NO327637B1

NO327637B1 - Fremgangsmate ved preparering av en vevspoding samt vevspoding preparert ved fremgangsmaten

Info

Publication number: NO327637B1
Application number: NO20023154A
Authority: NO
Inventors: Jeremy Ollerenshaw; Kirby S Black; Steven Goldstein
Original assignee: Cryolife Inc
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2009-09-07
Also published as: ES2329480T3; US7763081B2; JP2004500188A; PT1591078E; CY1109458T1; US6866686B2; EP1250109A4; AU3307201A; DK1591078T3; CA2396698C; NO20023154L; EP1250109A1; EP1591078A1; EP1591078B1; DE60139279D1; US20050191281A1; WO2001054619A1; AU783780B2; NO20023154D0; US20100285587A1

Description

Fremgangsmåte ved preparering av en vevspoding samt vevspoding preparert ved fremgangsmåten.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for preparering av et vevspodingsmateriale. Oppfinnelsen angår også et vevspodingsmateriale som kan brukes til flere formål.

Generelt har biologisk vev en bedre funksjonell ytelse enn tilsvarende syntetiske innretninger når det blir anvendt som et implantat i kroppen. Vevspodinger er for tiden i stor grad begrenset til autologt og allograft vev som har iboende begrensinger og logistiske bekymringer når det gjelder innhøsting, transportering og serologi. Det er således et behov for ytterligere kilder for biologiske vevspodinger. Vev fra dyr representerer en slik kilde. Vev fra dyr kan bli oppnådd relativt enkelt i store mengder fra slaktehus. Før bruk må imidlertid disse vevene bli behandlet for å fjerne antigene proteiner som kan fremkalle en forkastningsrespons hos verten etter implantasjon.

Fjerning av antigene proteiner kan bli oppnådd ved prosessering av donor vevet på en slik måte at den cellulære komponenten til donorvevet blir fjernet. Mange antigene proteiner er tilstede på cellulære membraner. Fjerning av celler fjerner derfor også disse proteinene. Etter decellularisering kan vevet bli pakket og sterilisert for anvendelse som en biologisk poding. Podingene kan bli implantert inn i mennesker og andre dyr for å reparere, forsterke eller erstatte naturlige strukturer, systemer eller eksisterende prostetiske innretninger. Disse innbefatter men er ikke begrenset til kardiovaskulære, vaskulære, urogenitale, neurologiske, gastrointestinale og ortopediske systemer. Podinger kan også bli anvendt for å skaffe tilveie hemodialyse tilgang.

Fra WO 98/36707 er det kjent en fremgangsmåte for fremstilling av biomateriale fra urinleder og for å anvende dette på preparering av vev. Denne publikasjonen viser at cellullært materiale, proteiner og fett må fjernes fra utgangsmaterialet og at dette kan gjøres ved ulike metoder.

Fra US 5.899.936 er det likeledes kjent en fremgangsmåte for å behandle naturlig forekommende vev som skal anvendes til implantasjon. Vevet blir behandlet for å drepe uønskede celler, slik at man forhindrer en forkastningsprosess.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for preparering av en vevspoding, som er kjennetegnet ved at den i det vesentligste omfatter: i) vasking av et utgangsvev oppnådd fra en human eller animalsk urinleder med et middel som reduserer biobelastning slik at nevnte utgangsvev blir desinfisert,

ii) decellularisering av desinfisert vev som resultat av trinn (i) med en oppløsning som lyserer celler av nevnte desinfiserte vev slik at det blir dannet en vevsmatriks, og

iii) bringe nevnte vevsmatriks som er resultat av trinn (ii) i kontakt med en nuklease slik at nukleinsyrer som er forbundet med nevnte vevsmatriks blir degradert, og

iv) vasking av nevnte vevsmatriks som er resultat av trinn (iii) slik at cellulær eller ekstracellulær debris blir fjernet og nevnte vevspoding blir oppnådd.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en vevspoding som er kjennetegnet ved at den er oppnådd ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte.

Ytterligere fordelaktige trekk ved foreliggende oppfinnelse er angitt i de uselvstendige patentkravene.

Formålene og fordelene ved foreliggende oppfinnelse vil fremkomme tydelig fra beskrivelsen som følger.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for preparering av vev fra et dyr eller menneske på en måte som gjør det velegnet for anvendelse i vaskulære og ikke-vaskulære podingsanvendelser. Vev preparert i følge fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse fremviser fysikalske og biologiske egenskaper som gjør det spesielt godt tilpasset vevspodingsapplikasjoner.

Vev som er egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan bli oppnådd fra menneskelige kadavre eller fra bovine dyr, porcine dyr eller andre dyr, for eksempel under slakteri betingelser. Vevet kan bli transportert til stedet for vevspreparering under betingelser som er nødvendig for å holde vevet ved en ønsket temperatur. Vevet kan bli transportert for eksempel nedsunket i en fysiologisk saltoppløsning, og ved ankomst inspisert, vasket, for eksempel i en fysiologisk saltoppløsning, og rengjort (dissekert) fri for uønsket vedhengende materiale, slik som bindevev og fett.

I en foretrukket utførelsesform er vevspodingsmaterialet en isolert urinleder. Annet vev kan imidlertid bli anvendt inkludert arterier, vener, sener, hjerteklaffer, fascia lata, perikardium og nerver.

Etter oppsamling og dissekering blir det transplanterte vevet fortrinnsvis vasket, for eksempel med fosfatbufret saltoppløsning (PBS), for å redusere uønsket mikrobiologisk vekst. Vevet blir deretter inkubert (for eksempel ved ca 37°C i ca 18 timer) i en oppløsning som inneholder et eller flere antimikrobiologiske midler, for eksempel et antibiotisk eller antisoppmiddel, eller blandinger av disse, for ytterligere å redusere biobelastningen. Foretrukkede antibiotiske midler innbefatter amakacin, lincomycin, cefotaxime, vancomycin, rifampin, diflucan og amphotericin B. En blanding av disse antibiotiske midlene blir fortrinnsvis anvendt. Vevet kan deretter bli kryopreservert for videre prosessering ved et senere tidspunkt eller umiddelbart være gjenstand for decellularisering.

Decellularisering blir fortrinnsvis gjennomført ved inkubering av vevet i en oppløsning som er effektiv i å lysere native celler i vevet. Vevet blir fordelaktig inkubert (for eksempel ved ca 37°C) i sterilt vann (for eksempel i ca 4 timer i det tilfellet med urinledere), imidlertid kan en vandig hypoton buffer eller buffer med lav ionisk styrke også bli anvendt. Om ønskelig kan decellulariseringsoppløsningen inkludere andre midler, slik som proteasehemmere (for eksempel chelatorer slik som EDTA).

Etter decellularisering blir resulterende vevsmatriks behandlet med en enzym (for eksempel nuklease) cocktailblanding for å degradere kjernematerialet. Nukleaser som kan bli anvendt for spaltning av nativ celle DNA og RNA inkluderer både eksonukleaser og endonukleaser. Andre nukleaser er egnede for anvendelse i dette trinnet av prosessen og er kommersielt tilgjengelige. For eksempel kan det bli anvendt en cocktailblanding som omfatter DNAse I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) og RNAse A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.).

Nukleasene er fortrinnsvis tilstede i en bufferoppløsning som inneholder magnesium og kalsium salter (for eksempel klorid salter), lonekonsentrasjon og pH i den buffrede oppløsningen, behandlingstemperatur og lengde på behandlingen blir valgt for å sikre det ønskede nivået med effektiv nukleaseaktivitet. I det tilfellet med urinledere er bufferen fortrinnsvis en Tris buffer ved pH 7,6. Nuklease cocktailblandingen inneholder fortrinnsvis ca 0,1 ug/ml til 50 fig/ml, fortrinnsvis 17 ug/ml av DNAse I, og ca 0,1 ug/ml til 50 ^g/rnl, fortrinnsvis 17 ug/ml av RNAse A. Nukleasebehandlingen kan bli utført ved for eksempel ca 20°C til ca 38°C, fortrinnsvis ved ca 37°C i ca 1 til 36 timer. I det tilfellet med urinledere er typisk nukleasebehandling i ca 19 timer tilstrekkelig.

Etter decellularisering og nukleasebehandling, kan resulterende vevsmatriks bli behandlet (vasket) for å sikre fjerning av celledebris hvilket kan inkludere cellulære proteiner, cellulære lipider og cellulær nukleinsyre, så vel som ekstracellulær debris, slik som ekstracellulære oppløselige proteiner, lipider og proteoglykaner. Fjerning av cellulær og ekstracellulær debris reduserer sannsynlighet for at transplantat vevsmatriks utløser en ugunstig immun respons fra mottakeren ved implantering. Vevet kan for eksempel bli inkubert i en buffer (for eksempel PBS) eller i en detergentoppløsning slik som en oppløsning av Triton X-100 i vann. Sammensetningen av oppløsningen, og betingelsene under hvilken den blir anvendt på vevsmatriks kan bli valgt for å redusere eller eliminere aktiviteten til nukleasen som utnyttes under nukleaseprosessering og for å fjerne celledebris. Prosessen kan innbefatte inkubering ved en temperatur mellom ca 2°C og 42°C, med 37°C som foretrukket. Vevsmatriks kan bli inkubert i detergentoppløsningen i opptil 7 dager, ca 24 timer er tilstrekkelig i det tilfellet med en urinledermatriks. Når det blir anvendt buffer istedenfor en detergentoppløsning, kan vevsmatriks bli inkubert i opp til 30 dager, idet ca 14 dager er tilstrekkelig i tilfellet med en urinleder matriks.

Hvis detergentoppløsning blir anvendt kan den bli vasket ut av vevsmatriks ved anvendelse av et antall vask i en steril vandig oppløsning (for eksempel vann). Det optimale antall vask og ganger kan raskt bestemmes, imidlertid er ca 4 ganger 30 minutters vask foretrukket i det tilfellet med urinleder matriks.

Etter vasking kan vevsmatriks deretter bli innpakket, sterilisert og/eller lagret før implantering. Innpakket vevsmatriks blir fordelaktig opprettholdt i en ikke-frossen tilstand, fortrinnsvis ved en temperatur mellom 0°C og 40°C, mer å foretrekke mellom 0°C og 20°C, mest å foretrekke mellom 2°C og opp til 8°C og under sterilisering ved anvendelse for eksempel av tilnærmelsen i Eksempel 11. Etter sterilisering kan vevsmatriks bli opprettholdt ved romtemperatur. Dersom det er ønskelig kan vevsmatriks bli kryopreservert før eller etter sterilisering for senere bruk. Teknikker i forbindelse med kryopreservering av vev er velkjent innen fagområdet. Brockbank, K. G. M. Basic Principles of Viable TissuePreservation. In: Transplantation Techniques and use of Cryopreserved Allograft Cardiac Valves and Vascular Tissue. D. R. Clarke (ed.), Adams Publishing Group, Ltd., Boston, pp 9 - 23, gjør rede for kryopreservering av vev og organer og er med dette inkorporert med referanse.

Vevsmatrikser fra oppfinnelsen, enten de tidligere er kryopreservert eller ikke, kan bli sterilisert ved å anvende teknikker som er kjente innen fagområdet. Det er fordelaktig at steriliseringen blir gjennomført ved å anvende gamma bestråling ved en dose mellom 10 kGy og 100 kGy, fortrinnsvis mellom 20 kGy og 40 kGy, og mer å foretrekke mellom 25 kGy og 40 kGy. Alternative måter å sterilisere innbefatter jodperedikksyre behandling eller elektronstråle. Etter sterilisering kan vevsmatriks bli lagret frosset eller ufrosset forut for implantering. Dersom det lagres kryopreservert, foreksempel i flytende nitrogen, er vevsmatriks stabil i minst 5 år. Før en frossen vevsmatriks anvendes, blir matriks opptint ved anvendelse av en protokoll utformet for å eluere kryobeskyttede oppløsninger. Matriks kan for eksempel bli tint raskt til 4°C i et vannbad ved en temperatur på 37 - 42 °C. Matriks kan deretter raskt bli overført til et vekstmedium slik som Dulbeccos' Modified Eagles Medium (DMEM) inneholdende mannitol (for eksempel ved ca 0,5 %). Mannitol og resterende kryobeskyttelser kan bli fjernet ved seriefotrynninger (vasking) med 0,5, 0,25 og 0,0 M oppløsninger av mannitol i DMEM. Etter vasking er vevet klar til bruk. For vev som ikke lagres frossent, kan alternative vaskeprotokoller bli anvendt, for eksempel vasking i PBS eller DMEM. Implanteringsprosedyrer som er kjent innen fagområdet kan bli anvendt og fremgangsmåten som velges er avhengig av vevsmatriks som blir anvendt og stedet for implanteringen.

Vevsmatriks som er resultat av ovenfor beskrevne prosess, særlig en urinledermatriks, kan bli anvendt som en ledningspoding (rørformet). For eksempel kan en urinleder matriks bli anvendt som en vaskulær poding, nerveleder, eller erstatning for en hvilken som helst rørformet struktur, innbefattet en urinleder. Når den blir anvendt som en ledningspoding bør diameteren på podingen generelt ca være den samme som diameteren til den naturlige strukturen. Podingene i følge oppfinnelsen fremviser gunstige egenskaper som hemodialyse aksess podinger.

For anvendelse i andre podingsapplikasjoner, kan en ledningspoding (for eksempel urinledervev matriks) som et resultat av prosessen over, bli langsgående skåret og rullet ut for å danne en vevlapp. Hele decellularisering/nukleasebehandlingsprosedyren som er beskrevet over kan bli gjennomført på vevlapper (for eksempel urinleder vev) preparert ved langsgående skjæring av segmentet og utrulling av det for å danne en forpodet lapp. De preparerte podingslappene kan bli utnyttet, for eksempel som et hud podingsmateriale eller for reparasjon av andre kroppsvev defekter for kirurgiske applikasjoner til en vevspodingslapp som har fysikalske og funksjonelle egenskaper som foreliggende podings sammensetning.

Vevsmatriks i foreliggende oppfinnelse virker som en plattform for spontan repopulering av vertscellene in vivo og fører til rekonstruksjon og stabilisering av vevet. Resultatet er en fullstendig funksjonell, ikke-immunogen, levedyktig konstruksjon som inneholder autologe celler som uttrykker kontraktile proteiner. Bedre tydelighet og mangel på infeksjon som sees i de foreliggende podingene kan tilskrives den tidlige inkorporeringen, recellulariseringen og remodellering av matriks med vertscellene.

Visse trekk ved foreliggende oppfinnelse er beskrevet i større detalj i de ikke-begrensende eksemplene som følger.

EKSEMPEL 1

Implantasjon av decellularisert bovin urinleder som en perifer vaskulær poding i

hund

Metoder

Ferske bovine urinledere ble samlet fra slaktehus i løpet av 2 timer fra død og transportert til prosesseringsanlegget ved 4°C i en oppløsning med fosfatbufret saltoppløsning for å hindre vevsdegradering under overføring. Ved mottak av vevet ble det utført en grovinspeksjon av vevet, og urinledene med 4 mm utside diameter og 30 til 40 cm lengde ble valgt til prosessering. Utvalgt urinledere ble dissekert ved å anvende sterile instrumenter for å fjerne uønsket vedhengende materialer slik som bindevev og fett. Urinledere ble deretter plassert i 300 ml kapasitets polypropylen beholdere og vasket fire ganger med 250 ml steril PBS for å redusere mikrobiologisk biobelastning. Urinledere ble deretter ført gjennom trinnene for å fjerne vevsceller og antigeninnhold.

Decellularisering ble startet ved inkubasjon i en cocktailblanding av antibiotika og antimykotiske midler som besto av en oppløsning med antibiotika. Denne blandingen inneholdt følgende: amakacin (34 (ig/ml), lincomycin (160 ug/ml), cefotaxime (18 ug/ml), vancomycin (136 (ag/ml), rifampin (82 ug/ml), diflucan (120 ug/ml) og amphotericin B (0,5 ug/ml). Inkuberingen var i 18 timer i en risteinkubator ved 37°C. For cellelysering ble den antibiotiske oppløsningen erstattet med 250 ml sterilt vann og inkubasjonen fikk anledning til fortsette i 4 timer i et ristende vannbad ved 37°C. Dette ble etterfulgt av inkubering i 19 timer ved 37°C i en enzymblanding for å degradere kjernematerialet som nå var eksponert ved lysering av celleorganeller. Denne cocktail inneholder DNAse I (47 Kunitz U/ml) og RNAse A (1 Kunitz U/ml) i en oppløsning inneholdende magnesiumklorid (1 ug/ml) og kalsium klorid (3 j^g/ml) og bufret ved anvendelse av Tris[hydroksimetyl]aminometan hydroklorid (50 ug/ml) ved pH 7,6. (DNAse I og RNAse A ble oppnådd fra Sigma Chemical Company (D-5025 og R-5000) og begge ble anvendt ved en konsentrasjon på 17 jag/ml). Deretter ble vevet anbragt i en 3,5 mM oppløsning av Triton X-100 detergent i sterilt vann for å fjerne celledebris. Denne inkubasjonen ble gjennomført i 24 timer ved 37°C i et ristende vannbad. Detergentoppløsningen ble deretter vasket ut av vevet i fire vask i sterilt vann ved 37°C i 30 minutter hver gang. Etter disse vaskingene, ble resulterende matriks innpakket, kryopreservert, sterilisert og plassert i lagring forut for anvendelse som en vaskulær poding.

For preservering ble vevet pakket i sterile pakninger inneholdende Dulbeccos' Modified Eagles Medium oppløsning (DMEM) og 10 % dimetyl sulfoksid (DMSO) med 10 % føtalt bovint serum. Kryopreservering ble gjennomført ved å anvende en fryser med kontrollert hastighet for å redusere pakketemperaturen til -80°C ved 0,5°C per minutt. Når vevstemperaturen hadde nådd -80°C ble hver pakning fjernet og plassert i flytende nitrogen ved -196°C for langtidslagring. Sterilisering av vev ble gjennomført i frossen tilstand ved anvendelse av en 25 - 30 kGy av gammabestråling. Etter sterilisering ble vevet lagret ved -196°C i flytende nitrogen inntil bruk.

Før implementering ble vevsmatriks opptint for å fjerne den kryobeskyttende oppløsningen fra vevet. Podingene ble tint raskt til 4°C i et vannbad ved en temperatur på 37 - 42°C. Vevet ble raskt overført til DMEM inneholdende 0,5 % mannitol. Mannitol og resterende kryobeskyttelsesmidler ble fjernet ved fortynning med 0,5, 0,25 og 0,0 M oppløsninger av mannitol i DMEM. Etter disse vaskingene ble implantering av acellulær bovin ledning (det vil si den resulterende rørformede matriks) gjennomført som en ende-til-side mellomposisjonen poding i venstre og høyre halspulsåre og venstre femorale arterier til en voksen bastard hund. Podingslengdene var mellom 9 og 12 cm og den indre diameteren til podingene var mellom 5 og 10 mm. Implanteringen ble utført ved å benytte standard kirurgiske teknikker for vaskulær podingsimplantering i disse posisjonene. En oral antikoagulerende kur av 325 mg Aspirin og 75 mg Persantin ble administrert daglig til dyret og denne begynte to dager før den kirurgiske prosedyren.

Etter to uker og etter fire uker etter kirurgi, ble det gjennomført arteriogrammer for å bestemme tydeligheten til de implanterte podingene. Dyret ble tatt livet av og podingene ble eksplantert umiddelbart etter andre arteriogram fire uker etter kirurgi. Eksplanterte podinger ble evaluert for åpenhet og grovutseende, og undersøkt histologisk videre for å bestemme podingens mikroskopske integritet.

Resultater

I løpet studiens fire ukers varighet, oppførte dyret seg normalt og det var ingen komplikasjoner etter kirurgi. Ved to uker og ved fire uker etter kirurgi, ble alle tre bovine urinleder podinger bestemt å være helt patent i angiografisk undersøkelse. Fire uker etter kirurgi, viste grovanalyse av det eksplanterte podingsvevet at det hadde vært en helningsprosess som hadde stabilisert podingene inn i det kirurgiske stedet og tydeligheten til alle podingene ble bekreftet ved observering av strømmen podingene forut for anbringelse av podingene i formalin for fiksering. Etter fiksering ble hver poding skåret i syv separate prøver for histologisk analyse. Prøvene ble tatt fra den native arterien i både proksimal og distal ende vekk fra podingen. Snitt av proksimale og distale anastamose steder ble tatt langs proksimal, midtre og distal del av hver poding. Etter prosessering, parafininnleiring og snitting, ble podingsprøver farget ved å anvende en standard hematxylin og eosin farge. Mikroskopisk analyse avslørte at podingene var strukturelt intakte. Matriks til den bovine urinlederen hadde begynt å bli revitalisert ved bevegelse av cellulære komponenter fra de ytre kantene til det kirurgiske området. Gjennom denne remodelleringen ble podingene tatt på utseende av naturlige arterielle blodtransporterende ledere.

EKSEMPEL 2

Implantering av decellularisert porcin urinleder som en periferell vaskulær poding hos hund.

Metoder

Porcint urinledervev ble samlet og preparert og preservert nøyaktig som beskrevet i Eksempel 1 med unntagelse for at dimensjonene på vevet som ble valgt for prosessering var 3 mm i indre diameter og 25 cm lengde. Implantering av behandlede porcine urinledere ble utført i en voksen bastard hund som en ende-til-ende interposisjonal vaskulær poding i venstre og høyre femorale arterier og i venstre og høyre carotid arterier. Alle podingene ble undersøkt ved arteriogram to uker etter kirurgi. Dyret ble tatt livet av fire uker etter kirurgi og podingene ble eksplantert i grovundersøkelse og histologisk evaluering for ytelse. Histologi prøver ble tatt og farget som beskrevet i Eksempel 1.

Resultater

Arteriogrammer gjennomført to uker etter implantering viste at podingene var patente. Under eksplantering viste grovundersøkelse at podingene var helt patente og vanskelig å skille fra de native blodkarene. Histologisk undersøkelse viste at podingene hadde blitt delvis recellularisert med spindelformede celler. Denne recellulariseringen representerer sannsynligvis det første trinnet i gjenforming til en fullt funksjonell blod-bærende leder som ikke kan skilles fra nativt vev.

EKSEMPEL 3

Implantering av decellularisert bovin urinleder arterie som en perifer vaskulær poding i hund

Metoder

Bovint urinleder arterievev ble samlet og preparert og preservert nøyaktig som beskrevet i Eksempel 1. Implantering av behandlet bovin urinleder arterie ble utført i en voksen bastard hund som en ende til side interposisjonal poding i karotid arterien. Etter 4 ukers implantering, ble podingene eksplantert og tatt til histologisk analyse.

Resultater

Ved fire uker etter implantering var implantatene patente. Histologi indikerte at disse podingene hadde begynt å ta på celler fra vertsdyret.

EKSEMPEL 4

Implantering av decellularisert bovin gastrisk arterie som en perifer vaskulær poding i hund

Metoder

Bovint gastrisk arterievev ble samlet og preparert og preservert nøyaktig som beskrevet i Eksempel 1. Implantering av behandlet bovin urinleder arterie ble utført i en voksen bastard hund som en ende til side interposisjonal poding i karotid arterien. Etter 4 ukers implantering, ble podingene eksplantert og tatt til histologisk analyse.

Resultater

EKSEMPEL 5

Bestemmelse av brudd styrke egenskaper ved decellularisert bovin urinleder

Metoder

Tre segmenter av bovint urinleder vev ble samlet og preparert og preservert nøyaktig som beskrevet i Eksempel 1. Ved anvendelse av komprimert nitrogen gass, ble trykket som var nødvendig for å bryte podingen bestemt ved langsom økning av topptrykket til nitrogen som var pålagt podingen. Gassen var inneholdt i podingen ved anvendelse av en standard høytrykksrør armatur og kabelklemmer. Hvert podingssegment ble undersøkt dobbelt og gjennomsnittlig brudd styrke for hver poding ble beregnet.

Resultater

De tre podingene ble funnet å brytes ved 3361, 2456 og 2327 mmHg, idet gjennomsnittet er 2715 mmHg. Denne størrelsen representerer en bruddstyrke på omtrent 1,5 ganger den til human frisk saphenøs vene som er vanlig å bruke i bypass kirurgiske prosedyrer.

EKSEMPEL 6

Bestemmelse av brudd styrke egenskaper ved decellularisert porcin urinleder

Metoder

Seks segmenter av porcint urinleder vev ble samlet og preparert og preservert nøyaktig som beskrevet i Eksempel 2. Ved anvendelse av komprimert nitrogen gass, ble trykket som var nødvendig for å bryte podingen bestemt ved langsom økning av topptrykket til nitrogen som var pålagt podingen. Gassen var inneholdt i podingen ved anvendelse av en standard høytrykksrør armatur og kabelklemmer. Hvert podingssegment ble undersøkt dobbelt og gjennomsnittlig brudd styrke for hver poding ble bestemt.

Resultater

De seks podingene ble funnet å brytes ved 2068, 5171, 6722, 6722, 5688 og 3620 mmHg, idet gjennomsnittet er 4999 mmHg. Denne størrelsen representerer en bruddstyrke på nesten 3 ganger den til human frisk saphenøs vene som er vanlig å bruke i bypass kirurgiske prosedyrer.

EKSEMPEL 7

In vitro recellularisering av decellularisert bovin urinleder med vaskulære ledningsceller

Metoder

Tre segmenter av bovint urinrør vev ble samlet og preparert og preservert nøyaktig som beskrevet i Eksempel 1. Hvert stykke med vev ble anbragt i en 75 cm<3> vevsdyrkingsflaske inneholdende DMEM og supplert med 10 % føtalt bovint serum. Hver poding ble sådd med endotele celler og glatte muskelceller for å muliggjøre cellevekst inn i podingssegmentene. Kulturer ble tilført ved anvendelse av fersk serum-supplert DMEM to ganger hver uke i 4 uker. Etter 4 uker ble vevene ekstrahert fra dyrkingssystemet og undersøkt ved å anvende histologisk seksjonering av vevet og H&E farging.

Resultater

Etter fire ukers celledyrking, ble endotele celler observert voksende på overflaten av podingsvevet, men ikke internt. I tillegg ble glatte muskel celler funnet voksende på overflaten av podingene og i veggen til podingsmaterialet med en gang de kunne oppnå tilgang på overflaten av podingen.

EKSEMPEL 8

Vevspoding avledet fra urinleder som aortisk poding i hund

Metoder

Bovine urinledere ble anvendt for å skaffe tilveie ledningsmatriks for den vaskulære vevspodingen. Disse vevene er tilgjengelige i lengder og diametre som er egnede for et antall vaskulære applikasjoner og de inneholder ikke klaffer i lumen eller innehar tributarier som krever ligeringer. Urinledere ble oppnådd fra slaktehus som var godkjent av U.S. Department of Agriculture. Vevene ble vasket i fysiologisk saltoppløsning og transportert for vevspreparering på is innen 24 timer fra innhøsting. Urinlederne ble først dissekert fri for vedhengende bindevev og fett og bare segmenter med en 6 mm diameter ble tatt for videre prosessering.

Begynnende prosessering bestod av reduksjon av den biologiske belastningen ved anvendelse av en oppløsning med flere antibiotika som beskrevet i Eksempel 1. Fjerning av mer enn 95 % av alt cellulært materiale ble oppnådd i flere trinn. Først var det inkubering i sterilt vann som produserte hypoton cellelysering. Resulterende vevsmatriks ble deretter ekvilibrert i buffer (PBS) og behandlet med en oppløsning inneholdende ribonuklease og deoksiribonuklease (se Eksempel 1). En isoton utvasking over flere dager fullførte fjerning av cellulært protein. Fjerning av cellulær debris ble overvåket ved anvendelse av hematoksylin og eosin farging av histologiske snitt. Vevsmatrikser ble deretter sterilisert ved gammastråling (25 kGy til 40 kGy) før anvendelse og analyse av sterilitet ble gjennomført på hver prosesseringssats.

Åtte bastard hunder som veide 22,7 til 27,2 kg ble anestesert med natrium thiopental, endotrakealt intubert og satt på inhalert isofluran. Abdomene ble preparert og drapert på steril måte. Et midtlinje innsnitt ble utført og den

abdominale aorta distal til de renale arteriene ble isolert i hver hund. Vaskulære ledninger ble preparert ved vasking av vevsmatriks i 100 ml steril HEPES-bufret Dulbecco's Modified Eagle Medium og et segment med tilnærmet lengde 6 cm og 6 mm i indre diameter ble innsatt som en aortisk interposisjon poding ved anvendelse av avbrutte prolene suturer for å konstruere proksimale, ende til ende, anastomoser. Alle dyrene mottok 325 mg aspirin og 75 mg dipyridamol p. o. daglig i to dager, forut for, og i 14 dager etter kirurgi.

Tydelighet og strukturell stabilitet ble observert med angiogråfisk undersøkelse hver 6 uke for de som overlevde lengre og med en gang umiddelbart før eutanasi. To dyr ble tatt livet av etter 3 uker, 3 etter 6 uker og 1 dyr 13 uker etter kirurgi. De to gjenværende dyrene ble til sist evaluert etter 43 uker og er fremdeles levende. Etter at de var tatt livet av ble podingene fjernet in bloc ved inkorporering av proksimale og distale anastamoser og grovinspisert og prosessert for histologisk analyse.

Etter innhøsting ble podinger fiksert i 10 % bufret formaldehyd oppløsning. Hele podingen sammen med anastamotiske steder og proksimal og distal aorta ble delt i 7 vevssegmenter og plassert i parafinblokker for prosessering. Hematoxylin og eosin-fargede snitt av disse vevene ble undersøkt og immunhistokjemisk analyse ble gjennomført ved anvendelse av spesifikk antibiotika for å identifisere tilstedeværelse av glatt muskel a-actin (a-SMA), desmin og vimentin kontraktile filamenter.

Resultater

Etter prosessering viste vaskulære vevspodinger preparert fra bovin urinleder fjerning av mer enn 95 % bovint cellulært materiale. Det gjenværende besto av cellulær debris og ikke intakte celler. Ledningspode sterilitet og pyrogene nivåer under 20 endotoksin enheter ble demonstrert. Implantering av disse interposisjon podingene inn i hundens infrarenale aorta var ukomplisert og håndteringsegenskapene til podingene var lik som normalt vaskulært vev.

Arteriogram utført på hver av hundene indikerte at podingene var fullstendig funksjonelle i løpet av 43-ukers implanteringsperioden uten tilsynekomst av dilatering eller stenose. Grovevaluering av alle eksplanterte podinger etter 3, 6 og 13 uker fra implantering bekreftet helt patente podinger. Histologisk undersøkelse viste en helende respons rundt podingsadventitia med recellularisering av medium. Et lag med celler på lumenal overflate liknet på endotelium. Alle cellene som ble funnet i podingen var antatt å ha opprinnelse fra verten, fordi det originale podingsmaterialet var acellulært. Grad av medial recellularisering var tilnærmet 20 % ved 3 uker, 30 % ved 6 uker og 50 % ved 13 uker. Revitalisering av podingsmediene syntes å forekomme fra advential område mot lumen og mens recellulariseringen skred frem, var det en periferisk organisering av celler som vokser perpendikulært på strømmen av blod i ledningen.

Analyse av anastomotiske steder viste at intimal hyperplasi var minimal og cellulær overvekst var åpenbar ved suturlinjen hvilket skaper en jevn overgang fra nativ aorta til podingen. Histologisk var det ingen evidens på hyperplastisk reaksjon som innsnevrer lumen i podingseksplantatet etter 13 uker. Innsnevring ble heller ikke observert angiografisk opp til 43 uker etter implantering.

Immunhistokjemisk farging ble anvendt for å identifisere celletype som var tilstede i de recellulariserte podingene. Andelen av celler som uttrykker glatte muskel celle kontraktile proteiner ble demonstrert ved anvendelse av farger som inneholder antistoffer til a-SME, desmin og vitaminer. En meget stor prosentdel av mediale celler ved 3, 6 og 13 uker, var a-SME positive. Vimentin ble også vanligvis uttrykt ved a-SME positive celler. Desminpositive celler var mindre forekommende men tilstede i en underpopulasjonen. De fleste cellene som var tilstede i podingene farget positiv for minst en av disse kontraktile proteinene. Da ingen intakte celler var tilstede i podingsledningen før implantering, var alle cellespesifikke immunofargende demonstrerbare for a-SME , desmin og vementin tilstede på celler som hadde opprinnelse fra verten.

EKSEMPEL 9

Anvendelse av vevspoding avledet fra urinleder som en arterio-venøs fistula i hund

Metoder

Ni segmenter av behandlet bovin urinleder vevpodingsleder, preparert som beskrevet i Eksempel 9 (20 cm x 6 mm ID) ble implantert som arteriovenøse podinger i karotidarterien (CA) og jugularvenen (JV) (n=5), eller i femoral arterien (FA) og femoralvenen (FV) (n=4) i 6 voksne hunder. En kontrollgruppe på 7 hunder mottok 11 (6 mm ID) polytetrafluoretylen (PTFE) podinger (7 i CA og JV, og 4 i FA og FV). Alle podinger ble modnet i 14 dager og deretter sham-aksessert en gang i uken med to 17-gauge hemodialyse nåler. Rutinemessig i løpet av en 6 måneders periode ble tydeligheten bestemt og blod ble tatt for å overvåke CBC og koaguleringsfaktorer. Histologisk analyse ble gjennomført i en undergruppe av eksplanterte podinger ved 2,4,10 og 24 uker.

Resultater

27 % (3/11) av PTFE podingene ble infiserte, mens ingen av vevpodingsledningene som var preparert i følge foreliggende oppfinnelse ble infiserte i løpet studien. Tydeligheten til vevspodingsledningen var 86 % sammenliknet med 72 % for PTFE podinger. Tallet på hvite blodceller øket ikke i noen av gruppene ved 2 og 7 uker og blodkoaguleringsfaktorer var også uforandret. Hemostase tidene etter sham klebing av podingene var lengre (gjennomsnitt 10 minutter) i PTFE podingene sammenliknet med vev podingsledningene (gjennomsnitt 3 minutter). Histologi ved 10 uker viste at podingsledningene hadde gjennomgått recellularisering av tunica media med vertens spindelformede celler så vel som ypperlig inkorporering i det omgivende vevet slik det viste seg ved kapillær innvekst i tunica adventitia. PTFE podinger viste ingen signifikant cellulær innvekst og et fravær av luminal endotelium.

EKSEMPEL 10

Pakking og sterilisering av vevspoding

Pakking

Vevsproduktet blir pakket i varmeforseglede klare polyester poser inneholdende fosfatbufret saltvann og lagret ved 4°C i opptil 7 dager forut for sterilisering

Transport

Tre frosne 21b kalde gelbrikker plasseres i bunnen av en forhåndsavkjølt 19" x 14,4" x 22" papp beholder isolert med 2" polyuretan skum. To pappseparatorer blir plassert på toppen av disse.

Tre kalde 21b gelbrikker blir tilsatt etterfulgt av produktladningen (11000 cm<3>).

To fyllbagger blir anvendt som temperaturindikatorer på hvilke forskjellige temperaturindikator strips er tilstede. En syv-dags mekanisk temperatur registrator blir også plassert blant prøvene

Tre kalde 21b gelbrikker blir plassert på toppen av produktladningen etterfulgt av en papp separator og tre frosne 21b gelbrikker. En skumplugg blir plassert på toppen av det siste laget av brikker og boksen blir lukket. Boksen blir transportert til en steriliseringsfasilitet for sterilisering med gammastråling ved 25 - 40 kGy. Boksen blir deretter returnert og produktet pakket opp og lagret ved romtemperatur inntil bruk. Total vevstid mellom pakking og oppakking er fortrinnsvis mindre enn 100 timer og temperaturen blir opprettholdt i denne perioden ved 2°C - 8°C.

Lagring

Vevspodingen kan bli lagret ved romtemperatur i to år.

All dokumentasjon som er sitert over er med dette innbefattet i sin 5 helhet med referanse.

En person med kunnskap innen fagområdet vil utfra beskrivelsen innse at forskjellige endringer i form og detaljer kan utføres uten å avvike fra rekkevidden til oppfinnelsen

Claims

1. Fremgangsmåte for preparering av en vevspoding, karakterisert ved at den i det vesentligste omfatter: i) vasking av et utgangsvev oppnådd fra en human eller animalsk urinleder med et middel som reduserer biobelastning slik at nevnte utgangsvev blir desinfisert, ii) decellularisering av desinfisert vev som resultat av trinn (i) med en oppløsning som lyserer celler av nevnte desinfiserte vev slik at det blir dannet en vevsmatriks, og v) bringe nevnte vevsmatriks som er resultat av trinn (ii) i kontakt med en nuklease slik at nukleinsyrer som er forbundet med nevnte vevsmatriks blir degradert, og vi) vasking av nevnte vevsmatriks som er resultat av trinn (iii) slik at cellulær eller ekstracellulær debris blir fjernet og nevnte vevspoding blir oppnådd.

2. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at nevnte middel som reduserer biobelastningen er et antimikrobisk middel.

3. Fremgangsmåte i følge krav 2, karakterisert ved at det antimikrobiologiske midlet omfatter et antibiotisk middel.

4. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at nevnte oppløsning som lyserer nevnte celler omfatter sterilt vann.

5. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at nevnte oppløsning som lyserer nevnte celler omfatter en vandig hypoton buffer eller buffer med lav jonisk styrke.

6. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at nevnte nuklease omfatter en eksonuklease og en endonuklease.

7. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert ved at nevnte nuklease omfatter DNAse I og RNAse A.

8. Fremgangsmåte i følge krav 7, karakterisert ved at trinn (iii) omfatter kontakt av nevnte vevsmatriks med nevnte nuklease ved 20°C til 38°C i 1 til 36 timer.

9. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter, etter trinn (iv), sterilisering av nevnte vevsmatriks.

10. Fremgangsmåte i følge krav 9, karakterisert ved at nevnte sterilisering blir gjennomført ved anvendelse av gammastråling, jod, peredikksyre eller elektronstråle.

11. Fremgangsmåte i følge krav 10, karakterisert ved at nevnte sterilisering blir gjennomført ved å anvende gammastråling.

12. Fremgangsmåte i følge krav 10, karakterisert ved at nevnte vevsmatriks blir opprettholdt ved en temperatur mellom 2°C og 8°C under nevnte sterilisering.

13. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter, etter trinn (iv), kryopreservering av nevnte vevsmatriks.

14. Vevspoding, karakterisert ved at den er oppnådd ved fremgangsmåten i følge krav 1.

15. Vevspoding i følge krav 14, karakterisert ved at nevnte vevspoding har en rørformet struktur.

16. Vevspoding i følge krav 15, karakterisert ved at nevnte vevspoding er en vaskulær poding, en urinlederpoding eller en nerveleder.

17. Vevspoding i følge krav 14, karakterisert ved at nevnte vevspoding er en lapp.

18. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter v) sterilisering av nevnte vevsmatriks som er resultat av (iv) mens man opprettholder nevnte vevsmatriks i en ikke-frossen tilstand ved en temperatur mellom 0°C og 40°C

19. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at utgangsvevet er urinleder, vene, arterie, sene, hjerteklaff, fascia lata, perikardium eller nerve.

20. Fremgangsmåte i følge krav 19, karakterisert ved at nevnte utgangsmateriale er urinleder.

21. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at nevnte middel som redusere biobelastning er et antimikrobisk middel.

22. Fremgangsmåte i følge krav 21, karakterisert ved at det antimikrobiologiske midlet omfatter et antibiotikum.

23. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at i trinn (v) er nevnte temperatur opprettholdt mellom 2°C og 8°C.

24. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at nevnte oppløsning som lyserer nevnte celler omfatter sterilt vann.

25. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at nevnte oppløsning som lyserer nevnte celler omfatter en vandig hypoton buffer eller buffer med lav jonisk styrke.

26. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at nevnte oppløsning som lyserer nevnte celler omfatter en proteasehemmer.

27. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at nevnte nuklease omfatter en eksonuklease og en endonuklease.

28. Fremgangsmåte i følge krav 27, karakterisert ved at nevnte nuklease omfatter DNAse I og RNAse A.

29. Fremgangsmåte i følge krav 28, karakterisert ved at trinn (iii) omfatter at man bringer nevnte vevsmatriks i kontakt med nevnte nuklease ved 20°C til 38°C i 1 til 36 timer.

30. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at trinn (iv) omfatter vasking av nevnte vevsmatriks ved 2°C til 42°C i opptil 7 dager.

31. Fremgangsmåte i følge krav 18 karakterisert ved at nevnte sterilisering blir gjennomført ved anvendelse av gammastråling, jod, peredikksyre eller elektronstråle.

32. Fremgangsmåte i følge krav 31, karakterisert ved at nevnte sterilisering blir gjennomført ved anvendelse av gammastråling.

33. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at den videre omfatter etter trinn (iv) og før trinn (v), eller etter trinn (v), kryopreservering av nevnte vevsmatriks.

34. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert ved at etter trinn (v), blir nevnte vevsmatriks opprettholdt ved ca 25°C forut for implantering.

35. Vevspoding, karakterisert ved at den blir oppnådd ved fremgangsmåten i følge krav 18

36. Vevspoding i følge krav 35, karakterisert ved at utgangsvevet er urinleder.

37. Vevspoding i følge krav 35 karakterisert ved at nevnte vevspoding har en rørformet struktur.

38. Vevspoding i følge krav 37 karakterisert ved at nevnte vevspoding er en vaskulær poding, en urinlederpoding eller en nerveledning.

39. Vevspoding i følge krav 35 karakterisert ved at nevnte vevspoding er en lapp.