NO328272B1 - Modifisert, rekombinant novirhabdovirus, komplementaere DNA-molekyler av genomet av nevnte novirhabdovirus, rekombinant vektor omfattende nevnte DNA-molekyl, vaksine omfattende nevnte novirhabdovirus, DNA-molekyl eller vektor for a oppna et medisinsk produkt. - Google Patents

Abstract

Anvendelse av modifiserte novirhabdovirus der NV-proteingenet er inaktivert for å oppnå. vaksiner for anvendelse særlig i fisk.

Description

MODIFISERT, REKOMBINANT NOVIRHABDOVIRUS, KOMPLEMENTÆRE DNA-MOLEKYL AV GENOMET AV NEVNTE NOVIRHABDOVIRUS, REKOMBINANT VEKTOR OMFATTENDE NEVNTE DNA-MOLEKYL, VAKSINE OMFATTENDE NEVNTE NOVIRHABDOVIRUS, DNA-MOLEKYL ELLER VEKTOR, SAMT ANVENDELSE AV NEVNTE NOVIRHABDOVIRUS, DNA-MOLEKYL ELLER VEKTOR FOR Å OPPNÅ ET MEDISINSK PRODUKT

Foreliggende oppfinnelse angår modifisert, rekombinant novirhabdovirus, komplementære DNA-molekyl av genomet av nevnte novirhabdovirus, rekombinant vektor omfattende nevnte DNA-molekyl, vaksine omfattende nevnte novirhabdovirus, DNA-molekyl eller vektor, samt anvendelse av nevnte novirhabdovirus, DNA-molekyl eller vektor for å fremstille vaksiner.

Novirhabdovirus er negativ-tråd RNA-virus av Rhabdoviridae-familien.

Novirhabdovirus genus omfatter forskjellige patogene arter for akvatiske dyr blant hvilke særlig skal nevnes to arter som er patogene for fisk og hovedsakelig for Salmonidae: den infeksiøse, hematopoietiske nekrosevirus (IHNV) og den virale, hemoragiske septicemia-virus (VHSV).

Strukturen for det novirhabdovirale genom er tilsvarende den til mamma1rhabdovirus, men skiller seg fra disse ved nærværet av et ytterligere gen som koder et ikke-strukturelt protein,' kalt NV-(for "non-virion- = ikke-virion"-)protein, hvis funksjon er forblitt ukjent til i dag.

Det novirhabdovirale genom omfatter seks gener hvis organise-ring kan representeres skjematisk som følger:

3'-N-P-M-G-NV-L-5'.

N representerer genet som koder nukleoproteinet, som er assosiert med den virale RNA; P representerer genet som koder fosfoproteinet assosiert med den virale polymerase; M representerer genet som koder matriksproteinet; G representerer genet som koder konvolutt glykoprotein G; NV representerer genet som koder NV-proteinet; og L representerer genet som koder den RNA-avhengige, virale RNA-polymerase.

IHNV og VHSV forårsaker betydelig skade ved fiskeoppdrett, særlig blant ungfisk. Vaksiner som er i stand til å gi beskyttende immunitet mot disse virus, har vært foreslått. De er basert enten på bruken av drepte eller inaktiverte virus, eller på bruken av glykoprotein G, som kan indusere syntesen av nøytraliserende antistoffer i stand til å gi beskyttende immunitet. Det har vært foreslått å benytte vaksiner basert på rekombinant glykoprotein G eller nakne DNA-vaksiner som bærer genet som koder glykoprotein G. Imidlertid må disse vaksiner administreres ved injeksjon og det er meget vanske-lig i praksis å benytte denne metode for administrering på tusenvis av ungfisk.

Tidligere studier utført av foreliggende oppfinnerteam (BIACCHESI et al., Journal of Virology, vol. 74, no. 23, 2000, s. 11247-11253) har vist at når NV genet av IHN-viruset er inaktivert og erstattet med et rapportørgen slik som genet som koder GFP (grønt, fluorescerende protein), bevarer de således produserte, rekombinante virus den infeksiøse evne og kan multiplikere normalt i cellekultur.

Resultatene fra forsøkene hos M. C. Johnson et al. (Journal of Virology, vol. 74, no. 5, 2000, s. 2343-2350) indikerer at

NV-proteinet ikke har en viktig funksjon i replikasjonen av Snakehead rhabdovirus (SHRV) i oppdrettsfisk. SHRV hører til novirhabdovirusslekten ved at det har et NV-gen. Publika-sjonen viser at konstruksjon av rekombinante SHR-virus fra cDNA klonet med et inaktivt NV-proteingen idet det ble inn-ført en nonsensmutasjon lokalisert 22 kodoner inn i den ko-dende sekvensen til NV-proteinet.

Fra EP 051522 er det kjent en virusmutant av VHSV til bruk i en vaksine i fisk, fortrinnsvis i laks. Novirhabdoviruset er attenuert ved å utsette det gradvis for stigende temperatur.

Oppfinnerne har nå overraskende funnet at de rekombinante IHN-virus som mangler NV-proteingenet, fullstendig mistet sin patogene evne. De har også funnet at hvis NV-genet av VHS-viruset skytes inn i stedet for det opprinnelige NVG, blir patogenisiteten for viruset reetablert. Hvis på den annen side VHS-virusglykoprotein-G-genet skytes inn i stedet for det opprinnelige NV-gen, oppnås ikke-patogene, infeksiøse virus som er i stand til å indusere protektiv immunitet mot både IHN-viruset og VHS-viruset. I tillegg har de funnet at selv om de rekombinante IHN-virus som mangler NV-proteingenet, bevarer sin evne til å multiplikere i cellekultur,

multiplikerer de ikke i fisk (eller elimineres meget hurtig).

Denne oppdagelse gjør det mulig å foreslå bruken av novirhabdovirus hvori NV-proteingenet er inaktivert, for in vivo eks-presjon av ett eller flere eksogene gener av interesse i en

fisk.

Et formål med oppfinnelsen er mer spesielt anvendelsen av novirhabdovirus hvori NV-proteingenet er inaktivert, for å oppnå medisinske produkter.

Uttrykket "novirhabdovirus hvori NV-genet er inaktivert" er ment å bety enhver novirhabdovirus som bærer en mutasjon som resulterer i fraværet av produksjon av NV-proteinet, eller produksjonen av et ikke-funksjonelt NV-protein, uten å under-trykke produksjonen eller funksjonen av de andre, virale proteiner.

NV-proteingenet kan for eksempel inaktiveres ved delesjon av minst en del av genet eller, fortrinnsvis, hele, eller even-tuelt ved nonsensmutering, leserammeskift og så videre. Inak-tiveringen vil generelt fortrinnsvis utføres ved delesjon av hele eller en betydelig del av genet, noe som gjør det mulig å unngå enhver risiko for reversjon av villtypeviruset.

Særlig er en gjenstand for oppfinnelsen en hvilken som helst novirhabdovirus hvori NV-proteinet er inaktivert og som i sitt genom inneholder minst ett heterologt gen som koder et protein av terapeutisk interesse.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen velges proteinet av terapeutisk interesse blant vaksineanti-gener av organismer, og spesielt virus, som er patogene for fisk, og særlig fra kapsid- eller konvoluttglykoproteiner av virus som er patogene for fisk. Som ikke-begrensende eksempler kan nevnes glykoprotein E2 og glykoprotein El av salmo-nidsovesykeviruset (VILLOING et al., Journal of Virology. volume 74, 2000, s. 173-183 og Diseases of Aquatic Organisms, Volume 40, 2000, s. 19-27) eller glykoprotein G av et rhabdovirus, særlig glykoprotein G av et novirhabdovirus av en art forskjellig fra den hvorfra den rekombinante novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen er avledet.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen skytes nevnte heterologe gen inn i en posisjon av det inaktiverte NV-proteingen.

Fortrinnsvis velges et rekombinant novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen blant: et IHN-virus hvori NV-proteingenet er inaktivert og

erstattet med glykoprotein-G-genet av et VHS-virus;

et VHS-virus hvori NV-proteingenet er inaktivert og erstattet med glykoprotein-G-genet av et IHN-virus.

Rekombinante novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved hjelp av fremgangsmåter som i og for seg kjent, og særlig ved hjelp av den metode som er beskrevet i US 6033886 for fremstilling av rhabdovirus, og som omfatter transfektering av en vertscelle som uttrykker RNA-polymerase med den komplementære DNA (cDNA) av det virale genom, og DNA-molekyler som koder N-, P- og L-virale proteiner.

cDNA av genomet av et rekombinant novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen oppnås fra cDNA av den tilsvarende villtypevirus ved innføring av en eller flere mutasjoner som inaktiverer NV-genet, og innføring av det heterologe gen av interesse. Disse modifikasjoner kan innføres ved hjelp av konvensjo-nelle, genetiske konstruksjonsteknikker.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også cDNA'en av genomet av et rekombinant novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen og også enhver rekombinant vektor omfattende nevnte cDNA.

En gjenstand for oppfinnelsen er også de medisinske produkter omfattende et novirhabdovirus hvori NV-genet er inaktivert, og særlig vaksiner omfattende et rekombinant novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen.

Vaksinene ifølge oppfinnelsen kan benyttes i fisk og særlig salmonider som oppdrettsørret og -laks.

Anvendelsen av et rekombinant novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen og som samtidig uttrykker glykoprotein G av opprinnel-sesnovirhabdoviruset og minst ett vaksineantigen avledet fra en annen patogenisk organisme, gjør det mulig å oppnå multi-valente vaksiner i stand til å gi beskyttelse mot minst to patogener. For eksempel gjør et rekombinant novirhabdovirus i henhold til oppfinnelsen og som ved siden av glykoprotein G av novirhabdoviruset, hvorfra den er avledet, uttrykker glykoprotein G av et novirhabdovirus av en annen art, det mulig å gi beskyttelse mot to arter av angjeldende novirhabdovirus.

I tillegg og til forskjell fra vaksinene som foreslås i den kjente teknikk og som kun kan administreres ved injeksjon, har vaksinene ifølge oppfinnelsen den fordel at de også er i stand til å kunne administreres ved balneasjon, det vil si ved enkelt tilsetning av vaksinen til vannet i oppdrettstan-ken som inneholder dyrene som skal immuniseres. Denne admi-nistreringsmetode er derfor meget enklere å gjennomføre enn injeksjon. I tillegg gjør den det mulig å løse problemer som reises ved immunisering av ungfisk som er de mest sensitive overfor de sykdommer som induseres av novirhabdovirus, men også de belastninger som forbindes med immunisering ved injeksjon.

Videre tillater mangelen på multiplikering i fisken av de rekombinante novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen at de kan benyttes uten risiko for disseminering til omgivelsene eller kontaminering av villtypearter.

Oppfinnelsen vil forstås bedre fra den følgende beskrivelse som henviser til ikke-begrensende eksempler på konstruksjon og bruk av rekombinante novirhabdovirus ifølge oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1: Konstruksjon av rekombinante novirhabdovirus ved erstatning av NV genet med et heterologt gen Konstruksjon av de rekombinante cDNA' er: Konstruksjonene ble gjennomført ved bruk av plasmidet pIHNV som beskrevet av BIACCHESI et al. (Journal of Virology, vol. 74, no. 23, 2000, s. 11247-11253). Dette plasmid inneholder den fullstendige cDNA av IHN-virusgenomet, klonet nedstrøms T7-fag RNA-polymerasepromotoren og oppstrøms for en ribozym-sekvens av hepatitt-8-viruset og T7-fag RNA-polymerasetranskripsjonsterminatoren, i vektoren pBlueScript SK (Stratagene).

Et rekombinant IHN-virus hvori NV-genet er skåret ut og erstattet med GFP-(Grønn, Fluorescerende Protein-)rapportør-genet, ble konstruert som beskrevet av BIACCHESI et al. (pub-lisering nevnt ovenfor).

Diagrammatisk:

Et Spel-restriksjonssete og et Smal-restriksjonssete ble inn-ført ved seterettet mutagenese (Quickchange kit, Stratagene) i et Eagl-Pstl-fragment av cDNA av IHN-virusgenomet på begge sider av den NV-åpne leseramme. Denne åpne leseramme ble skåret ut fra dette fragment ved Spel-Smal-digestering og erstattet med GFP-rapportørgenet. Det modifiserte Eagl- Pstl-fragment ble innført i plasmidet pIHNV i stedet for det tilsvarende området derav.

Det oppnådde plasmid kalles pINHV-ANV-GFP.

Rekombinante IHN-virus hvori NV-genet er erstattet med NV-genet eller G-genet av VHS ble konstruert som følger:

NV- og G-gener ble oppnådd fra 07-71-stammen av VHS (SCHUETZE H. Et al. "Virus Genes.", 19(1), 1999, s. 59-65; GenBank NC 000855) ved bruk av de følgende primere:

Karpeepitelceller (EPC: epitelioma papulosum cyprinid) infek-teres med VHS-viruset ved en infeksjonsmultiplisitet på 1. Tjuefire timer etter infeksjon lyseres cellene og total RNA ekstraheres (RNAgents Total RNA Isolation System kit, PROMEGA). Cirka 1 ug av RNA<1>ene denatureres i 10 minutter ved om-givelsestemperatur i nærvær av 40 mM hydroksymetylkvikksølv. Denaturert RNA anbringes så i en reaksjonsbeholder inneholdende 80 mM P~merkaptoetanol, 10 mM ditiotreitol og 1 mM dNTP, 40 U RNasin (GIBCO-BRL), 25 pmol VSHV G 3<1->primer eller VHSV NV 3'-primer og 200 U SUPERSCRIPT II, i buffer IX (GIBCO-BRL) . Blandingen holdes ved 42 °C i 1 time.

De oppnådde cDNA'er forsterkes ved PCR med VHSV G 5'-primeren eller VHSV NV 5'-primeren i nærvær av TAQ-polymerase (GIBCO BRL). PCR-produktene som oppnås på denne måte, renses og sub-klones inn i et TA-kloningsplasmid (pGEM-T Vector System,

PROMEGA).

Etter sekvensering skjæres VHSV G- eller NV DNA-fragmentene ut med Spel- og Smal-digestering.

Det ene eller andre av disse fragmenter skytes inn i stedet for NV-genet i EAGI-PstI-fragmentet av cDNA av IHN-virusgenomet, og Eagl- Pstl-fragmentet som modifiseres på denne måte, innføres i plasmidet pIHNV som antydet ovenfor.

De oppnådde plasmider kalles pINHV-ANV-NVSHV, henholdsvis

pINHV-ANV-GSHV.

Produksjon av de rekombinante virus:

Tre ekspresjonsplasmider omfattende respektivt genene som koder nukleoproteinet N, fosfoproteinet P og den RNA-avhengige RNA-polymerase L av IHN, ble konstruert som beskrevet av BIACCHESI et al. (publikasjon nevnt ovenfor). Disse konstruk-sjoner kalles respektivt pT7-N, pT7-P og pT7-L.

Plasmidet pIHNV, plasmidet pINHV-ANV-NVSHV eller plasmidet pINHV-ANV-GSHV og de 3 plasmider pT7-N, pT7-P og pT7-L i respektive doser på 1 ug, 0,5ug, 0,2 ug og 0,2 ug innføres ved transfeksjon i nærvær av lipofektamin (GIBCO-BRL) i EPC-celler som på forhånd er infisert med et rekombinant vaksine-virus som uttrykker T7-fag RNA-polymerase (vTF7-3, FUERST et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 92, 1986, s. 4477-4481).

Etter transfeksjon inkuberes cellene i 5 timer ved 37 °C og vaskes så med et MEM-kulturmedium (uten serum) og inkuberes i 7 dager ved 14 °C i MEM-kulturmedium inneholdende 2 % føtal kalveserum. Cellene og supernatanten fryses/tines og klares ved sentrifugering i 10 minutter og 10 000 omdreininger per minutt. Supernatanten benyttes ved en 1:10 fortynning for å infisere et sjikt av EPC-celler. Virusene fremstilles til supernatanten 3-4 dager etter infeksjon.

Strukturen for de oppnådde virus som omfatter hele genomet til villtypeviruset (rlHN) eller som stammer fra delesjon av NV-genet og dettes erstatning med genet som koder GFP (rlHN-ANV-GFP) , NV-genet av VHSV (rlHN-ANV-NWHS) eller G-genet av VHSV (rlHN-ANV-GVHS), er vist skjematisk i figur 1.

Virale forråd for hver av de fremstilte virus ble oppnådd ved suksessive passasjer i (EPC-)cellekultur av supernatanten hentet 7 dager etter transfeksjon (supernatant PO). Cellene infiseres ved infeksjonsmultiplisitet (m.o.i.) på 1. Etter 3 passasjer fjernes supematantene til forskjellige tidsrom etter infeksjonen og titreres ved begrenset fortynning for å etablere en vekstkurve.

Vekstkurven for villtype-VHS- og -IHN-virus og for den rekombinante virus IHNV-ANV-GVHSV er vist i figur 2. Disse kurver viser at det rekombinante virus IHNV-ANV-GVHSV multiplikerer i cellekultur så vel som villtype-IHN- eller VHS-virus.

EKSEMPEL 2: Patogenisitet og vaksineegenskaper for de rekombinante novirhabdovirus.

Patogenisitet

Patogenisiteten for de forskjellige novirhabdovirus som oppnås som beskrevet i eksempel 1 ovenfor ble bedømt ved for-søksinfeksjoner i regnbueørret { Oncorhyncus mykiss).

Infeksjon ved injeksjon:

Satser på 25 unge ørreter/tank (middelvekt 2 g) ble infisert ved injeksjon av forskjellige virus, testet i en mengde på IO6 PFU/fisk. De benyttede virus er som følger: Villtype-IHN-virus, fransk stamme 32/87 (wt 32/87);

Villtype-IHN-virus fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (rlHN);

Virus IHN-ANV-GFP (rlHN-ANV-GFP);

Virus IHN-ANV-NWHS (rlHn-ANV-NWHS) ;

Virus IHN-ANV-GVHS (rIHN-ANV-GVHS).

Mortaliteten overvåkes over en periode på 4 uker.

Resultatene oppnådd i 2 uavhengige forsøk er oppsummert i ta-bell l.

Infeksjon ved balneasjon:

Ung ørretfisk ble infisert ved balneasjon i henhold til føl-gende protokoll: Ungfisken anbringes i oppdrettstanker i et lite volum vann (3 liter vann per 100 til 150 ungfisk). Viruset for utprøving settes til vannet i tanken i en andel på 10<4> til 5 x 10<4 >PFU/ml (PFU = plakkformede enheter). Etter inkubering i 3 timer fylles tankene og vannsirkulasjonen reetableres.

De benyttede virus er som følger:

WtIHNV: vi11type-IHN-virus, fransk stamme 32/87;

WtVHSV: villtype-VHS-virus, stamme 07-71;

WtSVCV: vår-viremia av karpevirus (vesiculovirus ikke i stand til multiplikering i ørret), Fijan stamme (FIJAN et al., Veterinarski archiv (Zagreb), 41, 125138, 1971; complete sequence: HOFFMAN et al., GenBank AJ318079);

rIHNV: villtype-IHN-virus fremstilt som beskrevet i eksempel 1;

G-VHS: rekombinant IHN-virus som bærer G-genet av VHS-viruset i stedet for G-genet av IHN;

G-SVCV: rekombinant IHN-virus som bærer G-genet av SVCV-viruset i stedet for G-genet av IHN;

G-IHN-VS: rekombinant IHN-virus som bærer G-genet av VHS-viruset i stedet for NV-genet av IHN;

ANV-GFP: rekombinant IHN-virus som bærer GFP-genet i stedet for NV-genet av IHN;

NWHS: rekombinant IHN-virus som bærer NV-genet av VHS-viruset i stedet for NV-genet av IHN.

Resultatene er vist i figur 3.

Forklaring til figur 3:

X-akse: benyttet akse; blind: ikke-infisert ungfisk

Y-akse: kumulativ mortalitet 28 dager etter infeksjon (som prosent av det opprinnelige antall ungfisk).

Disse resultater viser at patogenisiteten for virusene er forbundet med nærværet av NV-genet; alle virus inneholdende dette gen resulterer i en høyere mortalitet av ungfisk; på den annen side mister alle virus hvori NV-genet var inaktivert , den patogene evne.

Vaksineegenskaper

Fisk (ung ørretfisk) immunisert ved balneasjon under de samme betingelser som i patogenisitetsprøvene med viruset rlHN-ANV-GVHS eller viruset rIHN-ANV-GFP, ble 1 måned senere un-derkastet en infeksjon ved balneasjon med villtype-IHNV- og

-VHSV-virus i en mengde av IO<4> til 5 x IO<4> PFU/ml.

Ingen signifikant mortalitet ble observert når det gjaldt fisk som var immunisert med viruset rlHN-ANV-GVHS. Fisk immunisert med viruset rIHN-ANV-GFP er også beskyttet mot IHNV-viruset. På den annen side døde de mellom 7 og 15 dager etter infeksjon med VHSV-viruset.

Disse resultater viser at immunisering med rlHN-ANV-GVHS-viruset effektivt beskytter mot både villtype-IHNV-virus og mot villtype-VHSV-virus.

Claims (8)

1. Rekombinant novirhabdovirus, karakterisert ved at NV-proteingenet er inaktivert og erstattet helt eller delvis med minst ett heterologt gen som koder et vaksineantigen av en organisme som er patogen mot fisk, hvor nevnte rekombinante novirhabdovirus er innrettet til å kunne fremkalle immunitet mot nevnte vaksineantigen og nevnte rekombinante novirhabdovirus .

2. Rekombinant novirhabdovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at det heterologe gen koder et kapsid- eller konvoluttglykoprotein for et virus som er patogen for fisk.

3. Rekombinant novirhabdovirus ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det er valgt blant: et infeksiøst, hematopoietisk nekrose-(IHN-)virus hvori NV-proteingenet er inaktivert og erstattet med glykoprotein-G-genet av et viralt, hemoragisk septicemia-(VHS-)virus; og et VHS-virus hvori NV-proteingenet er inaktivert og erstattet med glykoprotein-G-genet av et IHN-virus.

4. Komplementært DNA-molekyl (cDNA) av genomet av et rekombinant novirhabdovirus, karakterisert ved at det er som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 3.

5. Rekombinant vektor, karakterisert ved at det omfatter et cDNA-molekyl ifølge krav4.

6. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter et novirhabdovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller et nukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 4 og 5.

7. Vaksine ifølge krav 6, for forhindring av novirhabdo-virusinfeksjoner i fisk.

8. Anvendelse av et rekombinant novirhabdovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 eller et nukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 4 og 5 for å skaffe til veie et medisinsk produkt.