig grad reduserte aktiviteten av endotel-lipase. Dette bekrefter at verken apoC-II eller noen annen serumfaktor er en nødvendig kofaktor for endotel-lipase. Det viser også at det foreligger en endogen inhibitor av endotel-lipase i serum.
Figurene 28 A og 28 B viser at ekspresjon av EL ga høyere fosfolipaseaktivitet i post-heparinplasma på en doseavhengig måte. Injeksjon av tre forskjellige doser (lx IO<11>, 3x IO<10>eller lx IO<10>partikler) med AdhEL i mus førte til nærvær av EL-protein i post-heparinplasma. Hovedbånd på 68 kD og 40 kD, samt et mindre bånd på 55 kD, ble observert (figur 28A). 68 kD-båndet antas å være fullengde glykocylert EL, og båndet på 40 kD et proteolytisk fragment. Mengden EL-protein i plasma, anslått ved western-blotting er proporsjonal med dosen injisert vektor (figur 28B). Ekspresjonen av forskjellige nivåer av human EL førte til en signifikant og doseavhengig økning av fosfolipaseaktiviteten i post-heparinplasma, sammenliknet med Adnull-injiserte mus (9779 +/- 733, 6501 +/-1299,3963 +/- 796 nmoLml"1^"1 mot 952 +/- 258 nmoLmo^.t"1. Post-heparin-fosfolipaseaktiviteten korrelerte med nivået av humant EL-protein for båndene på 68 kD (r=0,98, P<0,01), 55 kD (r=0,83, P<0,05), og 40 kD (r=0,94, P<0,05).
Claims (3)
1.
Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og HDL-kolesterol og apolipoprotein AI,karakterisert vedat den omfatter: (A) måling av nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI i en første prøve som omfatter: (1) HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, (2) LIPG-polypeptid, og (3) analyseforbindelsen, med nivået av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI i en annen prøve som omfatter: (4) HDL-kolesterol og apolipoprotein AI, og (5) LIPG-polypeptid; og (B) fastsettelse av hvorvidt analyseforbindelsen effektivt inhiberer den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og HDL-kolesterol og apolipoprotein AI ved å observere hvorvidt den første prøve har et høyere nivå av HDL-kolesterol og apolipoprotein AI enn den andre prøven.
2.
Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og VLDL-kolesterol,karakterisert vedat den omfatter: (A) sammenlikning av VLDL-kolesterolnivået i en første prøve som omfatter: (1) VLDL-kolesterol, (2) LIPG-polypeptid, og (3) analyseforbindelsen, med VLDL-kolesterolnivået i en annen prøve som omfatter: (4) VLDL-kolesterol, og (5) LIPG-polypeptid; og (B) bestemmelse av hvorvidt analyseforbindelsen effektivt fremmer den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og VLDL-kolesterol ved å observere hvorvidt den første prøve har et lavere VLDL-kolesterolnivå enn den andre prøven.
3.
Fremgangsmåte for å bestemme hvorvidt en analyseforbindelse kan fremme den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og LDL-kolesterol,karakterisert vedat den omfatter: (A) sammenlikning av LDL-kolesterolnivået i en første prøve som omfatter: (1) LDL-kolesterol, (2) LIPG-polypeptid, og (3) analyseforbindelsen, med LDL-kolesterolnivået i en annen prøve som omfatter: (4) LDL-kolesterol, og (5) LIPG-polypeptid; og (B) bestemmelse av hvorvidt analyseforbindelsen effektivt fremmer den enzymatiske reaksjon mellom LIPG-polypeptidet og LDL-kolesterol ved å observere hvorvidt den første prøve har et lavere LDL-kolesterolnivå enn den andre prøven.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/277,401 US7008776B1 (en) | 1996-12-06 | 1999-03-26 | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
PCT/US2000/007870 WO2000057837A2 (en) | 1999-03-26 | 2000-03-24 | Compositions and methods for effecting the levels of cholesterol |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20014657D0 NO20014657D0 (no) | 2001-09-25 |
NO20014657L NO20014657L (no) | 2001-11-21 |
NO331779B1 true NO331779B1 (no) | 2012-03-26 |
Family
ID=23060703
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20014657A NO331779B1 (no) | 1999-03-26 | 2001-09-25 | Fremgangsmater for a bestemme hvorvidt en testforbindelse kan inhibere den enzymatiske reaksjonen mellom LIPG polypeptidet og HDL kolesterol og apolipoprotein A1 eller fremme den enzymatiske reaksjonen mellom LIPG polypeptidet og VLDL kolesterol eller LDL kolesterol |
NO20100214A NO331784B1 (no) | 1999-03-26 | 2010-02-11 | Anvendelse av et ribozym for fremstilling av et preparat i stand til a redusere den enzymatiske aktiviteten av LIPG hos en pasient. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20100214A NO331784B1 (no) | 1999-03-26 | 2010-02-11 | Anvendelse av et ribozym for fremstilling av et preparat i stand til a redusere den enzymatiske aktiviteten av LIPG hos en pasient. |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1171078A4 (no) |
JP (1) | JP2002540127A (no) |
KR (2) | KR100887164B1 (no) |
AU (1) | AU776684B2 (no) |
BR (1) | BR0009333A (no) |
CA (1) | CA2363486C (no) |
HK (1) | HK1043309A1 (no) |
IL (2) | IL145526A0 (no) |
MX (1) | MXPA01009727A (no) |
NO (2) | NO331779B1 (no) |
NZ (2) | NZ531180A (no) |
WO (1) | WO2000057837A2 (no) |
ZA (1) | ZA200107598B (no) |
Families Citing this family (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7507808B2 (en) * | 2002-12-12 | 2009-03-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of endothelial lipase expression |
US8288354B2 (en) | 2005-12-28 | 2012-10-16 | The Scripps Research Institute | Natural antisense and non-coding RNA transcripts as drug targets |
KR20110091796A (ko) | 2008-12-04 | 2011-08-12 | 오피케이오 큐알엔에이, 엘엘씨 | 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료 |
EP2370579B1 (en) | 2008-12-04 | 2017-03-29 | CuRNA, Inc. | Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo |
MX2011005912A (es) | 2008-12-04 | 2011-06-17 | Opko Curna Llc | Tratamiento de enfermedades relacionadas con factor de crecimiento endotelial vascular por inhibicion de transcrito antisentido natural para factor de crecimiento endotelial vascular. |
KR101682735B1 (ko) | 2009-02-12 | 2016-12-06 | 큐알엔에이, 인크. | 뇌 유래된 신경영양성 인자 (bdnf)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 뇌 유래된 신경영양성 인자 (bdnf) 관련된 질환의 치료 |
CN102482677B (zh) | 2009-03-16 | 2017-10-17 | 库尔纳公司 | 通过抑制nrf2的天然反义转录物治疗核因子(红细胞衍生2)‑样2(nrf2)相关疾病 |
JP5904935B2 (ja) | 2009-03-17 | 2016-04-20 | クルナ・インコーポレーテッド | デルタ様1ホモログ(dlk1)に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるdlk1関連疾患の治療 |
CA2761152A1 (en) | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Opko Curna, Llc | Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene |
CA2761142C (en) | 2009-05-06 | 2021-06-08 | Opko Curna, Llc | Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp |
ES2618572T3 (es) | 2009-05-08 | 2017-06-21 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la familia de la distrofina mediante inhibición de un transcrito antisentido natural para la familia de dmd |
KR101749356B1 (ko) | 2009-05-18 | 2017-07-06 | 큐알엔에이, 인크. | 재편성 인자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 재편성 인자 관련된 질환의 치료 |
KR101703695B1 (ko) | 2009-05-22 | 2017-02-08 | 큐알엔에이, 인크. | 전사 인자 e3(tfe3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 tfe3 및 인슐린 수용체 기질 2(irs2)의 치료 |
EP2435571B1 (en) | 2009-05-28 | 2016-12-14 | CuRNA, Inc. | Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene |
KR101801404B1 (ko) | 2009-06-16 | 2017-12-20 | 큐알엔에이, 인크. | 콜라겐 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 콜라겐 유전자 관련된 질환의 치료 |
KR101702689B1 (ko) | 2009-06-16 | 2017-02-06 | 큐알엔에이, 인크. | Pon1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 파라옥소나제 1(pon1) 관련된 질환의 치료 |
ES2618894T3 (es) | 2009-06-24 | 2017-06-22 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el receptor del factor de necrosis tumoral 2 (tnfr2) por inhibición del transcrito natural antisentido para tnfr2 |
CN102482672B (zh) | 2009-06-26 | 2016-11-09 | 库尔纳公司 | 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病 |
JP2013500017A (ja) | 2009-07-24 | 2013-01-07 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | サ−チュイン(sirt)への天然アンチセンス転写物の阻止によるサ−チュイン(sirt)関連疾患の治療 |
CN102762731B (zh) | 2009-08-05 | 2018-06-22 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对胰岛素基因(ins)的天然反义转录物来治疗胰岛素基因(ins)相关的疾病 |
JP6189594B2 (ja) | 2009-08-11 | 2017-08-30 | クルナ・インコーポレーテッド | アディポネクチン(adipoq)に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるアディポネクチン(adipoq)関連疾患の治療 |
EP2982755B1 (en) | 2009-08-21 | 2020-10-07 | CuRNA, Inc. | Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip |
EP2470657B1 (en) | 2009-08-25 | 2019-10-23 | CuRNA, Inc. | Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap |
NO2480669T3 (no) | 2009-09-25 | 2018-04-07 | ||
RU2639550C2 (ru) | 2009-12-16 | 2017-12-21 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1 |
RU2609631C2 (ru) | 2009-12-23 | 2017-02-02 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с фактором роста гепатоцитов (фрг), посредством ингибирования природного антисмыслового транскрипта к фрг |
EP2515947B1 (en) | 2009-12-23 | 2021-10-06 | CuRNA, Inc. | Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2 |
CN102770540B (zh) | 2009-12-29 | 2017-06-23 | 库尔纳公司 | 通过抑制肿瘤蛋白63(p63)的天然反义转录物而治疗p63相关疾病 |
KR101838305B1 (ko) | 2009-12-29 | 2018-03-13 | 큐알엔에이, 인크. | NRF1(Nuclear Respiratory Factor 1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 핵 호흡 인자 1 관련된 질환의 치료 |
US20120289583A1 (en) | 2009-12-31 | 2012-11-15 | Curna, Inc. | Treatment of insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irs2 and transcription factor e3 (tfe3) |
CN102906264B (zh) | 2010-01-04 | 2017-08-04 | 库尔纳公司 | 通过抑制干扰素调节因子8(irf8)的天然反义转录物而治疗irf8相关疾病 |
WO2011085066A2 (en) | 2010-01-06 | 2011-07-14 | Curna, Inc. | Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene |
US9200277B2 (en) | 2010-01-11 | 2015-12-01 | Curna, Inc. | Treatment of sex hormone binding globulin (SHBG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SHBG |
ES2671877T3 (es) | 2010-01-25 | 2018-06-11 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la RNASA (H1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a RNASA H1 |
KR101838308B1 (ko) | 2010-02-22 | 2018-03-13 | 큐알엔에이, 인크. | 피롤린-5-카르복실레이트 환원효소 1(pycr1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 pycr1과 관련된 질환의 치료 |
RU2612884C2 (ru) | 2010-04-02 | 2017-03-13 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с колониестимулирующим фактором 3 (csf3), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта k csf3 |
KR101900962B1 (ko) | 2010-04-09 | 2018-09-20 | 큐알엔에이, 인크. | 섬유아세포 성장 인자 21 (fgf21)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 섬유아세포 성장 인자 21 (fgf21) 관련된 질환의 치료 |
US9089588B2 (en) | 2010-05-03 | 2015-07-28 | Curna, Inc. | Treatment of sirtuin (SIRT) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (SIRT) |
TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制par4天然反股轉錄本治療par4相關疾病 |
RU2620978C2 (ru) | 2010-05-26 | 2017-05-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с метионинсульфоксидредуктазой а (msra), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена msra |
DK2576783T3 (en) | 2010-05-26 | 2018-03-12 | Curna Inc | TREATMENT OF ATONAL HOMOLOGY 1- (ATOH1) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTS AT ATOH1 |
PL2585596T3 (pl) | 2010-06-23 | 2021-06-28 | Curna, Inc. | Leczenie chorób związanych z podjednostką alfa kanału sodowego bramkowanego napięciem (SCNA) poprzez hamowanie naturalnego transkryptu antysensownego SCNA |
EP2593547B1 (en) | 2010-07-14 | 2017-11-15 | CuRNA, Inc. | Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg |
US8993533B2 (en) | 2010-10-06 | 2015-03-31 | Curna, Inc. | Treatment of sialidase 4 (NEU4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NEU4 |
CA2815212A1 (en) | 2010-10-22 | 2012-04-26 | Curna, Inc. | Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua |
WO2012068340A2 (en) | 2010-11-18 | 2012-05-24 | Opko Curna Llc | Antagonat compositions and methods of use |
KR102010598B1 (ko) | 2010-11-23 | 2019-08-13 | 큐알엔에이, 인크. | Nanog에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 nanog 관련된 질환의 치료 |
JP6188686B2 (ja) | 2011-06-09 | 2017-08-30 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | フラタキシン(fxn)への天然アンチセンス転写物の阻害によるfxn関連疾患の治療 |
EA029151B1 (ru) | 2011-09-06 | 2018-02-28 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦАМИ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (SCNxA), С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ |
DK2825648T3 (en) | 2012-03-15 | 2018-10-15 | Curna Inc | TREATMENT OF BRAIN-DERIVATIVE NEUROTROPHIC FACTOR (BDNF) -related DISEASES BY INHIBITATION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTION TO BDNF |
CN102628060A (zh) * | 2012-03-22 | 2012-08-08 | 北京济福霖生物技术有限公司 | 一种低脂奶的生产方法 |
EP2915882B1 (en) * | 2012-11-05 | 2018-10-17 | Shionogi & Co., Ltd. | Method for evaluating drug activity of medicine having therapeutic or preventive effect on disease to which el activity relates, and method for screening for el activity inhibitory substance |
SG11201507105RA (en) | 2013-03-14 | 2015-10-29 | Shionogi & Co | Monoclonal antibody, inhibiting the enzymatic activity of vascular endothelial lipase |
TWI688575B (zh) | 2014-09-11 | 2020-03-21 | 日商塩野義製藥股份有限公司 | 阻礙血管內皮脂酶之酵素活性的人類化單株抗體 |
AU2022214429A1 (en) | 2021-02-01 | 2023-09-14 | Regenxbio Inc. | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses |
EP4378480A1 (en) * | 2021-07-26 | 2024-06-05 | Purotech Bio, Inc. | Anti-hepatitis b virus agent targeting host factor lipg |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08507203A (ja) * | 1992-12-04 | 1996-08-06 | イノーバー ラボラトリーズ,インコーポレイテッド | 調節可能な核酸治療およびそれらの使用方法 |
BR9713847A (pt) * | 1996-12-06 | 2000-02-29 | Rhone Poulenc Rorer Pharma | Polipeptìdeo isolado codificado por um gene semelhante a lipase, composição, composição farmacêutica, fragmento antigênico, ácido nucleico isolado, vetor, célula recombinante, anticorpo, célula de hibridoma, processos para preparar um polipeptìdeo, para triar agonistas ou antagonistas de atividade llg, para a hidrólise enzimática de um éster de fosfatidilcolina, e para melhorar o perfil de lipìdeo no soro de um humano ou outro animal tendo um perfil de lipìdeo indesejável, e, camundongo transgênico. |
AU1941899A (en) * | 1997-12-19 | 1999-07-12 | Progenitor, Inc. | A lipase expressed in endothelial cells and methods for its use |
-
2000
- 2000-03-24 MX MXPA01009727A patent/MXPA01009727A/es active IP Right Grant
- 2000-03-24 AU AU39187/00A patent/AU776684B2/en not_active Ceased
- 2000-03-24 NZ NZ531180A patent/NZ531180A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 JP JP2000607588A patent/JP2002540127A/ja active Pending
- 2000-03-24 KR KR1020017012300A patent/KR100887164B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 KR KR1020057005114A patent/KR20050044812A/ko active Search and Examination
- 2000-03-24 BR BR0009333-5A patent/BR0009333A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-03-24 WO PCT/US2000/007870 patent/WO2000057837A2/en active IP Right Grant
- 2000-03-24 CA CA2363486A patent/CA2363486C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-24 EP EP00918362A patent/EP1171078A4/en not_active Ceased
- 2000-03-24 NZ NZ51435000A patent/NZ514350A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-03-24 IL IL14552600A patent/IL145526A0/xx unknown
-
2001
- 2001-09-14 ZA ZA200107598A patent/ZA200107598B/xx unknown
- 2001-09-20 IL IL145526A patent/IL145526A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-09-25 NO NO20014657A patent/NO331779B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-06-28 HK HK02104818.0A patent/HK1043309A1/zh unknown
-
2010
- 2010-02-11 NO NO20100214A patent/NO331784B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2000057837A8 (en) | 2001-09-27 |
KR20020029651A (ko) | 2002-04-19 |
EP1171078A4 (en) | 2002-11-06 |
BR0009333A (pt) | 2002-01-08 |
NO20014657L (no) | 2001-11-21 |
KR100887164B1 (ko) | 2009-03-10 |
CA2363486C (en) | 2012-12-18 |
NO331784B1 (no) | 2012-03-26 |
HK1043309A1 (zh) | 2002-09-13 |
WO2000057837A9 (en) | 2001-10-18 |
CA2363486A1 (en) | 2000-10-05 |
WO2000057837A2 (en) | 2000-10-05 |
ZA200107598B (en) | 2003-05-28 |
NO20100214L (no) | 2001-11-21 |
NZ531180A (en) | 2005-06-24 |
EP1171078A2 (en) | 2002-01-16 |
AU3918700A (en) | 2000-10-16 |
WO2000057837A3 (en) | 2001-01-25 |
KR20050044812A (ko) | 2005-05-12 |
IL145526A0 (en) | 2002-06-30 |
NO20014657D0 (no) | 2001-09-25 |
NZ514350A (en) | 2004-12-24 |
AU776684B2 (en) | 2004-09-16 |
MXPA01009727A (es) | 2002-07-22 |
IL145526A (en) | 2010-11-30 |
JP2002540127A (ja) | 2002-11-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2363486C (en) | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (hdl) cholesterol and apolipoprotein ai, very low density lipoprotein (vldl) cholesterol and low density lipoprotein (ldl) cholesterol | |
US20130059361A1 (en) | Compositions and Methods for Effecting the Levels of High Density Lipoprotein (HDL) Cholesterol and Apolipoprotein AI, Very Low Density Lipoprotein (VLDL) Cholesterol and Low Density Lipoprotein (LDL) Cholesterol | |
US8343494B2 (en) | Antibodies against LLG polypeptides of the triacylglycerol lipase family | |
Becker et al. | Purification, cloning, and expression of a human enzyme with acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase activity, which is identical to liver carboxylesterase. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |