NO316228B1 - Kjemiluminescerende sammensetning, testkit og fremgangsmåte for deteksjon av forskjellige analytter - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en kjemiluminescerende sammensetning, testkit og fremgangsmåte for detektering av forskjellige analyter ved anvendelse av et substituert acetanilid som eneste lysgenererende reagens.

Det er velkjent å utføre en kvantitativ eller kvalitativ analyse av en vandig væske ved å anbringe denne væsken i kontakt med en kombinasjon av reagenser som kan gi et detekterbart produkt i forhold til konsentrasjonen av analyten i væsken En nyttig analysetype anvender enzymatiske reaksjoner hvorved analyten, ved kontakt med de passende reagensene, reagerer med oksygen i nærvær av et egnet enzym til dannelse av hydrogenperoksyd i forhold til analytkonsentrasjonen. Et detekterbart produkt blir deretter frembragt av reaksjonen av hydrogenperoksyd i forhold til analytkonsentrasjonen i testvæsken. Peroksidase blir vanligvis benyttet i slike analyser

I andre analyser reageres en peroksidase i nærvær av hydrogenperoksid som har blitt tilsatt til systemet for å måle mengden av en spesiell analyt Analyter slik som glukose, triglycerider, urinsyre, kolesterol og kreatinkinase kan detekteres på denne måten samt spesifikke bindmgs-ligander i spesifikke bindingsanalyser hvor peroksidasen benyttes som en detekterbar merking ("label"). Slike bestemmelser kan utføres i oppløsning, tørre analytiske analyser eller diagnostiske testanordmnger Signalene som frembringes i slike analyser kan være et kolorimetnsk, kjemiluminiserende eller fluoreserende signal som benytter velkjente signalutviklende eller -genererende reagenser

Det finnes flere hovedtyper av luminescerende elle^n^lumino-metriske analyser som frembringer en lysemissjon som et resultat av tilstedeværelsen av analyten som er av interesse. Disse analysene er også kjent som kjemiluminescerende analyser og er beskrevet for eksempel i US-A-4 729 950 (Kricka et al) og publikasjoner som er angitt den. Forskjellige aromatiske aminer og fenoler, slik som p-iodfenol, anses som nyttige for å forøke eller forsterke lysfrem-bringelsen i slike analyser (kfr også US-A-4.598.044 til Kricka et al) Et foretrukket forsterkningsmiddel i kolori-metriske analyser har vært 4' -hydroksyacetani1id, som er beskrevet i US-A-4 828 983 (McClune)

Selv om de forsterkede kjemiluminescerende systemene gir tilstrekkelig lyssignal for immunoanalyser har reagensformuleringen visse ulemper Den optimale pH-verdien for lysemissjon ved anvendelse av luminol er 8,5. Den optimale pH-verdien for pepperrotperoksidaseaktivitet er imidlertid lavere (6 til 7) På grunn av høy ikke-enzymatisk oksidasjon av luminol blir bakgrunnen høy og sensitiviteten reduseres ved lave enzymkonsentrasjoner Ved den høyere pH-verdien har dessuten reagensformuleringen redusert holdbarhet (oksidant instabilitet og oksidasjon av luminol). Behovet for nøyaktig regulering av aktiviteten til flere reagenser i formuleringen representerer betydelige produksjons- og lagringsproblemer

En forbedring i sensitivitet ble oppnådd ved bruk av kationiske miceller med 4'-hydroksyacetanilid som et forsterkningsmiddel, som beskrevet i US-A-5 279 940 (Kissel) Flesteparten av problemene som er omtalt ovenfor er imidlertid fremdeles til stede selv etter dette fremskrittet innen teknikken

Litteraturen beskriver en rekke peroksidasebaserte reagens-systemer som produserer lysemissjon uten den formålstjenelige tilsetning av en kjent lumifor slik som luminol, lucigenm, akrldmiumestere eller dioksetaner Det er for eksempel kjent at pyrogallol (1,2,3-trlhydroksybenzen ) er et substrat for lysgenerermg ved pH 7. Den rapporterte sensitiviteten er imidlertid temmelig dårlig (0,1 nmolar deteksjonsgrense) og substratet er betydelig ustabilt overfor autooksidasjon. Forskjellige forsterkere, slik som o-fenylendiamin, er kjent for å forbedre sensitivitet, men deres anvendelse krever håndtering av en mer kompleks og ustabil reagensformulerlng, akkurat som i tilfellet med luminol

Det har derfor blitt foretatt forsøk på å benytte konvensjonelle fluorescerende eller fosforescerende fargestoffer slik som kjemiluminescerende signalgenerende substrater for peroksidase. Eosm Y har for eksempel blitt benyttet med peroksid ved pH 6.5 for å kontrollere peroksidasenlvåer ned til molarkonsentrasjoner Dette kan imidlertid bare gjøres ved tilsetning av peroksidet til blandingen av fargestoff og peroksidase og når dette er gjort blir bakgrunnen for høy og senstiviteten temmelig lav

Pepperrotperoksidasekatalysert oksidasjon av ketoner og aldehyder slik som aceton og propanal kan utvikle lysemissjon med visse fluorescerende fargestoffer. Lav "turnover"-verdi og substratustabilitet gjør imidlertid slike systemer upraktiske for kommersialisering.

Det har blitt observert at lys kan utvikles når peroksidasen anvendes som en oksidase, slik som med NADH, dihydroksy-fumarat eller luciferin som substrater Disse systemene har også sine problemer, spesielt dårlig sensitivitet, behov for oksygen i systemet (hvilket utelukker deres anvendelse i tørre analytiske elementer), og kompliserte reaksjons-mekanismer

Koukli et al (Analyst, 114, 711, 1989) beskriver bestemmelse av acetaminofen (4'-hydroksyacetanilid) basert på kjemi-luminesensen som frembringes ved dens reaksjons med cerium (IV) i sur oppløsning

Schmitt et al (Photochem Photobiol., 51, 719, 1990) har vist at 4'-hydroksyacetanilid frembringer lys med peroksidase-katalyse i nærvær av en kationisk micelle Kun høye nivåer (større enn 10 nmolar) av peroksidasen som analyt var imidlertid detekterbare, og maksimum lysemissjon ble observert bare ved pH 8,8 Det er ingen indikasjon på at sensitiviteten kunne forøkes slik at pmolare nivåer av analyten kunne måles ved nøytral pH-verdi.

Til tross for den betydelige forskningen innenfor dette området er det således fremdeles et behov for et enkelt, høysensitivit kjemiluminescerende peroksidase deteksjonssystem som virker ved nøytral pH-verdi, har lav bakgrunn i nærvær av et oksidasjonsmiddel og som ikke krever oksygen for lysgenerering

De ovenfor omtalte problemer løses ved at det ifølge oppfinnelsen er tilveiebragt en vandig sammensetning for tilveiebringelse av et kjemiluminescerende signal innbefattende: a) et oksidasjonsmiddel i en mengde fra ca 1 til ca 10 mmolar, b) et kationisk overflateaktivt middel av lav molekylvekt som er tilstede i en mengde fra ca 0,05 til ca 2% over dens kritiske micellekonsentrasjon, eller en kationisk polymer som er til stede i en mengde fra ca 0,01 til.ca 2 vekt-£, c) en buffer for opprettholdelse av sammensetningens pH-verdi fra ca 6 til ca 8,5, og d) et substituert acetanilid som er til stede i en total mengde fra ca 0,05 til ca 10 mmolar som den eneste kjemiluminescerende signalgenererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til peroksidase, hvor det substituerte acetanilidet har strukturen (I):

hvor R<1> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer,

R<2> er hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, alkoksyalkyl med 1-4 karbonatomer, hydroksyalkyl med 1-4 karbonatomer, ammoalkyl med 1-4 karbonatomer, halogenalkyl med 1-4 karbonatomer, eller alkenyl med 2-5 karbonatomer,

R^ er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer,

R<4> og R55 er uavhengig hydrogen eller en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0,01, og

R<6> og R<7> er uavhengig hydrogen, halogen, cyano eller metyl,

forutsatt at minst én av R<4> og R<5> er en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0 01, og videre forutsatt at sammensetningen er vesentlig fri for noe annet kjemiluminescerende middel

Oppfinnelsen tilveiebringer også et diagnostisk testkit for bestemmelse av en analytt som er katalytisk relatert til peroksidase, hvilket kit er kjennetegnet ved at det i individuell pakning innbefatter

i) den vandige sammensetningen som beskrevet ovenfor, og

ii ) en peroksidase eller en spesifikk peroksidasemerket bmdingsforbindelse.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en testanordning for detektering av peroksidase eller en analytt som er katalytisk relatert til peroksidase, hvor testanordningen er kjennetegnet ved at den innbefatter et absorberende bærermateriale og inneholder

det lavmolekylvektige kationiske overflateaktive middelet eller kationiske polymer som beskrevet ovenfor,

bufferen som beskrevet ovenfor, og

det substituerte acetanilidet som beskrevet ovenfor, forutsatt at elementet er vesentlig fritt for annet kjemiluminescerende middel

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere en fremgangsmåte for frembringelse av et detekterbart signal som respons på peroksidase, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den innbefatter A) reaksjon av en peroksidase i nærvær av den ovenfor beskrevne vandige sammensetning,

for frembringelse av et detekterbart kjemiluminescerende signal, og

B) bestemmelse av det resulterende kjemiluminescerende signal som et mål for peroksidase

Oppfinnelsen tilveiebringer også en spesifikk bindingsanalyse for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, og denne bindmgsanalysen er kjennetegnet ved at den innbefatter: A) dannelse av et spesifikt peroksidasemerket bindingskompleks av en spesifikk bindingsligand med en reseptor som er spesifikk for liganden, B) anbringelse, etter separering av ikke-kompleksdannede materialet fra det spesifikke peroksidasemerkede bindmgs-komplekset, av det spesifikke peroksidasemerkede bindings-komplekset i kontakt med den vandige sammensetningen som er beskrevet ovenfor for frembringelse av et detekterbart kjemiluminescerende signal, og C) bestemmelse av det resulterende kjemiluminescerende signalet som et mål for den spesifikke bindingsliganden

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et forenklet kjemiluminescerende deteksjonssystem for peroksidase som benytter et hvilket som helst av visse substituerte acetanilider som kjemiluminescerende middel istedenfor konvensjonelle reagenser. Dette systemet gjør det mulig for brukeren å detektere p-molare nivåer av peroksidasen i opplsøning eller å benytte tørre analytiske elementer ved realtivt nøytral pH-verdi, og dermed tilveiebringe høy sensitivitet Det observeres også lav bakgrunn i fravær av peroksidase ved utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Figur 1 er et grafisk stolpediagram som viser kjemilumine-senssignal ved forskjellige pH-verdier for en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i nedenstående eksempel 9 Figur 2 er et grafisk stolpediagram som viser kjemi-lummesenssignal ved forskjellige pH-verdier for en kontroll-sammensetnmg, som beskrevet i nedenstående eksempel 9 Figur 3 er en grafisk fremstilling av kjemiluminescerende signal mot log konsentrasjon av thyroidstimulerende hormon (TSH) som beskrevet i nedenstående eksempel 18.

Foreliggende oppfinnelse kan med fordel utføres i en hvilken som helst analytisk metode som er utviklet for a generere et kjemiluminescerende signal som svar på tilstedeværelsen av en peroksidase. Slike analyser kan innebære deteksjon av et organisk eller uorganisk peroksid, (slik som hydrogenperoksid) eller peroksidase (i sin frie form), eller deteksjon av en ikke-immunologisk analyt andre enn peroksidase eller hydrogenperoksid Spesielt er oppfinnelsen nyttig ved utførelse av spesifikke bindingsanalyser som genererer et kjemiluminescerende signal

Analysen kan være kvalitativ eller kvantitativ eller begge deler, og kan anvendes for a detektere en biologisk eller kjemisk substans (dvs en analyt) i vandige væsker inkludert humane eller animalske biologiske fluider, avfallsfluider, matvarer, miljøutslipp, kjemiske prosesseringsvæsker og andre materialer som er åpenbare for en fagmann på området. Spesielt kan analysen benyttes for a detektere en analyt i humane eller animalske biologiske fluider, inkludert, men ikke begrenset til, helt blod, serum, plasma og urin.

Hydrogenperoksid (eller et annet peroksid) kan bestemmes ved bruk av foreliggende oppfinnelse I tillegg kan oppfinnelsen benyttes til å bestemme analyter som er i stand til å produsere hydrogenperoksid, det vil si analyter som deltar i en eller flere reaksjoner til dannelse av hydrogenperoksid i nærvær av egnede signalgenererende reagenser og en peroksidase Slike analyter anses i foreliggende sammenheng som "analyter som er katalytisk relatert til peroksidase"

I en foretrukket utførelse er oppfinnelsen nyttig for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, eller dens tilsvarende reseptor (dvs. en substans som spesifikt sammenbindes med liganden) Slike ligander innbefatter, men er ikke begrenset til, antistoffer og andre proteiner (inkludert 1lpoproteiner, blodprotemer, enzymer og glyko-proteiner), haptener, legemidler, hormoner, steroider, toksiner, vira, bakterier, vitaminer, saccharider (inkludert polysaccharider), immunsystem modulatorer (slik som lnter-leukmer), lipider, nukleinsyrer, ikke-proteinholdige blodkomponenter, eller hvilke som helst komponenter derav som er åpenbare for en fagmann på området

En kritisk komponent i foreliggende vandige sammensetning som genererer kjemiluminescerende signal er et eller flere substituerte acetanilider med den nedenfor definerte struktur (I). Disse forbindelsene er de eneste kjemiluminescerende signalgenererende reagenser som benyttes ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse. Sammensetningene, testkitene, testanordningene og fremgangsmåtene er med andre ord vesentlig frie for alle andre potensielle kjemiluminescerende signalgenererende reagenser Med "vesentlig frie" menes at slike reagenser enten ikke er til stede i det hele tatt, eller er til stede i såpass små mengder at et eventuelt signal som de genererer ikke kan observeres over bakgrunns-signalet

Ved utførelse av foreliggende oppfinnelse kan således anvendelse av forskjellige andre konvensjonelle kjemi-luminescensgenererende forbindelser unngås. For eksempel unngås luminol og lignende 2,3-dihydro-l ,4-ftalazmdion derivater med foreliggende oppfinnelse

Forbindelsene som benyttes for å generere et lyssignal er definert ved strukturen (I).

hvor R<1> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer (slik som metyl, etyl, isopropyl, hydroksymetyl, aminometyl og metoksymetyl) R<*> er fortrinnsvis hydrogen eller metyl, og mer foretrukket er den hydrogen.

R<2> er hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer (slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl og isobutyl), alkoksyalkyl med 1-4 karbonatomer (slik som metoksymetyl og metoksyetyl), hydroksylakyl med 1-4 karbonatomer (slik som hydroksymetyl, 1-hydroksyetyl, 2-hydroksyetyl og 2,3-dihydroksypropyl), ammoalkyl med 1-4 karbonatomer (slik som aminometyl, 2-aminoetyl, 3-aminopropyl, 2,4-diaminobutyl, metylaminometyl, 2,2-dimetylammoetyl og 4-aminobutyl), halogenalkyl med 1-4 karbonatomer (slik som klormetyl, brommetyl, 2-kloretyl, 1,1-diklormetyl, 1,1,1-triklormetyl, 2 ,2 ,2-trikloretyl og 3-klorpropyl), eller alkenyl med 2-5 karbonatomer (slik som ethenyl, 1-propenyl, isopropenyl og 2-butenyl). R<2> er fortrinnsvis hydrogen, metyl, metoksymetyl, hydroksymetyl, klormetyl eller ethenyl. Mer foretrukket er den hydrogen eller metyl, i det metyl er mest foretrukket.

R<3> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer (slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, N-butyl og isobutyl). R<3> er fortrinnsvis hydrogen eller metyl og mer foretrukket er den hydrogen

R<4> og R<5> er uavhengig hydrogen eller en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigma verdi på minst ca 0 01 og fortrinnsvis minst ca 0 3, forutsatt at minst et av de to radikalene er en elektronfjernende gruppe

Hammett-sigmaverdier beregnes i overensstemmelse med standardprosedyrer som er beskrevet for eksempel i Steric Effects in Organic Chemistry, John Wlly & Sons, Inc., 1956, s 570-574 og Progress in Physical Organic Chemistry, vol 2, Interscience Publishers, 1964, s 333-339 Representative elektronfjernende grupper som har postive Hammett-sigmaverdier inkluderer cyano, karboksy, nitro, halogen (fluor, brom, klor eller iod), trihalogenmetyl (for eksempel trifluormetyl eller trlklormetyl), karbonyl, karbamoyl, sulfonyl, sulfamoyl, estere, og andre som er åpenbare for fagfolk pa området. Foretrukne elektronfjernende grupper er halogen (slik som klor eller brom) og cyano Klor, brom og cyano er mer foretrukne elektronfjernende grupper, og klor eller brom er mest foretrukket for både R<4> og R<5>.

R<6> og R<7> er uavhengig hydrogen, metyl, cyano, eller halogen (slik som klor eller brom) Fortrinnsvis er en av eller begge substituenter hydrogen, metyl eller klor, og mest foretrukket er hegge hydrogen

Representative elektronoverføringsmidler som har struktur (I) inkluderer

3'-klor-4'-hydroksyacetanilid,

3' ,5'-diklor-4'-hydroksyacetanilid,

2'-metyl-3'-klor-4'-hydrocyacetanilid, 2' ,3'-diklor-4'-hydroksyacetanilid,

2' ,5'-diklor-4'-hydroksyacetanilid,

3'-fluor-4'-hydroksyacetanilid,

3',5'-difluor-4'-hydroksyacetanilid,

3'-brom-4'-hydroksyacetam1id,

3',5'-dibrom-4'-hydroksyacetanilid,

3'-klor-4'-hydroksy-6'-metylacetani1id, 3'-cyano-4'-hydroksyacetanilid, 3 ' , 5 ' -dicyano-4 ' -hydroksyacetam 1 id ,

N-metyl-N-(3-klor-4-hydroksyfeny1)acetamid, N-(3-klor-4-hydroksyfenyl)methakrylamid, N-(3-klor-4-metoksyfenyl )acetamid,

N-(3-klor-4-hydroksyfeny1)-2-kloracetamid, N-(3-klor-4-hydroksyfenyl )-2,2-dikloracetamid, N-(3-klor-4-hydroksyfenyl)-2,2,2-trikloracetamld, N-( 3-klor-4-hydroksyfenyl )-2-hydroksyacetanild, N-(3-klor-4-hydroksyfenyl)-2-metoksyacetamid og N-(3-klor-4-hydroksyfenyl)-2-aminoacetamid.

De mest foretrukne forbindelsene er 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid og 3'-brom-4'-hydroksyacetanilid

Noen av disse forbindelsene er kommersielt tilgjengelige Andre kan fremstilles generelt fra kjente utgangsmaterialer som følger: de halogenerte forbindelsene med struktur (I) fremstilles ved halogenering av det kjente forløper anilidet (for eksempel 4'-hydroksy- eller -alkoksyacetanilid) med et kjent halo-genenngsmiddel slik som sulfurylklorid, sulfurylbromid , ellre det frie halogenet i nærvær av syre. Når den ønskede forløperen ikke er tilgjengelig kan en passende substituert fenol nitreres ved mild nitrering ved bruk av kjente teknikker (for eksempel med salpetersyre i et oppløsnings-middel slik som iseddik) fulgt av hydrogenering, typisk over platina eller palladium for dannelse av aminet (kfr. J. Am. Chem Soc 49, 1093, 1927) Aminet blir deretter acylert for eksempel ved kondensasjon med det ønskede acyleringsmiddelet slik som et anhydrid (for eksempel eddiksyreanhydrid) eller et syreklond slik som akrylsyreklorid, for dannelse av anilidet Egnede acyleringsprosedyrer er også beskrevet av Challis et al, The Chemistry of Amides, s 731-857, Inter-sciences Publishing, New York, 1970 Dersom de valgte utgangsmaterialene ikke allerede tilveiebringer de nødvendige elektronf jernmgsgruppene så kan det resulterende anilidet hensiktsmessig halogeneres som beskrevet ovenfor. Aminfor-løperen til anilidet kan alternativt acyleres med et acylermgsmiddel som gir gruppen ved R<2> (for eksempel trikloreddiksyreklond eller maleinsyreanhydrid), eller den aromatiske ringen i anilidet kan alkyleres, acyleres eller nitreres ved R<4-> eller R<5-> (eller begge) stillingene ved bruk av kjente teknikker for tilveiebringelse av de nødvendige eleltronfjerningsgruppene fra R<4> og R<5>

En annen komponent i foreliggende vandige sammensetning er et lavmolekylvektig kationisk overflateaktivt middel for tilveiebringelse av miceller, eller en kationisk polymer for tilveiebringelse av et hydrofobt miljø for forøket sensitivitet, lagnngsstabilitet og kinetisk stabilitet.

Overflateaktive midler er generelt forbindelser som nedsetter overflatespenningen til vann som velkjent for fagfolk Slike materialer er vanligvis syntetiske, men noen er naturlig forekommende Kationiske overflateaktive midler har en netto positiv ladning og er beskrevet i en rekke publikasjoner inkludert for eksempel Surfactants and Interfacial Phenomena, av Milton J. Rosen, John Wiley & Sons, N Y , 1978, s 13-17 og er identifisert ved varebetegnelser i McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, North American Ed., McCutcheon's Division, The Manufacturmg Confectioner Publishing Co., 1988, side 259 Positive ladninger i de overflateaktive midlene kan tilveiebringes ved hjelp av kationiske grupper som innbefatter, men ikke er begrenset til, kvarternært ammonium, kvaternært fosfonium, sulfonium, pyridinium, pyrimidinium, lmidazolium og oksonium

Spesielt nyttige kationiske overflateaktive midler og polymerer kan representeres ved strukturen (II) hvor R<8> er substituert eller usubstituert alkyl med minst 7 karbonatomer, og fortrinnsvis fra 10-20 karbonatomer (slik som n-oktyl, isononyl, isodecyl, dodecyl , tetradecyl , heksadecyl, oktadecyl , eikosyl , 2,7,8-trimetyldecyl, 4-etyl-6-metyldodecyl, benzyl og fenetyl), substituert eller usubstituert aryl med 6-14 karbonatomer i den aromatiske kjernen (slik som fenyl, naftyl eller anthryl ) som kan være substituert med en eller flere hydrofobe grupper slik som lineær eller forgrenet alkyl med 1-10 karbonatomer (slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, heksyl, oktyl, isookstyl, nonyl eller isononyl), halogen og andre som er kjent for fagfolk på området Slike substituerte arylgrupper inkluderer, men er ikke begrenset til, xylyl, tolyl, lsononyl-fenyl, dimetylfenyl og triklorfenyl R<8> kan også være substituert eller usubstitiuert alkenyl med 8-20 karbonatomer (slik som 1-oktenyl, 1-decenyl og 2-dodecenyl), eller en polymer gruppedel (beskrevet i det nedenstående)

R<8> er fortrinnsvis alkyl eller alkenyl med 14-16 karbonatomer, i det grupper slik som 2,4-dimetyl-6-etyldecyl, tetradecyl og heksadecyl er mer foretrukket.

I struktur (II) kan R^ være alkyl eller alkenyl som definert for R<8>, substituert eller usubstituert alkyl med 1-7 karbonatomer (slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, metoksymetyl, benzyl og heksyl), substituert eller usubstituert alkenyl med 2-7 karbonatomer (slik som ethenyl, allyl, isopropenyl og n-butenyl ), eller karbocyklisk aryl med 6-10 karbonatomer i nngsystemet (slik som fenyl, tolyl, xylyl, naftyl og p-metoksyfenyl).

R<10> og R<11> er uavhengig substituert eller usubstituert alkyl med 1-7 karbonatomer (slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, metoksymetyl, benzyl og heksyl), substituert eller usubstituert alkenyl med 2-7 karbonatomer (slik som ethenyl, isopropenyl og allyl), eller karbocyklisk aryl med 6-10 karbonatomer i ringsystemet (slik som fenyl, tolyl, xylyl, naftyl og p-metoksyfenyl)

Hvilke som helst to eller tre av R<9>, R<*0> og R<11> kan alternativt tas sammen til å representere tilstrekkelige karbonatomer og et oksygen-, nitrogen- eller svovelatom for sammen med det kvarternære ammoniumatomet å fullende en kationisk 5-til 6-leddet heterocyklylgruppe Eksempler på slike grupper innbefatter, men er ikke begrenset til, pyridmium, piperi-dinium, pyrrolidinium, morfollnium, quinolinium, pyrimidinium, akridmium, benzotiazolium, benzoksazolinium og lmidazolium

R9, R<10> og R<*1> er fortrinnsvis uavhengig metyl eller etyl.

Y~ er et egnet enverdig syreanion som ikke er et substrat eller inhibitor for peroksydaser inkludert, men ikke begrenset til, perklorat, halogenid (slik som fluorid, klorid og bromid), tetrafluorborat, triflat, metylsulfat, heksafluorfosfat, nitrat, p-toluensulfonat og andre som vil være åpenbare for fagfolk på området. Halogenidanioner er foretrukket

Eksempler på nyttige ikke-polymere kationiske overflateaktive midler er heksadecyltrimetylammoniumklorid, dodecyltrimetyl-ammoniumklorid, cetyltrimetylammoniumbromid (ogsa kjent som heksadecyltrimetylammoniumbromid), kokostrimetylammonium-klond, talgtrimetylammoniumklorid, soyatrimetylammonium-klorid, myristyltrlmetylammoniumklorid, stearyltrimetyl-ammoniumklorid, cetyletyldimetylammoniumbromid, didodecyldi-metylammoniumbromid, cetylpyrldimumklorid og myristyldi-metylbenzylammoniumklorid

Cetyltrimetylammoniumbromid og cetyltrimetylammoniumklorid er mest foretrukket

Mange av disse overflateaktive midlene er lett tilgjengelige fra en rekke forskjellige kommersielle kilder Andre kan lett fremstilles av en erfaren kjemiker ved bruk av kjente utgangsmaterlaler og fremgangsmåter

Når R<8> i struktur (II) er en polymer gruppedel så kan hovedkjeden til slike polymerer være konvensjonelle poly-estere, polyamider, polyetylenimmer, polykarbonater, celluloseholdige materialer og vinyladdisjon homo- og-kopolymerer omfattende gjentagende enheter av en monomer som har den ønskede positive ladningen Disse materialene kan fremstilles fra konvensjonelle materialer ved bruk av konvensjonelle prosedyrer Polymeren kan ha ladningene innkorporert deri fra utgangsmaterlaler, eller fra kjemisk reaksjon etter fremstilling

Spesielt nyttige kationiske polymerer er vmyladdisjonshomo-eller -kopolymerer fremstilt fra etylenisk umettede polymeriserbare monomerer som har de nødvendige positivt ladede gruppene, og en eller flere komonomerer som tilveiebringer hydrofobe områder som er karakteristiske for overflateaktive midler, tverrbundete omrader eller andre egnede egenskaper

Representative kationiske monomerer inkluderer, men er ikke begrenset til, N-cykloheksyl-N ,N-dimetyl-N-(m- & p-vmyl-benzyl)ammoniumklorid , 3- ( 2-hydroksypropyl )-l-vmyl-lmidazoliumklorid og l-metyl-4-vinylpyridiniumklorid Nyttige komonomerer inkluderer, men er ikke begrenset til, styren og dens derivater (slik som vinyltoluen og p-t-butylstyren), akryl- og methakrylsyreestere (slik som metylakrylat, metylmetakrylat, butylakrylat og butylmetakrylat), tverrbmd-bare monomerer (slik som divmylbenzen, etylendiakrylat, etylendimetakrylat og N,N<*->metylenbis (akrylamid)] Andre nyttige polymerer er beskrevet for eksempel som beisemidler i US-A-4 069.017 (Wu et al) og US-A-4 024 839 (Wu et al). Slike materialer har generelt kvaternære ammonium- eller kvaternære fosfoniumgrupper pendante fra polymerhovedkjeden og fortrinnsvis har i det minste fra ca 40 til 100 vekt-# av de etylenisk umettede polymeriserbare monomeravledede gjentagende enhetene slike grupper De gjenværende gjentagende enhetene kan være avledet fra en rekke forskjellige etylenisk umettede polymeriserbare monomerer som angitt i de ovenfor refererte patenter.

Representative kationiske polymerer inkluderer, men er ikke begrenset til, poly(N,N,N-trimetyl-N-vinylbenzylammonium-klond), poly[styren-co-benzyl-N,N-dimetyl-N-(m- & £-vmylhenzyl )ammoniumklorid-co-divinylbenzen] , poly (N ,N ,N-trioktyl-N-vinylbenzylfosfoniumklorid), poly[styren-co-N-vinylbenzyl-N,N,N-triheksylammoniumklorid], poly(styren-co-N,N,N-trimetyl-N-vinylbenzylammoniumklorid), poly[N-cykloheksyl-N ,N-dimetyl-N-(m- & p_-vinylbenzyl )ammoniumklorid] , poly [ s ty ren-co-1-vinylimidazol-c_o-3-( 2-hyd r ok sy etyl )-l-vinylimidazoliumklorid] og andre som er åpenbare for fagfolk på området En foretrukket kationisk polymer er poly[N-cykloheksyl-N,N-dimetyl-N-(m- & p_-vinylbenzyl Ammoniumklorid]

Foreliggende signalgivende sammensetning er generelt buffret til en pH-verdi fra 6 til ca 8 5 (fortrinnsvis fra ca 6.5 til ca 8) ved bruk av en eller flere egnede buffere som velkjent innen teknikken Det kan for eksempel anvendes slike buffere som tris(hydroksymetyl)aminometan, bis(2-hydroksyetyl)-lmmotris-(hydroksymetyl)metan, N,N-bis(2-hydroksyetyl )-2-ammoetansulf onsyre , 1, 3-bis[tris(hydroksymetyl )metylammo] - propan, N-(2-hydroksyetyl )-piperazm-N'-(3-propansulfonsyre), N-(2-hydroksyetyl)piperazin-N'-(2-etansulfonsyre) og fosfat Tris(hydroksymetyl)-aminometan er foretrukket I forbindelse med angivelsen av pH-verdi refererer betegnelsen "ca" til 0 2 enheter

Et oksidasjonsmiddel er nødvendig for utførelse av foreliggende oppfinnelse for å bevirke eksitasjon av det substituerte acetanilidet slik at lys emitteres i nærvær av en peroksydase Forskjellige nyttge oksydasjonsmidler er kjent, men perboration og hydrogenperoksid er foretrukket, i det det sistnevnte er mest foretrukket.

Forskjellige eventuelle tilsetningsmidler som kan innbefattes i den vandige sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse er gelateringsmidler, forskjellige uorganiske salter for lonestyrke (slik som natriumklorid og kallumklorid) og stabilisatorer slik som natriumbenzoat

I foreliggende vandige signalgivende sammensetning kan mengdene av hver komponent varieres avhengig av hvor det er meningen å benytte den, reagensenes spesielle sensitivitet, og andre faktorer som fagfolk på området kjenner til. Følgende generelle områder er således ment å gi en veiledning for fagmannen og er ikke begrenset til utførelsen av foreliggende oppfinnelse

Mengden av oksydasjonsmiddel er generelt minst ca 1 mmolar, i det en mengde i området fra ca 1 til ca 10 mmolar er foretrukket. Det substituerte anilidet av struktur (I) er generelt til stede i en mengde på i det minste ca 0,05 mmolar. I det en mengde i området fra ca 0,05 til ca 10 mmolar er foretrukket. Det kationiske overflateaktive middelet er generelt til stede i en mengde fra ca 0,05 til ca 2% over den kritiske micellekonsentrasjonen, og når den kationiske polymeren anvendes er den generelt til stede i en mengde fra ca 0 01 til ca 2 vekt-% Mengden av buffer kan variere avhengig av den benyttede buffer, men den er vanligvis fra ca 0,01 til ca 0,03 molar I forbindelse med definisjonen av konsentrasjoner refererer betegnelsen "ca" til ± 10^ av den angitte verdi.

Den "kritiske micellekonsentrasjonen" for mange overflateaktive midler er velkjent eller den kan lette bestemmes ved bruk av prosedyrer som beskrevet for eksempel i Surfactant Science and Technology, Meyers, VCH Publishers, New York, kapittel 3, 1988.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en peroksidase-holdig vandig sammensetning som en del av et kit, og denne sammensetningen inneholder en peroksidase i fri form, eller som en merking eller markør konjugert med et spesifikt bindingsmolekyl (slik som et antistoff, avidin eller biotin) En slik sammensetning kan ogsa være buffret slik som beskrevet ovenfor for foreliggende signalgivende sammensetning. Mengdene av peroksidase eller peroksidasemerket spesifikt bindingsmolekyl som er tilstede i sammensetningen vil lett forstås av fagfolk på området.

Foruten de ovenfor beskrevne sammensetninger kan kitet også innbefatte andre individuelt forpakkede reagenser, utstyr og instruksjoner som er nyttig for utførelse av en rekke forskjellige analytiske metoder (beskrevet i det nedenstående) Pakkingen av kitkomponenter er velkjent pa omradet.

I foreliggende sammenheng skal "peroksidase" bety en hvilken som helst peroksidativ substans (enzymatisk eller på annen måte) som katalyserer oksidasjonen av et substrat, det vil si det heri beskrevne substituerte acetanilidet, for frembringelse av den passende lysemissjon Mikrobielle, fungale og planteperoksidaser er foretrukket, i det pepperrotperoksidase er mest foretrukket Mengden av peroksidase kan variere sterkt på grunn av mengden av andre komponenter benyttet i reaksjonen. En nyttig mengde vil lett være åpenbar for fagfolk på omradet, men en minimum mengde vil generelt være minst ca 1 x IO-<7> I U /ml (eller en ekvivalent mengde for ikke-enzymatisk peroksidative substanser). I.U. representerer den internasjonale enheten for enzymaktivitet og er definert som det omfang av enzymaktivitet som skal til for å katalysere omdannelsen av et mikromol substrat til produkt pr minutt under standardbetingelser

I spesifikke bmdingsmetoder anvendes peroksidasen som et konjugat med en spesifikk bindingsligand eller reseptor for dette, eller med et spesifikt bindingsmolekyl som er reaktivt med enten liganden eller reseptoren Liganden og reseptoren blir kompleksdannet i slike analyser og dermed merket med peroksidasen for eventuell deteksjon av de merkede kompleksdannede eller merkede ikke-kompleksdannede materialene. Fremstillingen av slike konjugater kan oppnås ved bruk av en rekke forskjellige kjente teknikker (for eksempel beskrevet av Yoshitake et al, Eur J. Biochem , 101, 395, 1979, og i US-A-5.106 732 av Kondo et al.).

Forskjellige spesifikke b mdmgsanalysef ormater er nyttige ved utførelse av foreliggende oppfinnelse og innbefatter nukleinsyre-hybrldisermgsanalyser , immunokjemiske analyser (slik som enzymimmunoanalyser, sandwichanalyser, konkurrerende bmdingsanalyser, direkte bmdingsanalyser) og andre som er velkjent innen teknikken Slike analyser er generelt beskrevet for eksempel i US-A-4 598.044, US-A-4 745 077 (Holian et al), US-A-5 077 198 (Shih et al.), US-A-5 085 986 (Mauck et al), Matthews et al, Anal. Biochem 169, sidene 1-25 (1988), og wO 88/01302 (publisert 25 februar 1988) Foreliggende fremgangsmåte kan forutgås av en ampliflkasjons-prosess, slik som polymerasekjedereaksjon (vanligvis kjent som PCR) som beskrevet for eksempel i US-A-4 965 188 (Mullis et al) og 1igasekjedereaksjon som er generelt beskrevet av Weiss, Science, 254, sidene 1292-3, 1991 for å øke mengden av målsøkt nukleinsyre som deretter kan detekteres ved bruk av foreliggende sammensetning

Spesielt nyttige spesifikke bmdingsmetoder ifølge oppfinnelsen er de som er kjent innen teknikken som sandwichanalyser hvorved liganden av interesse kompleksdannes med minst en første og annen reseptor enten samtidig eller i en ønsket rekkefølge En av reseptorene er en oppfangmgs- eller erobnngsreagens som enten uoppløseliggjøres på en egnet bærer (slik som mikrotiterplate, polymere, magnetiske eller glasspartikler, film, membran, filterpapir og andre materialer som er kjent innen teknikken (ved adsorpsjon, kovalent eller andre kjente festemetoder, eller er i stand til å bli uoppløseliggjort ved ytterligere kompleksdannelse eller reaksjon Erobringsreagensen kan for eksempel merkes med en spesifikk bmdingsgruppe (for eksempel biotin) som er reaktiv med sm tilsvarende reseptorgruppe (for eksempel avidin) som er uoppløseliggjort på en bærer

I sandwich-analysene er den andre reseptoren for liganden av interesse en deteksjonsreagens som kan merkes med en peroksidase, eller er i stand til å bli merket på en slik måte gjennom ytterligere spesifikke bindingsreaksjoner (slik som gjennom et avidm-biotin-kompleks) Deteksjon av merkingen oppnås ved bruk av foreliggende sammensetning.

I mer foretrukne utførelser er liganden av interesse et antigenisk materiale med hvilket antistoffer er reaktive, eller en nukleinsyre med hvilken komplementære nukleinsyrer (slik som ollgonukleotider) kan hybridiseres Andre ut-førelser inkluderer konkurrerende bmdingsanalyser hvor en spesifikk bindingsligand av interesse konkurrerer med en peroksidasemerket analog av liganden for en enkelt resptor.

De ovenfor beskrevne analyser kan utføres i oppløsning eller i et tørt format Oppløsningsanalyser refererer generelt til metoder som utføres i oppløsning i en egnet beholder, og i tilfellet for heterogene spesifikke bmdingsanalyser blir egnede separenngsteknikker og -utstyr da benyttet for å separere ubundede materialer fra de bundede materialene. I tørre analyser kan kjemiske eller spesifikke bindingsreaksjoner utføres i et tørt element, teststrimmel eller fiberark og tilstedeværelsen av analyten detekteres inne i elementet ved reaksjon av de forskjellige reagensene når en testprøve påføres på elementet eller testanordnlngen Detaljer angående slike elementer er velkjent innen teknikken, inkludert for eksempel US-A-3 992 158 (Przybylowicz et al), US-A-4 258 001 (Pierce et al), US-A-4 292.272 (Kitajima et al), US-A-4 430.436 (Koyama et al) og US-A-4 670 381 (Frickey et al)

Elementene omfatter generelt minst et absorberende bærer-matenale, og eventuelt ytterligere reagenslag eller -soner Reagensene som er nyttige i foreliggende oppfinnelse kan være like eller forskjellige lag eller soner i elementet

Følgende eksempler gis for å illustrere utførelses av foreliggende oppfinnelse Alle prosentandeler er ved vekt, med mindre annet er angitt

Alle reagenser og utstyr er, hvis ikke annet er angitt, oppnådd fra Eastman Kodak Company eller andre kommersielle kilder

Følgende fremstillinger beskriver representative prosedyrer for fremstilling av de substituerte acetanilidene som er nyttige ved utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Fremstilling A

I en 1 liters rundbunnet kolbe (utstyrt med en magnetisk omrøringsanordning) ble iseddik (700 ml) blandet med 4'-hydroksyacetanilid (50 g) inntil det faste stoffet var fullstendig oppløst. Den resulterende oppløsningen ble avkjølt til mellom 10 og 15°C og til denne ble det tilsatt SO2CI2 (47 g) og den resulterende oppløsningen ble omrørt 1 1 time Vann (200 ml) ble deretter tilsatt og 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid ble krystallisert som et hvitt bunnfall

(60 g, 98£ utbytte)

Fremstilling B

I en 500 ml rundbunnet kolbe (utstyrt med en magnetisk omrøringsanordning) ble vann (200 ml) blandet med 4-amino-2,6-diklorfenolhydroklond (20 g) inntil det faste stoffet var fullstendig oppløst Den resulterende oppløsningen ble oppvarmet til 70° C og til denne ble det tilsatt eddiksyreanhydrid (11 g) og den resulterende oppløsningen ble omrørt i 1 time Ved avkjøling ble det dannet krystaller av 3',5'-diklor-4'-hydroksyacetanilid (19.6 g, 95% utbytte)

Eksempler 1-4: vandige k. iemilumipescerende sammensetninger Vandige sammensetninger ifølge oppfinnelsen for tilveiebringelse av et kjemiluminescerende signal ble fremstilt ved blanding av cetyltrimetylammoniumklorid (0 1&), hydrogenperoksid (3 mmolar) og forskjellige kjemiluminescerende midler (1 mmolar) i tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid buffer (0 05 molar, pH 7 2) Flere kontrol1 sammensetninger ble likeledes fremstilt for å inkludere kjente fluorescerende fargestoffer Signalgenerering ble målt ved 37<*>C ved bruk av et konvensjonelt Turner TD-20e lummometer da forskjellige mengder av pepperrotperoksidase (Sigma Chemical XII) ble blandet med sammensetningene (sluttvolum på 200 pl)

Som kjemiluminescerende midler inneholdt eksempel 1 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid, eksempel 2 inneholdt 3'-fluor-4'-hydroksyacetanilid, eksempel 3 inneholdt 2'-metyl-3'-klor-4'-hydroksyacetanilid og eksempel 4 inneholdt 3'-brom-4'-hydroksyacetanilid

Kontroll A inneholdt fluorescein, kontroll B inneholdt eosin Y og kontroll C inneholdt koumarin 343

Nedenstående tabell I viser de gjennomsnittlige lyssignalene generert av sammensetningene for tre replikater i hvert forsøk (10 sekunders integrerte lysenheter ved t=4 minutter) etter tilsetning av peroksidase "Signal-til-støy"-forholdet (S/N) er forholdet for lyssignalet generert av sammensetningen i nærvær av pepperrot peroksidase til bakgrunns-signalet (ingen peroksidase)

Resultatene i tabell I viser at foreliggende sammensetninger utviser lav bakgrunn og høy sensitivitet i nærvær av pepperrotperoksidase selv ved en pmolar-konsentrasjonen av enzymet Kontrollsammensetningene viste enten høy bakgrunn (kontroller A og B) eller uakseptabelt lavt S/N-forhold (kontroll C), eller begge deler ved 100 pmolar-enzymnivået.

Eksempel 5 Foretrukket vandig kjemiluminescerende sammen setning

En foretrukket vandig sammensetning ifølge oppfinnelsen ble

fremstilt ved blanding av dietylentriaminpentaeddiksyre (100 umolar), hydrogenperoksid (2 mmolar), cetyltrimetylammoniumbromid (0 1%) og 3'-klor-4'-hydroksyacetam1id (0 5 mmolar) i tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid (0.05 molar, pH 8)

Kontroller D, E og F ble fremstilt på samme måte, men inneholdt 4'-hydroksyacetanilid (0 5 mmolar), 4-iodfenol (1 mmolar) og 4'-hydroksykanelsyre (0 5 mmolar) i stedenfor det substituerte 4'-hydroksyacetanilid Sluttvolumet for reaksjonsblandmg var 200 pl etter tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av pepperrotperoksidase (Sigma Chemical XII).

Tabell II nedenfor angir de gjennomsnittlige lyssignaldata (10 sekunders integraler ved t=5 minutter) for 3 replikater oppnådd ved bruk av et konvensjonelt Turner TD-20e lummometer ved 37°C Foreliggende oppfinnelse viser større sensitivitet enn sammensetninger som inneholder tidligere kjente forbindelser

Eksempel 6- Sammen lignmgseksempel

Dette eksempelet sammenligner foreliggende oppfinnelse med sammensetninger fremstilt ved bruk av kjemiluminescerende midler som er beskrevet i den tidligere teknikk En sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse (eksempel 6) ble fremstilt ved blanding av dietylentnaminpentaeddiksyre (10 umolar), hydrogenperoksid (3 mmolar), cetyltrlmetyl-ammoniumklorid (01%) og 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid (1 mmolar) i tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid (0,05 molar, pH 7 2) Eksempel 6a ble utført ved bruk av samme sammensetning, men på en annen dag.

Kontrollsammensetninger G og H inneholdt purpurogal1m (Sigma Chemical) (0 2 mmolar), etanol (25% for kontroll G og 5% for kontroll H), hydrogenperoksid (12 5 mmolar) og chelatenngs-middel (10 pmolar) i fosfatbuffer (0 01 molar, pH 6 5). Kontrollsammensetninger I og J ble fremstilt i likhet med foreliggende sammensetning med unntagelse for at de Inneholdt henholdsvis 7-hydroksykoumarm eller esculinmonohydrat som kjemiluminescerende midler (hver ved 1 mmolar)

Tabell III nedenfor angir de gjennomsnittlige signaldata oppnådd for 3 replikater da forskjellige mengder av pepperrotperoksidase ble tilsatt ved bruk av fremgangsmåten og utstyret beskrevet i eksemplene 1-4. Sluttvolumet for hver reaksjonsblandmg var 200 pl.

Eksempel 7 Bakgrunnssammenligninger

Dette eksempelet viser at foreliggende vandige sammensetning viser lavt bakgrunnssignal sammenlignet med tidligere kjente sammensetninger

En sammensetning ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved blanding av 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid (1 mmolar), cetyltrimetylammoniumklorid (0,1%), dietylentrlammpentaddik-syre (10 umolar) og hydrogenperoksid (3 mmolar) i tris-(hydroksymetyl )-aminometanhydroklorid buffer (0.05 molar, pH 8 5).

En kontroll K-sammensetning var lik foreliggende sammensetning med unntagelse for at den inneholdt fluorescein som kjemiluminescerende middel og hadde en pH-verdi på 7 2, og kontroll L var lik kontroll K med unntagelse for at den inneholdt eosin Y istedenfor fluorescein Kontroll M var lik foreliggende sammensetning med unntagelse for at den også inneholdt luminol (1 mmolar) og hadde en pH-verdi på 8. Kommersielt tilgjengelig AMERLITE™-signal genererende reagens inneholdende luminol (0 2 mmolar) og p_-iodfenol (0 25 mmolar) i natnumperborat buffer (1 mmolar, pH 8 5) ble sammenlignet som kontroll N

Tabell IV nedenfor inneholder det gjennomsnittlige bak-grunnssignalet og standardavvik oppnådd fra tre replikater ved bruk av et Turner DT-20e luminometer ved 37"C (10 sekunders integraler) Reaksjonsblandingsvolumet for hver sammensetning var 200 ul.

Disse resultatene tyder på at foreliggende sammensetning viser vesentlig 0 bakgrunn i frahver av en peroksidase mens mange kjente kjemiluminescerende sammensetninger utviser observerbar bakgrunn

Eksempel 8 Deteksnon av fungal peroksidase

Dette eksempelet viser nyttigheten av foreliggende oppfinnelse med henblikk på deteksjon av en fungal peroksidase, slik at det er klart at oppfinnelsen ikke er begrenset til en spesiell peroksidase ved dens utførelse.

En sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse ble fremstilt ved blanding av 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid (1 mmolar), dietylentriaminpentaeddiksyre (10 umolar), cetyltrimetylammoniumklorid (01%) og hydrogenperoksid (3 mmolar) i tris(hydroksymetyl )ammometanhydroklorid buffer ( 0 05 molar, pH 7 2) Data (gjennomsnitt for tre replikater (fra detek-sjonen av forskjellige mengder av peroksidase fra soppen Arthromyces ramosus (Sigma Chemical) ble oppnådd ved bruk av prosedyren beskrevet i eksemplene 1-4, og er angitt i nedenstående tabell V

Eksempel 9 Sammenligning ved nøytral pH

En sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse og en sammensetning ifølge tidligere teknikk (kontroll P) ble sammenlignet ved forskjellige pH-analyseverdier.

Foreliggende sammensetning ble fremstilt ved blanding av trletylentriammpentaeddiksyre (10 umolar), hydrogenperoksid (2 mmolar), 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid (1 mmolar) og cetyltrimetylammoniumbromid (0 1%) i tris(hydroksymetyl )-ammometanhydroklorid buffer (0 2 molar)

Kontroll P-sammensetningen inneholdt luminol (1 mmolar), 4'-hydroksyacetani1id (0 15 mmolar), cetyltrimetylammoniumbromid (0,1%) og hydrogenperoksid (2 mmolar) i buffer (0 05 molar)

Sigma Chemical XII-pepperrotperoksidase ble tilsatt til hver sammensetning (250 pmolar for oppfinnelsen, 25 pmolar for kontroll P) slik at det ble oppnådd sluttvolumer for reaksj onsblandmgene på 200 ul. Det resulterende signalet ble observert ved bruk av en kommersielt tilgjengelig Lummoskan-plateavleser ved enten 25 eller 37° C (10 sekunders integral ved t=5 sekunder) for kontroll P, og et Turner TD-20e luminometer ved 37°C (10 sekunders integral ved t=5 sekunder) for oppfinnelsen Resultatene er fra tre replikater for hver sammensetning og er illustrert på fig. 1 for oppfinnelsen og på fig. 2 for kontroll P På fig 2 representerer den første stolpen ved hver pH-verdi det signal som blir oppnådd ved 25'C og den andre stolpen representerer signalet oppnådd ved 37° C

Det fremgår tydelig at foreliggende oppfinnelse på optimal måte genererer lys nær nøytral pH-verdi mens kontroll P-sammensetningen gir et optimalt signal ved pH 8.5-8 75

Eksempel 10: Analytisk element

Dette eksempelet viser fremstillingen av en testanordning ifølge oppfinnelsen og dens anvendelse for å detektere peroksidase ved forskjellige konsentrasjoner ved bruk av foreliggende oppfinnelse.

En vandig sammensetning ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved blanding av cetyltrimetylammoniumbromid (0 1%), dietylentriaminpentaeddiksyre (10 umolar), hydrogenperoksid (2 mmolar) og 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid (1 mmolar) i tris(hydroksymetyl )aminometanhydrokloridbuffer (0.05 molar, pH 8)

En forrådsoppløsning av Sigma Chemical XII pepperrotperoksidase (8 umolar) ble fremstilt i den samme bufferen Denne oppløsningen ble seriefortynnet i den angitte buffer for fremstilling av oppløsninger med varierende mengder peroksidase for blanding med en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse.

Tørre analytiske elementer ble fremstilt og hadde den generelle strukturen som er vist på figurene 1-3 i U S S N 07/938 460 (inngitt 31 august 1992 av Belly et al), inneholdende Whatman GF/B-glassmikrofibere som absorberende lag for tilveiebringelse av en høy vaskekapasitet i elementene. Disse elementene som er vist heri er illustrerende for foreliggende oppfinnelse og er ikke vesentlig for dens utførelse. Forskjellige andre elementstrukturer kan likeledes anvendes

Hvert fremstilte element hadde følgende komponenter i reagensmatrisen som er i kontakt med det absorberende laget

Foreliggende sammensetning (100 ul) ble påført på elementet I og fikk trenge inn i det absorberende laget En annen prøve I av sammensetningen ble blandet med en peroksidaseoppløsmng i et 40 1-volum forhold og denne blandingen (5 ul) ble påført på elementet Etter en 5 minutters inkubasjonsperiode ved romtemperatur ble elementets ramme fjernet og laget inneholdende reagensene og reaksjonsproduktene ble plassert i et konvensjonelt luminometer i 5 minutter for å registrere lysemissjonen (10 sekunders integral).

Tabell VI nedenfor angir data oppnådd fra to replikater av hver peroksidasekonsentrasjon (oppnådd ved å variere mengden av peroksidaseoppløsmng benyttet i reaksjonsblandingen) Disse resultatene viser nyttigheten av foreliggende oppfinnelse for detektering av peroksidase ved anvendelse av et tørt analytisk element med akseptabel sensitivitet og lav bakgrunn

Eksempler 11-17: Sammenligning av forskjellige kationiske

overflateaktive midler

Nyttigheten av forskjellige kationiske overflateaktive midler og kationiske polymerer ble demonstrert ved bruk av forskjellige av disse forbindelsene i foreliggende sammensetning, og maling av peroksidase som en analyt

Sammensetningene ble fremstilt ved blanding av 3'-klor-4 '-hydroksyacetanilid (1 mmolar), hydrogenperoksid (3 mmolar), dietylentrlaminpentaeddiksyre (10 umolar) og det kationiske materialet (angitt nedenfor, varierende mengder) i tris-(hydroksymetyl )aminometanhydroklorid buffer (0 05 molar, pH

7 2 )

Sigma Chemical XII pepperrotperoksidase (100 pmolar) ble blandet med sammensetningen og de resulterende lyssignalene fra reaksj onsblandmgen (200 ul) ble målt ved bruk av et Turner TD-20e luminometer ved 37<*>C (10 sekunders integral ved

t=4 minutter) Bakgrunnssignaler fra sammensetningene ble målt uten tilstedeværelsen av peroksidasen

De oppnådde data er angitt i tabell VII nedenfor som gjennomsnitt for tre replikater av foreliggende sammensetninger Bakgrunnssignalene er gjennomsnittene for 12 datapunkter i løpet av 1-4 minutter Disse data viser at forskjellige kationiske materialer kan benyttes i foreliggende sammensetninger på grunn av lav bakgrunn og høy sensitivitet.

De kationiske materialene som ble benyttet er følgende

Eksempel 11* cetyltnmetylammoniumklorid (0.1%),

eksempel 12 polyfstyren-co-N-vinylimidazol-co-3-(2-hvdroksv-etyl )-l-vmylimidazoliumklorid] (50 40 10 molarforhold )

(0 025%),

eksempel 13 cetylpyridiniumklorid (0,1%),

eksempel 14 poly[styren-co-N-benzyl-N ,N-dimetyl-N-(m- & p_-vmylbenzyl) ammoniumklorid-co-di vinyl benzen! (4 95 4 95 0 1 molarforhold) (0 05%), eksempel 15. poly[N-cykloheksyl-N,N-dimetyl-N-(m- & p-vmylbenzyl )ammoniumklorid] (0 25%), eksempel 16 cetyltrimetylammoniumbromid (0 1%), og

eksempel 17 polyfstyren-co-N-vinylImidazol-co-3-f 2-hydroksyetyl )-l-vmylimidazoliumklorid] (44:20:36 molarforhold)

(0 1%)

Eksempel 18: Oppløsningsinununoanalyse for thyroidstimulerende

hormon ( TSH)

Dette eksempelet viser utførelsen av foreliggende oppfinnelse for detektering av TSH i en biologisk prøve Analysen ble utført ved bruk av et kommersielt tilgjengelig AMERLITE™ hurtig TSH-immunoanalysekit (Kodak Clmical Diagnostics, Ltd ), platevasker/inkubator og kjemiluminescens avlesnings-apparat

Det kjemiluminescerende signalet ble generert ved bruk av en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse inneholdende 3'-klor-4'-hydroksyacetam1id (1 mmolar), hydrogenperoksid (3 mmolar), dietylentrlaminpentaeddiksyre (10 umolar) og cetyltrimetylammoniumklorid (0 1%) i tris(hydroksymetyl )-aminometanhydroklorid buffer (0 05 molar, pH 7 2).

Protokollen beskrevet i ovennevnte kommersielle AMERLITE^<M >hurtig-TSH-kit ble fulgt. 1) en prøve inneholdende 0-100 ul U /ml av TSH ble tilsatt til en testbrønn i nevnte testanordningskit inneholdende monoklonale anti-TSH-antistoffer adsorbert til dens vegger. 2) anti-3-TSH-pepperrotperoksidase-konjugat i det kommersielle kitet ble tilsatt til testbrønnen for dannelse av et ternaert kompleks

3) Inkubasjon ble utført ved 37°C i ca 30 minutter.

4) Ubundede materialer ble vasket fra testveggen ved bruk av den kommersielle vaskeoppløsnmgen i kitet 5) Oppløsningen (som beskrevet ovenfor) for generering av det kjemiluminescerende signalet ble deretter tilsatt, og det resulterende signalet ble evaluert etter 5 minutter ved bruk av kjemiluminescensavleserens "scan-only"-programvaremodus

Fig 3 viser signalresultatene. Vesentlig signal ble generert i nærvær av 4, 20 og 100 ul U /ml TSH (siste tre datapunkter) Foreliggende oppfinnelse er således nyttig for bestemmelse av en immunologisk analyt

Eksempler 19-21: Ytterligere knemiluminescerende sammensetninger

Flere vandige sammensetninger ble fremstilt og testet i likhet med de eksemplene 1-4 ovenfor Sammensetningene ble fremstilt ved blanding av cetyltrimetylammoniumklorid (0 1%), hydrogenperoksid (3 mmolar), dietylentrlammpentaeddiksyre (10 umolar) og forskjellige kjemiluminescerende midler (1 mmolar) i tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid buffer (0.05 molar, pH 7 2) Signalgenerermg ble målt ved 37° C ved bruk av et konvensjonelt Turner TD-20e luminometer da forskjellige mengder pepperrotperoksidase (Sigma Chemical XII) ble blandet med sammensetningene (sluttvolum på 200 ul) Som kjemiluminescerende midler inneholdt eksempel 19 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid, eksempel 20 inneholdt 2',5'-diklor-4 ' - hydroksyacetanilid og eksempel 21 inneholdt 2',3'-diklor-4'-hydroksyacetanilid.

Tabell VIII i det nedenstående viser de gjennomsnittlige lyssignalene generert av sammensetningene for tre replikater i hvert forsøk (10 sekunders integrerte lysenheter ved t=4 minutter) etter tilsetning av peroksidase "Signal-ti1-støy"-forholdet (S/N) er forholdet for lyssignalet generert av sammensetningen i nærvær av pepperrotperoksidase til signalet generert fra bakgrunnen (ingen peroksidase)

Claims (16)

1 Vandig sammensetning for tilveiebringelse av et kjemiluminescerende signal .karakterisert ved at den innbefatter. a) et oksidasjonsmiddel i en mengde fra ca 1 til ca 10 mmolar, b) et kationisk overflateaktivt middel av lav molekylvekt tilstede i en mengde fra ca 0 05 til ca 2% over dens kritiske micellekonsentrasjon, eller en kationisk polymer tilstede i en mengde fra ca 0.01 til ca 2 vekt-%, c) en buffer for opprettholdelse av sammensetningens pH-verdi ved fra ca 6 til ca 8,5, og d) et substituert acetanilid som er tilstede I en total mengde fra ca 0.05 til ca 10 mmolar som den eneste kjemiluminescerende signalgenererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til peroksydase, hvor det substituerte acetanilidet har strukturen (I)" hvor R<1> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer, R<2> er hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, alkoksyalkyl med 1-4 karbonatomer, hydroksyalkyl med 1-4 karbonatomer, ammoalkyl med 1-4 karbonatomer, halogenalkyl med 1-4 karbonatomer, eller alkenyl med 2-5 karbonatomer, R3 er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer, R<4> og R<5> er uavhengig hydrogen eller en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0,01, og R^ og R<7> er uavhengig hydrogen, halogen, cyano eller metyl, forutsatt at minst én av R<4> og R^ er en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0.01, og videre forutsatt at sammensetningen er vesentlig fri for noe annet kjemiluminescerende middel.

2 Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at R<1> er hydrogen eller metyl, R<2> er hydrogen, metyl , metoksymetyl, hydroksymetyl, klormetyl eller etenyl, R<3> er hydrogen eller metyl, R<4> og R^ er uavhengig hydrogen, halogen eller cyano, og R^ og R<7> er uavhengig hydrogen, klor eller metyl

3 Sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved at r! er hydrogen, R<2> er hydrogen eller metyl, R<3> er hydrogen, minst en av R<4> og R^ er klor eller brom, og R<*> og R<7> er hver hydrogen.;

4 . Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den ytterligere innbefatter peroksidase eller et peroksidase-merket spesifikt bindingsmolekyl;

5 Sammensetmg ifølge krav 1, karakterisert ved at det kationiske overflateaktive middelet er cetyltrimetylammoniumbromid eller cetyltrimetylammoniumklorid;

6 Sammensetning ifølge krav 5, karakterisert ved at oksydasjonsmiddelet er hydrogenperoksid, bufferen er tris(hydroksymetyl)ammometan, og det substituerte acetanilidet er 3'-klor-4'-hydroksyacetanilid eller 3'-brom-4'-hydroksyacetanilid;

7 . Diagnostisk testkit for bestemmelse av en analytt som katalytisk er relatert til peroksidase, karakterisert ved at nevnte kit i individuell forpakning innbefatter: i) den vandige sammensetningen ifølge krav 1, og ii) en peroksidase eller et peroksidasemerket spesifikt bindmgsmater lale;

8. Testkit ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte peroksidasemerkede spesifikke bindingsmateriale er et peroksidasemerket antistoff eller en peroksidasemerket spesifikk bmdmgsligandanalog.;

9 Testanordnmg for deteksjon av peroksidase eller en analytt som katalytisk er relatert til peroksidase, karakterisert ved at testanordnmgen innbefatter et absorberende bærermateriale, og inneholder: et kationisk overflateaktivt middel av lav molekylvekt tilstede i en mengde fra ca 0,05 til ca 2% over dets kritiske micellekonsentrasjon, eller en kationisk polymer tilstede i en mengde fra ca 0,01 til ca 2 vekt-%, en buffer for opprettholdelse av sammensetningens pH-verdi fra ca 6 til ca 8,5, og et substituert acetanilid som er tilstede 1 en total mengde fra ca 0,05 til ca 10 mmolar som den eneste kjeroi-lummescerende signalgenererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til peroksidase, hvor det substituerte acetanilidet har strukturen (I): hvor r! er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer, R<2> er hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, alkoksyalkyl med 1-4 karbonatomer, hydroksyalkyl med 1-4 karbonatomer, ammoalkyl med 1-4 karbonatomer, halogenalkyl med 1-4 karbonatomer, eller alkenyl med 2-5 karbonatomer, R<3> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer, og R<4> og R<5> er uavhengig hydrogen eller en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0,01, R^ og R<7> er uavgenig hydrogen, halogen, cyano eller metyl, forutsatt at minst én av R<4> og R<5> er en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0,01, og videre forutsatt at nevnte element er vesentlig fritt for noe annet kjemiluminescerende middel.;

10. Fremgangsmåte for frembringelse av et detekterbart signal som respons på peroksidase, karakterisert ved: A) reaksjon av en peroksidase i nærvær av a) et oksidasjonsmiddel i en mengde fra ca 1 til ca;10 mmolar, b) et kationisk overflateaktivt middel av lav molekylvekt til stede i en mengde fra ca 0,05 til ca 2% over dets kritiske micellekonsentrasjon, eller en kationisk polymer tilstede i en mengde fra ca 0,01 til ca 2 vekt-%, c) en buffer for opprettholdelse av sammensetningens pH-verdi ved fra ca 6 til ca 8,5, og d) et substituert acetanilid som er tilstede i en total mengde fra ca 0,05 til ca 10 mmolar som den eneste kjemiluminescerende signal genererende reagens som gir et signal som respons på den katalytiske aktiviteten til peroksidase, hvor det substituerte acetanilidet har strukturen (I). hvor R<*> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer, R<2> er hydrogen, .alkyl med 1-4 karbonatomer, alkoksyalkyl med 1-4 karbonatomer, hydroksyalkyl med 1-4 karbonatomer, aminoalkyl med 1-4 karbonatomer, halogenalkyl med 1-4 karbonatomer, eller alkenyl med 2-5 karhonatomer, R<3> er hydrogen eller alkyl med 1-4 karbonatomer, og R<4> og R<5> er uavhengig er hydrogen eller en elektronfjernende gruppe som har en Hammett-sigma verdi på minst ca 0,01, R<6> og R<7> er uavhengig hydrogen, halogen, cyano eller metyl, forutsatt at minst én av R<4> og R^ er en elektronfjerende gruppe som har en Hammett-sigmaverdi på minst ca 0,01, og videre forutsatt at intet annet kjemiluminescerende middel er til stede under reaksjonen, for frembringelse av et detekterbart kjemiluminescerende signal, og B) bestemmelse av det resulterende kjemiluminescerende signal som et mål for peroksidase

11 Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at peroksidasen detekteres som en del av et peroksidasemerket spesifikt bindingskompleks

12 Spesifikk bindingsanalyse for bestemmelse av en spesifikk bindingsligand, karakterisert ved at den innbefatter A) dannelse av et peroksidasemerket spesifikt bindingskompleks av en spesifikk bindingsligand med en reseptor som er spesifikk for nevnte ligand, B) anbringelse, etter separering av ikke-kompleksdannede materialer fra nevnte peroksidasemerkede spesifikke bindingskompleks, av nevnte peroksidasemerkede kompleks i kontakt med sammensetning ifølge krav 1 for frembringelse av et detekterbart kjemiluminescerende signal, og C) bestemmelse av det resulterende kjemiluminescerende signal som et mål for den spesifikke bindingsliganden.

13 Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den spesifikke bindingsliganden kompleksdannes med en første og annen reseptor for denne, hvor den første reseptoren er en oppfangingsreagens og den andre reseptoren er en deteksjonsreagens som bindes til peroksidase eller er en peroksidasemerket reagens, for derved å danne en sandwich av nevnte ligand og nevnte første og andre reseptorer

14 Fremgangsmåte ifølge krav 13, for bestemmelse av et antigen som nevnte spesifikke bindmgsmater lale, karakterisert ved at nevnte første og andre reseptorer er antistoffer som er spesifikke til nevnte antigen.

15 Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den spesifikke bindmgsliganden konkurrerer med en peroksidasemerket spesifikk bindingsligand for en enkelt reseptor som er spesifikk for den spesifikke bindings-1iganden.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, for bestemmelse av en nukleinsyre, karakterisert ved at nevnte første og andre reseptorer er oligonukleotider som er komplementære til forskjellige sekvenser i nevnte nukleinsyre.