PT1591078E

PT1591078E - Enxerto de tecido

Info

Publication number: PT1591078E
Application number: PT05076303T
Authority: PT
Inventors: Steven Goldstein; Kirby S Black; Jeremy D Ollerenshaw
Original assignee: Cryolife Inc
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2009-10-21
Also published as: NO20023154D0; AU783780B2; NO20023154L; CA2396698A1; ES2329480T3; CY1109458T1; EP1591078A1; US20050191281A1; WO2001054619A1; US7763081B2; US20020128724A1; EP1250109A4; DE60139279D1; DK1591078T3; US20100285587A1; US6866686B2; NO327637B1; AU3307201A; EP1591078B1; CA2396698C

Description

ΕΡ 1 591 078/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Enxerto de tecido" O presente pedido de patente reivindica prioridade do Pedido Provisório 60/178 632, apresentado em 28 de Janeiro de 2000.

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um método de preparação de um material de enxerto de tecido.

ANTERIORIDADE

Em geral, quando usados como um implante corporal, os tecidos biológicos têm um melhor desempenho funcional do que os dispositivos sintéticos equivalentes. Os enxertos de tecido estão presentemente amplamente limitados a tecidos autólogos e de homoenxertos que têm restrições inerentes de fornecimento e preocupações logísticas de colheita, transporte e sorologias. Consequentemente, há uma necessidade de fontes adicionais de enxertos de tecido biológico. Os tecidos animais representam essas fontes. Os tecidos animais podem ser relativamente fáceis de obter em grandes quantidades a partir de matadouros. Antes do uso, contudo, estes tecidos têm que ser tratados para a remoção de proteínas antigénicas que provocam uma resposta de rejeição pelo hospedeiro após a implantação. A remoção de proteínas antigénicas pode ser conseguida pelo processamento do tecido dador de tal maneira que se remova o componente celular do tecido dador. Muitas proteínas antigénicas estão presentes nas membranas celulares. Assim, a remoção de células também remove estas proteínas. Após a descelularização, o tecido pode ser embalado e esterilizado para uso como um enxerto biológico. Os enxertos podem ser implantados em seres humanos e outros animais para reparar, aumentar ou substituir estruturas naturais, sistemas ou dispositivos protéticos existentes. Estes incluem mas não se lhes restringem, o sistema cardiovascular, vascular, urogenital, neurológico, gastrointestinal e ortopédico. Os enxertos também podem ser usados para proporcionar acesso à hemodiálise. 2 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ

Em WO 98/36707 revelam-se enxertos utilizando uréter como material de partida. Em US 5 899 936 descrevem-se métodos para a preparação de enxertos por lavagem, descelularização e repopulação das matrizes.

Um método de processamento de tecido animal pode torná-lo adequado para implantação num hospedeiro humano (ou não humano). O tecido humano pode ser processado para uso como um implante de homoenxerto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de preparação de um material de enxerto de tecido e ao material de enxerto multiuso resultante. A invenção também se refere a um método de utilização do enxerto de tecido como substituição para tecido vascular ou não vascular.

Um aspecto da invenção proporciona um método de preparação de um enxerto de tecido tubular, como enunciado na reivindicação 1.

Os objectos e as vantagens da presente invenção ficarão claros a partir da descrição que se segue.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de preparação de um tecido humano ou animal de maneira a torná-lo adequado para uso em aplicações de enxerto vasculares e não vasculares. O tecido preparado de acordo com o método da presente invenção exibe propriedades físicas e biológicas que o tornam particularmente bem adaptado para aplicações de enxerto de tecido. O tecido adequado para uso na presente invenção pode ser obtido de cadáveres humanos ou de bovino, porcino ou outro animal, por exemplo, sob condições de matadouro. O tecido pode ser transportado até ao ponto da preparação do tecido sob condições necessárias para manter o tecido a uma temperatura desejada. Os tecidos podem ser transportados, por exemplo, imersos numa solução salina fisiológica e na chegada, inspeccionados, lavados, por exemplo, numa solução salina 3 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ fisiológica e limpos (dissecados) isentos de material aderente não desejado, como tecido conjuntivo e gordura. 0 material de enxerto de tecido é um uréter isolado. Contudo, podem ser usados outros tecidos incluindo artérias, veias, tendões, válvulas cardíacas, faseia lata, pericárdio e nervos, mas não se inserem no âmbito da presente invenção.

Após a colheita e a dissecção, o tecido de transplante é vantajosamente, primeiro lavado, por exemplo, com solução salina tamponada com fosfato (PBS), para reduzir a carga biológica microbiana. 0 tecido é então incubado (e.g., a cerca de 37°C durante cerca de 18 horas) numa solução contendo um ou mais agentes antimicrobianos, por exemplo, um antibiótico ou um agente antifúngico, ou mistura destes, para reduzir ainda mais a carga biológica. Os antibióticos preferidos incluem amicacina, lincomicina, cefotaxima, vancomicina, rifampina, diflucan e anfotericina B. Vantajosamente, é usada uma mistura destes antibióticos. 0 tecido pode então ser criopreservado para processamento adicional num momento posterior ou imediatamente sujeito a descelularização. A descelularização é preferivelmente conseguida por incubação do tecido numa solução eficaz para lisar as células nativas no tecido. Vantajosamente, o tecido é incubado (e.g., a cerca de 37°C) em água estéril (por exemplo, durante cerca de 4 horas no caso dos uréteres), contudo podem também ser usados um tampão hipotónico aquoso ou um tampão de baixa força iónica. Se desejado, a solução de descelularização pode incluir outros agentes, como inibidores de protease (e.g., quelantes como o EDTA).

Após a descelularização, a matriz de tecido resultante é tratada com um cocktail de nucleases para degradar o material nuclear. As nucleases que podem ser usadas para a digestão de ARN e ADN de células nativas incluem tanto exonucleases como endonucleases. Outras nucleases são adequadas para uso neste passo do processo e estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, pode ser usado um cocktail compreendendo ADNase I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) e ARNase A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.). 4 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ

Preferivelmente, as nucleases estão presentes numa solução tampão que contém sais de cálcio e de magnésio (e.g., sais de cloreto) . A concentração iónica e o pH da solução tamponada, a temperatura de tratamento e a duração do tratamento são seleccionados para assegurar o nível desejado de actividade nuclease eficaz. No caso de uréteres, o tampão é preferivelmente um tampão Tris a pH 7,6. Preferivelmente, o cocktail de nucleases contém cerca de 0,1 μρ/ιηΐ a 50 μρ/ιηΐ, preferivelmente 17 μρ/ιηΐ, de ADNase I e cerca de 0,1 μρ/πιΐ a 50 μρ/ιηΐ, preferivelmente 17 μρ/πιΐ, de ARNase A. O tratamento com nucleases pode ser efectuado a, por exemplo, cerca de 20°C a cerca de 38°C, preferivelmente a cerca de 37°C, durante cerca de 1 a 36 horas. No caso de uréteres, o tratamento com nucleases durante cerca de 19 horas é geralmente suficiente.

Subsequentemente à descelularização e ao tratamento com nucleases, a matriz de tecido resultante pode ser tratada (lavada) para assegurar a remoção de detritos celulares que podem incluir proteína celular, lípidos celulares e ácido nucleico celular, assim como detritos extracelulares, tais como proteínas extracelulares solúveis, lípidos e proteoglicanos. A remoção de detritos celulares e extracelulares reduz a probabilidade da matriz de tecido de transplante eliciar uma resposta imunológica adversa do receptor sobre o implante. Por exemplo, o tecido pode ser incubado numa solução tampão (e.g., PBS) ou numa solução de detergente como uma solução de Triton x-100 em água. A composição da solução e as condições sob as quais esta é aplicada à matriz de tecido podem ser seleccionadas para diminuir ou eliminar a actividade da nuclease utilizada durante o processamento com nuclease e para remover os detritos celulares. O processo pode incluir a incubação a uma temperatura entre cerca de 2°C e 42°C, preferindo-se 37°C. A matriz de tecido pode ser incubada na solução de detergente por um período até 7 dias, sendo suficiente cerca de 24 horas no caso de uma matriz de uréter. Quando é usado tampão em vez de uma solução de detergente, a matriz de tecido pode ser incubada por um período até 30 dias, sendo suficiente cerca de 14 dias no caso de uma matriz de uréter.

Se usada, a solução de detergente pode ser lavada da matriz de tecido utilizando lavagens múltiplas com uma solução 5 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ aquosa estéril (e.g., água). O número e os tempos óptimos de lavagens podem ser facilmente determinados, contudo, cerca de 4 lavagens de 30 minuto são preferidas no caso de matrizes de uréter.

Após a lavagem, a matriz de tecido pode então ser embalada, esterilizada e/ou armazenada antes da implantação. Vantajosamente, a matriz de tecido embalada é mantida num estado não congelado, preferivelmente a uma temperatura entre 0°C e 40°C, mais preferivelmente, entre 0°C e 20°C, o mais preferivelmente entre 2°C e 8°C até e durante a esterilização utilizando, por exemplo, a abordagem usada no Exemplo 11. Após a esterilização, a matriz de tecido pode ser mantida à temperatura ambiente. Se desejável, a matriz de tecido pode ser criopreservada antes ou após a esterilização para uso posterior. As técnicas de criopreservação de tecido são bem conhecidas na especialidade. Brockbank, K.G.M. Basic

Principies of Viable Tissue Preservation, em: Transplantation Techniques and use of Cryopreserved Allograft Cardiac Valves and Vascular Tissue. D.R. Clarke (ed.), Adams Publishing Group, Ltd., Boston, pp 9-23, discute a criopreservação de tecidos e órgãos e é aqui incorporado como referência.

As matrizes de tecido, quer criopreservadas previamente ou não, podem ser esterilizadas utilizando técnicas de esterilização reconhecidas na especialidade. Vantajosamente, a esterilização é efectuada utilizando irradiação gama numa dose entre lOkGy e lOOkGy, preferivelmente entre 20kGy e 40kGy, mais preferivelmente entre 25kGy e 40kGy. Modos alternativos de esterilização incluem o tratamento com ácido peracético iodado ou feixe de electrões. Após a esterilização, a matriz de tecido pode ser armazenada congelada ou descongelada antes da implantação. Se armazenada criopreservada, por exemplo, em azoto liquido, a matriz de tecido é estável durante pelo menos 5 anos. Antes da utilização de uma matriz de tecido congelada, a matriz é descongelada utilizando um protocolo concebido para eluir soluções crioprotectoras. Por exemplo, a matriz pode ser descongelada rapidamente para 4°C num banho de água a uma temperatura de 37-42°C. A matriz pode ser então rapidamente transferida para um meio de crescimento como o meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, DMEM) contendo manitol (e.g., a cerca de 0,5%). O manitol e os 6 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ crioprotectores residuais podem ser removidos por diluição em série (lavagem) com soluções de manitol 0,5, 0,25 e 0,0M em DMEM. A seguir às lavagens, o tecido está pronto para ser usado. Para tecidos armazenados não congelados, podem ser usados protocolos alternativos de lavagem, por exemplo, lavagem em PBS ou DMEM. Podem ser usados procedimentos de implantação reconhecidos na especialidade e o procedimento seleccionado está dependente da matriz de tecido usada e do local de implantação. A matriz de tecido resultante do processo acima descrito, particularmente uma matriz de uréter, pode ser usada como enxerto de conduta (tubular). Por exemplo, uma matriz de uréter pode ser usada como um enxerto vascular, guia de nervo ou substituição para qualquer estrutura tubular, incluindo um uréter. Quando usada como um enxerto de conduta, o diâmetro do enxerto deve genericamente ser aproximadamente o mesmo que o diâmetro da estrutura nativa. Os enxertos resultantes do processo acima descrito demonstram caracteristicas favoráveis como enxertos de acesso a hemodiálise.

Para uso noutras aplicações de enxerto, uma matriz de tecido de uréter resultante do processo acima pode ser cortada longitudinalmente e desenrolada para formar uma peça de tecido. O procedimento completo de descelularização/tratamento com nuclease acima descrito pode ser realizado em peças de tecido (e.g., tecido de uréter) preparadas cortando o segmento longitudinalmente e desenrolando-o para formar uma peça de pré-enxerto. As peças de enxerto preparadas podem ser utilizadas, por exemplo, como um material de enxertos de pele ou para reparação de outros defeitos de tecidos corporais prestando-se eles próprios a aplicação cirúrgica de uma peça de tecido de enxerto tendo as caracteristicas funcionais e físicas da presente composição de enxerto.

Uma matriz de tecido pode actuar como um suporte para repopulação espontânea por células hospedeiras in vivo conduzindo à reconstrução e estabilização do tecido. O resultado é uma construção viável, não imunogénica, completamente funcional, contendo células autólogas que expressam proteínas contrácteis. A melhor taxa de patência e ausência de infecção observadas nos presentes enxertos podem 7 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ ser atribuíveis à incorporação, recelularização e remodelação precoces da matriz com células hospedeiras.

Certos aspectos da presente invenção são descritos em maior detalhe nos Exemplos não restritivos que se seguem. EXEMPLO 1

Implantação de Uréter Bovino Descelularizado como um Enxerto Vascular Periférico no Cão Métodos

Foram recolhidos uréteres frescos de bovino de matadouros nas 2 horas seguintes à morte e enviados para as instalações de processamento a 4°C numa solução salina de fosfato tamponada (PBS) para prevenir a degradação do tecido em trânsito. Após a recepção do tecido, foi feita uma inspecção superficial ao tecido e foram seleccionados para processamento uréteres de 4mm de diâmetro exterior e 30 a 40 cm de comprimento. Os uréteres seleccionados foram dissecados utilizando instrumentos estéreis para a remoção de material aderente não desejado como tecido conjuntivo e gordura. Os uréteres foram então colocados em recipientes de polipropileno de 300ml de capacidade e lavados quatro vezes com 250ml de PBS estéril para reduzir a carga biológica microbiana. Os uréteres passaram então por passos para a remoção do tecido celular e do conteúdo em antigénios. A descelularização foi iniciada por incubação num cocktail de antibióticos e agentes antimicóticos que consistia numa solução de antibióticos. Esta mistura continha o seguinte: amicacina (34 μg/ml), lincomicina (160 μg/ml), cefotaxima (181 μg/ml), vancomicina (136 μg/ml), rifampina (82 μρ/ιηΐ), Diflucan (120 μρ/ιηΐ) e anfotericina B (0,5 μρ/ιηΐ) . Incubou-se durante 18 horas numa incubadora com agitação a 37°C. Para a lise celular, a solução de antibiótico foi substituída por 250 ml de água estéril e permitiu-se que a incubação prosseguisse durante 4 horas num banho de água com agitação a 37°C. Seguiu-se a incubação num cocktail enzimático durante 19 horas a 37°C para degradar o material nuclear agora exposto por lise dos organelos celulares. Este cocktail continha ADNase I (47 U Kunitz/ml) e ARNase A (1 U Kunitz/ml) 8 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ numa solução contendo cloreto de magnésio (1 μg/ml) e cloreto de cálcio (3 μg/ml) e tamponada utilizando cloridrato de Tris(hidroximetil)aminometano (50 μg/ml) a pH 7,6. (A ADNase I e a ARNase A foram obtidas de Sigma Chemical Company (D-5025 e R-5000) e foram ambas usadas a uma concentração de 17 μρ/ιηΐ) . Subsequentemente, o tecido foi colocado numa solução de detergente Triton X-100 a 3,5 mM em água estéril para a remoção de detritos celulares. Esta incubação foi realizada durante 24 horas a 37°C num banho de água com agitação. A solução de detergente foi então lavada do tecido por quatro lavagens com água estéril a 37°C cada uma com a duração de 30 minutos. Após estas lavagens, a matriz resultante foi embalada, criopreservada, esterilizada e colocada em armazenamento antes de ser usada como um enxerto vascular.

Para a preservação, o tecido foi embalado em embalagens esterilizadas contendo solução de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 % com soro bovino fetal a 10 %. A criopreservação foi realizada utilizando um tanque de criopreservação com descida de temperatura a velocidade controlada. Para reduzir a temperatura da embalagem para -80°C a 0,5°C por minuto. Quando a temperatura do tecido atingiu -80°C cada embalagem foi removida e colocada em azoto liquido a -196°C para armazenamento de longo termo. A esterilização do tecido foi realizada no estado congelado utilizando uma dose de 25-30 kGy de radiação gama. A seguir à esterilização, o tecido foi armazenado a -196°C em azoto liquido até ser usado.

Antes da implantação, a matriz de tecido foi descongelada para remover a solução crioprotectora do tecido. Os enxertos foram descongelados rapidamente para 4°C num banho de água a uma temperatura de 37-42°C. O tecido foi rapidamente transferido para DMEM contendo 0,5% de manitol. O manitol e os crioprotectores residuais foram removidos por diluição com soluções de manitol em DMEM 0,5, 0,25 e 0,0 Μ. A seguir a estas lavagens, a implantação de conduta de bovino acelular (isto é, da matriz de tecido tubular resultante) foi realizada na forma de um enxerto interposicional término-lateral nas artérias carótidas esquerda e direita e femoral esquerda de um cão adulto sem raça definida. Os comprimentos dos enxertos estavam entre 9 e 12 cm e o diâmetro interno dos enxertos 9 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ estava entre 5 e 10 mm. A implantação foi feita utilizando técnicas cirúrgicas padronizadas para implantação de enxertos vasculares nestas posições. Foi administrado diariamente ao animal um regime de anticoagulantes orais de 325 mg de Aspirina e 75 mg de Persantin com inicio dois dias antes do procedimento cirúrgico.

Duas semanas e quatro semanas após a cirurgia, foram realizados arteriogramas para determinar a patência dos enxertos implantados. O animal foi sacrificado e os enxertos imediatamente explantados a seguir ao segundo arteriograma, quatro semanas após a cirurgia. Os enxertos explantados foram avaliados relativamente à patência e à aparência superficial e ainda examinados histologicamente para determinar a integridade microscópica do enxerto.

Resultados

Durante as quatro semanas de duração do estudo, o animal comportou-se normalmente e não houve complicações a seguir à cirurgia. A duas semanas e a quatro semanas após a cirurgia, determinou-se no exame angiográfico que os três enxertos de uréter bovino estavam completamente desobstruídos. A quatro semanas após cirurgia, a análise superficial do tecido de enxerto explantado indicou ter havido uma resposta de cura que tinha estabilizado o enxerto no local da cirurgia e a patência de todos os enxertos foi confirmada pela observação do fluxo através do enxerto antes de colocar os enxertos em formalina para fixação. Após a fixação, cada enxerto foi cortado em sete amostras separadas para análise histológica. As amostras foram tomadas a partir da artéria nativa, em ambas as extremidades proximal e distai longe do enxerto. Secções dos locais de anastomose proximal e distai foram tomadas juntamente com a porção proximal, média e distai de cada enxerto. A seguir ao processamento, inclusão em parafina e seccionamento, as amostras de enxerto foram coradas utilizando um corante padronizado de hematoxilina e eosina. A análise microscópica revelou enxertos estruturalmente intactos. A matriz de uréter de bovino tinha começado a ficar revitalizada através do movimento de componentes celulares a partir dos extremos exteriores da área cirúrgica. Através desta remodelação os enxertos foram tomando a aparência de condutas naturais transportadoras de sangue arterial. 10 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ EXEMPLO 2

Implantação de Uréter Porcino Descelularizado como Enxerto Vascular Periférico no Cão Métodos O tecido de uréter porcino foi recolhido, preparado e preservado exactamente como descrito no Exemplo 1 com a excepção de que as dimensões dos tecidos seleccionados para processamento foram de 3 mm em diâmetro interno e 25 cm em comprimento. A implantação de uréteres tratados de porcino foi feita num cão adulto sem raça definida na forma de um enxerto vascular interposicional término-terminal nas artérias femorais esquerda e direita e nas artérias carótidas esquerda e direita. Todos os enxertos foram examinados por arteriograma duas semanas após a cirurgia. O animal foi sacrificado quatro semanas após a cirurgia e os enxertos foram explantados para exame superficial e avaliação histológica de desempenho. As amostras histológicas foram tomadas e coradas como descrito no Exemplo 1.

Resultados

Os arteriogramas realizados duas semanas após a implantação mostraram que os enxertos estavam desobstruídos. Após explante, o exame superficial indicou que os enxertos estavam completamente desobstruídos e eram difíceis de distinguir do vaso sanguíneo nativo. Os exames histológicos mostraram que os enxertos se tornaram parcialmente recelularizados com células fusiformes. Esta recelularização provavelmente representa os primeiros estágios de remodelação para uma conduta transportadora de sangue completamente funcional que seria indiscernível do tecido nativo. 11 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ EXEMPLO COMPARATIVO 3

Implantação de Artéria Uterina Bovina Descelularizada como Enxerto Vascular Periférico no Cão Métodos 0 tecido da artéria uterina de bovino foi recolhido, preparado e preservado exactamente como descrito no Exemplo 1. A implantação de artéria uterina de bovino tratada foi feita num cão adulto sem raça definida na forma de um enxerto interposicional término-lateral na artéria carótida. Após 4 semanas de implantação, os enxertos foram explantados e tomados para análise histológica.

Resultados

Quatro semanas após a implantação, os enxertos estavam desobstruídos. A histologia indicou que estes enxertos tinham começado a tomar células do animal hospedeiro. EXEMPLO COMPARATIVO 4

Implantação de Artéria Gástrica Bovina Descelularizada como Enxerto Vascular Periférico no Cão Métodos O tecido da artéria gástrica de bovino foi recolhido, preparado e preservado exactamente como descrito no Exemplo 1. A implantação da artéria uterina de bovino tratada foi feita num cão adulto sem raça definida na forma de um enxerto interposicional término-lateral na artéria carótida. Após 4 semanas de implantação, os enxertos foram explantados e tomados para análise histológica.

Resultados

Quatro semanas após a implantação, os enxertos estavam desobstruídos. A histologia indicou que estes enxertos tinham começado a tomar células do animal hospedeiro. 12 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ EXEMPLO 5

Determinação de Características de Resistência ao Rebentamento de Uréter bovino Descelularizado Métodos

Três segmentos de tecido de uréter bovino foram recolhidos, preparados e preservados exactamente como descrito no Exemplo 1. Utilizando azoto gasoso comprimido, foi determinada a pressão requerida para rebentar o enxerto aumentando lentamente a pressão de carga de azoto aplicada ao enxerto. 0 gás foi mantido no enxerto utilizando acessórios para tubos e braçadeiras de alta pressão padronizados. Cada segmento de enxerto foi testado em duplicado e foi calculada a resistência média ao rebentamento para cada enxerto.

Resultados

Os três enxertos rebentaram a 448, 327 e 310 kPa (3361, 2456 e 2327 mm Hg), sendo a média de 361 kPa (2715 mm Hg). Esta grandeza representa uma resistência ao rebentamento de cerca de 1,5 vezes a da veia safena fresca humana que é normalmente usada em procedimentos cirúrgicos de bypass. EXEMPLO 6

Determinação de Características de Resistência ao rebentamento de Uréter de Porcino Descelularizado Métodos

Seis segmentos de tecido de uréter porcino foram recolhidos, preparados e preservados exactamente como descrito no Exemplo 2. Utilizando azoto gasoso comprimido, foi determinada a pressão requerida para rebentar o enxerto aumentando lentamente a pressão de carga de azoto aplicada ao enxerto. O gás foi mantido no enxerto utilizando acessórios para tubos e braçadeiras de alta pressão padronizados. Cada segmento de enxerto foi testado em duplicado e foi determinada a resistência média ao rebentamento para cada enxerto.

Resultados

Os seis enxertos rebentaram a 275, 689, 896, 816, 758, e 483 kPa (2068, 5171, 6722, 6722, 5688 e 3520 mm Hg), sendo a 13 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ média de 666 kPa (4999 mm Hg). Este valor representa uma resistência ao rebentamento de quase 3 vezes a da veia safena fresca humana, que é normalmente usada em procedimentos cirúrgicos de bypass. EXEMPLO COMPARATIVO 7

Recelularização In Vitro de Uréter bovino Descelularizado com Células de Conduta Vascular Métodos

Três segmentos de tecido de uréter bovino foram recolhidos, preparados e preservados exactamente como descrito no Exemplo 1. Cada pedaço de tecido foi colocado num balão de cultura de tecido de 75 cc contendo DMEM e suplementado com soro bovino fetal a 10%. Cada enxerto foi semeado com células endoteliais ou células do músculo liso para permitir o crescimento celular nos segmentos de enxerto. As culturas foram alimentadas utilizando DMEM fresco suplementado com soro duas vezes em cada semana durante 4 semanas. Após 4 semanas, os tecidos foram extraídos do sistema de cultura e examinados utilizando seccionamento histológico do tecido e coloração H&E.

Resultados

Após quatro semanas de cultura celular, as células endoteliais foram observadas a crescer na superfície do tecido de enxerto mas não internamente. Em adição, as células do músculo liso cresceram na superfície dos enxertos e na parede do material de enxerto assim que conseguiam ter acesso na superfície do enxerto. EXEMPLO 8

Enxerto de Tecido Derivado de Uréter como Enxerto Aórtico no Cão Métodos

Foram usados uréteres de bovino para proporcionar a matriz de condutas para o enxerto de tecido vascular. Estes tecidos estão disponíveis em comprimentos e diâmetros adequados para várias aplicações vasculares e não contêm válvulas no lúmen nem possuem tributárias que requeiram 14 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ ligação. Os uréteres foram obtidos de matadouros aprovados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. Os tecidos foram lavados com solução salina fisiológica e transportados em gelo nas 24 horas seguintes à colheita para a preparação do tecido. Os uréteres foram primeiro dissecados isentos de tecido conjuntivo aderente e gordura e apenas foram levados para processamento adicional os segmentos com um diâmetro interno de 6 mm. 0 processamento inicial consistiu na redução de carga biológica utilizando uma solução de antibióticos múltiplos como descrito no Exemplo 1. A remoção de mais de 95% de todo o material celular foi conseguida em vários passos. Primeiro, a incubação em água estéril produziu lise celular hipotónica. A matriz de tecido resultante foi então equilibrada em tampão (PBS) e tratada com uma solução contendo ribonuclease e desoxirribonuclease (veja-se o Exemplo 1) . Uma lavagem isotónica de vários dias completou a remoção da proteína celular. A remoção de detritos celulares foi monitorizada utilizando coloração de secções histológicas com hematoxilina e eosina. As matrizes de tecido foram então esterilizadas por irradiação gama (25 kGy a 40 kGy) antes do uso e foi realizada a análise de esterilidade em cada lote de processamento.

Oito cães sem raça definida, pesando 22,6-27,2 kg (50 a 60 lb) foram anestesiados com tiopental sódico, intubados endotraquealmente e colocados em isoflurano para inalação. Os abdómens foram preparados e envoltos de modo estéril. Foi feita uma incisão mediana e foi isolada a aorta abdominal distai até às artérias renais em cada cão. As condutas vasculares foram preparadas por lavagem da matriz de tecido em 100 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco tamponado com hepes estéril e um segmento de aproximadamente 6 cm de comprimento e 6 mm de diâmetro interno foi inserido como enxerto de interposição aórtica utilizando suturas de prolene interrompidas para construir anastomoses distai e proximal término-terminal. Todos os animais receberam 325 mg de aspirina e 75 mg de dipiridamol p.o. diariamente durante 2 dias antes e durante 14 dias a seguir à cirurgia. A patência e a estabilidade estrutural foram observadas com exame angiográfico a seguir à cirurgia a cada 6 semanas 15 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ nos mais sobreviventes e uma vez imediatamente antes da eutanásia. Foram sacrificados dois animais às 3 semanas, 3 às 6 semanas e 1 animal às 13 semanas após a cirurgia. Os 2 animais restantes foram avaliados pela última vez passadas 43 semanas e ainda estão vivos. Após o sacrificio, os enxertos foram removidos em bloco incorporando anastomoses distais e proximais, inspeccionados superficialmente e processados para análise histológica. A seguir à colheita, os enxertos foram fixados em solução tamponada de formaldeído a 10%. O conjunto do enxerto com os locais anastomóticos e a aorta nativa proximal e distai foi dividido em 7 segmentos de tecido e colocado em blocos de parafina para processamento. Foram examinadas secções destes tecidos coradas com hematoxilina e eosina e foi realizada a análise imuno-histoquímica utilizando antibióticos específicos para identificar a presença de filamentos contrácteis de a-actina (a-SMA), desmina e vimentina do músculo liso.

Resultados

Após o processamento, os enxertos de tecido vascular preparados a partir de uréter bovino apresentaram remoção de mais do que 95% de material celular de bovino. O restante consistia em detritos celulares e células não intactas. Foram demonstrados esterilidade do enxerto de conduta e níveis de pirogénios abaixo de 20 unidades de endotoxina. A implantação destes enxertos de interposição na aorta infra-renal canina não foi complicada e as propriedades de manuseamento dos enxertos foram similares às do tecido vascular normal.

Os arteriogramas realizados em cada um dos cães indicaram que os enxertos estavam completamente funcionais durante o período da semana 43 do implante, sem aparecimento de dilatação ou estenose. A avaliação superficial de todos os enxertos explantados após 3, 6 e 13 semanas de implantação confirmou enxertos completamente desobstruídos. O exame histológico mostrou uma resposta curativa em redor da adventícia do enxerto com recelularização do meio. Uma camada de células na superfície lumenal assemelhava-se a endotélio. Presumiu-se que todas as células encontradas no enxerto tenham sido originadas pelo hospedeiro porque o material de enxerto original era acelular. A extensão da recelularização mediana 16 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ foi aproximadamente 20% a 3 semanas, 30% a 6 semanas e 50% a 13 semanas. A revitalização do meio de enxerto parece ter ocorrido a partir da área adventicial em direcção ao lúmen e, à medida que as recelularizações progrediram, houve organização circunferencial de células com crescimento perpendicular ao fluxo de sangue na conduta. A análise de locais anastomóticos mostrou que a hiperplasia da intima era mínima e era evidente sobrecrescimento celular na linha de sutura criando uma transição lisa da aorta nativa para o enxerto.

Histologicamente, não houve evidência de reacção hiperplástica estreitando o lúmen no enxerto explantado após 13 semanas. Angiograficamente também não foi observado estreitamento até 43 semanas após a implantação.

Foi usada coloração imuno-histoquímica para identificar o tipo de células presentes nos enxertos recelularizados. A proporção de células expressando proteínas contrácteis do músculo liso foi demonstrada utilizando manchas contendo anticorpos para α-SMA, desmina e vimentina. Uma percentagem muito grande de células medianas foi positiva para oc-SMA a 3, 6 e 13 semanas. A vimentina foi também normalmente expressa por células positivas para α-SMA. As células positivas para a desmina eram menos abundantes, mas estavam presentes numa subpopulação. A maioria das células presentes nos enxertos coraram positivamente para pelo menos uma destas proteínas contrácteis. Como não estavam presentes células intactas nas condutas do enxerto antes do implante, toda a imunocoloração específica das células demonstrável para α-SMA, desmina e vimentina estava presente em células que tinham sido originadas pelo hospedeiro. EXEMPLO 9

Uso de Enxerto de Tecido Derivado de Uréter como Fístula Arteriovenosa no Cão Métodos

Foram implantados nove segmentos de conduta de enxerto de tecido de uréter bovino tratado, preparados como descrito no Exemplo 9, na forma de enxertos arteriovenosos 17 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ (20 cm χ 6 mm ID) na artéria carótida (AC) e na veia jugular (VJ) (n=5), ou na artéria femoral (AF) e veia femoral (VF) (n=4) em 6 cães adultos. Um grupo de controlo de 7 cães recebeu 11 enxertos (6 mm ID) de politetrafluoroetileno (PTFE) (7 na AC e vj, e 4 na AF e VF) . Todos os enxertos foram maturados durante 14 dias e então foram acedidos simuladamente uma vez por semana com duas agulhas de hemodiálise de calibre 17. Rotineiramente, durante um período de 6 meses, foi avaliada a patência e foi retirado sangue para monitorizar CBC e os factores de coagulação. A análise histológica foi realizada num subgrupo de enxertos explantados a 2, 4, 10 e 24 semanas.

Resultados 27% (3/11) dos enxertos de PTFE infectaram, enquanto nenhuma das condutas de enxertos de tecido preparadas de acordo com a presente invenção infectaram durante o estudo. A taxa de patência da conduta de enxerto de tecido foi de 86% comparada com 72% para os enxertos de PTFE. A contagem de glóbulos brancos não se elevou em cada grupo a 2 e 7 semanas e os factores de coagulação do sangue também se mantiveram inalterados. Os tempos de hemostasia após a ligação simulada dos enxertos foram maiores (média de 10 minutos) nos enxertos de PTFE comparado com as condutas de enxerto de tecido (média de 3 minutos) . A histologia a 10 semanas mostrou que as condutas de enxerto de tecido sofreram recelularização do meio da túnica com células fusiformes do hospedeiro assim como excelente incorporação nos tecidos circundantes como evidenciado pelo crescimento interno capilar na túnica adventícia. Os enxertos de PTFE não mostraram crescimento interno celular significativo e mostraram uma ausência de endotélio lumenal. EXEMPLO 10

Embalagem e Esterilização de Enxerto de Tecido Embalagem O produto de tecido é embalado em bolsas de poliéster transparentes seladas pelo calor contendo solução salina tamponada de fosfato e armazenado a 4o centígrados por um período até 7 dias antes da esterilização. 18 ΕΡ 1 591 078/ΡΤ

Expedição São colocados três tijolos de gel frio congelados de 0,9 kg (2 lb) no fundo de um recipiente de cartão pré-refrigerado (48x37x56cm) (19"xl4,5"x22") isolado com 2" de espuma de poliuretano. São-lhes colocados em cima dois separadores de cartão.

Adicionam-se três tijolos de gel frio de 0,9 kg (2 lb) seguidos pela carga de 18 litros (1100 polegadas cúbicas) de produto. São usados dois sacos de enchimento como indicadores de temperatura nos quais estão presentes várias tiras indicadoras de temperatura, os sacos de enchimento são colocados entre as amostras. É também colocado entre as amostras um registador mecânico de temperatura de sete dias. São colocados três tijolos de gel frio de 0,9 kg (2 lb) no topo da carga de produto seguidos por um separador de cartão e três tijolos congelados de gel de 0,9 kg (2 lb) . É colocado um tampão de espuma no topo da última camada de tijolos e a caixa é fechada. A caixa é enviada para as instalações de esterilização para esterilização por irradiação gama a 25-40 kGy. A caixa é então devolvida e o produto é desembalado e armazenado à temperatura ambiente até ser usado. O tempo total entre embalar e desembalar o tecido é vantajosamente menor do que 100 horas e a temperatura é mantida por todo este período a 2 °C-8 °C.

Arma z enament o O enxerto de tecido pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 2 anos.

Lisboa, 2009-10-14

Claims

ΕΡ 1 591 078/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de um enxerto de tecido tubular que consiste em: i) lavar um tecido de partida, que é um uréter humano ou animal, com pelo menos um agente de redução de carga biológica de modo a que o tecido de partida referido seja desinfectado, 11) descelularizar o tecido desinfectado resultante do passo (i) com uma solução que lisa as células do referido tecido desinfectado de modo a formar-se uma matriz de tecido, iii) contactar a referida matriz de tecido resultante do passo (ii) com uma nuclease de modo a que o ácido nucleico associado à referida matriz de tecido seja degradado, iv) lavar a referida matriz de tecido resultante de (iii) de modo a que sejam removidos os detritos celulares ou extracelulares e seja obtido o referido enxerto de tecido e, opcionalmente criopreservar e/ou esterilizar a referida matriz de tecido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o referido pelo menos um agente de redução de carga biológica compreende um agente antimicrobiano.
3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que o agente antimicrobiano compreende um antibiótico.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a referida solução que lisa as células referidas compreende água estéril.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a referida solução que lisa as células referidas compreende um tampão hipotónico aquoso ou um tampão de baixa força iónica.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a referida solução que lisa as células referidas compreende um inibidor de protease. ΕΡ 1 591 078/ΡΤ 2/4
7. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a referida nuclease compreende uma exonuclease e/ou uma endonuclease.
8. Método de acordo com a reivindicação 7 em que a referida nuclease compreende desoxirribonuclease I (ADNase I) e ribonuclease A (ARNase A).
9. Método de acordo com a reivindicação 8 em que 0 passo (iii) compreende o contacto da referida matriz de tecido com a referida nuclease a uma temperatura de 20 a 38°C durante 1 a 36 horas.
10. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o passo (iv) compreende a lavagem da referida matriz de tecido a uma temperatura de 2 a 42°C.
11. Método de acordo com a reivindicação 1 que consiste ainda em, após o passo (iv), esterilizar a referida matriz de tecido.
12. Método de acordo com a reivindicação 11 em que a referida matriz de tecido é mantida num estado não congelado a uma temperatura entre 0°C e 40°C.
13. Método de acordo com a reivindicação 11 em que a referida matriz de tecido é mantida a cerca de 25°C antes da implantação.
14. Método de acordo com a reivindicação 11 em que a referida esterilização é efectuada utilizando irradiação gama, iodo, ácido peracético ou feixe de electrões.
15. Método de acordo com a reivindicação 14 em que a referida esterilização é efectuada utilizando irradiação gama.
16. Método de acordo com a reivindicação 14 em que a referida matriz de tecido é mantida a uma temperatura entre 2°C e 8°C durante a referida esterilização.
17. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a referida matriz de tecido é criopreservada. ΕΡ 1 591 078/ΡΤ 3/4
18. Enxerto de tecido produzido por um método que consiste nos passos de: i) lavagem de um tecido de partida, que é um uréter humano ou animal, com pelo menos um agente de redução de carga biológica de modo a que o tecido de partida referido seja desinfectado, ii) descelularização do tecido desinfectado resultante do passo (i) com água estéril ou um tampão hipotónico aquoso que lisa as células do referido tecido desinfectado de modo a formar-se uma matriz de tecido descelularizada, iii) contacto da referida matriz de tecido descelularizada resultante do passo (ii) com pelo menos uma nuclease de modo a que o ácido nucleico associado à referida matriz descelularizada seja degradado, iv) lavagem da referida matriz de tecido descelularizada tratada com nuclease, resultante de (iii) de modo a que sejam removidos os detritos celulares ou extracelulares e seja produzido o referido enxerto e, opcionalmente, criopreservação e/ou esterilização do referido enxerto.
19. Enxerto de tecido de acordo com a reivindicação 18, que é um enxerto arteriovenoso descelularizado não fixo.
20. Enxerto arteriovenoso de acordo com a reivindicação 19 em que o referido tecido de partida é um uréter bovino.
21. Enxerto de tecido de acordo com as reivindicações 18-20 adequado para uso onde o tecido defeituoso do paciente tenha uma estrutura tubular.
22. Enxerto de tecido de acordo com a reivindicação 21 em que o referido enxerto de tecido é um enxerto vascular, um enxerto de uréter ou um guia de nervo.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4, 5, 8, 11 e 17, em que o referido enxerto de tecido tubular é um enxerto arteriovenoso.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o referido tecido de partida é um uréter de bovino. ΕΡ 1 591 078/ΡΤ 4/4
25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24 em que a referida nuclease é seleccionada do grupo que consiste em ADNase I e ARNase A.
26. Enxerto arteriovenoso de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindicação 20 em que pelo menos uma nuclease referida é seleccionada do grupo que consiste em ADNase I e ARNase A.
27. Enxerto arteriovenoso de acordo com a reivindicação 26 em que a referida pelo menos uma nuclease é ADNase I e ARNase A. Lisboa, 2009-10-14