FI112543B - Kemiluminoiva reagenssi ja analyysimenetelmä, joissa käytetään substituoitua asetanilidia valon muodostukseen - Google Patents

Description

1 12543

Kemiluminoiva reagenssi ja analyysimenetelmä, joissa käytetään substituoitua asetanilidia valon muodostukseen Tämä keksintö koskee kemiluminoivaa koostumusta, 5 koevälinesarjaa ja menetelmää erilaisten analysoitavien ai neiden toteamiseksi käyttäen substituoitua asetanilidia ainoana valoa kehittävänä reagenssina.

On hyvin tunnettua suorittaa vesipitoisen nesteen kvantitatiivinen tai kvalitatiivinen analyysi saattamalla 10 tämä neste kosketukseen reagenssien yhdistelmän kanssa, joka kykenee tuottamaan todettavissa olevan tuotteen suhteessa nesteessä olevan analysoitavan aineen väkevyyteen. Eräässä hyödyllisessä määritystyypissä käytetään hyväksi entsymaattisia reaktioita, joissa analysoitava aine joudut-15 tuaan kosketukseen sopivien reagnessien kanssa, reagoi hapen kanssa sopivan entsyymin läsnä ollessa tuottaen vetyperoksidia suhteessa analysoitavan aineen väkevyyteen. Todettavissa oleva tuote tuotetaan sitten vetyperoksidin reaktiolla suhteessa koenesteessä olevan analysoitavan aineen 20 väkevyyteen. Peroksidaasia käytetään yleensä tällaisissa määrityksissä.

’· ‘ Toisessa määrityksessä peroksidaasin annetaan rea- *. goida vetyperoksidin läsnä ollessa, jota on lisätty systee- ·,, : miin, kulloisenkin analysoitavan aineen määrän mittaamiseksi 25 si. Analysoitavat aineet, kuten glukoosi, triglyseridi, ; : : virtsahappo, kolesteroli ja kreatiinikinaasi voidaan myös todeta tällä tavoin samoin kuin määrätyt sidosligandit määrätyissä sidosmäärityksissä, joissa peroksidaasia käytetään todettavissa olevana merkkiaineena. Tällaisia määrityksiä 30 voidaan suorittaa liuoksessa, kuivina analyyttisinä määri-tyksinä tai diagnostisilla koelaitteilla. Tällaisissa mää-V · rityksissä tuotetut signaalit voivat olla kolorimetrisiä, kemiluminoivia tai fluoresoivia signaaleja käyttäen hyvin tunnettuja signaalin kehittäviä reagensseja.

' 35 On olemassa useita luminoivien tai luminometristen määritysten päätyyppejä, jotka tuottavat valon emission 2 Λ Λ , ' ?·“ / I ! : / » · *— V- ^ seurauksena kiinnostavan analysoitavan aineen läsnäolosta. Nämä määritykset tunnetaan myös kerniluminoivina määrityksinä ja niitä on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 729 950 (Kricka et ai.) ja siinä mainituissa julkaisuis-5 sa. Erilaisia aromaattisia amiineja ja fenoleja, kuten p-jodifenolia, pidetään hyödyllisenä valon kehittämisen parantamiseksi tällaisissa määrityksissä (ks. myös US-patentti julkaisu 4 598 044, Kricka et ai.). Eräs edullinen kolorimetristen määritysten parantaja on ollut 4’-10 hydroksiasetanilidi, jota on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 828 983 (McClune).

Vaikka parannetut kemiluminoivat systeemit tuottavat riittävän valosignaalin immuunimäärityksiin, reagenssin kokoonpanolla on tiettyjä haittoja. Optimi-pH-arvo valon 15 emissiolle luminolia käyttäen on 8,5. Optimi-pH-arvo pipar-juuriperoksidaasin aktiivisuudelle on kuitenkin alhaisempi (6 - 7). Johtuen luminolin voimakkaasta ei-entsymaattisesta hapettumisesta tausta on voimakas ja herkkyys laskee alhaisilla entsyymiväkevyyksillä. Sitä paitsi korkeammalla pH-20 arvolla reagenssikokoonpanolla on lyhentynyt varastointi- ikä (hapettimen epästabiilisuus ja luminolin hapettuminen). Tarve kriittisesti säätää useiden kokoonpanossa olevien ; reagenssien aktiivisuutta muodostaa huomattavia valmistus- : ja varastointiongelmia.

_ ’ 25 Herkkyyden parannus saavutettiin käyttäen kationi- : ; ; siä misellejä parantavana aineena olevan 4'- ; ; · hydroksiasetanilidin kanssa, kuten US-patenttijulkaisussa 5 279 940 (Kissel) on kuvattu. Kuitenkin useimmat edellä mainituista ongelmista jäävät jäljelle jopa tämän alalla 30 tapahtuneen edistysaskeleen jälkeen.

Kirjallisuudessa kuvataan lukuisia peroksidaasiin 1 >’ perustuvia reagenssisysteeme j ä, jotka aikaansaavat valon _ : emissiota lisäämällä tarkoituksellisesti tunnettua lumifo- / ria, kuten luminolia, lusigeniiniä, akridiniumestereitä tai 35 dioksetaaneja. On esimerkiksi tunnettua, että pyrogalloli (1,2,3-trihydroksibentseeni) on alusta valon kehittymiselle 3 A A i f, — ! ί,.: ’; 0 pH-arvolla 7. Ilmoitettu herkkyys on kuitenkin melko huono (toteamisraja 0,1 nM) ja alusta on huomattavan epästabiili itsehapettumisen suhteen. Erilaisten parannusaineiden, kuten o-fenyleenidiamiinin, tiedetään parantavan herkkyyttä, 5 mutta niiden käyttö vaatii monimutkaisemman ja epästabiilin reagenssikokoonpanon hallintaa aivan niin kuin luminolin tapauksessa.

On esiintynyt yrityksiä käyttää tavanomaisia fluoresoivia tai fosforoivia väriaineita kemiluminoivan signaa-10 Iin kehittävinä alustoina peroksidaasille. Esimerkiksi eo-siini Y:tä on käytetty yhdessä peroksidin kanssa pH-arvolla 6,5 peroksidaasitasojen seuraamiseen aina p-molaarisiin pitoisuuksiin asti. Tämä voidaan tehdä kuitenkin vain lisäämällä peroksidi väriaineen ja peroksidaasin seokseen ja kun 15 tämä tehdään, tausta on liian voimakas ja herkkyys melko huono.

Ketonien ja aldehydien, kuten asetonin ja propanaa-lin piparjuuriperoksidaasilla katalysoitu hapetus voi saada aikaan valon emissiota tietyillä fluoresoivilla väriaineil-20 la. Kuitenkin alhainen vaihtoluku ja alustan epästabiilisuus tekevät tällaiset systeemit epäkäytännöllisiksi kaupalliseen käyttöön.

; On havaittu, että valoa voidaan kehittää, kun pe- ' roksidaasia käytetään oksidaasina, kuten alustoina toimivan 25 NADH:n, dihydroksifumaraatin tai lusiferiinin kanssa. Myös ; näillä systeemeillä on ongelmansa, varsinkin huono herk- ; kyys, hapen tarve systeemissä (poisluettuna niiden käyttö kuivissa analyyttisissä elementeissä) ja monimutkaiset re-,·, aktiomekanismit.

30 Koukli et ai. (Analyst, 114, 711, 1989) kuvaavat asetaminofeenin (4'-hydroksiasetanilidin) määritystä pe-v * rustuen kemiluminenssiin, jota sen reaktio serium(IV):n f : kanssa tuottaa happamassa liuoksessa.

· Schmitt et ai. (Photochem. Photobiol. , 51, 719, 35 1990) osoittivat, että 4'-hydroksiasetanilidi kehittää va loa peroksidikatalyysillä kationisen misellin läsnä olles- 4 1 r..

sa. Kuitenkin vain peroksidaasin suuret pitoisuudet (yli 10 nM) analysoitavana ainena olivat todettavissa ja maksimi valon emissio havaittiin vain pH-arvolla 8,8. Mitään mainintaa ei esiinny siitä, että herkkyyttä voitaisiin paran-5 taa niin, että analysoitavan aineen p-molaarisia pitoisuuksia voitaisiin mitata neutraalilla pH-arvolla.

Näin ollen huolimatta huomattavasta tutkimuksesta tällä alalla jäljelle jää tarve yksinkertaiselle, erittäin herkälle peroksidaasin kemiluminoivalle toteamissysteemil-10 le, joka toimii neutraalilla pH-arvolla, jolla on heikko tausta hapettimen läsnä ollessa ja joka ei vaadi happea valon kehittämiseen.

Edellä mainitut ongelmat ratkaistaan vesipitoisella koostumuksella, joka on tarkoitettu aikaansaamaan kemilu-15 minoiva signaali ja joka sisältää: a) hapetinta noin 1-10 mM:n määrän, b) alhaisen moolimassan kationista pinta-aktiivista ainetta, jota on läsnä noin 0,05 - 2 % yli sen kriittisen misellipitoisuuden, tai kationista polymeeriä, jota on läs- 20 nä noin 0,01 - 2 paino-%, c) puskurointiainetta koostumuksen pH-arvon pitämi- "· ‘ seksi välillä noin 6 - 8,5 ja : d) substituoitua asetanilidia, jota on läsnä noin * 0,05 - 10 mM:n kokonaismäärä ainoana kerniluminoivan signaa- 25 Iin kehittävänä reagenssina, joka saa aikaan signaalin re-.* : : aktiona peroksidaasin katalyyttiseen aktiivisuuteen, jolla substituoidulla asetanilidilla on rakenne (I): 0 5 t V . ^ . P ^ . ‘ -t r *

k : I

pV'Y'Xr1'

ORJ

’’k 30 5 A Si ..... / ' , I \ j.c jossa R1 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-kyyliryhmä, R2 on vetyatomi, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyy-liryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkoksialkyyliryhmä, 5 1-4 hiiliatomia sisältävä hydroksialkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä aminoalkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä haloalkyyliryhmä tai 2-5 hiiliatomia sisältävä a1kenyy 1iryhmä, R3 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-10 kyyliryhmä, R4 ja R5 ovat toisistaan riippumatta vetyatomi tai elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vähintään noin 0,01 ja R6 ja R7 ovat toisistaan riippumatta vety- tai ha-15 loatomi, syaani- tai metyyliryhmä, edellyttäen, että ainakin toinen ryhmistä R4 ja R5 on elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vähintään noin 0,01 ja edellyttäen edelleen, että koostumus on oleellises-20 ti vapaa mahdollisesta muusta kemiluminoivasta aineesta.

Tämä keksintö kohdistuu myös diagnostiseen koevä-•f ‘ linesarjaan, jolla määritetään peroksidaasiin katalyytti- ; sesti liittyvä analysoitava aine, joka välinesarja sisältää erillisessä pakkauksessa: 25 i) edellä kuvattua vesipitoista koostumusta ja ; ii) peroksidaasia tai peroksidaasilla merkittyä ; spesifistä sidosyhdistettä.

Edelleen tämä keksintö kohdistuu koevälineeseen, jolla todetaan peroksidaasi tai peroksidaasiin katalyytti-30 sesti liittyvä analysoitava aine, joka koeväline koostuu absorboivasta kantoainemateriaalista ja sisältää: v : edellä kuvattua alhaisen moolimassan kationista : : pinta-aktiivista ainetta tai kationista polymeeriä, ,V( edellä kuvattua puskuria, ja 35 edellä kuvattua substituoitua asetanilidia, edellyttäen, että elementti on oleellisesti vapaa 6

s\ ✓·} ,·' A

! i l ,,11 c mahdollisesta muusta kemiluminoivasta aineesta.

Yhä edelleen tämä keksintö kohdistuu menetelmään, jolla tuotetaan todettavissa oleva signaali reaktiona pe-roksidaasille, jossa menetelmässä: 5 A) annetaan peroksidaasin reagoida edellä kuvatun vesipitoisen koostumuksen läsnä ollessa todettavissa olevan kerniluminoivan signaalin tuottamiseksi ja B) määritetään tuloksena oleva kemiluminoiva signaali peroksidaasin mittana.

10 Tämä keksintö kohdistuu myös spesifiseen sidosmää- ritykseen spesifisen sidosligandin määrittämiseksi, jossa menetelmässä: A) muodostetaan peroksidaasilla merkitty spesifisen sidosligandin spesifinen sidoskompleksi ligandille spesifi- 15 sen repseptorin kanssa, B) kun kompleksoitumattomat materiaalit on poistettu peroksidaasilla merkitystä spesifisestä sidoskompleksis-ta, saatetaan peroksidaasilla merkitty spesifinen sidos-kompleksi kosketukseen edellä kuvatun vesipitoisen koostu- 20 muksen kanssa todettavissa olevan kemiluminoivan signaalin tuottamiseksi ja C) määritetään tuloksena oleva kemiluminoiva signaali spesifisen sidosligandin mittana.

.* Esillä oleva keksintö saa aikaan yksinkertaistetun 25 kemiluminoivan toteamissysteemin peroksidaasille käyttäen mitä tahansa tietyistä substituoiduista asetanilideista ke-; miluminoivana aineena tavanomaisten reagenssien sijasta.

Tämä systeemi tekee käyttäjälle mahdolliseksi todeta peroksidaasin p-molaarisia tasoja liuoksessa tai käyttää kuivia 30 analyyttisiä elementtejä suhteellisen neutraalilla pH-arvolla ja tämä saa aikaan suuren herkkyyden. Heikko tausta ilman peroksidaasia havaitaan myös käytettäessä tämän keksinnön toteutusta.

• Kuvio 1 on pylväsdiagrammi, joka esittää kemilu- . 35 minointisignaalia eri pH-arvoilla tämän keksinnön koostu mukselle, kuten jäljempänä esimerkissä 9 kuvataan.

7 Λ -. ...... / 7 ! ί ... "

Kuvio 2 on pylväsdiagrammi, joka esittää kemilu-minointisignaalia eri pH-arvoilla tarkistuskoostumukselle kuten jäljempänä olevassa esimerkissä 9 kuvataan.

Kuvio 3 on graafinen esitys kemiluminoivasta sig-5 naalista kilpirauhasta kiihottavan hormonin (TSH) logaritmisen pitoisuuden funktiona, kuten jäljempänä olevassa esimerkissä 18 kuvataan.

Esillä oleva keksintö voidaan toteuttaa edullisesti missä tahansa analyyttisessä menetelmässä, joka on suunni-10 teltu kehittämään kemiluminoiva signaali reaktiona peroksi-daasin läsnäololle. Tällaisia määrityksiä voivat olla orgaanisen tai epäorgaanisen peroksidin (kuten vetyperoksidin) tai peroksidaasin (sen vapaassa muodossa) toteaminen tai muun ei-immunologisen analysoitavan aineen kuin perok-15 sidaasin tai vetyperoksidin toteaminen. Erityisesti tämä keksintö on hyödyllinen spesifisten sidosmääritysten toteuttamisessa, jotka kehittävät kerniluminoivan signaalin.

Määritys voi olla kvalitatiivinen tai kvantitatiivinen tai molempia ja sitä voidaan käyttää biologisen tai 20 kemiallisen aineen (ts. analysoitavan aineen) toteamiseen vesipitoisissa nesteissä mukaan luettuna ihmisen tai eläinten biologiset nesteet, jätenesteet, elintarvikkeet, ympä-: ristöön joutuva poistovirta, kemialliset prosessointi- ’ nesteet ja muut alaan perehtyneelle helposti ilmi käyvät 25 näytteet. Erityisesti määritystä voidaan käyttää analysoi-; tavan aineen toteamiseen ihmisen tai eläinten biologisista ; nesteistä mukaan luettuna, niihin kuitenkaan rajoittumatta, täysveri, seerumi, plasma ja virtsa.

Vetyperoksidi (tai muu peroksidi) voidaan määrittää ..*t 3 0 tällä menetelmällä. Lisäksi tätä keksintöä voidaan käyttää analysoitavien aineiden määrittämiseen, jotka kykenevät ; * tuottamaan vetyperoksidia, ts. analysoitavien aineiden, ; jotka ottavat osaa yhteen tai useampiin reaktioihin tuotta- , en vetyperoksidia sopivien signaalin kehittävien reagenssi- 35 en ja peroksidaasin läsnä ollessa. Tällaisia analysoitavia 8 1 I : Λ aineita pidetään tässä "analysoitavina aineina, jotka liittyvät katalyyttisestä peroksidaasiin".

Edullisessa toteutusmuodossa tämä keksintö on hyödyllinen spesifisen sidosligandin tai sitä vastaavan resep-5 torin määrittämiseen (ts. aineen, joka sitoutuu spesifisesti ligandiin). Tällaisia ligandeja ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, vasta-aineet ja muut proteiinit (mukaan luettuna lipoproteiinit, veriproteiinit, entsyymit ja glyko-proteiinit), hapteenit, lääkeaineet, hormonit, steroidit, 10 myrkylliset aineet, virukset, bakteerit, vitamiinit, sakka-ridit (polysakkaridit mukaan luettuna) , immuunijärjestelmän modulaattorit (kuten interleukiinit), lipidit, nukleiinihapot, ei-proteiinipitoiset veren komponentit tai mitkä tahansa niiden komponentit, jotka alaan perehtynyt helposti 15 ymmärtää.

Tämän keksinnön kerniluminoivan signaalin kehittävän vesipitoisen koostumuksen kriittinen komponentti on yksi tai useampi edellä määritellyn rakenteen (I) mukainen substituoitu asetanilidi. Nämä yhdisteet ovat ainoita kerni -20 luminoivan signaalin kehittäviä reagensseja, joita tämän keksinnön toteutuksessa käytetään. Toisin sanoen koostumukset, koevälinesarjat, koevälineet ja -menetelmät ovat ; oleellisesti vapaita kaikista muista kerniluminoivan signaa- '· Iin kehittävistä reagensseista. Sanonnalla "oleellisesti 25 vapaa" tarkoitetaan, että joko näitä reagensseja ei ole lainkaan läsnä tai niitä on läsnä niin pienet määrät, että mahdollinen signaali, jonka ne kehittävät, ei ole todettavissa taustasignaalin yli.

Näin ollen tämän keksinnön toteutuksessa erilaisten 30 muiden tavanomaisten kerniluminoivan signaalin kehittävien ” yhdisteiden käyttö voidaan välttää. Esimerkiksi luminoli ja V : vastaavat 2,3-dihydro-1,4 - ftalatsiinidionijohdannaiset väl- : tetään esillä olevan keksinnön avulla.

Valosignaalin kehittämiseen käytetyt yhdisteet mää-35 ritellään rakenteella (I) : 9 0 z'-x-z-z* F* \ F; 4 R * OR·1 jossa R1 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-kyyliryhmä (kuten metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, hydrok-5 simetyyli-, aminometyyli- ja metoksimetyyliryhmä). Edullisesti R1 on vetyatomi tai metyyliryhmä ja edullisemmin se on vetyatomi.

R2 on vetyatomi, 1 - 4-hiiliatomia sisältävä alkyy-liryhmä (kuten metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, t-butyyli-10 ja isobutyyliryhmä) ,1-4 hiiliatomia sisältävä alkoksial-kyyliryhmä (kuten metoksimetyyli- ja metoksietyyliryhmä), 1-4 hiiliatomia sisältävä hydroksialkyyliryhmä (kuten hydroksimetyyli-, 1-hydroksietyyli-, 2-hydroksietyyli- ja 2,3-dihydroksipropyyliryhmä), 1-4 hiiliatomia sisältävä 15 aminoalkyyliryhmä (kuten aminometyyli-, 2-aminoetyyli-, 3- aminopropyyli-, 2,4-diaminobutyyli-, metyyliaminometyyli-, .* ‘ 2,2-dimetyyliaminoetyyli- ja 4-aminobutyyliryhmä), 1-4 hiiliatomia sisältävä ha loal kyy li ryhmä (kuten kloorimetyy-iit·’ li-; bromimetyyli-, 2-kloorietyyli-, 1,1-dikloorimetyyli- , ;· 20 1,1,1-trikloorimetyyli-, 2,2,2-trikloorietyyli- ja 3- klooripropyyliryhmä) tai 2-5 hiiliatomia sisältävä alke- nyyliryhmä (kuten etenyyli-, 1-propenyyli-, isopropenyyli-ja 2-butenyyliryhmä) . Edullisesti R2 on vetyatomi, metyy- li-; metoksimetyyli-, hydroksimetyyli-, kloorimetyyli- tai ,,( 25 etenyyliryhmä. Vielä edullisemmin se on vetyatomi tai me tyyliryhmä, joista metyyliryhmä on kaikkein edullisin.

: R3 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al- ! ; kyyliryhmä (kuten metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, t- butyyli-, n-butyyli- ja isobutyyliryhmä). Edullisesti R3 on 30 vetyatomi tai metyyliryhmä ja edullisemmin se on vetyatomi.

t j I'''· i ' A ” i ,:. ,: il ...

10 R4 ja R5 ovat toisistaan riippumatta vetyatomi tai elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vähintään noin 0,01 ja edullisesti vähintään noin 0,3 edellyttäen, että ainakin toinen näistä kahdesta radikaalista 5 on elektronin poistava ryhmä.

Hammett-sigma-arvot lasketaan standardimenettelyjen mukaan, joita on kuvattu esimerkiksi teoksissa Steric Effects in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., 1956, sivut 570 - 574 ja Progress in Physical Organic Chemistry, 10 Vol. 2, Interscience Publishers, 1964, sivut 333 - 339.

Edustavia elektronin poistavia ryhmiä, joilla on positiiviset Hammett - sigma-arvot, ovat syaani-, karboksi-, nitro-, halo- (fluori-, bromi-, kloori- tai jodi-), trihalometyyli-(esim. trifluorimetyyli- tai trikloorimetyyli-), karbonyy-15 li-, karbamoyyli-, sulfonyyli-, sulfamoyyli- ja esteriryh-mät ja muut, jotka ovat alaan perehtyneelle helposti ilmeneviä. Edullisia elektronin poistavia ryhmiä ovat halo-(kuten kloori- tai bromi-) ja syaaniryhmät. Kloori-, bromi-ja syaaniryhmät ovat edullisempia elektronin poistavia ryh-20 miä ja kloori- ja bromiryhmät ovat kaikkein edullisimpia kummallekin radikaaleista R4 ja R5.

* R6 ja R7 ovat toisistaan riippumatta vetyatomi, me- ; tyyli-, syaani- tai haloryhmä (kuten kloori- tai bromiryh- mä) . Edullisesti jompikumpi tai molemmat substituenteista 25 ovat vetyatomi, metyyli- tai klooriryhmä ja kaikkein edul-; ; : lisimmin molemmat ovat vetyatomeja.

; i ; Tyypillisiä elektroninsiirtoaineita, joilla on ra- i kenne (I), ovat: : V , 3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidi, 3 0 3', 5 '-dikloori-4 '-hydroksiasetanilidi, 7' 2'-metyyli-31-kloori-4'-hydroksiasetanilidi, v · 2',31-dikloori-4'-hydroksiasetanilidi, ί (_ _ '· 2 ' , 5 ' -dikloori -4 ' -hydroksiasetanilidi , , ·. *, 3'-fluori-4'-hydroksiasetanilidi, 35 3',5'-difluori-41-hydroksiasetanilidi, 31-bromi-4'-hydroksiasetanilidi, 11 11:.;;' 3 3’,51-dibromi-4'-hydroksiasetanilidi, 31-kloori-41-hydroksi-61-metyyliasetanilidi , 31-syaani-41-hydroksiasetanilidi, 31,51-disyaani-41-hydroksiasetanilidi, 5 N-metyyli-N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)asetamidi, N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli) metakryyliamidi , N-(3-kloori-4-metoksifenyyli)asetamidi, N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)-2-klooriasetamidi, N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)-2,2-10 diklooriasetamidi, N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)-2,2,2-triklooriasetamidi, N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)-2-hydroksiasetamidi, N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)-2-metoksiasetamidi 15 j a N-(3-kloori-4-hydroksifenyyli)-2-aminoasetamidi. Kaikkein edullisimpia yhdisteitä ovat 31-kloori-41 -hydroksiasetanilidi ja 3'-bromi-4'-hydroksiasetanilidi.

Eräitä näistä yhdisteistä on kaupallisesti saatava-20 na. Muita voidaan valmistaa tunnetuista lähtöaineista ylei sesti seuraavasti:

Rakenteen (I) halogenoidut yhdisteet valmistetaan : halogenoimalla tunnettua edeltäjäanilidia (esim. 4'- ,t: hydroksi- tai alkoksiasetanilidia) tunnetulla halogenointi- 25 aineella, kuten sulfuryylikloridilla, sulfuryylibromidilla, tai vapaalla halogeenilla hapon läsnä ollessa. Kun haluttua : ; ede11äjäyhdiste11ä ei ole saatavissa, sopivasti substituoi- tua fenolia voidaan nitrata lievällä nitrauksella käyttäen tunnettua tekniikkaa (esimerkiksi typpihapolla liuottimes-30 sa, kuten jääetikassa) mitä seuraa hydraus, tyypillisesti platinan tai palladiumin yläpuolella amiinin valmistamisek-· .; : si (ks. J, Am. Chem. Soc. 4 9, 1093, 1927) . Amiini asyloi- : daan sitten esimerkiksi kondensoimalla halutulla asylointi- , ·. aineella, kuten anhydridillä (esimerkiksi etikkahappoanhyd- 35 ridillä) tai happokloridilla, kuten akryylihappokloridilla, anilidin valmistamiseksi. Sopivia asylointimenettelyjä ovat 12 s i / 1 i il. f' v- kuvanneet myös Challis et ai., The Chemistry of Amides, sivut 731 - 857, Intersciences Publishing, New York, 1970.

Jos valitut lähtöaineet eivät jo saa aikaan vaadittavia elektronin poistavia ryhmiä, tuloksena oleva anilidi voi-5 daan sopivasti halogenoida edellä kuvatulla tavalla. Vaihtoehtoisesti anilidin amiiniedeltäjä voidaan asyloida asy-lointiaineella, joka saa aikaan radikaalissa R2 olevan ryhmän (esimerkiksi trikloorietikkahappokloridilla tai male-iinihappoanhydridillä) tai anilidin aromaattinen rengas 10 voidaan alkyloida, asyloida tai nitrata R4 tai R5-asemasta (tai molemmista) käyttäen tunnettua tekniikkaa vaadittavien elektronin poistavien ryhmien aikaansaamiseksi radikaaleista R4 ja R5.

Tämän keksinnön vesipitoisen koostumuksen toinen 15 komponentti on alhaisen moolimassan kationinen pinta-aktiivinen aine, jolla aikaansaadaan misellejä, tai kationinen polymeeri, jolla aikaansaadaan hydrofobinen ympäristö parannetulle herkkyydelle, varastostabiilisuudelle ja kineettiselle stabiilisuudelle.

20 Pinta-aktiiviset aineet ovat yleisesti yhdisteitä, jotka alentavat veden pintajännitystä, kuten alaan perehtynyt hyvin ymmärtää. Yleensä tällaiset materiaalit ovat synteettisiä, mutta joitakin esiintyy luonnossa. Kationisilla pinta-aktiivisilla aineilla on positiivinen nettovaraus ja 25 niitä on kuvattu lukuisissa julkaisuissa, mukaan luettuna esimerkiksi Surfactants and Interfacial Phenomena, toim. Milton J. Rosen, John Wiley and Sons, N.Y., 1978, sivut 13 - 17 ja niitä on lueteltu kauppanimillä julkaisussa

McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, North American 30 Ed., McCutcheon's Division The Manufacturing Confectioner Publishing Co., 1988, sivu 259. Pinta-aktiivisissa aineissa olevia positiivisia varauksia voivat saada aikaan kationi- set ryhmät, joita ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, kvaternäärinen ammonium-, kvaternäärinen fosfonium-, sul-35 fonium-, pyridinium-, pyrimidinium-, imidatsolium- ja ok-soniumionit.

13

Vi:'."-:.'

Erityisen hyödyllisiä, kationisia pinta-aktiivisia aineita ja polymeerejä voidaan esittää rakenteella (II): R9

5 I

R8 - N+ - R10 X" R11 10 jossa R8 on substituoitu tai substituoimaton alkyyliryhmä, jossa on vähintään 7 hiiliatomia ja edullisesti vähintään 10 - 20 hiiliatomia (kuten n-oktyyli-, isononyyli-, isode-kyyli-, dodekyyli-, tetradekyyli-, heksadekyyli-, oktade-kyyli-, eikosyyli-, 2,7,8-trimetyylidekyyli-, 4-etyyli-6- 15 metyylidodekyyli-, bentsyyli- ja fenetyyliryhmät), substi-tuoidut tai substituoimattomat aryyliryhmät, joiden aromaattisessa ytimessä on 6 - 14 hiiliatomia (kuten fenyyli-, naftyyli- tai antryyliryhmät), jotka voi olla substituoitu yhdellä tai useammilla hydrofobisilla ryhmillä, kuten 1 -20 10 hiiliatomia sisältävillä lineaarisilla tai haarautuneil la alkyyliryhmillä (kuten metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, t-butyyli-, heksyyli-, oktyyli-, iso-oktyyli-, nonyyli- tai : isononyyliryhmillä), haloryhmillä ja muilla alaan perehty- : neen tuntemilla ryhmillä. Tällaisia substituoituja aryyli- 25 ryhmiä ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, ksylyyli-, , tolyyli-, isononyylifenyyli-, dimetyylifenyyli- ja trikloo- rifenyyliryhmät. R8 voi myös olla 8-20 hiiliatomia sisältävä substituoitu tai substituoimaton alkenyyliryhmä (kuten 1-oktenyyli-, 1-dekenyyli- ja 2-dodekenyyliryhmä) tai poly-30 meerinen ryhmitys (kuvataan jäljempänä).

• ' Edullisesti R8 on 14 - 16 hiiliatomia sisältävä al- ' kyyli- tai alkenyyliryhmä sellaisten ryhmien kuin 2,4- dimetyyli-6-etyylidekyyli-, tetradekyyli- ja heksadekyyli -ryhmät ollessa edullisempia.

3 5 Rakenteessa (II) R9 voi olla alkyyli- tai alkenyy- liryhmä, joka määriteltiin radikaalille Rs, 1-7 hiiliato-‘ 1 mia sisältävä substituoitu tai substituoimaton alkyyliryhmä (kuten metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, t-butyyli-, metok- 14 ιι<:- simetyyli-, bentsyyli- ja heksyyliryhmä), 2-7 hiiliatomia sisältävä substituoitu tai substituoimaton alkenyyliryhmä (kuten etenyyli-, allyyli-, isopropenyyli- ja n-butenyyliryhmä) tai karbosyklinen aryyliryhmä, jonka ren-5 gassysteemissä on 6 - 10 hiiliatomia (kuten fenyyli-, to- lyyli-, ksylyyli-, naftyyli- ja p-metoksifenyyliryhmä).

R10 ja R11 ovat toisistaan riippumatta 1-7 hiiliatomia sisältäviä substituoituja tai substituoimattomia alkyyliryhmiä (kuten metyyli-, etyyli-, isopropyyli-, 10 t-butyyli-, metoksimetyyli-, bentsyyli- ja heksyyliryhmiä); 2-7 hiiliatomia sisältäviä substituoituja tai substituoimattomia alkenyyliryhmiä (kuten etenyyli-, isopropenyyli-ja allyyliryhmiä) tai karboksyklisiä aryyliryhmiä, joiden rengassysteemissä on 6 - 10 hiiliatomia (kuten fenyyli-, 15 tolyyli-, ksylyyli-, naftyyli- ja p-metoksifenyyliryhmiä).

Vaihtoehtoisesti mitkä tahansa kahden tai kolmen radikaaleista R9, R10 ja R11 voidaan ajatella yhdessä edus tavan riittävää määrää hiiliatomeja ja happi-, typpi- tai rikkiatomeja 5- tai 6-jäseninen heterosyklyylisen kationi-20 sen ryhmän muodostamiseksi yhdessä kvaternäärisen ammonium-ryhmän kanssa. Esimerkkejä tällaisista ryhmistä ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, pyridinium-, piperidinium-, pyrrolidinium-, morfolinium-, kinolinium-, pyrimidinium-, .: akridinium-, bentsotiatsolium-, bentsoksatsolinium- ja imi- . ‘ 2 5 datsoliumryhmät.

: ; Edullisesti R9, R10 ja R11 ovat toisistaan riippu- ; ; ; matta metyyli- tai etyyliryhmiä.

X' on sopiva yksiarvoinen hapan anioni, joka ei ole peroksidaasien alusta-aine tai inhibiittori, mukaan luettu-30 na, niihin kuitenkaan rajoittumatta, perkloraatti-, hali-di-, (kuten fluoridi-, kloridi- ja bromidi-ionit), tetra- fluoriboraatti-, triflaatti-, metyylisulfaatti-, heksafluo- rif osf aatti-, nitraatti-, p-tolueenisulfonaatti-ionit ja muut, jotka käyvät alaan perehtyneelle helposti ilmi. Hali-, ; 35 dianionit ovat etusijalla.

15 1i::.::::

Esimerkkejä hyödyllisistä ei-polymeerisistä ka-tionisista pinta-aktiivisista aineista ovat heksadekyylit-rimetyyliammoniumkloridi, dodekyylitrimetyyliammoniumklori-di, setyylitrimetyyliammoniumbromidi (tunnetaan myös nimel-5 lä heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidi), kookostrimetyy-liammoniumkloridi, talitrimetyyliammoniumkloridi, soijatri-metyyliammoniumklori- di, myristyylitrimetyyliammoniumbromidi, stearyylitrimetyy-liammoniumkloridi, setyylietyylidimetyyliammoniumbromi- 10 di, didodekyylidimetyyliammoniumbromidi, setyylipyridinium- kloridi ja myristyylidimetyylibentsyyliammoniumkloridi.

Setyylitrimetyyliammoniumbromidi ja setyylitrime-tyyliammoniumkloridi ovat kaikkein edullisimpia.

Useimpia näistä pinta-aktiivisista aineista on hel-15 posti saatavissa lukuisista kaupallisista lähteistä. Kokeneet kemistit voivat helposti valmistaa muita käyttäen tunnettuja lähtöaineita ja menettelyjä.

Kun R8 rakenteessa (II) on polymeerinen ryhmitys, tällaisen polymeerin perusrunko voi olla tavanomaista poly-20 esteriä, polyamidia, polyetyleeni-imiiniä, polykarbonaat- tia, selluloosamateriaalia ja vinyyliadditiohomo- ja kopo-lymeeria, joka koostuu sellaisen monomeerin toistuvista yk-siköistä, jolla on haluttu positiivinen varaus. Nämä mate-riaalit voidaan valmistaa tavanomaisista materiaaleista 25 käyttäen tavanomaisia menettelyjä. Polymeerissä voi olla : : : varauksia, jotka ovat liittyneet siihen lähtömateriaaleista ; ; j. lähtien tai kemiallisesta reaktiosta sen valmistuksen jäl keen.

Erityisen hyödyllisiä kationisia polymeerejä ovat > 3 0 vinyyliadditiohomo- tai -kopolymeerit, jotka on valmistettu 1’ etyleenisesti tyydyttymättömistä polymeroituvista monomee- V : reistä, joissa on vaadittavat positiivisesti varautuneet : ryhmät, ja yhdestä tai useammista komonomeereista, jotka aikaansaavat hydrofobisia alueita, jotka ovat tunnusomaisia ’ \ 35 pinta-aktiivisille aineille, silloitettuja alueita tai mui ta sopivia ominaisuuksia.

11 /-7 16

Tyypillisiä kationisia monomeereja ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, N-sykloheksyyli-N,N-dimetyyli-N-(m-ja p-vinyylibentsyyli)ammoniumkloridi, N-bentsyyli-N,N-dimetyyli-N-(m- ja p-vinyylibentsyyli)ammoniumkloridi, 3- 5 (2-hydroksipropyyli)-1-vinyyli-imidatsoliumkloridi ja 1-me- tyyli-4-vinyylipyridiniumkloridi. Hyödyllisiä komonomeerejä ovat, niihin kuitenkaan rajoittumatta, styreeni ja sen johdannaiset (kuten vinyylitolueeni ja p-t-butyylistyreeni), akryyli- ja metakryylihappoesterit(kuten metyyliakrylaatti, 10 metyylimetakrylaatti, butyyliakrylaatti ja butyylimetakry- laatti), silloittuvat monomeerit (kuten divinyylibentseeni, etyleenidiakrylaatti, etyleenidimetakrylaatti ja N,N'-metyleenibis(akryyliamidi). Muita hyödyllisiä polymeerejä on kuvattu esimerkiksi peittausaineina US-patenttijulkai-15 suissa 4 069 017 (Wu et ai.) ja 4 024 839 (Wu et ai.). Tällaisissa materiaaleissa on yleensä kvaternäärisiä ammonium-tai kvaternäärisiä fosfoniumryhmiä, jotka riippuvat polymeerin perusrungosta ja edullisesti vähintään noin 40 - 100 paino-%:lla etyleenisesti tyydyttymättömistä, polymeroitu-20 vasta monomeerista johdetuista toistuvista yksiköistä on tällaisia ryhmiä. Loput toistuvista yksiköistä voi olla johdettu lukuisista eri etyleenisesti tyydyttymättömistä ; polymeroituvista monomeereista, kuten edellä yksilöidyissä patenteissa on mainittu.

25 Tyypillisiä kationisia polymeerejä ovat, niihin : kuitenkaan rajoittumatta, poly(N,M,N-trimetyyli-N-vinyyli- ; , bentsyyliammoniumkloridi) , poly[styreeni-ko-bentsyyli-N,N- dimetyyli-N-(m- ja p-vinyylibentsyyli)ammoniumkloridi-ko- y, divinyylibentseeni], poly(N,N,N-trioktyyli-N-vinyylibents- * 30 yylifosfoniumkloridi) , poly [styreeni-ko-N-vinyylibentsyyli- 1 N,N,N-triheksyyliammoniumkloridi] , poly(styreeni-ko-N,N,N- V · trimetyyli-N-vinyylibentsyyliammoniumkloridi), poly[N-syk- ^: loheksyyli-N,N-dimetyyli-N-(m- ja p-vinyylibentsyyli)ammo- niumkloridi] , poly[styreeni-ko-l-vinyyli-imidatsoli-ko-3-1 35 (2-hydroksietyyli)-1-vinyyli-imidatsoliumkloridi] ja muut, jotka käyvät alaan perehtyneelle helposti ilmi. Edullinen 11 17 kationinen polymeeri on poly[N-sykloheksyyli-N,N-dimetyyli-N(m- ja p-vinyylibentsyyli)ammoniumkloridi].

Tämän keksinnön signaalin aikaansaava koostumus puskuroidaan yleensä pH-arvoon noin 6 - 8,5 (edullisesti noin 5 6,5-8) käyttäen yhtä tai useampia alalla hyvin tunnettuja sopivia puskureita. Esimerkiksi sellaisia puskureita kuin tris(hydroksimetyyli)aminometaania, bis(2-hydroksietyyli)-iminotris(hydroksimetyyli)metaania, N,N-bis(2-hydroksietyyli) -2-aminoetaanisulfonihappoa, 1,3-bis[tris(hydroksimetyy-10 li)metyyliamino]propaania, N-(2-hydroksietyyli)piperatsii-ni-N'-(3-propaanisulfonihappoa), N-(2-hydroksietyyli) piper-atsiini-N'-(2-etaanisulfonihappoa) ja fosfaattia voidaan käyttää. Tris(hydroksimetyyli)aminometaani on etusijalla. Termi "noin" viittaa pH-arvon määrittelemiseen käytettynä 15 ±0,2 yksikköön.

Tämän keksinnön toteutuksessa tarvitaan hapetinta aiheuttamaan substituoidun asetanilidin viritys niin, että valoa emittoituu peroksidaasin läsnä ollessa. Tunnetaan erilaisia hyödyllisiä hapettimia, mutta perboraatti-ioni ja 20 vetyperoksidi ovat edullisia, viimemainitun ollessa kaikkein edullisin.

Erilaisia valinnaisia lisäaineita, joita voidaan sisällyttää tämän keksinnön vesipitoiseen koostumukseen, ovat kelatointiaineet, erilaiset epäorgaaniset suolat ioni-25 vahvuuden lisäämiseksi (kuten natriumkloridi ja kaliumklo-ridi) ja stabilisaattorit, kuten natriumbentsoaatti.

: ; ; Tämän keksinnön vesipitoisessa, signaalin aikaan saavassa koostumuksessa kunkin komponentin määriä voidaan vaihdella riippuen siitä, missä sitä on tarkoitus käyttää, 30 reagenssien kulloisestakin herkkyydestä ja muista tekijöistä, jotka alaan perehtynyt helposti ymmärtää. Näin ollen seuraavien yleisten vaihtelualueiden on tarkoitettu aikaan- ·., I saavan opasteen kokeneelle työntekijälle eikä rajoittavan ·,·, tämän keksinnön toteutusta.

35 Hapettimen määrä on yleensä vähintään noin 1 mM, määrän välillä noin 1 - 10 mM ollessa edullinen. Rakenteen 11::.:: /:: 18 (I) substituoitua asetanilidia on yleensä läsnä vähintään noin 0,05 mM:n määrä, alueen välillä noin 0,05 - 10 mM ollessa etusijalla. Kationista pinta-aktiivista ainetta on yleensä läsnä noin 0,05 - 2 %:n määrä yli kriittisen misel-5 lipitoisuuden ja kun käytetään kationista polymeeriä, sitä on yleensä läsnä noin 0,01 - 2 paino-%:n määrä. Puskurin määrä voi vaihdella riippuen käytetystä puskurista, mutta yleensä se on noin 0,01 - 0,3 molaarinen. Pitoisuuksien määrittelemiseen tässä käytettynä termi "noin" viittaa 10 +10 %:iin mainitusta arvosta.

Monien pinta-aktiivisten aineiden "kriittinen mi-sellipitoisuus" on hyvin tunnettu tai se voidaan helposti määrittää käyttäen menettelyjä, joita on kuvattu esimerkiksi teoksessa Surfactant Science and Technology, Meyers, VCH 15 Publishers, New Yrok, luku 3, 1988.

Tämä keksintö kohdistuu myös peroksidaasia sisältävään vesipitoiseen koostumukseen osana välinesarjaa, joka koostumus sisältää peroksidaasia vapaassa muodossa tai merkkiaineena, joka on konjugoitu spesifiseen sidosmolekyy-20 liin (kuten vasta-aineeseen, avidiiniin tai biotiiniin). Tällainen koostumus voi olla myös puskuroitu kuten edellä kuvattiin tämän keksinnön signaalin aikaansaavan koostumuk-• : sen suhteen. Tässä koostumuksessa läsnä olevan peroksidaa- sin tai peroksidaasilla merkityn spesifisen sidosmolekyylin 25 määrät kävisivät alaan perehtyneelle helposti ilmi.

Edellä kuvattujen koostumusten ohella välinesarja voi sisältää myös muita erikseen pakattuja reagensseja, välineitä ja ohjeita, jotka ovat hyödyllisiä lukuisten eri analyyttisten menetelmien (kuvataan jäljempänä) toteuttami-·.' 30 sessa. Välinesarjan komponenttien pakkaaminen on alalla hy vin tunnettua.

·.· · Tässä käytettynä "peroksidaasin" tarkoitetaan ole- ' J van mikä tahansa peroksidoiva aine (entsymaattinen tai ,·+, muu), joka katalysoi alustan, toisin sanoen tässä kuvatun 35 substituoidun asetanilidin hapettumista sopivan valon emission aikaansamiseksi. Mikrobi-, sieni- ja kasviperoksidaa- 19 11 :." 47 sit ovat etusijalla piparjuuriperoksidaasin ollessa kaikkein edullisin. Peroksidaasin määrä voi vaihdella laajasti johtuen muiden reaktiossa käytettyjen komponenttien määrästä. Hyödyllinen määrä käy alaan perehtyneelle helposti il-5 mi, mutta minimimäärä olisi yleensä vähintään noin 1 x 10"7 I. U./ml (tai vastaava määrä ei-entsymaattisille peroksidoi-ville aineille). I.U. edustaa entsyymiaktiivisuuden kansainvälistä yksikköä ja se määritellään entsyymiaktiivisuuden määräksi, joka vaaditaan katalysoimaan alusta-aineen 1 10 mikromoolin konversio tuotteeksi minuutissa standardiolo-suhteissa.

Spesifisissä sidosmenetelmissä peroksidaasia käytetään konjugaattina spesifisen sidosligandin tai sen reseptorin kanssa tai spesifisen sidosmolekyylin kanssa, joka 15 reagoi joko ligandin tai reseptorin kanssa. Ligandi ja reseptori ovat kompleksoituja tällaisissa määrityksissä ja siten merkittyjä peroksidaasilla merkityn kompleksi- tai merkityn kompleksoimattoman materiaalin mahdollista toteamista varten. Tällaisten konjugaattien valmistus voidaan 20 saada aikaan käyttäen useita eri tunnettuja tekniikoita (esimerkiksi kuten ovat kuvanneet Yoshitake et. ai., Eur.

J. Biochem, , 101, 395, 1979 ja Kondo et ai. US-patentti- julkaisusssa 5 106 732.

Erilaiset spesifiset sidosmääritysmuodot ovat hyö-25 dyllisiä tämän keksinnön toteutuksessa ja niihin kuuluvat ; nukleiinihapon hybridisointimääritykset, immuunikemialliset ; , ; määritykset (kuten entsyymi -immuunimääritykset, kerrosmää- ritykset, kilpailevat sidosmääritykset, suorat sidosmääri-tykset) ja muut alalla hyvin tunnetut määritykset. Tällai-30 siä määrityksiä on kuvattu yleisesti esimerkiksi US- patenttijulkaisuissa 4 598 044, 4 745 077 (Holian et ai.), • - 5 077 198 (Shih et ai.), 5 085 986 (Mauck et ai.), Matthews ! et ai., Anal. Biochem., 169, sivut 1 - 25 (1988) ja W0 88/01302 (julkaistu 25. helmikuuta 1988). Tämän keksinnön 35 menetelmää voi edeltää vahvistusprosessi, kuten polyme raasiketjureaktio (tunnetaan yleisesti lyhenteellä PCR) , 20 li:/ jota on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 965 188 (Mullis et ai.) ja ligaasiketjureaktio, jota on kuvannut yleisesti Weiss, Science, 254, sivut 1292 - 1293, 1991, tavoitellun nukleiinihapon määrän lisäämiseksi, joka 5 voidaan sitten todeta käyttäen tämän keksinnön koostumusta.

Erityisen hyödyllisiä tämän keksinnön spesifisiä sidosmenetelmiä ovat ne, jotka tunnetaan alalla kerrosmää-rityksinä, joissa mielenkiintoinen ligandi kompleksoidaan ainakin ensimmäisen ja toisen reseptorin kanssa joko saman-10 aikaisesti tai halutussa järjestyksessä. Toinen reseptoreista on sieppausreagenssi, joka on joko tehty liukenemattomaksi sopivalle tukiaineelle (kuten mikrotiitterilevylle, polymeerisille, magneettisille tai lasihiukkasille, kalvolle, membraanille, suodatinpaperille ja muille alalla tunne-15 tuille materiaaleille) adsorptiolla, kovalenttisilla tai muilla tunnetuilla kiinnitysmenettelyillä, tai joka kyetään tekemään liukenemattomaksi lisäkompleksoinnilla tai -reaktiolla. Esimerkiksi sieppausreagenssi voidaan merkitä spesifisellä sidosryhmityksellä (esim. biotiinilla), joka rea-20 goi sitä vastaavan reseptoriryhmityksen (esim. avidiinin) kanssa, joka on tehty liukenemattomaksi tukiaineelle.

Kerrosmäärityksissä toinen mielenkiintoisen ligan-·' din reseptori on toteamisreagenssi, joka voi olla merkitty • peroksidaasilla tai joka kyetään merkitsemään spesifisillä 25 lisäsidosreaktioilla (kuten avidiini-biotiinikompleksilla).

: Merkkiaineen toteaminen suoritetaan käyttäen tämän keksin- ; nön koostumusta.

Edullisimmissa toteutusmuodoissa mielenkiintoinen ligandi on antigeenimateriaali, jonka kanssa vasta-aineet 30 reagoivat, tai nukleiinihappo, jonka kanssa täydentäviä nukleiinihappoja (kuten oligonukleotideja) voidaan hybri-: · doida. Muita toteutusmuotoja ovat kilpailevat sidosmääri- tykset, joissa mielenkiintoinen spesifinen sidosligandi , , , kilpailee ligandin peroksidaasilla merkityn analogin kanssa 35 yhdestä ja samasta reseptorista.

11:.: ' 21

Edellä kuvatut määritykset voidaan suorittaa liuoksessa tai kuivassa muodossa. Liuosmääritykset viittaavat yleisesti menetelmiin, jotka suoritetaan liuoksessa sopivassa säiliössä ja heterogeenisten spesifisten sidosmääri-5 tysten kyseessä ollen sopivaa erotustekniikkaa ja -laitteistoa käytetään sitten sitoutumattomien materiaalien erottamiseen sidotuista materiaaleista. Kuivissa määrityksissä kemialliset tai spesifiset sidosreaktiot voidaan suorittaa kuivassa elementissä, koesuikaleessa tai kuituarkis-10 sa ja analysoitavan aineen läsnäolo todetaan elementissä erilaisten reagenssien reagoidessa, kun koenäyte levitetään elementille tai koevälineelle. Tällaisia elementtejä koskevat yksityiskohdat ovat alalla hyvin tunnettuja mukaan luettuna esimerkiksi US-patenttijulkaisut 3 992 158, (Przyby-15 lowicz et ai.), 4 258 001 (Pierce et ai.), 4 292 272 (Kita-jima et ai.), 4 430 436 (Koyama et ai.) ja 4 670 381 (Frickey et ai.), jotka liitetään viitteenä tähän esitykseen .

Yleensä elementit sisältävät vähintään yhtä absor-20 boivaa kantomateriaalia ja valinnaisesti lisäreagenssiker-roksia tai -vyöhykkeitä. Esillä olevassa keksinnössä hyödylliset reagenssit voivat olla elementin samassa tai eri kerroksissa tai vyöhykkeissä.

Seuraavat esimerkit esitetään tämän keksinnön to-25 teutuksen kuvaamiseksi, mutta niiden ei ole tarkoitettu • olevan rajoittavia. Kaikki prosentit ovat painoprosentteja , ellei toisin mainita.

Ellei toisin mainita kaikki reagenssit ja laitteet saatiin Eastman Kodak Company -yhtiöltä tai muista kaupal-! 30 lisistä lähteistä.

Seuraavat valmistusmenetelmät kuvaavat tyypillisiä : menettelyjä joidenkin tämän keksinnön toteutuksessa hyödyl- ; ; listen substituoitujen asetanilidien valmistamiseksi.

. . Valmistusmenetelmä A

' 35 1 l:n pyöreäpohjaisessa kolvissa (varustettu mag- neettisekoittajalla) jääetikkaan (700 ml) sekoitettiin 4'- 22 1 il· hydroksiasetanilidia (50 g), kunnes kiinteä aine oli täysin liuennut. Saatu liuos jäähdytettiin välille 10 - 15 °C ja siihen lisättiin SC>2Cl2:a (47 g) ja saatua liuosta sekoitettiin 1 tunti. Vettä (200 ml) lisättiin sitten ja 3'-5 kloori-41-hydroksiasetanilidia kiteytyi valkoisena sakkana (60 g, saanto 98 %).

Valmistusmenetelmä B

500 ml:n pyöreäpohjaisessa kolvissa (varustettu magneettisekoittajalla) vettä (200 ml) sekoitettiin 4-10 amino-2,6-dikloorifenolihydrokloridin (20 g) kanssa, kunnes kiinteä aine oli täysin liuennut. Saatu liuos lämmitettiin 70 °C:seen ja siihen lisättiin etikkahappoanhydridiä (11 g) ja saatua liuosta sekoitettiin 1 tunti. Liuoksen jäähtyessä muodostui 3',5’-dikloori-4'-hydroksiasetanilidin kiteitä 15 (19,6 g, saanto 95 %).

Esimerkit 1-4

Vesipitoiset kerniluminoivat koostumukset Tämän keksinnön vesipitoisia koostumuksia kemilu-minoivan signaalin aikaansaamiseksi valmistettiin sekoitta-20 maila setyylitrimetyyliammoniumkloridia (0,1 %), vetyperoksidia (3 mM) ja eri kerni 1 uminoivia aineita (1 mM) ' tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridipuskurin (0,05 M, pH 7,2). Useita tarkistuskoostumuksia valmistet-: tiin samalla tavoin sisältämään tunnettuja fluoresoivia vä- 25 riaineita. Signaalin syntyminen mitattiin 37 °C:ssa käyttäen tavanomaista Turner TD-20e -luminometriä, kun eri määriä piparjuuriperoksidaasia (Sigma Chemical XII) sekoitettiin koostumuksiin (lopullinen tilavuus 200 μΐ).

Kemiluminoivina aineina esimerkki 1 sisälsi 3'-30 kloori-4'-hydroksiasetanilidia, esimerkki 2 sisälsi 3'- ‘y’ fluori-4'-hydroksiasetanilidia, esimerkki 3 sisälsi 2'- j; : metyyli-3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidia ja esimerkki 4 ; ; sisälsi 3'-bromi-41-hydroksiasetanilidia.

Tarkistus A sisälsi fluoreseiinia, tarkistus B si-35 sälsi eosiini Y:a ja tarkistus C sisälsi kumariini 343:a.

23

Seuraava taulukko I esittää koostumusten synnyttämiä keskimääräisiä valosignaaleja kolmella toistolla jokaisessa kokeessa (10 sekunnin integraaliset valoyksiköt, kun t = 4 min) peroksidaasin lisäyksen jälkeen. "Signaa- 5 li/kohina"-suhde (S/N) on koostumuksen piparjuuriperoksi-daasin läsnä ollessa synnyttämän valosignaalin suhde taustasta syntyneeseen signaaliin (ilman peroksidaasia).

Taulukko I

Esimerkki 1 Esimerkki 2 Esimerkki 3 Esimerkki 4

Perok- si-

daasi siSJ- S/N Sig- S/N Sig- S/N Signaali S/N

naali naali naali taso (pM)_________ 0 0,008 1,0 0,012 1,0 0,007 1,0 0,007 1,0 0,1 0,010 1,25 0,060 5,0 1 0,080 10 0,410 34 0,050 7,1 0,010 14 10 1,25 156 3,80 317 0,080 11 0,72 103 10o 61,40 7675 10,56 880 0,69 99 16,56 2366 10 _========_======;===_:==;=========_=:=====:==:=_1

' Proksidaasitaso Tarkistus A Tarkistus B Tarkistus C

: (pM)

Signaali S/N Signaali S/N Signaali S/N

; : ; 0 1,51 1,0 0,227 1,0 0,006 1,0 0,1 X ------ ·_·_ 10 0,64 0,4 - 100 0,70 0,46 0,17 0,75 0,06 10

Taulukon I tulokset osoittavat, että tämän keksin-non koostumuksilla on alhainen taustakohina ja suuri herk-kyys piparjuuriperoksidaasin läsnä ollessa jopa 1 pM ent-15 syymipitoisuudella. Tarkistuskoostumuksilla oli joko voima kas taustakohina (tarkistukset A ja B) tai ei-hyväksyttävän 11^: 24 alhainen S/N-suhde (tarkistus C) tai molemmat 100 pM ent-syymitasolla.

Esimerkki 5

Edullinen vesipitoinen kemiluminoiva koostumus 5 Tämän keksinnön edullinen vesipitoinen koostumus valmistettiin sekoittamalla dietyleenitriamiinipentaetikka-happoa (100 μΜ) , vetyperoksidia (2 mM) , setyylitrimetyy-liammoniumbromidia (0,1 %) ja 3'-kloori-4'-hydroksiasetani-lidia (0,5 mM) , tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydroklo-10 ridiin (0,05 M, pH 8). Tarkistukset D, E ja F valmistettiin samalla tavoin, mutta ne sisälsivät 4'-hydroksiasetanilidia (0,5 mM) , 4-jodifenolia (1 mM) ja 4'-hydroksikanelihappoa (0,5 mM) substituoidun 41-hydroksiasetanilidin sijasta. Jokaisen reaktioseoksen lopullinen tilavuus oli 200 μΐ sen 15 jälkeen, kun oli lisätty eri pitoisuuksia piparjuuriperok-sidaasia (Sigma Chemical XII).

Seuraavassa taulukossa II luetellaan kolmen toisto-kokeen keksimääräinen valosignaali (10 sekunnin integraalit, kun t = 5 min) käyttäen tavanomaista Turner TD-20e-20 luminometriä 37 °C:Ssa. Esillä olevalla keksinnöllä on suurempi herkkyys kuin koostumuksilla, jotka sisältävät aikai-V ' semman tekniikan yhdisteitä.

! ·' Taulukko II

Peroksi- Esim. 5 Vert. D Vert. E Vert. F

: daasitaso (pM)_____ 25 3,85 0,076 2,28 0,48 250 68,6 10,16 16,2 1,21 2 500 112,7 48,12 93,9 9,50 V * 25 25

Vi

Esimerkki 6 Vertailuesimerkki Tässä esimerkissä verrataan esillä olevaa keksintöä koostumuksiin, jotka on valmistettu käyttäen aikaisemmassa 5 tekniikassa kuvattuja kemiluminoivia aineita.

Tämän keksinnön koostumus (esimerkki 6) valmistettiin sekoittamalla dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa (10 μΜ) , vetyperoksidia (3 mM) , setyylitrimetyyliammonium-kloridia (0,1 %) ja 3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidia 10 (1 mM) tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridiin (0,05 M, pH 7,2). Esimerkki 6a suoritettiin käyttäen samaa koostumusta, mutta eri päivänä.

Tarkistuskoostumukset G ja H sisälsivät purpurogal-liinia (Sigma Chemical) (0,2 mM), etanolia (25 % tarkistuk-15 sessa G ja 5 % tarkistuksessa H), vetyperoksidia (12,5 mM) ja kelatointiainetta (10 μΜ), fosfaattipuskurissa (0,01 M, pH 6,5). Tarkistuskoostumukset I ja J valmistettiin kuten tämän keksinnön koostumus paitsi, että ne sisälsivät 7-hydroksikumariinia tai eskuliinimonohydraattia samassa jär-20 jestyksessä kemiluminoivina aineina (molempia 1 mM)

Seuraavassa taulukossa III luetellaan kolmesta • toistokokeesta saadut keskimääräiset signaalitulokset, kun : lisättiin eri määriä piparjuuriperoksidaasia käyttäen esi- ; merkeissä 1-4 kuvattua menettelyä ja laitteistoa. Jokai- . 25 sen reaktioseoksen lopullinen tilavuus oli 200 μΐ.

_Taulukko III_

Peoksidaasi- Esimerkki 6 Tarkistus 6 Tarkistus H

'. taso (pM)

Signaali S/N Signaali S/N Signaali S/N

1 0 0,00033 1 0,590 1 0,339 1 ',· ’ 0,5 0,036 107 0,662 1,1 0,405 1,2 ' 5,0 0,582 1747 0,835 1,4 0,61 1,8 500 381 1,143xl06 6,04 10,2 10,51 31 1000 143 0,43xl06 56,8 96,3 18,13 53 11:,::: / : 26

Peroksidaasi- Esimerkki 6a Tarkistus I Tarkistus J

taso

Signaali S/N Signaali S/N Signaali S/N (PM)_______ 0 0,005 1 0,036 1 0,024 1 0,5 - - - 5,0 ------ 50 18,23 3 646 1,79 49,7 0,019 0,8 500 - - ....

1000 - - -

Esimerkki 7

Taustakohinan vertailut Tämä esimerkki osoittaa, että esillä olevan keksin-5 nön vesipitoisella koostumuksella on alhainen taustasignaa-li verrattuna aikaisemman tekniikan koostumuksiin.

Esillä olevan keksinnön koostumus valmistettiin sekoittamalla 3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidia (1 mM) , se-tyylitrimetyyliammoniumkloridia (0,1 %), dietyleenitriamii-10 nipentaetikkahappoa (10 μΜ) ja vetyperoksidia (3 mM) tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridipuskuriin ‘ : (0,05 M, pH 8,5).

, ; Tarkistus K:n koostumus oli kuten tämän keksinnön : koostumus paitsi, että se sisälsi fluoreseiiniä kemilu- • 15 minoivana aineena ja sen pH oli 7,2, ja tarkistus L oli sa- : ; manlainen kuin tarkistus K paitsi, että se sisälsi eosiini ; , Y:a fluoreseiinin sijasta. Tarkistus M oli kuten tämän kek sinnön koostumus paitsi, että se sisälsi myös luminolia (1 mM) ja sen pH oli 8. Kaupallisesti saatavaa valmistetta . ' 20 Amerlite™ Signal Generating Reagent, joka sisältää lu minolia (0,2 mM) ja p-jodifenolia (0,25 mM) natriumperbo-ί raattipuskurissa (1 mM, pH 8,5), verrattiin tarkistus N:n ; nimellä.

Seuraavassa taulukossa IV luetellaan kolmesta tois-25 tokokeesta saadut keskimääräiset taustasignaalit ja stan- dardipoikkeamat käyttäen Turner TD-20e -luminometria 27 37 °C:ssa (10 sekunnin integraalit). Reaktioseoksen tilavuus jokaisella koostumuksella oli 200 μΐ.

Taulukko IV

Koostumus Keskimääräinen Standardipoikkeama taustasignaali

Esimerkki 7 0,018 0,025

Tarkistus K 1,76 0,38

Tarkistus L 0,272 0,05

Tarkistus M 0,097 0,013

Tarkistus N 7,24 1,215 5 Nämä tulokset osoittavat, että tämän keksinnön koostumuksella on olennaisesti nollataustakohina ilman pe-roksidaasia, kun taas monilla tunnetuilla kerniluminoivilla koostumuksilla on havaittava taustakohina.

10 Esimerkki 8

Sieniperoksidaasin toteaminen Tämä esimerkki osoittaa esillä olevan keksinnön hyödyllisyyden sieniperoksidaasin toteamisessa, joten on selvää, ettei tämä keksintö rajoitu käytössään määrättyyn 15 peroksidaasiin.

; . Tämän keksinnön koostumus valmistettiin sekoitta- _ maila 3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidia (1 mM) , diety- leenitriamiinipentaetikkahappoa (10 μΜ) , setyylitrimetyy-liammoniumkloridia (0,1 %) ja vetyperoksidia (3 mM) 20 tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridipuskuriin (0,05 M, pH 7,2). Tulokset (kolmen toistokokeen keskiarvo) : sienestä Arthromyces ramosus (Sigma Chemical) saadun perok- ' . sidaasin eri määrien toteamisesta saatiin käyttäen esimer keissä 1-4 kuvattua menettelyä ja ne luetellaan seuraa-’25 vassa taulukossa V.

28 11V ν

Taulukko V

Peroksidaasi- Signaali S/N

taso (pM) 0 0,005 1 50 0,34 68 500 52,77 10 554

Esimerkki 9

Vertailu neutraalilla pH-arvolla 5 Tämän keksinnön koostumusta ja aikaisemman teknii kan koostumusta (tarkistus P) verrattiin erilaisilla määrityksen pH-arvoilla.

Tämän keksinnön koostumus valmistettiin sekoittamalla dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa (10 μΜ), vety-10 peroksidia (2 mM), 3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidia (1 mM) ja setyylitrimetyyliammoniumbromidia (0,1 %) tris(hydroksi-metyyli)aminometaanihydrokloridipuskuriin (0,2 M).

Tarkistus P:n koostumus sisälsi luminolia (1 mM) , 4'-hydroksiasetanilidia (0,15 mM), setyylimetyyliammonium-',· ·' 15 bromidia (0,1 %) ja vetyperoksidia (2 mM) puskurissa !/: (0, 05 M) .

' Sigma Chemical XII -nimistä piparjuuriperoksidaasia h lisättiin kumpaankin koostumukseen (250 pM tämän keksinnön ; koostumukseen ja 25 pM tarkistus P:n koostumukseen) niin, , 20 että lopullisiksi reaktioseosten tilavuuksiksi saatiin 200 μΐ. Tuloksena olevaa signaalia tarkasteltiin käyttäen , kaupallisesti saatavaa Luminoskan-levylukijaa joko 25 tai 37 °C:ssa (10 sekunnin integraali, kun t = 5 s) tarkistus ·' P:n koostumukselle ja Turner TD-2 0e-luminometria tämän kek- , 25 sinnön koostumukselle. Tulokset ovat kummallakin koostumuk- h sella kolmesta toistokokeesta ja ne esitetään kuviossa 1 tämän keksinnön koostumukselle ja kuviossa 2 tarkistus P:n koostumukselle. Kuviossa 2 ensimmäinen pylväs kullakin pH- 29 1 f :. : : ' ; arvolla edustaa 25 °C:ssa saatua signaalia ja toinen pylväs edustaa 37 °C:ssa saatua signaalia.

On ilmeistä, että esillä oleva keksintö synnyttää optimaalisesti valoa lähellä neutraalia pH-arvoa, kun taas 5 tarkistus P:n koostumus saa aikaan optimisignaalin pH- arvolla 8,5 - 8,75.

Esimerkki 10

Analyyttinen elementti Tämä esimerkki esittää tämän keksinnön koelaitteen 10 valmistusta ja sen käyttöä peroksidaasin toteamiseen eri väkevyyksillä käyttäen hyväksi esillä olevaa keksintöä.

Tämän keksinnön vesipitoinen koostumus valmistettiin sekoittamalla setyylitrimetyyliammoniumbromidia (0,1 %) , dietyleenitriamiinipentaetikkahappoa (10 μΜ) , ve-15 typeroksidia (2 mM) ja 31-kloori-41-hydroksiasetanilidia (1 mM) tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridipusku-riin (0,05 M, pH 8).

Sigma Chemical XII -nimisen piparjuuriperoksidaasin varastoliuos (8 μΜ) valmistettiin samaan puskuriin. Tämä 20 liuos sarjalaimennettiin mainittuun puskuriin liuosten valmistamiseksi, joissa oli eri määrät peroksidaasia, sekoitettavaksi tämän keksinnön koostumukseen.

Valmistettiin kuivia analyyttisiä elementtejä, joilla oli ratkaisemattoman US-patenttihakemuksen, sarjanu-25 mero 07/938 460 (jätetty 31. elokuuta 1992 nimillä Belly et ; : i ai.), kuvioissa 1-3 esitetty yleinen rakenne, joka sisäl- ; si Whatman GF/B-lasimikrokuituja absorboivana kerroksena suuren pesukapasiteetin aikaansaamiseksi elementteihin. Nä-V, mä tässä esitetyt elementit valaisevat esillä olevaa kek- 30 sintöä eivätkä ole olennaisia sen toteuttamiselle. Erilai- ’/ siä muita elementtirakenteita voidaan käyttää samalla ta- * voin.

/ / Jokaisessa valmistetussa elementeissä oli seuraavat komponentit reagenssimatriisissa, joka on kosketuksessa ab-3 5 sorboivaan kerrokseen.

30 lv. ·<:

Elementin rakenne g/m2

Huokoinen Poly(vinyylitolueeni-ko-metak-5 levitysker- ryylihappo) (painosuhde 98:2) ros helmiä 130

Poly(metyyliakrylaatti-ko-natrium-2-akryyliamido-2-metyyli-propaanisulfonaatti-ko-2-aseto-10 asetoksietyylimetakrylaatti) (painosuhde 90:4:6) 2,583

Zonyl™ FSN fluorattu pinta-aktiivinen aine (DuPont) 0,054 15 Tris(hydroksimetyyli)aminometaani- 1,211 hydrokloridipuskuri (pH 8, 0,1 M)

Dietyleenitriamiinipentaetikka- happo 0,004 20 Sideaine- Gelatiini (kovetettu) 10,15 kerros Puskuri (sama kuin edellä, pH 8, 0,1 M) 1,21 ; Dietyleenitriamiinipentaetikka- : happo 0,004 25 Triton™ X-100 ioniton pinta- : aktiivinen aine (Union Carbide) 0,02

Poly(etyleenitereftalaatti)-tukiaine i » 30 --- : . Tämän keksinnön koostumusta (100 μΐ) levitettiin elementille ja sen annettiin imeytyä absorboivaan kerrokseen. Toinen näyte koostumuksesta sekoitettiin peroksi-35 daasiliuoksen kanssa tilavuussuhteessa 40:1 ja tätä seosta (5 μΐ) levitettiin elementille. Viiden minuutin haudonta- 1ν : 31 jakson jälkeen huoneenlämpötilassa kehys otettiin pois elementistä ja reagenssit ja reaktiotuotteet sisältävä kerros asetettiin tavanomaiseen luminometriin 5 minuutiksi valon emission rekisteröimiseksi (10 sekunnin integraali).

5 Seuraavassa taulukossa VI luetellaan jokaisen pe- roksidaasiväkevyyden kahdesta toistokokeesta saadut tulokset (saatu vaihtelemalla reaktioseoksessa käytetyn peroksi-daasiliuoksen määrää). Nämä tulokset osoittavat esillä olevan keksinnön hyödyllisyyden peroksidaasin osoittamisessa 10 käyttäen kuivaa analyyttistä elementtiä, jolla on hyväksyttävä herkkyys ja alhainen taustakohina.

Taulukko VI

Peroksidaasitaso (pM) Signaali S/N

0 0,108 1 10 0,168 1,56 20 0,182 1,69 50 0,300 2,78 : . 100 0,420 3,89 / 200 0,704 6,52 1 000 2,96 27,40 2 000 4,48 41,48 ; 10 000 7,22 66,85 20 000 7,46 69,07 ·' 15 Esimerkit 11 - 17

Eri kationisten pinta-aktiivisten aineiden vertailu

Eri kationisten pinta-aktiivisten aineiden ja ka-,V tionisten polymeerien hyödyllisyys osoitettiin käyttäen ' ' erilaisia näitä yhdisteitä tämän keksinnön koostumuksissa ’ 20 ja mittaamalla peroksidaasi analysoitavana aineena.

11' 32

Koostumukset valmistettiin sekoittamalla 3'-kloori-4'-hydroksiasetanilidia (1 mM), vetyperoksidia (3 mM) , di-etyleenitriamiinipentaetikkahapppoa (10 μΜ) ja kationista materiaalia (luetellaan seuraavassa, eri määrät) tris(hyd-5 roksimetyyli)aminometaanihydrokloridipuskuriin (0,05 M, pH 7,2) .

Sigma Chemical XII -nimistä piparjuuriperoksidaasia (100 pM) sekoitettiin koostumukseen ja reaktioseoksesta (200 μΐ) saadut valosignaalit mitattiin käyttäen Turner TD-10 20e -luminometria 37 °C:ssa (10 sekunnin integraali, kun t = 4 min) . Koostumuksista saadut taustasignaalit mitattiin ilman peroksidaasin läsnäoloa.

Saadut tulokset luetellaan seuraavassa taulukossa VII tämän keksinnön koostumusten kolmen toistokokeen kes-15 kiarvoina. Taustasignaalit ovat kahdentoista tulospisteen keskiarvoja 1-4 minuutin ajalta. Nämä tulokset osoittavat, että eri kationisia materiaaleja voidaan käyttää esillä olevan keksinnön koostumuksissa johtuen alhaisesta taustakohinasta ja suuresta herkkyydestä.

20 Käytetyt kationiset materiaalit ovat seuraavat:

Esimerkki 11: Setyylitrimetyyliammoniumkloridi : (0,1 %) ,

Esimerkki 12: Poly[styreeni-ko-N-vinyyli-imidatso- li-ko-3-(2-hydroksietyyli)-1-vinyyli-imidatsoliumkloridi] 25 (moolisuhde 50:40:10) (0,025 %),

Esimerkki 13: setyylipyridiniumkloridi (0,1 %), , ; , Esimerkki 14: poly[styreeni-ko-N-bentsyyli-N,N- dimetyyli-N-(m- ja p-vinyylibentsyyli)ammoniumkloridi-ko-divinyylibentseeni] (moolisuhde 4,95:4,95:0,1) (0,05 %) , 30 Esimerkki 15: Poly [N-sykloheksyyli-N,N-dimetyyli-N- (m- ja p-vinyylibentsyyli)ammoniumkloridi] (0,25 %), j ; Esimerkki 16: Setyylitrimetyyliammoniumbromidi (0,1 %) j a

Esimerkki 17: Poly[styreeni-ko-N-vinyyli-imidatso- 35 li-ko-3-(2-hydroksietyyli)-1-vinyyli-imidatsoliumkloridi] (moolisuhde 44:20:36) (0,1 %) .

1:.:. - ? 33

Taulukko VII

Koostumus Signaali Taustasignaali S/N

Esimerkki 11 65,81 0,017 3 890

Esimerkki 12 1,82 0,009 202,2

Esimerkki 13 0,30 0,010 31,0

Esimerkki 14 4,02 0,016 248,7

Esimerkki 15 22,53 0,033 681,0

Esimerkki 16 60,99 0,017 3 588

Esimerkki 17 8,92 0,034 264,9

Esimerkki 18

Kilpirauhasta kiihottavan hormonin (TSH) liuosim-5 muunimääritys Tämä esimerkki esittää tämän keksinnön toteutusta TSH:n toteamisessa biologisessa näytteessä. Määritys suoritettiin käyttäen kaupallisesti saatavaa Amerlite™ Fast TSH-immuunimääritysvälinesarjaa (Kodak Clinical Diagnos-10 ties, Ltd), levynpesuri/haudontalaitetta ja kemiluminoinnin 1 : lukulaitetta.

Kemiluminoiva signaali synnytettiin käyttäen tämän keksinnön koostumusta, joka sisälsi 31-kloori-41-hydroksi-asetanilidia (1 mM) , vetyperoksidia (3 mM) , dietyleenitri-‘,:/ 15 amiinipentaetikkahappoa (10 μΜ) ja setyylitrimetyyliammoni- ’·* ’ umkloridia (0,1 %) tris (hydroksimetyyli) aminometaanihydro- kloridipuskurissa (0,05 M, pH 7,2).

; Noudatettiin mainitussa kaupallisessa Amerlite™ ·’,,,· TSH-välinesarjassa kuvattua ohjetta: 20 1) Näyte, joka sisälsi 0 - 100 μ I.U./ml TSH:a, li- sättiin välinesarjan koelaitteen koesyvennykseen, joka sisälsi sen seinämille adsorboituja monoklonaalisia anti-TSH-vasta-aineita.

34 1 v.. -: 2) Kaupallisen välinesarjan ant i-/3-TSH-pipar juuri-peroksidaasikonjugaattia lisättiin koesyvennykseen tertiää-risen kompleksin muodostamiseksi.

3) Haudontaa suoritettiin 37 °C:ssa noin 30 minuut- 5 tia.

4) Sitoutumattomat materiaalit pestiin koesyvennyk-sestä käyttäen kaupallisen välinesarjan pesuliuosta.

5) Kemiluminoivan signaalin synnyttämiseen tarkoitettua liuosta (kuvattu edellä) lisättiin sitten ja saatua 10 signaalia arvioitiin 5 minuutin kuluttua kerniluminoinnin lukulaitteen "pelkkä skannaus"-ohjelmointitavalla.

Kuvio 3 esittää signaalituloksia. Huomattava signaali syntyi, kun läsnä oli 4, 20 ja 100 μΐ.υ./ml TSH:a (kolme viimeistä tulospistettä). Näin ollen esillä oleva 15 keksintö on hyödyllinen immunologisen analysoitavan näyt teen määrityksessä.

Esimerkit 19 - 21: Muita kerni luminoi via koostumuksia

Useita vesipitoisia koostumuksia valmistettiin ja 20 testattiin samalla tavoin kuin edellä esimerkeissä 1-4.

Koostumukset valmistettiin sekoittamalla setyylitrimetyy-, ‘ liammoniumkloridia (0,1 %) , vetyperoksidia (3 mM) , diety- , ; leenitriamiinipentaetikkahappoa (10 mM) ja erilaisia kemi- • luminoivia aineita (1 mM) tris(hydroksimetyyli)aminome- 25 taanihydrokloridipuskuriin (0,05 M, pH 7,2). Signaalin syn- ; tyminen mitattiin 37 °C:ssa käyttäen tavanomaista Turner . , , TD-20e -luminometria, kun eri määriä piparjuuriperoksi- daasia (Sigma Chemical XII) sekoitettiin koostumuksiin (lo-pullinen tilavuus 200 μΐ) .

1,( 30 Kemiluminoivina aineina esimerkki 19 sisälsi 3'- kloori-4'-hydroksiasetanilidia, esimerkki 20 sisälsi 2',5'-: ' dikloori-4'-hydroksiasetanilidia ja esimerkki 21 sisälsi 2',3'-dikloori-4'-hydroksiasetanilidia.

Seuraava taulukko VIII esittää keskimääräisiä va-35 losignaaleja, jotka koostumukset synnyttivät kolmen toisto-kerran keskiarvona jokaisessa kokeessa (10 sekunnin integ- 35 raaliset valoyksiköt, kun t = 4 min) peroksidaasin lisäyksen jälkeen. "Signaalin suhde kohinaan" (S/N) on koostumuksen piparjuuriperoksidaasin läsnä ollessa synnyttämän valosignaalin suhde taustan (ei peroksidaasia) synnyttämään 5 signaaliin.

_Taulukko VIII_

Koostumus Peroksi- Signaali Taus- S/N

daasitaso tasig- (pM) naali

Esimerkki 19 0 0,01 0,01 1

Esimerkki 19 0,1 0,05 0,01 5

Esimerkki 19 1 0,54 0,01 54

Esimerkki 19 10 13,79 0,01 1379

Esimerkki 19 100 272,37 0,01 2,72xl04

Esimerkki 20 0 0,02 0,02 1

Esimerkki 20 0,1 0,02 0,02 1

Esimerkki 20 1 0,03 0,02 1,5

Esimerkki 20 10 0,07 0,02 3,5

Esimerkki 20 100 30,46 0,02 1523 p : Esimerkki 21 0 0,1 0,01 1

Esimerkki 21 0,1 0,1 0,01 1

Esimerkki 21 1 0,1 0,01 1 h Esimerkki 21 10 0,22 0,01 22

Esimerkki 21 100 5,57 0,01 557 < i Tätä keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti vii-10 täten erityisesti sen edullisiin toteutusmuotoihin, mutta on ymmärrettävä, että muutoksia ja modifiointeja voidaan suorittaa keksinnön hengen ja suojapiirin puitteissa.

Claims (16)

1. Kemiluminoivan signaalin aikaansaamiseen tarkoitettu vesipitoinen koostumus, tunnettu siitä, että se 5 sisältää: a) hapetinta noin 1-10 mM:n määrän, b) alhaisen moolimassan kationista pinta-aktiivista ainetta, jota on läsnä noin 0,05 - 2 % yli sen kriittisen misellipitoisuuden, tai kationista polymeeriä, jota on läs- 10 nä noin 0,01 - 2 paino-%, c) puskuria mainitun koostumuksen pH-arvon pitämiseksi välillä noin 6 - 8,5 ja d) substituoitua asetanilidia, jota on läsnä noin 0,05 - 10 mM:n kokonaismäärä ainoana kemiluminoivan signaa-

2. R6 ja R7 ovat toisistaan riippumatta vety- tai ha- loatomi, syaani- tai metyyliryhmä, edellyttäen, että ainakin toinen ryhmistä R4 ja R5 on elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vähintään noin 0,01, ja I 25 edellyttäen edelleen, ettei mitään muuta kemilu- minoivaa ainetta ole läsnä mainitun reaktion aikana, : todettavissa olevan kemiluminoivan signaalin tuot- .' "; tamiseksi, ja B) määritetään tuloksena oleva kemiluminoiva sig-\ 30 naali peroksidaasin mittana. li:;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tun-15 nettu siitä, että R1 on vetyatomi tai metyyliryhmä, R2 on vetyatomi, metyyli-, metoksimetyyli-, hydroksimetyyli-, kloorimetyyli- tai etenyyliryhmä, R3 on vetyatomi tai metyyliryhmä, R4 ja R5 ovat toisistaan riippumatta vety- tai haloatomi tai syaaniryhmä ja R6 ja R7 ovat toisistaan riip-20 pumatta vety- tai klooriatomi tai metyyliryhmä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että R2 on vetyatomi tai metyyliryhmä, R3 on • vetyatomi, ainakin toinen ryhmistä R4 ja R5 on kloori- tai : bromiatomi ja R6 ja R7 ovat kumpikin vetyatomeja.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tun- : nettu siitä, että se sisältää lisäksi peroksidaasia tai . peroksidaasilla merkittyä spesifistä sidosmolekyyliä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tun-.. . nettu siitä, että mainittu kationinen pinta-aktiivinen 30 aine on setyylitrimetyyliammoniumbromidi tai setyylitrime- I I tyyliammoniumkloridi. ! _.

: 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen koostumus, tun- nettu siitä, että mainittu hapetin on vetyperoksidi, mai-nittu puskuri on tris (hydroksimetyyli) aminometaani ja mai-35 nittu substituoitu asetanilidi on 31-kloori-41-hydroksiasetanilidi tai 31-bromi-41-hydroksiasetanilidi. lii.-·

7. Diagnostinen koevälinesarja, joka on tarkoitettu peroksidaasiin katalyyttisesti liittyvän analysoitavan aineen määrittämiseen, tunnettu siitä, että mainittu vä-linesarja sisältää erillisessä pakkauksessa: 5 i) patenttivaatimuksen 1 mukaista vesipitoista koostumusta ja ii) peroksidaasia tai peroksidaasilla merkittyä spesifistä sidosyhdistettä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koevälinesarja, 10 tunnettu siitä, että mainittu peroksidaasilla merkitty spesifinen sidosyhdiste on peroksidaasilla merkitty vasta-aine tai peroksidaasilla merkitty spesifinen sidosligan-dianalogi.

9. Koeväline peroksidaasin tai peroksidaasiin kata-15 lyyttisesti liittyvän analysoitavan aineen toteamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu koeväline sisältää absorboivaa kantoainemateriaalia ja sisältää: alhaisen moolimassan kationista pinta-aktiivista ainetta, jota on läsnä noin 0,05 - 2 % yli sen kriittisen 20 misellipitoisuuden, tai kationista polymeeriä, jota on läsnä noin 0,01 - 2 paino-%, ' ' puskuria mainitun koostumuksen pH-arvon pitämiseksi . välillä noin 6 - 8,5 ja substituoitua asetanilidia, jota on läsnä noin : 25 0,05 - 10 mM:n kokonaismäärä ainoana kerniluminoivaa signaa- ; lia synnyttävänä reagenssina, joka saa aikaan signaalin re- t;1. aktiona peroksidaasin katalyyttiselle aktiivisuudelle, jol la substituoidulla asetanilidilla on rakenne (I): 0 · · . K. -. j -* ' -7 V: ‘ W ’ ! bo orJ IV,.··· j ossa R1 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-kyyliryhmä, R2 on vetyatomi, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyy-5 liryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkoksialkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä hydroksialkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä aminoalkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä haloalkyyliryhmä tai 2-5 hiiliatomia sisältävä alkenyyliryhmä,

10. Menetelmä todettavissa olevan signaalin tuotta- • miseksi reaktiona peroksidaasille, tunnettu siitä, et- 25 tä: ; A) annetaan peroksidaasin reagoida, kun läsnä on a) hapetinta noin 1-10 mM:n määrä, b) alhaisen moolimassan kationista pinta-aktiivista ainetta, jota on läsnä noin 0,05 - 2 % yli sen kriittisen 30 misellipitoisuuden, tai kationista polymeeriä noin 0,01 - 2 paino-%:n määrä, c) puskuriainetta mainitun koostumuksen pH- : ; arvonpitämiseksi välillä noin 6 - 8,5 ja - d) substituoitua asetanilidia, jota on läsnä noin 35 0,05 - 10 mM:n määrä ainoana kerniluminoivan signaalin syn nyttävänä reagenssina, joka aikaansaa signaalin reaktiona 11;. - ' 40 peroksidaasin katalyyttiselle aktiivisuudelle, jolla sub-stituoidulla asetanilidilla on rakenne (I): o _.i 1 =7 - I! O Pk 5 j ossa R1 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-kyyliryhmä, R2 on vetyatomi, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyy- 10 liryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkoksialkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä hydroksiaikyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä aminoalkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä haloalkyyliryhmä tai 2-5 hiiliatomia sisältävä a1kenyy1i ryhmä,

10 R3 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al- kyy1i ryhmä j a R4 ja R5 ovat toisistaan riippumatta vetyatomi, tai elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vähintään noin 0,01,

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu peroksidaasi todetaan osana peroksidaasi11a merkittyä spesifistä sidoskompleksia.

12. Spesifinen sidosmääritys spesifisen sidosligan-5 din määrittämiseksi, tunnettu siitä, että: A) muodostetaan spesifisen sidosligandin peroksi-daasilla merkitty spesifinen sidoskompleksi, jonka reseptori on spesifinen mainitulle ligandille, B) sen jälkeen kun kompleksoitumattomat materiaalit 10 on erotettu mainitusta peroksidaasilla merkitystä spesifisestä sidoskompleksista, saatetaan mainittu peroksidaasilla merkitty kompleksi kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen koostumuksen kanssa todettavissa olevan kemiluminoi-van signaalin tuottamiseksi ja

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu spesifinen sidosligandi kompleksoidaan sille tarkoitetun ensimmäisen ja toisen re- 20 septorin kanssa, mainitun ensimmäisen reseptorin ollessa sieppausreagenssi ja mainitun toisen reseptorin ollessa to-' teamisreagenssi, joka sitoutuu peroksidaasiin tai on perok- * I : sidaasilla merkitty reagenssi, jolloin muodostuu mainitun ligandin ja mainitun ensimmäisen ja toisen reseptorin ker-'1' 25 rosrakenne.

• 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä anti- < » * geenin määrittämiseksi mainittuna spesifisenä sidosyhdis- teenä, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen ja toinen reseptori ovat mainitulle antigeenille spesifisiä 30 vasta-aineita. i *

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, V : tunnettu siitä, että mainittu spesifinen sidosligandi kilpailee peroksidaasilla merkityn spesifisen sidosligandin kanssa ainoasta reseptorista, joka on spesifinen mainitulle 35 spesifiselle sidosligandille. 1 r Λ"'

15 C) määritetään tuloksena oleva kemiluminoiva sig naali mainitun spesifisen sidosligandin mittana.

15 R3 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al- kyyliryhmä, : R4 ja R5 ovat toisistaan riippumatta vetyatomi tai elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vä-; hintään noin 0,01,

15 R6 ja R7 ovat toisistaan riippumatta vety- tai ha- loatomi, syaani- tai metyyliryhmä, edellyttäen, että ainakin toinen ryhmistä R4 ja R5 on elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vähintään noin 0,01, ja 20 edellyttäen edelleen, että mainittu elementti on oleellisesti vapaa mistä tahansa muusta kemiluminoivasta ' ‘ aineesta.

15 Iin synnyttävänä reagenssina, joka saa aikaan signaalin re aktiona peroksidaasin katalyyttiseen aktiivisuuteen, jolla substituoidulla asetanilidilla on rakenne (I): f], p/* ~ } ‘ - C - P' ? j p? v · - ' - ^ " * . ^ - 4 t*. S<. • S ' ' ' . OR3 20 jossa 1 * R1 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-kyyliryhmä, R2 on vetyatomi, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyy-25 liryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä alkoksialkyyliryhmä, ·_·' 1-4 hiiliatomia sisältävä hydroksialkyyli ryhmä, 1-4 : : : hiiliatomia sisältävä aminoalkyyliryhmä, 1-4 hiiliatomia sisältävä haloalkyyliryhmä tai 2-5 hiiliatomia sisältävä alkenyyl i ryhmä, Vl‘ 30 11:,.:: ^' 37 R3 on vetyatomi tai 1-4 hiiliatomia sisältävä al-kyy1i ryhmä, R4 ja R5 ovat toisistaan riippumatta vetyatomi tai elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on vä-5 hintään noin 0,01, ja R6 ja R7 ovat toisistaan riippumatta vety- tai ha-loatomi, syaani- tai metyyliryhmä, edellyttäen että ainakin toinen ryhmistä R4 ja R5 on elektronin poistava ryhmä, jonka Hammett-sigma-arvo on 10 vähintään noin 0,01, ja edellyttäen lisäksi, että mainittu koostumus on oleellisesti vapaa mistä tahansa muusta kemiluminoivasta aineesta.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä nukleiinihapon määrittämiseksi, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen ja toinen reseptori ovat oligonukleotide-ja, jotka täydentävät mainitun nukleiinihapon eri ketjun 5 osia. f i 1 r. /