JP2004500188A - 組織移植片 - Google Patents

Abstract

本発明は、組織移植片材料を調製する方法に関する。本発明はまた、多目的組織移植片材料に、そして血管および非血管組織の置換物として、前記材料を用いる方法にも関する。

Description

【０００１】
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、２０００年１月２８日提出の仮出願第６０／１７８，６３２号から優先権を請求する。
【０００２】
技術分野
本発明は、組織移植片材料を調製する方法に関する。本発明はまた、多目的組織移植片材料に、そして血管および非血管組織の置換物として、前記材料を用いる方法に関する。
【０００３】
背景
一般的に、生物学的組織は、身体移植片として用いる際、同等の合成装置より優れた機能的性能を有する。組織移植片は、現在、主として自家および同種移植片に限定されており、これらは固有の供給上の制約、並びに採取、輸送および血清学の物流管理上の懸念を有する。したがって、生物学的組織移植片のさらなる供給源に対する必要性がある。動物組織は、こうした供給源を代表する。動物組織は、比較的容易に、屠殺場から多量に得ることが可能である。しかし、使用前に、これらの組織を処理して、移植後、宿主による拒絶反応を引き出す、抗原性タンパク質を除去しなければならない。
【０００４】
抗原性タンパク質の除去は、ドナー組織の細胞性構成要素が除去されるような方式で、ドナー組織をプロセシングすることによって、達成することが可能である。多くの抗原性タンパク質が細胞膜上に存在する。したがって、細胞の除去はまた、これらのタンパク質も除去する。脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｉｎｇ）の後、生物学的移植片として使用するため、組織をパッケージングし、そして滅菌することが可能である。移植片をヒトおよび他の動物に移植し、天然構造、系または現存する補綴装置を修復するか、増大するか、または置き換えることが可能である。これらには、限定されるわけではないが、心臓血管、血管、泌尿生殖器、神経学的、胃腸および整形系が含まれる。移植片はまた、血液透析アクセスを提供するのに用いることも可能である。
【０００５】
本発明は、ヒト（または非ヒト）宿主に移植するのに適したものにするように、動物組織をプロセシングする方法を提供する。本発明はまた、同種移植移植片として使用するため、ヒト組織をプロセシングする方法も提供する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、組織移植片材料を調製する方法に、そして生じた多目的移植片材料に関する。本発明はまた、血管または非血管組織の置換物として、組織移植片を用いる方法に関する。
【０００７】
本発明の目的および効果は、以下の説明から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、血管および非血管移植片適用に使用するのに適したものにするような方式で、動物またはヒト組織を調製する方法に関する。本発明の方法にしたがって調製された組織は、該組織を組織移植片適用に特によく適したものにする、物理的および生物学的特性を示す。
【０００８】
本発明に使用するのに適した組織は、ヒト死体から、あるいはウシ、ブタまたは他の動物から、例えば屠殺場条件下で、得ることが可能である。組織は、望ましい温度に組織を維持するのに必要な条件下で、組織調製地点まで輸送することが可能である。組織は、例えば、生理学的塩溶液に浸して輸送し、そして到着した際、検査し、例えば生理学的塩溶液中で洗浄し、そして結合組織および脂肪などの望ましくない付着物質を含まないように浄化する（切開する）ことが可能である。
【０００９】
好ましい態様において、単離された尿管が組織移植片材料である。しかし、動脈、静脈、腱、心臓弁、大腿筋膜、心膜および神経を含む、他の組織を用いることが可能である。
【００１０】
収集および切開後、移植組織は、都合よくは、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でまず洗浄し、汚染微生物数（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を減少させる。その後、組織を、１以上の抗菌剤、例えば抗生物質または抗真菌剤、あるいはそれらの混合物を含む溶液中でインキュベーションし（例えば約３７℃で約１８時間）、汚染微生物数をさらに減少させる。好ましい抗生物質には、アマカシン（ａｍａｋａｃｉｎ）、リンコマイシン、セフォタキシム、バンコマイシン、リファンピン、ダイフルカンおよびアンホテリシンＢが含まれる。好適には、これらの抗生物質の混合物を用いる。その後、組織は、後にさらにプロセシングするため、凍結保存してもよいし、または直ちに脱細胞化に供してもよい。
【００１１】
脱細胞化は、好ましくは、組織中の天然細胞を溶解するのに有効な溶液中で、組織をインキュベーションすることによって達成される。好適には、組織は、滅菌水中で（例えば尿管の場合、約４時間）インキュベーションする（例えば約３７℃で）が、水性低張緩衝液または低イオン強度緩衝液もまた、用いることが可能である。望ましい場合、脱細胞化溶液は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡなどのキレート剤）などの他の剤を含んでもよい。
【００１２】
脱細胞化後、生じた組織マトリックスを酵素（例えばヌクレアーゼ）カクテルで処理し、核成分を分解する。天然細胞ＤＮＡおよびＲＮＡの消化に用いることが可能なヌクレアーゼには、エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ両方が含まれる。本方法のこの工程で使用するのに他のヌクレアーゼが適しており、そして商業的に入手可能である。例えば、ＤＮアーゼＩ（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ミズーリ州セントルイス）およびＲＮアーゼＡ（ＳＩＧＭＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ミズーリ州セントルイス）を含むカクテルを用いることが可能である。
【００１３】
好ましくは、ヌクレアーゼは、マグネシウムおよびカルシウム塩（例えば塩化物塩）を含む緩衝溶液中に存在する。緩衝溶液のイオン濃度およびｐＨ、処理温度および処理の長さは、望ましいレベルの有効なヌクレアーゼ活性を確実にするよう選択される。尿管の場合、緩衝液は、好ましくは、ｐＨ７．６のＴｒｉｓ緩衝液である。好ましくは、ヌクレアーゼカクテルは、約０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１７μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、および約０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１７μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを含む。ヌクレアーゼ処理は、例えば約２０℃から約３８℃で、好ましくは約３７℃で、約１から３６時間、達成することが可能である。尿管の場合、典型的には、約１９時間のヌクレアーゼ処理が十分である。
【００１４】
脱細胞化およびヌクレアーゼ処理に続き、生じた組織マトリックスを処理し（洗浄し）、細胞性タンパク質、細胞性脂質、および細胞性核酸と共に、細胞外可溶性タンパク質、脂質およびプロテオグリカンなどの細胞外破片を含む可能性がある細胞破片の除去を確実にすることが可能である。細胞性および細胞外破片の除去は、移植に際して、レシピエントから不都合な免疫反応を引き出す、移植組織マトリックスの可能性を減少させる。例えば、組織は、緩衝液（ＰＢＳ）中で、または水中のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００溶液などの界面活性剤溶液中で、インキュベーションすることが可能である。溶液組成、および溶液組成が組織マトリックスに適用される条件は、ヌクレアーゼプロセシング中に利用されたヌクレアーゼの活性を減少させるかまたは除去し、そして細胞破片を除去するように選択することが可能である。本方法には、約２℃および４２℃の間の温度でのインキュベーションが含まれる可能性があり、３７℃が好ましい。組織マトリックスは、７日まで、界面活性剤溶液中でインキュベーションすることが可能であり、尿管マトリックスの場合、約２４時間が十分である。界面活性剤溶液より緩衝液を用いる際、組織マトリックスは、３０日まで、インキュベーションすることが可能であり、尿管マトリックスの場合、約１４日が十分である。
【００１５】
用いられた場合、界面活性剤溶液は、滅菌水性溶液（例えば水）中での多数回の洗浄を用いて、組織マトリックスから洗い落とすことが可能である。最適洗浄回数および時間は、容易に決定することが可能であるが、尿管マトリックスの場合、約４　３０分間の洗浄が好ましい。
【００１６】
洗浄後、今度は組織マトリックスを移植前にパッケージングし、滅菌し、そして／または保存することが可能である。好適には、パッケージングされた組織マトリックスは、非凍結状態、好ましくは０℃および４０℃の間、より好ましくは０℃および２０℃の間、最も好ましくは２℃および８℃の温度で、例えば実施例１１で用いられるアプローチを用いた滅菌までそして滅菌中、維持する。滅菌後、組織マトリックスは室温で維持することが可能である。望ましい場合、組織マトリックスは、後で使用するため、滅菌前にまたは滅菌後に、凍結保存することが可能である。組織の凍結保存技術は、当該技術分野に公知である。Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ，　Ｋ．Ｇ．Ｍ．　Ｂａｓｉｃ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．：　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｒｄ　Ａｌｌｏｇｒａｆｔ　Ｃａｒｄｉａｃ　Ｖａｌｖｅｓ　ａｎｄ　Ｖａｓｕｌａｒ　Ｔｉｓｓｕｅ．中　Ｄ．Ｒ．　Ｃｌａｒｋｅ（監修），　Ａｄａｍｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｌｔｄ．，　ボストン，　ｐｐ．９−２３は、組織および器官の凍結保存を論じ、そして本明細書に援用される。
【００１７】
本発明の組織マトリックスは、あらかじめ凍結保存されていてもいなくても、当該技術分野に認識される滅菌技術を用いて、滅菌することが可能である。好適には、滅菌は、１０ｋＧｙおよび１００ｋＧｙの間、好ましくは２０ｋＧｙおよび４０ｋＧｙの間、より好ましくは２５ｋＧｙおよび４０ｋＧｙの間の用量で、ガンマ線照射を用いて達成される。別の滅菌法には、ヨウ素、過塩素酸処理または電子ビームが含まれる。滅菌後、組織マトリックスは、移植前に、凍結してまたは未凍結で保存することが可能である。例えば液体窒素中で凍結保存する場合、組織マトリックスは、少なくとも５年間、安定である。凍結組織マトリックスを用いる前に、凍結保護物質溶液を溶出するよう設計されたプロトコルを用いて、マトリックスを融解する。例えば、マトリックスは、３７−４２℃の温度の水槽中、迅速に４℃に融解することが可能である。その後、マンニトール（例えば約０．５％）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの増殖培地に、マトリックスを迅速に移すことが可能である。マンニトールおよび残渣凍結保護物質は、ＤＭＥＭ中のマンニトール０．５、０．２５および０．０Ｍ溶液での連続希釈（洗浄）によって、除去することが可能である。洗浄後、組織は用いる準備が出来ている。凍結保存されなかった組織に関しては、別の洗浄プロトコル、例えばＰＢＳまたはＤＭＥＭ中での洗浄を用いることが可能である。当該技術分野に認識される移植法を用いることが可能であり、そして選択される方法は、用いる組織マトリックスおよび移植部位に応じる。
【００１８】
上述の方法から生じる組織マトリックス、特に尿管マトリックスは、導管（管状）移植片として用いることが可能である。例えば、尿管マトリックスは、血管移植片、神経ガイド、または尿管を含む管状構造いずれかの置換物として用いることが可能である。導管移植片として用いる際、移植片の直径は、一般的に、天然構造の直径とほぼ同じであるべきである。本発明の移植片は、血液透析アクセス移植片として好ましい特徴を示す。
【００１９】
他の移植片適用で使用するため、上記の方法で生じた導管移植片（例えば尿管組織マトリックス）は、長軸方向に切断し、そして伸ばして組織パッチを形成することが可能である。上述の脱細胞化／ヌクレアーゼ処理法全体は、部分を長軸方向に切断し、そして開いて移植前パッチを形成することによって調製した組織（例えば尿管組織）パッチに対して、行うことが可能である。調製された移植片パッチは、例えば、皮膚移植片材料として、または他の体組織の欠陥を修復するために利用することが可能であり、本移植片組成物の物理的および機能的特性を有する組織移植片パッチの外科的適用に向いている。
【００２０】
本発明の組織マトリックスは、ｉｎ　ｖｉｖｏで、宿主細胞による自発的再増殖の足場として作用し、組織再構築および安定化を導く。結果は、収縮タンパク質を発現する自家細胞を含む、完全に機能する、非免疫原性生存可能構築物である。本移植片に見られる、より優れた開存性（ｐａｔｅｎｃｙ）率および感染の欠如は、早期の取り込み、再細胞化および宿主細胞とマトリックスのリモデリングに起因しうる可能性がある。
【００２１】
本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載される。
【００２２】
【実施例】
実施例１
イヌにおける末梢血管移植片としての脱細胞化ウシ尿管の移植
方法
新鮮なウシ尿管は、死亡２時間以内に屠殺場から収集し、そして輸送中の組織分解を妨げるため、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中、４℃で、プロセシング施設に輸送した。組織を受け取ると、全体の組織検査を行い、そしてプロセシングのため、外径４ｍｍおよび長さ３０から４０ｃｍの尿管を選択した。滅菌器具を用いて、選択した尿管を切開し、結合組織および脂肪などの望ましくない付着物質を除去した。その後、尿管を３００ｍｌ容積のポリプロピレン容器に入れ、そして２５０ｍｌの滅菌ＰＢＳで４回洗浄し、汚染微生物数を減少させた。その後、尿管に、組織細胞および抗原内容物を除去する工程を行った。
【００２３】
脱細胞化は、抗生物質溶液からなる抗生物質および抗真菌剤のカクテル中でインキュベーションすることによって開始した。この混合物は、以下を含んだ：アマカシン（３４μｇ／ｍｌ）、リンコマイシン（１６０μｇ／ｍｌ）、セフォタキシム（１８１μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（１３６μｇ／ｍｌ）、リファンピン（８２μｇ／ｍｌ）、ダイフルカン（１２０μｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（０．５μｇ／ｍｌ）。インキュベーションは、震蘯インキュベーター中、３７℃で１８時間であった。細胞溶解のため、抗生物質溶液を２５０ｍｌの滅菌水で置き換え、そして震蘯水槽中で、３７℃で４時間、インキュベーションを進行させた。この後、酵素カクテル中、３７℃で１９時間インキュベーションし、細胞小器官を溶解することによって、ここでは曝露されている、核成分を分解した。このカクテルは、塩化マグネシウム（１μｇ／ｍｌ）および塩化カルシウム（３μｇ／ｍｌ）を含み、そしてｐＨ７．６のＴｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩酸（５０μｇ／ｍｌ）を用いて緩衝されている溶液中に、ＤＮアーゼＩ（４７Ｋｕｎｉｔｚ　Ｕ／ｍｌ）およびＲＮアーゼＡ（１Ｋｕｎｉｔｚ　Ｕ／ｍｌ）を含んだ（ＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＡはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄ−５０２５およびＲ−５０００）から得て、そしてどちらも１７μｇ／ｍｌの濃度で用いた）。続いて、組織を、滅菌水中のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００界面活性剤の３．５ｍＭ溶液中に入れ、細胞破片を除去した。このインキュベーションは、震蘯水槽中で、３７℃で２４時間行った。その後、３７℃でそれぞれ３０分間、滅菌水中で４回洗浄することによって、界面活性剤溶液を組織から洗浄した。これらの洗浄後、生じたマトリックスを、血管移植片として用いる前に、パッケージングし、凍結保存し、滅菌し、そして貯蔵所に入れた。
【００２４】
保存のため、組織は、ダルベッコの修飾イーグル培地溶液（ＤＭＥＭ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に１０％ウシ胎児血清を含む滅菌パッケージ中に、パッケージングした。凍結保存は、制御速度フリーザーを用いて行い、１分あたり０．５℃で、−８０℃のパッケージング温度まで低下させた。組織温度が−８０℃に達した際、各パッケージを取り出し、そして長期保存のため、−１９６℃の液体窒素中に入れた。組織の滅菌は、２５−３０ｋＧｙ用量のガンマ線照射を用いて、凍結状態で行った。滅菌後、組織は、使用まで、液体窒素中、−１９６℃で保存した。
【００２５】
移植前に、組織マトリックスを融解し、組織から凍結保護物質溶液を除去した。移植片は、３７−４２℃の温度の水槽中、迅速に４℃に融解した。０．５％マンニトールを含むＤＭＥＭに組織を迅速に移した。マンニトールおよび残渣凍結保護物質は、ＤＭＥＭ中のマンニトール０．５、０．２５および０．０Ｍ溶液での希釈によって除去した。これらの洗浄後、無細胞ウシ導管（すなわち生じた管状組織マトリックス）の移植は、成体雑種犬の左および右頚動脈、並びに左大腿動脈中で、端側（ｅｎｄ−ｔｏ−ｓｉｄｅ）中間物挿入（ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）移植として行った。移植片長は、９および１２ｃｍの間であり、そして移植片の内径は、５および１０ｍｍの間であった。移植は、これらの位置で、血管移植片移植の標準的な外科技術を用いて行った。３２５ｍｇアスピリンおよび７５ｍｇペルサンチンの経口抗凝血措置を、外科処置２日前から開始して、毎日、動物に投与した。
【００２６】
手術後２週および４週で、動脈造影を行い、移植した移植片の開存性を決定した。手術後４週での第二の動脈造影直後に、動物を屠殺し、そして移植片を外植した。外植移植片を、開存性および全体の外観に関して評価し、そして組織学的にさらに検査して、移植片の顕微鏡的完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を決定した。
【００２７】
結果
研究の４週間の期間中、動物は正常に行動し、そして手術後の合併症はなかった。手術後２週および４週で、すべての３つのウシ尿管移植片は、血管造影検査に基づいて、完全に開存性であると測定された。手術後４週で、外植された移植片組織の全体の解析により、手術部位に移植片を安定化する治癒反応があったことが示され、そしてすべての移植片の開存性は、固定のため、移植片をホルマリンに入れる前に、移植片を通じる流れを観察することによって確認した。固定後、組織学的解析のため、各移植片を７つの別個の試料に切断した。移植片の近位端および遠位端両方で、天然動脈から試料を採取した。近位および遠位吻合部位の切片は、各移植片の近位、中間、遠位部分に沿って採取した。プロセシング後、パラフィンに包埋し、そして切片作成した移植片試料は、標準的なヘマトキシリンおよびエオジン染色を用いて染色した。顕微鏡解析は、移植片が構造的に損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ことを明らかにした。ウシ尿管のマトリックスは、手術領域の外縁からの細胞性構成要素の移動を通じて、生き返り始めていた。このリモデリングを通じ、移植片は、天然動脈血運搬導管の外見を獲得していた。
【００２８】
実施例２
イヌにおける末梢血管移植片としての脱細胞化ブタ尿管の移植
方法
ブタ尿管組織は、プロセシングに選択した組織の寸法が、内径３ｍｍおよび長さ２５ｃｍであったことを例外とし、ちょうど実施例１に記載されるように、収集し、そして調製し、そして保存した。処理したブタ尿管の移植は、成体雑種犬において、左および右大腿動脈中で、そして左および右頚動脈中で、端端（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）中間物挿入血管移植として行った。手術２週間後、動脈造影図によって、すべての移植片を検査した。手術４週間後、動物を屠殺し、そして全体検査および組織学的性能評価のため、移植片を外植した。実施例１に記載されるように、組織試料を採取し、そして染色した。
【００２９】
結果
移植２週間後に行った動脈造影は、移植片が開存性であることを示した。外植に際し、全体検査は、移植片が完全に開存性であり、そして天然血管と区別することが困難であることを示した。組織学的評価は、移植片が、部分的に紡錘形細胞で再細胞化されていることを示した。この再細胞化は、おそらく、天然組織から識別不能であろう、完全に機能する血液運搬導管にリモデリングする第一の段階に相当する。
【００３０】
実施例３
イヌにおける末梢血管移植片としての脱細胞化ウシ子宮動脈の移植
方法
ウシ子宮動脈組織は、ちょうど実施例１に記載されるように、収集し、そして調製し、そして保存した。処理したウシ子宮動脈の移植は、成体雑種犬において、頚動脈中で、端側中間物挿入移植として行った。移植４週間後、移植片を外植し、そして組織学的解析のため、採取した。
【００３１】
結果
移植４週間後、移植片は開存性であった。組織像は、これらの移植片が宿主動物由来の細胞を獲得し始めていることを示した。
【００３２】
実施例４
イヌにおける末梢血管移植片としての脱細胞化ウシ胃動脈の移植
方法
ウシ胃動脈組織は、ちょうど実施例１に記載されるように、収集し、そして調製し、そして保存した。処理したウシ子宮動脈の移植は、成体雑種犬において、頚動脈中で、端側中間物挿入移植として行った。移植４週間後、移植片を外植し、そして組織学的解析のため、採取した。
【００３３】
結果
移植４週間後、移植片は開存性であった。組織像は、これらの移植片が宿主動物由来の細胞を獲得し始めていることを示した。
【００３４】
実施例５
脱細胞化ウシ尿管の破裂力特性の測定
方法
ウシ尿管組織の３つの部分を、ちょうど実施例１に記載されるように、収集し、そして調製し、そして保存した。圧縮窒素ガスを用いて、移植片に適用する窒素のヘッド圧を、ゆっくりと増加させることによって、移植片を破裂させるのに必要な圧力を測定した。ガスは、高圧パイプ付属器具およびケーブルタイを用いて、移植片内に含めた。各移植片部分は、２つ組で試験し、そして各移植片に関する平均破裂力を計算した。
【００３５】
結果
３つの移植片は、３３６１、２４５６および２３２７ｍｍＨｇで破裂することが見出され、平均は２７１５ｍｍＨｇであった。この大きさは、バイパス外科処置に一般的に用いられる、ヒトの新鮮な伏在静脈のほぼ１．５倍の破裂力に相当する。
【００３６】
実施例６
脱細胞化ブタ尿管の破裂力特性の測定
方法
ブタ尿管組織の６つの部分を、ちょうど実施例２に記載されるように、収集し、そして調製し、そして保存した。圧縮窒素ガスを用いて、移植片に適用する窒素のヘッド圧を、ゆっくりと増加させることによって、移植片を破裂させるのに必要な圧力を測定した。ガスは、高圧パイプ付属器具およびケーブルタイを用いて、移植片内に含めた。各移植片部分は、２つ組で試験し、そして各移植片に関する平均破裂力を決定した。
【００３７】
結果
６つの移植片は、２０６８、５１７１、６７２２、６７２２、５６８８および３６２０ｍｍＨｇで破裂することが見出され、平均は４９９９ｍｍＨｇであった。この値は、バイパス外科処置に一般的に用いられる、ヒトの新鮮な伏在静脈のほぼ３倍の破裂力に相当する。
【００３８】
実施例７
血管導管細胞での脱細胞化ウシ尿管のｉｎ　ｖｉｔｒｏ再細胞化
方法
ウシ尿管組織の３つの部分を、ちょうど実施例１に記載されるように、収集し、そして調製し、そして保存した。ＤＭＥＭを含み、そして１０％ウシ胎児血清を補った７５ｃｃ組織培養フラスコに、各組織片を入れた。各移植片に内皮細胞または平滑筋細胞を植え付け、細胞が移植片部分内に増殖することを可能にした。培養に、４週間の間、各週２回、新鮮な血清補足ＤＭＥＭを与えた。４週間後、培養系から組織を抽出し、そして組織の組織学的切片形成およびＨ＆Ｅ染色を用いて調べた。
【００３９】
結果
細胞を４週間培養した後、内皮細胞は移植片組織の表面上で増殖するが、内部には増殖しないことを観察した。さらに、平滑筋細胞が移植片表面に接近可能になると、直ちに、移植片表面上でそして移植片材料の壁の中で、該細胞が増殖することを見出した。
【００４０】
実施例８
イヌにおける動脈移植片としての尿管由来の組織移植片
方法
ウシ尿管を用いて、血管組織移植片用の導管マトリックスを提供した。これらの組織は、いくつかの血管適用に適した長さおよび直径で入手可能であり、そして管腔中に弁を含まず、また結紮を必要とする支脈（ｔｒｉｂｕｔａｒｉｅｓ）を持たなかった。尿管は、米国農務省認可屠殺場から得た。組織を生理学的塩溶液中で洗浄し、そして採取２４時間以内に、氷上で、組織調製のため輸送した。尿管はまず、付着する結合組織および脂肪を含まないように切開し、そしてさらなるプロセシングのため、６ｍｍ内径を持つ部分のみを採取した。
【００４１】
最初のプロセシングは、実施例１に記載されるような多数の抗生物質溶液を用いた汚染微生物数の減少からなった。すべての細胞成分の９５％以上の除去を、いくつかの工程で行った。まず、滅菌水中でのインキュベーションは、低張細胞溶解を生じた。その後、生じた組織マトリックスを、緩衝液（ＰＢＳ）中で平衡化し、そしてリボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液で処理した（実施例１を参照されたい）。数日間に渡る等張洗浄で、細胞タンパク質除去を完了した。細胞破片の除去は、組織学的切片のヘマトキシリンおよびエオジン染色を用いて監視した。その後、使用前に、ガンマ線照射（２５ｋＧｙから４０ｋＧｙ）によって、組織マトリックスを滅菌し、そして滅菌性の解析は、各プロセシングバッチに対して行った。
【００４２】
体重５０から６０ｌｂの雑種犬８頭を、チオペンタールナトリウムで麻酔し、気管内挿管し、そしてイソフルランを吸入させた。無菌方式で、腹部を用意し、そして覆った。各イヌで、正中線切開し、そして腎動脈に対して遠位の腹部大動脈を単離した。血管導管は、滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝ダルベッコの修飾イーグル培地１００ｍｌ中で組織マトリックスを洗浄することによって調製し、そして断続プロレン縫合を用いて、近位および遠位、端端吻合を構築するよう、長さおよそ６ｃｍおよび内径６ｍｍの部分を動脈中間物挿入移植片として挿入した。すべての動物に、３２５ｍｇアスピリンおよび７５ｍｇジピリダモールを、ｐ．ｏ．で、手術前２日間、そして手術後１４日間、毎日投与した。
【００４３】
開存性および構造的安定性は、より長い生存動物では手術後６週間ごとに、そして安楽死直前に１度、血管造影検査で観察した。２頭の動物は、手術後３週で、３頭は６週で、そして１頭は１３週で屠殺した。残った２頭の動物は、４３週で最後に評価し、そしていまだ生存中である。屠殺後、近位および遠位吻合を取り込む塊で移植片を除去し、全体的に検査し、そして組織学的解析のためプロセシングした。
【００４４】
採取後、移植片を１０％緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定した。吻合部位に沿った移植片全体、並びに近位および遠位天然動脈を７つの組織部分に分割し、そしてプロセシングのため、パラフィンブロック中に入れた。これらの組織のヘマトキシリンおよびエオジン染色切片を調べ、そして平滑筋α−アクチン（α−ＳＭＡ）、デスミンおよびビメンチン収縮フィラメントの存在を同定するため、特異的抗体を用いて、免疫組織化学的解析を行った。
【００４５】
結果
プロセシング後、ウシ尿管から調製した血管組織移植片は、ウシ細胞成分の９５％以上の除去を示した。残留物は、細胞破片からなり、そして損なわれていない細胞ではなかった。導管移植片が無菌性であり、そして発熱物質レベルが２０内毒素単位未満であることが立証された。イヌ腎臓下大動脈へのこれらの中間挿入移植片の移植は複雑ではなく、そして移植片の取り扱い特性は、通常の血管組織と類似であった。
【００４６】
各イヌに行った動脈造影は、４３週間の移植期間に渡り、移植片が完全に機能し、拡張または狭窄の外見を持たないことを示した。移植３、６および１３週間後の外植移植片すべての全体評価により、完全に開存性の移植片であることが確認された。組織学的検査により、移植片外膜周囲で、内側の再細胞化を伴う治癒反応が示された。管腔表面上の細胞層は、内皮に似ていた。移植片に見られるすべての細胞は、元来の移植片材料が無細胞性であるため、宿主に由来していると仮定された。内側の再細胞化の度合いは、３週でおよそ２０％、６週で３０％、そして１３週で５０％であった。移植片内側の再生（ｒｅｖｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、管腔に向かう外膜領域から生じるようであり、そして再細胞化が進行するにつれ、導管中の血液流に垂直に増殖する細胞の円周構成があった。
【００４７】
吻合部位の解析は、内膜の過形成が最小限であることを示し、そして縫合線で、細胞過増殖が明らかであり、天然動脈から移植片へのスムーズな遷移を生成していた。組織学的に、１３週間後に外植された移植片において、管腔を狭窄させる過形成反応の証拠はなかった。また、移植４３週間後まで、血管造影で、狭窄は観察されなかった。
【００４８】
免疫組織化学染色を用いて、再細胞化移植片に存在する細胞の種類を同定した。平滑筋収縮タンパク質を発現する細胞の比率は、α−ＳＭＡ、デスミンおよびビメンチンに対する抗体を含む染色を用いて立証した。３、６、および１３週で、非常に高い割合の内側細胞が、α−ＳＭＡ陽性であった。ビメンチンもまた、α−ＳＭＡ陽性細胞によって、一般的に発現された。デスミン陽性細胞は、より豊富でなかったが、下位集団に存在した。移植片に存在する細胞の大部分は、これらの収縮タンパク質の少なくとも１つで陽性に染色された。移植前に、移植片導管には損なわれていない細胞が存在しなかったため、α−ＳＭＡ、デスミンおよびビメンチンに関して立証可能な細胞特異的免疫染色はすべて、宿主に由来する細胞上に存在した。
【００４９】
実施例９
イヌにおける動静脈瘻としての尿管由来組織移植片の使用
方法
実施例９に記載されるように調製された、処理ウシ尿管組織移植片導管の９つの部分（２０ｃｍｘ６ｍｍ　ＩＤ）を、６頭の成体イヌの頚動脈（ＣＡ）および頚静脈（ＪＶ）に（ｎ＝５）、または大腿動脈（ＦＡ）および大腿静脈（ＦＶ）に（ｎ＝４）、動静脈移植片として移植した。７頭のイヌの対照群に１１（６ｍｍ　ＩＤ）のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）移植片を与えた（７つはＣＡおよびＪＶに、そして４つはＦＡおよびＦＶに）。すべての移植片は、１４日間成熟させ、そしてその後、２本の１７ゲージ血液透析針で、週１度、偽接触した（ｓｈａｍ−ａｃｃｅｓｓｅｄ）。６ヶ月の期間に渡り、日常的に、開存性を評価し、そして血液を抜き取って、ＣＢＣおよび凝固因子を監視した。２、４、１０および２４週で、外植移植片の下位群で、組織学的解析を行った。
【００５０】
結果
ＰＴＦＥ移植片の２７％（３／１１）が感染したが、本発明にしたがって調製した組織移植片導管のいずれも、研究中、感染しなかった。組織移植片導管の開存性率は、ＰＴＦＥ移植片の７２％に比較し、８６％であった。白血球数は、２および７週で、どちらの群でも上昇しておらず、そして血液凝固因子もまた、変化なかった。移植片の偽刺傷後の止血時間は、組織移植片導管（平均３分間）に比較し、ＰＴＦＥ移植片でより長かった（平均１０分間）。１０週での組織像は、組織移植片導管が、宿主紡錘形細胞を含む中膜の再細胞化と共に、外膜への毛細管内殖によって立証されるような、周囲組織への優れた取り込みを経ていたことを示した。ＰＴＦＥ移植片は、有意な細胞内殖を示さず、そして管腔内皮は存在しなかった。
【００５１】
実施例１０
組織移植片のパッケージングおよび滅菌
パッケージング
組織産物は、リン酸緩衝生理食塩水を含む熱密封透明ポリエステルパウチにパッケージングし、そして滅菌前に、７日間まで、４℃で保存する。
【００５２】
輸送
２”のポリウレタン発泡体で断熱した、あらかじめ冷却した１９”ｘ１４．５”ｘ２２”のボール紙の容器の底に、３つの凍結２ｌｂ冷ゲルブリックを置く。２つのボール紙のセパレーターをこれらの最上部に置く。
【００５３】
３つの冷２ｌｂゲルブリックを添加した後、産物を積載する（１，１００平方インチ）。
多様な温度指標片が存在する２つの充填剤バッグを温度指標として用い、充填剤バッグを試料の中に置く。７日間の機械的温度記録装置もまた、試料の中に置く。
【００５４】
産物を積載した最上部に３つの冷２ｌｂゲルブリックを置き、その後、ボール紙セパレーターおよび３つの凍結２ｌｂゲルブリックを入れる。発泡体プラグをブリックの最後の層の上に置き、そして箱を閉める。
【００５５】
ガンマ線照射によって２５−４０ｋＧｙで滅菌するため、箱を滅菌施設に輸送する。その後、箱を戻し、そして産物を箱から出し、そして使用まで室温で保存する。パッケージングおよび開梱までの総組織時間は、好適には１００時間未満であり、そして温度は、この期間を通じて、２℃から８℃に維持される。
【００５６】
保存
組織移植片は、２年間、室温で保存することが可能である。
上に引用されるすべての文献は、その全体が本明細書に援用される。
【００５７】
当業者は、本開示を読み、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形および詳細の多様な変化を作成することが可能であることを認識するであろう。

Claims (46)

1. 組織移植片を調製する方法であって：
   ｉ）ヒトまたは動物尿管から得た出発組織を、前記出発組織が消毒されるように、汚染微生物数減少剤で洗浄し、
   ｉｉ）組織マトリックスが形成されるように、消毒された前記組織の細胞を溶解する溶液で、工程（ｉ）から生じた消毒された組織を脱細胞化し、そして
   ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた前記組織マトリックスを、組織マトリックスと関連する核酸が分解されるように、ヌクレアーゼと接触させ、そして
   ｉｖ）細胞または細胞外破片が除去され、そして前記組織移植片が得られるように、（ｉｉｉ）から生じた前記組織マトリックスを洗浄する
   ことを含む、前記方法。
2. 前記汚染微生物数減少剤が抗菌剤である、請求項１記載の方法。
3. 抗菌剤が抗生物質を含む、請求項２記載の方法。
4. 前記細胞を溶解する前記溶液が、滅菌水を含む、請求項１記載の方法。
5. 前記細胞を溶解する前記溶液が、水性低張緩衝液または低イオン強度緩衝液を含む、請求項１記載の方法。
6. 前記ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む、請求項１記載の方法。
7. 前記ヌクレアーゼがＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＡを含む、請求項６記載の方法。
8. 工程（ｉｉｉ）が、２０℃から３８℃で、１から３６時間、前記組織マトリックスを前記ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項７記載の方法。
9. 工程（ｉｖ）の後に、前記組織マトリックスを滅菌することをさらに含む、請求項１記載の方法。
10. 前記滅菌が、ガンマ線照射、ヨウ素、過酢酸または電子ビームを用いて達成される、請求項９記載の方法。
11. 前記滅菌が、ガンマ線照射を用いて達成される、請求項１０記載の方法。
12. 前記組織マトリックスが、前記滅菌中、２℃から８℃の間の温度で維持される、請求項１０記載の方法。
13. 工程（ｉｖ）の後に、前記組織マトリックスを凍結保存することをさらに含む、請求項１記載の方法。
14. 請求項１記載の方法によって得ることが可能な、組織移植片。
15. 欠陥組織を有する患者を治療する方法であって、前記欠陥組織を、請求項１記載の方法によって得ることが可能な、未固定脱細胞化組織移植片で置き換えることを含む、前記方法。
16. 前記欠陥組織が管状構造を有する、請求項１５記載の方法。
17. 前記組織移植片が管状構造を有する、請求項１５記載の方法。
18. 前記組織移植片が血管移植片、尿管移植片または神経ガイドである、請求項１７記載の方法。
19. 前記組織移植片がパッチである、請求項１５記載の方法。
20. 前記欠陥組織が皮膚である、請求項１９記載の方法。
21. 組織移植片を調製する方法であって：
    ｉ）ヒトまたは動物供給源から得た出発組織を、前記出発組織が消毒されるように、汚染微生物数減少剤で洗浄し、
    ｉｉ）組織マトリックスが形成されるように、消毒された前記組織の細胞を溶解する溶液で、工程（ｉ）から生じた消毒された組織を脱細胞化し、
    ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から生じた前記組織マトリックスを、前記組織マトリックスと関連する核酸が分解されるように、ヌクレアーゼと接触させ、
    ｉｖ）細胞または細胞外破片が除去され、そして前記組織移植片が得られるように、（ｉｉｉ）から生じた前記組織マトリックスを洗浄し、そして
    ｖ）（ｉｖ）から生じた前記組織マトリックスを、０℃から４０℃の間の温度で、非凍結状態で維持しながら滅菌する
    ことを含む、前記方法。
22. 出発組織が、尿管、静脈、動脈、腱、心臓弁、大腿筋膜、心膜または神経である、請求項２１記載の方法。
23. 前記出発組織が尿管である、請求項２２記載の方法。
24. 前記汚染微生物数減少剤が抗菌剤である、請求項２１記載の方法。
25. 抗菌剤が抗生物質を含む、請求項２４記載の方法。
26. 工程（ｖ）において、前記温度が２℃から８℃の間に維持される、請求項２１記載の方法。
27. 前記細胞を溶解する前記溶液が、滅菌水を含む、請求項２１記載の方法。
28. 前記細胞を溶解する前記溶液が、水性低張緩衝液または低イオン強度緩衝液を含む、請求項２１記載の方法。
29. 前記細胞を溶解する前記溶液が、プロテアーゼ阻害剤を含む、請求項２１記載の方法。
30. 前記ヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む、請求項２１記載の方法。
31. 前記ヌクレアーゼがＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＡを含む、請求項３０記載の方法。
32. 工程（ｉｉｉ）が、２０℃から３８℃で、１から３６時間、前記組織マトリックスを前記ヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項３１記載の方法。
33. 工程（ｉｖ）が、２℃から４２℃で、７日間まで、前記組織マトリックスを洗浄することを含む、請求項２１記載の方法。
34. 前記滅菌が、ガンマ線照射、ヨウ素、過酢酸または電子ビームを用いて達成される、請求項２１記載の方法。
35. 前記滅菌が、ガンマ線照射を用いて達成される、請求項３４記載の方法。
36. 工程（ｉｖ）の後、そして工程（ｖ）の前に、または工程（ｖ）の後に、前記組織マトリックスを凍結保存することをさらに含む、請求項２１記載の方法。
37. 工程（ｖ）の後に、前記組織マトリックスが、移植前、約２５℃に維持される、請求項２１記載の方法。
38. 請求項２１記載の方法によって得ることが可能な、組織移植片。
39. 出発組織が尿管である、請求項３８記載の組織移植片。
40. 欠陥組織を有する患者を治療する方法であって、前記欠陥組織を、請求項２１記載の方法によって得ることが可能な、未固定脱細胞化組織移植片で置き換えることを含む、前記方法。
41. 前記欠陥組織が管状構造を有する、請求項４０記載の方法。
42. 前記欠陥組織が管状構造を有する、請求項４０記載の方法。
43. 前記組織移植片が管状構造を有する、請求項４０記載の方法。
44. 前記組織移植片が血管移植片、尿管移植片または神経ガイドである、請求項４３記載の方法。
45. 前記組織移植片がパッチである、請求項４０記載の方法。
46. 前記欠陥組織が皮膚である、請求項４５記載の方法。