NO315929B1 - Nye forbindelser, farmasöytisk preparat inneholdende disse, samt anvendelseav forbindelser for fremstilling av medikamenter som forbedrersynaptisk overföring og l¶ring - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår nye forbindelser, farmasøytiske preparater inneholdende disse, samt deres anvendelse for fremstilling av medikamenter som gir bedre læringskapasitet. Mer spesifikt angår oppfinnelsen forbindelser som induserer langstids potentiering (LTP) og forbedrer kognitivfunksjonen i pattedyr.

Hippokampusformasjonen som er et spesialisert område av limbisk korteks lokalisert i temporallappen, er også kjent som cornu ammonis fra hvilken de to navnene på hoveddelene kommer, CA1 og CA3. Neuroner i entorhinal korteks bringer videre innkommende informasjon gjennom en bunt av aksoner kalt perforantveien til neuroner i dentatgyrus, et annet område av hippokampalformasjonen. Alle forbindelsesområder av hjernen sender informasjon til og mottar informasjon fra hippokampalformasjonen, via entorhinal korteks. Hippokampalformasjonen er således i en posisjon at den vet - og påvirker - hva som foregår i resten av hjernen. Flere neurotransmittere, inkludert glutamat, gamma-aminosmørsyre (GABA), noradrenalin, serotonin og acetylcholin har en dypeffekt på aktivitet av hippokampalformasjonen, og uten tvil dens funksjoner.

LTP er en bruksindusert økning i størrelsen av postsynaptisk respons (dvs. styrking av den synaptiske forbindelsen mellom to neuroner) forårsaket av binding av glutamat til reseptorene i postsynaptisk membran. Opprettholdelse av LTP kan involvere både presynaptiske og postsynaptiske mekanismer (for en oversikt, se Bliss & Colingridge, Nature, 361:31-39,1993). Denne økningen forstås ved å tydeliggjøre at LTP er forbundet med forbedret kongitiv funksjon. LTP ble først oppdaget i 1966 og var resultat av en respons til høyfrekvens elektrisk stimulering (tetanus) av aksonene i perforantveien med en svikt av tilnærmet ett hundre pulser av elektrisk stimulering, avlevert i løpet av noen få sekunder. Bevis for LTP hadde forekommet ble oppnådd ved periodisk avlevering av enkle pulser til perforantveien og registrering av respons i dentatgyrus. Hvis, for eksempel, populasjonen EPSP (felteksitatorisk postsynaptisk potential) er større enn den var før tetanus, har LTP funnet sted. LTP kan også bli fremstilt i feltene CA3 og CA1 så vel som i neokorteks (Perkins og Teyler, Brain Research, 439:25-47,1988; Brown et al., i Neural Models of Plasticity: Experimental and Theoretical Approaches, utgitt av J.H. Byrne og W.O. Berry, San Diego: Academic Press, 1989). Den kan vare i flere måneder (Bliss og Lømo, J. Physiol., 232:331,1973). Enda mer viktig er at LTP kan involvere interaksjon mellom forskjellige synapser på et spesielt neuron. Dette innebærer at når svake og sterke synapser på et enkelt neuron blir stimulert tilnærmet samtidig, blir de svake synapsene forsterket, og denne forsterkningen av synapsen har blitt foreslått å være basis for langtidslæring (Hebb, The Organization of Behaviour, New York: Wiley-Interscience, 1949). Dette fenomen fremstilt ved assosiasjon (i tid) mellom aktiviteten av to synapser, kalles assosiativ LTP fordi den minner om det som skjer under klassisk kondisjonering for lærte responser.

Mange eksperimenter har demonstrert at assosiativ LTP kan foregå i hippokampalvevskiver, som blir holdt i et temperaturregulert kammer fylt med en væske som minner om interstetielt fluid og forblir levende opp til 40 timer. Chatterji, Stanton og Sejnowski (Brain Research, 95-145-150,1989) stimulerte for eksempel to sett av aksoner: aksonene som er tilknyttet dentatgyrus med feltet CA3 (sterk input) og et sett av kollaterale aksoner som fremkommer fra andre pyramidale celler i CA3 (svak input). Forskere har funnet at når den svake input og den sterke input blir stimulert sammen, økte responsene av CA3 pyramidalceller til den svake input.

LTP forekommer når en tilstrekkelig mengde kalsium kommer inn i post-synaptisk neuron. Når en hippokampalskive er plassert i en oppløsning som inneholder meget lite kalsium, foregår ikke LTP (Dunwiddie og Lynch, Brain Res., 169:103-110,1979). Det ble funnet at induksjon av LTP kunne bli blokkert med intracellulær induksjon av kalsiumchelator (EDTA) (Lynch et al., Nature, 305:719-721,1983). Disse resultatene antyder at kalsiumsignalering er involvert i induksjonen av LTP. Flere kalsiumsensitive enzymer har blitt foreslått å spille en rolle i å omdanne det begynnende kalsiumsignalet til vedvarende modifikasjone av synapitisk styrke. Inntreden av kalsium inn i dendritisk ryggrad forårsaker for eksempel strukturelle endringer i ryggraden ved aktivering av enzymet kalpain, som medvirker i nedbryting av spektrin, et protein som synes å tjene som rammeverkstøtte for strukturen av ryggraden. Disse endringene minsker den elektriske resistensen mellom ryggrad og resten av dendriten og øker således effekten av EPSP'erpå dendritisk membranpotential. Staubli et al. (Brain Res., 444:153-158, 1988) har funnet at proteolytisk aktivitet av kalpain er blokkert ved infusjon av et medikament kalt leupeptin inn i laterale ventrikler av rotter med resultatet at elektrisk stimulering av hippokampus ikke lenger produserer LTP.

En additiv effekt er nødvendig for å produsere LTP. En serie av elektriske pulser avlevert ved en høy hastighet alle i en ladning vil produsere LTP, men samme antall pulser gitt ved en lavere hastighet vil ikke. Hver puls produserer åpenbart en ettereffekt som forsvinner over tid. Dersom neste puls kommer før ettereffekten avtar, vil dens egen effekt bli forsterket. Hver puls "igangsetter" ("primes") den følgende. Dersom intervallet mellom pulsene blir valgt forsiktig, er det nødvendig med lite stimulering. Eksperimenter har vist at igangssettingseffekten består av en depolarisering av den postsynaptiske membranen: depolariseringen forårsaket av en puls igangsetter synapsen for den neste. N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren, en type glutamatreseptor navngitt for sin agonist, er glutamataktivert kalsiumpermeabel ionekanaler, som normalt er blokkert av magnesiumioner for å hindre å hindre kalsiumioner mot å komme inn i cellen. Når den postsynaptiske membranen er depolarisert, blir magnesiumionet kastet ut fra ionekanalen, og i nærvær av glutamat vil kanalene åpnes, og tillate at kalsiumioner kommer inn i det dendritiske området der de påvirker de fysikalske endringene som er ansvarlige for LTP. Collingridge et al. (J. Physiol., 334:33-46,1983) oppdaget at medikamenter slik somAPV (2-amino-S-fosfonopentanoat), som blokkerer N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptorer, forhindrer LTP mot å ta plass i CA1 feltet og dentatgyrus. Slike medikamenter hadde ingen effekt på noen LTP som allerede hadde

vært etablert, og viser at NMDA reseptoreren ikke er involvert i opprettholdelse av LTP.

Selv om LTP er en sterk cellulær modell for læring og hukommelse, er det fremdeles et uløst spørsmål om LTP deltar i hukommelsedannelse. Behandling som påvirker LTP har også generelt konsekvenser for ervervelse av visse læringsoppgaver. Når rotter blir eksponert til nye, komplekse miljøer, øker ekstracellulær populasjon i dentatgyrus, det samme som den gjør når entorhinal korteks er utsatt for høyfrekvens stimulering, og behandlinger som interfererer med LTP også interfererer med læring av oppgaver hvori hippokampus er involvert. Morris et al. (Nature, 319:774-776,1986) trente rotter i manøvrering i en "melkelabyrint", en romlig ledet oppgave i separate eksperimenter. Når APV var infusert i dyrenes laterale vetrikler, ble dyrene forhindret i å lære oppgaven. Fysikalsk skade på hippokampus resulterte i samme manglende evne til å lære en romlig ledet oppgave. Den sterkeste støtten for en rolle for LTP ved læring og hukommelse vil sannsynligvis komme fra oppdagelsen av et medikament som induserer LTP in vivo og forbedrer minst en form for læring i pattedyr.

Til nå har ikke noe medikament blitt oppdaget som vil kjemisk stimulere hippokampus for å sørge for LTP in vivo når det blir administrert perifert. Medikamenter som induserer LTP kan være effektive i behandling av kognitiv forringelse slik som hukommelsestap og læringsdysfunksjon forbundet med Alzheimers sykdom, slag og andre neurologiske forstyrrelser. De kan også være nyttige for bedring av læringspotential i friske pattedyrhjerner. Praktisk utnyttelse av et slikt medikament vil avhenge av dens evne til å krysse blod-hj erne-barrieren uten å indusere skadelige effekter, slik som anfall og konvulsjoner, siden injeksjon inn i laterale ventrikaler av hjernen ikke er en praktisk metode for å forbedre læring i mennesker og dyr. Kort påføring in vitro til skiver av rottehippokampus av K<+> kanalblokkerere (tetraetylammonium, mast-celle-degranuleringspeptid) eller metabotropisk glutamatreseptor mot aminocyklopentan-lS,3R-dekarboksylat (1S,3R-ACPD) induserer en langvarig potentiering av synaptiske responser (Cherubini et al., Nature, 328:70-73. 1987; Aniksztejn og Ben-Ari, Nature, 349:67-69,1991; og Bashir et al., Nature, 363:347-350, 1993). Når mast-celle-degranuleringspeptidet eller 1S.3R-ACPD blir administrert direkte i hjernen, produserer begge forbindelsene anfall og konvulsjoner i forsøksdyr (Chrubini et al., Nature, 328:70-73,1987; Bidard et al., Brain Res., 48:235-244,1987; Sacaan og Schoepp, Neurosci. Lett., 139:77-82,1992). Det eksisterer derfor et behov for oppdagelsen av nye forbindelser som har evne til å indusre LTP in vivo og for metoder for å utnytte disse for å bedre læringsevne i mennesker og dyr.

Nye forbindelser, slik som analoger og derivater av Brefeldin A (BA), er tilveiebrakt og induserer sikkert LTP og forbedrer kognitiv funksjon når det blir administrert perifert til et pattedyr. Disse forbindelsene krysser blod-hjernebarrieren og øker effekten av synaptisk overføring i hippokampusregionen av hjernen for å indusere LTP. Til nå har alle forbindelser som induserer LTP in vitro og som har blitt testet for in vivo induksjon av LTP, forårsaket anfall og konvulsjoner i laboratoriedyr. I motsetning til dette kan forbindelsene i oppfinnelsen trygt administreres in vivo til pattedyr uten indusering av sykeffekter hos subjektet som blir behandlet.

DE 3247379 beskriver noen Brefeldin-A-derivater og deres fremstilling. Derivatene anvendes for bekjempelse av uønsket plantevekst. Ingen former for medisinsk anvendelse på pattedyr er beskrevet.

Det blir her tilveiebrakt anvendelser av forbindelser slik som BA og analoger og derivater av BA for fremstilling av medikamenter for å forbedre læring og hukornmelseslagring i subjekter med friske hjerner som ønsker å fungere ved et høyt læringsnivå så vel som hos subjekter som lider av lærings- og hukommelsesdysfunksjon forbundet med en nedgang i effekt av synaptisk overføring eller tap av funksjonelle synapser slik som man finner i tidlig trinn av Alzheimers sykdom. Fig. IA er et skjematisk diagram som viser posisjoner av stimulering og registreringselektroder i et hippokampalt snitt. Registrerende elektroder ble plassert i det pyramidale cellelaget av CA1 regionen og stratumradiatum for ekstracellulære registreringer av populasjonsutslaget (PS) og henholdsvis felteksitatorisk postsynaptisk potential (EPSP). Eksperimentene ble gjennomført med over 30 snitt. Fig. IB er en graf som viser PS registrert i et snitt av hippokampalt vev før (prikket linje) og ISO minutter etter (heltrukken linje) anvendelse av BA. PS amplituden øker 150 minutter etter anvendelse av BA. Fig. 1C er en graf som viser feltet EPSP registrert i et snitt av hippokampalt vev før (prikket linje) og 150 minutter etter (heltrukken linje) anvendelse av BA. Amplituden og helning av felt EPSP øker 150 minutter etter anvndelse av BA. Fig. 2A er en graf som viser tidsforløp av endringene i amplitude av PS registrert i et kontrollhippokampalt snitt eksponert til bæreroppløsning uten BA. Fluktueringer av PS amplitude var innenfor ±20% av basislinjen under registreringen. PS amplituden ble målt som angitt ved pilen i fig. IB. Fig. 2B er en graf som viser tidsforløp av endringer i amplitude av PS registrert i et snitt av hippokamptalt vev ved administrering av tetanus (elektrisk sjokk) ved t = 15 minutter, som angitt ved pilhodet. Fig. 2C er en graf som viser tidsforløp av endringer i amplitude av PS og helning av felt EPSP registrert i et hippokampalt snitt ved administrering av BA. Etter induksjon av LTP, forårsaket tetanus av 100 Hz i et sekund påført ved t = 240 minutter, en ytterligere økning i amplitude av PS og helning av felt EPSP, som indikerer ytterligere LTP. Helningen av felt EPSP ble målt som angitt ved pilen i fig. 1C. Fig. 3 er en graf som viser resultatene av registreringer i et hippokamptalt snitt administrert en N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptor blokkerer forut for og under administrering av BA (0,1 ug/ml). Resultatene viser induksjon av LTP uten involvering av NMDA reseptorer. Fig. 4A er en graf som viser resultatene av registreringer ved tidspunktene a, b, c og d av PS i hippokampus av en forsøksrotte injisert intraperitonealt med BA for å indusere

LTP.

Fig. 4B er en graf som viser tidsforløp av endring i populasjonsutslagsamplituden indusert i hippokampus til en forsøksrotte injisert intraperitonealt med BA (3 mg/kg) for å indusere LTP ved tidspunktet som angitt ved pilen i fete typer. Fig. 4C er en graf som vise resultatene av registreringer ved tidspunktene x, y og z av PS i hippokampus av en kontrollrotte injisert perifert med saltvannsbærer. Fig. 4D er en graf som viser tidsforløp av endring i populasjonsutslagsamplitude i hippokampus i en kontollrotte injisert perifert med saltvannsbærer ved tidspunkt som angitt ved pilen i fete typer. Fig. 5 er en skjematisk tegning som illustrerer apparaturen som ble anvendt for å teste ervervelse av hemmende unngåelsesoppgaver i mus. Fig. 6A er et dose-responshistogram som viser gjennomsnittlig retensjonslatentheter i sekunder av eksperimentelle mus administrert BA to time før trening i ervervelse av hemmende unngåelsesoppgaver. Fig. 6B er er histogram som viser gjennomsnittlig antall forsøk for ervervelse av hemmende unngåelsesoppgaver i testmus administrert BA to timer før treningsforsøk. Fig. 7 er en skjematisk tegning som illustrerer Y labyrintappaturen som ble anvendt for å teste hemmende unngåelse i mus. Fig. 8 er et dose-responshistogram som viser gjennomsnittlig antall feil ved en reversert diskriminerende oppgave som en funksjon av dose BA administrert to timer forut for trening i Y labyrinten illustrert i fig. 7. Kontrollgruppen av 12 mus ble administrert saltvann (bærer). Dess høyere gjennomsnittlig antall feil, dess større er indikasjon på ervervelse av oppgaven. Alle tre grupper av mus (12 mus pr. gruppe) som mottok BA utviste en høyere gjennomsnittlig antall feil enn kontrollgruppen. Fig. 9 er et tidsforløphistogram som viser gjennomsnittlig retensjonslatentheter i grupper av mus (n = 12) trenet i apparaturen illustrert i fig. 5 som har blitt injisert intraperitonealt med BA 7 dager eller 120 minutter før treningsforsøk, umiddelbart før trening eller to timer etter treningsforsøkene. Fig. 10 er et tidsforløphistogram som sammenligner gjennomsnittlig retensjonslatentheter i grupper av mus (n = 12) trenet i Y labyrintapparaturen illustrert i fig. 7 som har blitt injisert intraperitonealt med BA eller bærer enten 7 dager eller 120 minutter før treningsforøk, umiddelbart før trening eller to eller seks timer etter treningsforsøkene.

Foreliggende oppfinnelse skaffer tilveie forbindelser som krysser blodhjernebarrieren når administrert perifert, hvilket øker effektivitet av synaptisk overføring i hippokampalregionen av hjernen. Slike forbindelser øker LTP av slike synapser uten å involvere NMDA reseptorer. De kan utnyttes for å bedre lærings- og hukommelseslagring i pattedyrsubjekter med friske hjerner så vel som i subjekter som lider av lærings- og hukornmelsesdysfunksjon på grunn av en nedgang i effekt av synaptisk overføring eller tap av funksjonerende synapser slik det forekommer i Alzheimers sykdom.

De foretrukne forbindelsene er BA og analoger eller derivater derav, som produserer signifikant dose og tidsavhengige effekter på hukommelse i læringsoppgaver. Ytelesevnen i retensjonsoppgaver blir også forbedret i dyrene som ble administrert medikamentene så mye som to timer etter læring av oppgaven ble avsluttet, dette indikerer at effektene av medikamentet ikke skyldes påvirkninger på ikke-assosierte prosesser, slik som følelse, motivasjon og motorprosesser, som kunne direkte påvirke ervervelse eller retensjon av læring.

Derivater og analoger av BA er screenet og overvåket for å bestemme deres nytte ved indusering av LTP ved å anvende utnyttelse av hippokampale snittpreparater. En bipolar stimuleringselektrode er anbrakt i stratum radiatum for å stimulere Schaffer kollaterale/kommissurale fibre. Registreringselektroder blir plassert i det pyramidale cellelaget av CA1 regionen og i stratum radiatum som vist i fig. IA for å registrere henholdsvis populasjonsutslag (PS) og felteksitatorisk postsynaptisk potential (EPSP). PS blir registrert før administrering av medikamentet som skulle bli testet og ved tidsintervaller etter administrering av medikament, for eksempel ved ca. 2 minutters intervaller i opp til 250 minutter etter administrering av BA i et kunstig cerebrospinalfluid ved en konsentrasjon på 0,1 ug/ml. For å evaluere effekten av BA, ble kontrollsnitt av hippokampalt vev undersøkt med bærer. I tillegg blir helningen av felt EPSP overvåket som en indikasjon på induksjon av LTP som illustrert i fig. 1C.

Den kjemiske strukturen til BA er som følger:

Foreliggende oppfinnelse omfatter forbindelser med formel hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<*>, -SH, -NR^r<Z>, og et karbonyloksygen; R<1> er et Cj til C4 alkyl; og R<2> er hydrogen og forbindelser med formel hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<*>, -SH, -NR<2>r<2>, og et karbonyloksygen; R<1> er et Ci til C4 alkyl; og R<2> er hydrogen og R' er uavhengig av hverandre et Ci til C4 alkyl, samt forbindelser med formel

hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<1>, -SH, -NR<2>R<2>, og et karbonyloksygen; R<1> er et Ci til C4 alkyl; og R<2> er hydrogen og R' er uavhengig et Ci til C4 alkyl.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det inneholder en av de nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for å bedre læring i et pattedyr ved perifer administrering av en terapeutisk mengde som induserer langtidspotensiering, hvor forbindelsen har en struktur valgt blant:

hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<1>, -SH, -SR<1>, -NR<2>R2, og et karbonyloksygen; R<*> er hydrogen eller -OH; R<1> er et Ci til C4 alkyl; R<2> er hydrogen

eller et Ci til C4 alkyl; hver R' er uavhengig av hverandre et Ci til C4 alkyl, hver R" er uavhengig av hverandre valgt blant -H, -OH-, -OR<1> og -NR<2>R<2> og R'" er uavhengig av

hverandre valgt blant

Metoder for syntese av BA og dens derivater og analoger er vekjente innenfor fagområdet (Corey og Wollenberg, Tetrahedron Lett., s. 4701-4704,1976; Kitahara et al., Tetrahedron Lett., s. 3021-3024,1979).

I adferdseksperimenter ved anvendelse av mus er det blitt oppnådd evidens som indikerer at BA forbedrer retensjon i to læringsoppgaver: hemmende unngåelse (IA) og Y labyrmtdiskrimmering (YMD). Når det ble administrert perifert ved intraperitoneal injeksjon to timer før trening, produserte medikament doseavhengige effekter på retensjonstester administrert 48 timer etter trening. I begge oppgavene ble signifikante effekter oppnådd ved doser på 1,0 og 3,0 mg/kg, men en dose på 10 mg/kg var mest effektiv i Y labyrintoppgaven. I begge oppgavene var også medikamentet effektivt i forbedring av retensjon når det ble injisert enten en uke forut for trening eller umiddelbart etter trening. IY labyrintprøven ble det oppnådd betydelige effekter når medikamentet ble administrert to timer, men ikke seks timer etter trening. Medikamenitnjeksjoner adminstrert to timer etter trening var ineffektive i IA oppgaven.

Evidens viser klart at BA produserer signifikant dose og tidsavhengige effekter i pattedyr på 48 timers hukommelsen i læringsoppgaver. Faktum at retenjson blir forbedret ved etter-treningsinjeksjoner viser at medikamenteffektene ikke skyldes påvirkninger og ikke-assosiasjonsprosesser (for eksempel sensoriske, motivasjons- og motorprosesser) som direkte påvirker ervervelse eller retensjonsytelse. Funn indikerer at medikamentet påvirker retensjon ved å endre hukommelseslagirngsprosessene. Hukommelsesforbedrende effekter oppnådd med BA tilsvarer de som ble oppnådd med medikamenter som påvirker noradrenerge agonister, opiat og GABAergiske antagonister, så vel som cholinergiske agonister.

De to oppgavene som ble anvendt i eksperimentene som beskrevet i denne søknaden tilveiebringer meget forskjellige mål på hukommelse. I IA oppgaven viste mus hukommelse av fotsjokktrening ved hemming av høy sannsynlighetsrespons (forlater det belyste kammeret i et smug for å komme inn i en mørk avdeling). På den annen side viste mus i Y labyrintoppgaven hukommelse av trening på hvordan man kunne unnslippe fotsjokk selv om inngangene til rømningssmuget hadde blitt straffet med fotsjokk under retensjonstestprøvene. De to adferdsmålingene, responshemming og smugvalg, skaffer tilveie evidens at medikamentinj eksj oner administrert enten før eller kort etter trening signifikant forbedrer hukommelsen ved retensjon slik det ble fastsatt to dager etter trening.

LTP indusert ved BA adskiller seg på flere måter fra den som blir produsert av andre metoder som utnytter et tog av høyfrekvens elektriske stimuleringer. Elektriske stimuleringer induserer LTP umiddelbart, mens induksjon av LTP ved BA vanligvis forekommer 60 til 120 minutter etter medikamentanvendelse. I det tilfellet med tetanus-indusert LTP, er aktivering av NMDA reseptoren essensiell for utløsning av LTP. Induksjon av LTP ved BA synes i motsetning til dette å være en prosess uavhengig av NMDA reseptorer fordi BA forårsaker LTP i nærvær av en hemmer av NMDA reseptorer kjent som 2-amino-5-fosfonopentanoat (APV).

BA induserer LTP i CA1 området av hippokampus i anesteserte rotter etter perifer administrering, og dette indikerer at BA krysser blod-hjernebarrieren og virker på målmolekyle i hjernen som fører til induksjon av LTP. Denne observerte virkningen av BA er ny.

Det er evidens å antyde at syntese av nye proteiner er nødvendig for LTP. Ekspresjon av de umiddelbart tidlige genene zif/269 og c-fos er indusert av tetanusstimulering, og blir blokkert ved NMDA reseptorantagonister. Disse resultatene viser at kalsiumsignalering er nødvendig for induksjon av umiddelbart tidlige gener. Etter tetanisering blir proteinkinase C mRNA nedregulert, mens mRNA som kode for Ca^<+>Zkalmodium-avhengig proteinkinase blir oppregulert. Endret genuttrykk kan spille en rolle i induksjon, ekspresjon og/eller opprettholdelse av LTP. Ved å anvende in situ og Northern blot hybridiseringsteknikker, kan effektene av BA på ekspresjon av gener (umiddelbart-tidlig gener, vekstfaktorgener, neuroaktive peptidgener, proteinkinasegener og reseptor og ionekanalgener) kan bli målt i spesifkke hjerneregioner. Det kan bestemmes om de påviste endringene i genekspresjon er ledsaget av endringer i nivåer av kodet protein ved å anvende antistoffer til proteinet som kodes av genet som er interessant.

Neurotransmitterreseptorer og ionekanaler er fundamentale elementer som kreves for signalering i hjernen. Involvering av flere neurotransmitterreseptorer i induksjon av LTP ved et tog av høyfrekvens elektriske stimuleringer har blitt demonstrert ved anvendelse av reseptorantagonister. Gjennom virkningen på slike molekyler påvirker BA signaltransduksjonsprosesser involvert i LTP. Ved ekspresjon av tallrike reseptorer og ionekanaler i Xenopus oocytes eller dyrkede celler og ved å anvende tallrike biokjemiske og elektrofysiologiske teknikker, kan det bli bestemt om binding av BA modulerer funksjonen til en reseptor (for eksempel glutamat, acetylcholin eller GABA reseptorer) eller en ionekanal (for eksempel natrium, kalium eller kalsiumionekanaler), eller om den aktiverer second messenger-veier. Siden mange forskjellige undertyper av reseptorer og ionekanaler allerede har blitt klonet, kan en cDNA som koder for en spesifikk undertype av en spesiell reseptor eller ionekanal bli oppnådd relativt enkelt ved å utnytte polymerasekjedereaksjon i standard teknikker. Reseptor cDNA kan bli uttrykt i dyrkede celler for å studere interaksjonen av reseptorene eller ionekanalene med BA med standard elektrofysiologiske teknikker.

For å bestemme medikamentbindende protein, kan konvensjonelle teknikker for karakterisering av medikamentbindende proteiner kjent innenfor fagområdet bli anvendt. Disse teknikker involverer først rensing av det ønskede proteinet ved å måle bindingsaktivitet av radioaktive medikamenter i fraksjoner fra preparater av brutte celler etter hvert rensetrinn. I en alternativ utførelsesform blir genet som uttrykker proteinfrekvensen til hvilken BA binder bestemt ved preparering av et cDNA bibliotek i en RNA ekspresjonsvektor fra størrelsesfraksjonert hippocampus mRNA, og en mRNA blanding blir syntetisert in vitro og analysert etter injeksjon inn i oocyter ved å anvende en velkjent teknikk som er beskrevet av J.B. Gurdon et al., (Nature, 233:177-72,1971) og Sumikawa et al. (Methods in Neuroscience, vol. 1, 30-35,1989). Ekspresjonen av BA bindende protein blir deretter testet ved måling av elektrofysiologiske responer eller Ca<2+> signaler som respons til anvendelse av BA in vitro. Når det blir observert en positiv respons, blir biblioteket oppdelt i serie inntil et enkelt positivt klon er identifisert. Fra klonen kan BA bindende protein bli oppnådd og reprodusert enten syntetisk eller rekombinant ved å anvende teknikker som er velkjente innenfor fagområdet. Oppløsningen av strukturen til det bindende protein tillater utforming og screening av nye medikamenter.

En utførelsesform av oppfinnelsen er en anvendelse for fremstilling av medikamenter for å øke den synaptiske effektiviteten ved indusering av LTP i subjekter for perifer administrering av en terapeutisk mengde av forbindelsene i oppfinnelsen, slik som BA og dens analoger og derivater. En annen utførelsesform av denne oppfinnelsen er en anvendelse for fremstilling av medikamenter for lindring av læringssvikt hos et subjekt som har behov for dette for perifer administrering av en terapeutisk mengde av en forbindelse i oppfinnelsen. Ca. 5% av den generelle populasjonen over 65-årsalder lider av Alzheimers sykdom, og utbredelsen av denne sykdom øker med økende alder. Den gradvise økning av alder i populasjonen innebærer at flere menneske sannsynligvis vil lide av Alzheimers sykdom. Det fins ingen effektiv behandling mot Alzheimers sykdom. Utvikling av behandlinger for denne sykdom er et viktig trekk. Synaptiske forbindelser i hippokampus, et hjerneområde som er kjent å være viktig for læring og hukommelse, er særlig sårbart for Alzheimers sykdom, et faktum som innebærer tap av hukommelses-karaktertrekk i tidlige trinn av Alzheimers sykdom. En fremgangsmåte for å redusere hukommelsestap som er forbundet med Alzheimers sykdom er derfor å bedre den synaptiske effekten ved synapsene som forblir på de langsomt atrofierende neutronene ved perifer injeksjon av en terapeutisk mengde av en forbindelse i oppfinnelsen.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen er en anvendelse for fremstilling av et medikament for å bedre læring i pattedyr for perifer administrering av en mengde BA som er tilstrekkelig til å indusere LTP i hjernene hos slike pattedyr. Slik det her blir anvendt, er en "terapeutisk mengde" av BA, eller en analog eller derivat derav, en mengde beregnet til å oppnå og opprettholde et blodnivå i hjernen til et menneske eller dyr over en tidsperiode som er ønsket tilstrekkelig for å bedre LTP. Disse mengdene varierer med potenthet av hver analog eller derivat, mengden som er nødvendig for den ønskede terapeutiske eller annen effekt, hastighet på eliminering eller nedbryting av substans av kroppen med en gang den har kommet inn i blodstrømmen, blod-hjernebarrieretransportmekanismen som er involvert i transport av medikament i hjernen, og mengden av BA eller dens analog eller derivat i formuleringen.

En person innenfor behandlingsfagområdet ved betingelser som her er beskrevet, vil vite hvordan man kan titrere doseringen for å oppnå den ønskede terapeutiske effekten. I henhold til konvensjonell forsiktig formuleringspraksis blir en dosering nær den lavere enden av det nyttige området av et spesielt middel vanligvis benyttet til å begynne med, og doseringen øker eller avtar som angitt i henhold til den observerte responsen, som i rutineprosedyren til den behandlende lege. Generelt er imidlertid mengen av BA, dens analog eller derivatet, i området fra ca. 1,0 til 15,0, fortrinnsvis 3,0 til 10,0 mg/kg kroppsvekt til subjektet som skal bli behandlet for forbedret læring og hukommelsesretensj on.

Fortrinnsvis og hensiktsmessig blir kombinert- eller enkeltmedikamentet administrert til subjektet som skal bli behandlet ved injeksjon, for eksempel, intravenøst eller intraperitonealt i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer. Bæreren kan omfatte et hvilket som helst konvensjonelt fortynningsmiddel for injeksjoner slik som de som er beskrevet i Remingtons "Pharmaceutical Sciences", 17. utgave (Mark Publishing Co., Pa), der beskrivelsen er innbefattet her med referanse. BA kan for eksempel bh oppløst i eller suspendert i en vandig eller ikke-vandig steril bærer som tilfredsstiller testen for pyrogenisitet, slik som sterilt vann eller sterilt vandige oppløsninger av elektrolytter og/eller dekstrose. En person med kunnskap innenfor fagområdet vil raskt tilveiebringe ytterligere egnede bærere for preparering og administrering av de terapeutiske dosene av medikamenter som her er beskrevet.

De følgende eksempler illustrerer måten der oppfinnelsen kan bli praktisisert. Det er imidlertid undeforstått at eksempelene har illustrative formål.

EKSEMPEL 1

Tverrgående snitt (500 um) ble kuttet fra hippokampi av 4-8 uker gamle rotter (eller marsvin som veide 300-400 g), dyppet og kontinuerlig perfusert ved 2-3 ml/min. med oksygenert kunstig cerebrospinalfluid (10 mM NaCl; 5 mM KC1; 1,3 mM NaH2P04; 1,9 mM MgSC-4-7 H2O; 22 mM NaHCC>3) ved 30°. Eksitatorisk post-synaptiske potentialer ble utløst hvert 5. sekund ved stimulering av Schaffer kollateral/kommissurale fibre med bipolar wolframstimulerende elektoder. Stimulerende og registrerende elektroder ble plassert som vist i fig. IA inn i pyramidalcellelaget av CA1 regionen av stratum radiatum for henholdsvis ekstracellulære registreringer av populasjonsutslag (PS) og felteksitatorisk postsynaptisk potential (EPSP). En bipolar stimuleringselektrode anbrakt i stratum radiatum ble anvendt til å stimulere Schaffe kollaterale/kommissurale fibre.

PS ble registrert fra CA1 pyramidalt cellelagt før og etter BA (0,05-0,5 ug/ml; MW = 280,37) anvendelse med glassmikroelektroder fylt med kunstig cerebrospinalfluid. En forrådsløsning av BA i metanol (1 mg/ml) ble fortynnet med oksygenert kunstig cerebrosinalfluid og påført hippokampale snitt ved 2-3 ml/min. i 2 til 10 minutter. For å evaluere effekten av BA, ble PS amplituden og helningen av EPSP overvåket før og etter påføring av BA.

Som vist i fig. IB, ble PS registrert før og ved 150 minutter etter påføring av BA i en konsentrasjon på 0,1 ug/ml. Som vist i fig. 1C, ble felt EPSP registrert før og 150 minutter etter påføring av BA i en konsentrasjon på 0,1 ug/ml. Etter induksjon av LTP øket amplitude og helning på felt EPSP. For å evaluere effekten av BA, ble helning av EPSP målt som angitt i kontrollregistreringen.

BA-indusert potentiering varte i flere timer eller til og med lenger. Graden av BA-indusert potentiering i individuelle snitt varierte mye, sannsynligvis på grunn av forskjeller i betingelsene ved hippokampussnit, medikamentkonsentrasjoner og/eller varighet av medikamentanvendelse.

EKSEMPEL 2

Studier ble gjennomført for å bestemme tidsforløp av induksjon av LTP ved BA i hippokampalvev. Amplituden av PS ble registrert i flere kontrollhippokampale snitt som vist i fig. 2A. Fluktueringe av PS amplitude var innen ±20% av basislinjen under registreringen. Ved påføring av tetanus på 100 Hz i 1 sekund ved t = 15, øket amplitudene av registrert PS fra ca. 2 mV til ca. 6 mV (fig. 2B). I tetanikkindusert LTP øket PS amplituden umiddelbart etter tetanus av 100 Hz i et sekund og nådde et platanivå i løpet av flere minutter som var høyere enn det som var før tetanus.

Som vist i fig. 2C, når BA ble administrert til hippokampalt vev ved t = 50 minutter, begynte PS amplitude og helningen av EPSP å øke tilnærmet 60 minutter etter BA anvendelse ved t = 10 minutter. Etter en firegangers økning (400% av den til kontoUsnittet) i PS forekom ved t = 240 minutter, og en liten økning i helningen av felt EPSP ble observert. Ved administrering av tetanus av 100 hz i 1 sekund ved ca. t = 240 til dette snitt av hippokampalt vev der LTP allerede hadde blitt indusert ved BA, ble det observert en ytterligere økning i PS og helning av felt EPSP. Figuren, som er vist, er et representativt resultat. Tilsvarende resultater ble oppnådd fra over 30 snitt.

EKSEMPEL 3

Et eksperiment ble gjennomført for å måle BA-indusert (0,1 ug/ml) økning i LTP i et hippokampalt snitt fremstilt som i eksempel 1 i nærvær av APV, en N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptorblokkerer. Administrering av en 50 uM oppløsning av APV ble startet ved t = 10 minutter og fortsatte inntil t = 50 minutter. Som vist i fig. 3, resultererte administrering av 0,1 ug/ml BA i kunstig cerebralspinalfluid i eksempel 1 ved ca. t = 25 minutter, i en tre-ganger økning i amplituden av PS i forhold til samme snitt før BA anvendelse. Dette viser NMDA reseptoruavhengig induksjon av LTP ved BA.

EKSEMPEL 4

Induksjon av LTP in vivo ved Brefeldin A.

I dette eksperimentet ble LTP indusert i CA1 området av hippokampus til anesteserte hannlige Sprague Dawley (250-275 g) rotter som var ca. 2 måneder gamle etter perifer administrering av BA, og viser at BA krysser blodhjernebarrieren i tilstrekkelig konsentrasjon til å indusere LTP. Registreringer av PS (fig. 4A) og tidsforløpet av endringen i PS amplitude (fig. 4B) ble gjort rett før og ved intervaller etter intraperitoneal administrering av BA ved en konsentrasjon på 3 mg/kg. Fig. 4C og 4D viser registreringer av PS og tidsforløp av endringen i PS amplitude, fra en kontollrotte som mottok injeksjon av saltvannbærer uten BA. Tilsvarende resultater ble oppnådd med fire ytterligere dyr. Slik man kan se ved å sammenligne resultatene oppsummert i fig. 4A og 4D, viste rotten som mottok perifert BA en 200% økning i amplitude i løpet av ca. 170 minutter, mens amplituden av PS i kontrollrotten avtok svakt.

EKSEMPEL 5

Effekt av BA ved læring av hemmende unngåelse.

For testing av læring i en hemmende unngåelse (IA) oppgave, ble fem grupper av 12 hannlige, CD-1 mus (Charles River Labs, Wilmington, MA) (27-30 g, 3-4 uker) undersøkt for å bestemme effekt ved læring av perifer administrering to timer før trening av enten saltvannsbærer (3% etanol i fysiologisk saltvann) (som kontroll) eller 0,3,1,0, 3,0 eller 10,0 mg/kg BA i saltvannsbæreren. Testapparaturen som ble anvendt var en oppdelt lysboks som er illustrert skjematisk i fig. 5. En side av boksen bie belyst, mens den andre siden som er svakt større enn den belyste siden forble mørk. I den mørke armen hadde gulvet to plater separert med mindre enn en centimeter knyttet til en positiv og en negativ terminal for å avlevere et sjokk på 0,6 mA gjennom gulvstokkene av boksen i den mørke avdelingen til dyrets fot.

Dyr ble injisert enten 7 dager eller 120 minutter forut for trening, eller 120 minutter etter trening og testet 48 timer senere. For trening ble musen plassert vendt mot eksperimentet (vekk fra døren til det mørke kammeret) i den belyste siden av boksen. Døren som deler de to kamrene ble løftet og tiden som gikk før musen gikk inn i det mørke kammeret (latenthet) ble målt. Ved å motta et mildt sjokk returnerte musen til den belyste siden, ved hvilket tidspunkt klokken ble innstilt på nytt. Deretter ble en andre latenthet målt og dersom latentheten var høyere enn 60 sekunder, men mindre enn 300 sekunder, ble den registrert. Det ble krevet av alle dyrene å vise en minimum 60 sekunders latenthet for å komme inn det mørke kammeret, ved hvilket punkt de ble antatt at de hadde ervervet hemmingsunngåelsesoppgaven (ervervelse). 48 timer etter trening ble en retensjonstest gjennomført der dyret ble plassert i det belyste kameraet og latentheten til å gå inn i det mørke kammeret ble registrert. Alle eksperimenter ble kjørt som doble blindstudier. Statistisk signifikans ble beregnet i henhold til analysen av varians (ANOVA) og Mann-Whitney ikke-parametrisk testing.

Slik det er vist i fig. 6A, viste mus behandlet med 1,0 og 3,0 mg/kg doser statistisk signifikant økning (p<0,05) i gjennomsnittlig retensjonslatentheter, sammenlignet med de i kontrollmus, og dette viser at disse dyrene ble værende i det belyste kammeret lenger før gjeninntreden i det mørke kammeret, der de tidligere hadde erfart sjokk, enn kontrollmusene. Økte retensjonslatentheter er indikasjoner på økt hukommelsesretensjon.

Det gjennomsnittlig antall prøver som var nødvendig for hver gruppe for å nå 60 sekunds kriterienivå (betegnet ervervelse) er vist i fig. 6B. Det var ingen signifikant forskjell i ervervelse blant gruppene, dette viser at medikamentet ikke påvirker den begynnende oppnåelse av 60 sekunders latentheten.

EKSEMPEL 6

Ervervelse av reversert diskriminering i en Y labyrintoppgave.

Y labyrintapparaturen som illustrert i fig. 7 består av et lyskammer med tre armer, hver tilnærmet 30 cm lang. Gulvene av armene var lik de i IA apparaturen i eksempel 5, og har to plater separert med mindre enn en centimeter knyttet til en positiv og en negativ terminal for å avlevere et 0,35 mA sjokk til foten av testdyret. Y labyrinten ble anvendt til å teste dyrets kapasitet til å huske hvilken av de to armene som leverte et sjokk under den foreløpige læringsfasen. Under testfasen blir den sikre armen reversert fra den som var sikker under læringsfasen. Dess mer dyret husker fra læringsfasen, dess flere feil vil den gjøre under testfasen. En høy feilskår viser læring av oppgaven.

Treningsfasen i Y labyrintdiskrimineringsreverseringsoppgaven var som følger. Dyrene ble plassert i en trearmet Y labyrintapparatur, der hver arm var separert av en glidedør (fig. 7). Den venstre arm ble belyst under testing som under trening, mens senterarmen og den høyre armen forble mørk. Dyrene ble plassert i det mørke sentrum (start) armen (ved basis av Y); etter 10 sekunder ble et fotsjokk (0,35 mA, 60 Hz) avlevert til startarmen og til skjæringspunktet til alle tre armene, men ikke til den belyste armen inntil dyret kom inn i den opplyste armen. Mus som mislykkes i å komme i den belyste armen i løpet av 60 sekunder, ble fjernet og anbrakt igjen i startarmen. De som hadde fullstendig kommet inn i den belyste armen, ble løftet og returnert til startarmen. Intervallet mellom treningsprøvene var 40 sekunder. Det endelige trinnet i treningen krevet at, når det var gitt valg mellom opplyste og mørke armer, valgte musene den opplyste armen tre ganger etter hverandre (kriteriet). Alle musene ble deretter gjenstand for en tvunget inngang i den mørke armen, der de mottok et 5 sekunders fotsjokk for å sikre at alle dyrene erfarte fotsjokk i den mørke armen.

Testing ble gjennomført 48 timer senere, men med den mørke armen som den sikre armen og den belyste armen som tilveiebringer fotsjokk. Alle mus ble gitt seks testprøver. Registreringer ble gjort av den første armen valgt av dyret under testing (L = lys eller D = mørk) og av latentperioden for å nå den mørke (sikre) armen. Antall feil i seks prøver ble registrert. Slik det er vist ved data i fig. 8, resulterte administrering av BA i saltvannsbærer beskrevet over til tre grupper mus (n = 12) ved en dosering på 1,0, 3,0 eller 10,0 mg/kg kroppsvekt i en statistisk signifikant økning av feil i forhold til kontrollgruppen (n = 24), som mottok administrering bare av saltvannsbærer (3% etanol i fysiologisk saltvann), og dette viser at medikamentet forenkler hukommelsen for denne oppgaven.

EKSEMPEL 7

For å bestemme retensjonslatentheter av BA, ble medikamentet injisert perifert til grupper av mus (n = 12) ved en dosering på 3 mg/kg intraperitonealt ved forskjellige tidsintervaller forut for eller etter trening og utøvelse av den ervervede læringsoppgaven som er beskrevet i eksempel 6 i søknaden. Fire sett av kontroll- og testgrupper av mus (12 mus pr. gruppe) ble injisert med BA ved en dosering på 3 mg/kg kroppsvekt 7 dager forut for trening, 120 minutter forut for trening, umiddelbart forut for trening eller 120 minutter etter trening. Slik det er vist ved resultatene oppsummert i fig. 9, var gjennomsnittlige retensjonslatentheter i testdyrene signifikant høyere enn kontroll når medikament ble injisert 7 dager forut for trening, 2 timer forut for trening og umiddelbart etter trening. Injeksjon av BA to timer etter trening resulterte imidlertid ikke i en økning i retensjonslatenthet i forhold til kontollgruppen. Ingen negative helseeeffekter som kunne skyldes administrering av BA ble observert i testmusene.

EKSEMPEL 8

For å bestemme retensjonslatenthetene av BA ble medikamentet injisert intraperitonealt i grupper av mus ved en dosering på 3 mg/kg ved forskjellige tidsintervaller forut for eller etter trening og utøvelse av den ervervede læringen i Y labyrintoppgaven som beskrevet i eksempel 7 i søknaden. Fire sett av kontroll- og testgrupper med mus (12 mus pr. gruppe) ble injisert med BA ved en dosering på 3 mg/kg kroppsvekt 7 dager forut for trening, 120 minutter forut for trening, umiddelbart etter trening, eller 120 minutter etter trening. Som vist i resultatene oppsummert i fig. 10, var antall feil på reversering i testdyrene betydelig høyere enn i parallellkontrollgruppen når medikament ble injisert opp til 7 dager forut for trening og opp til 2 timer etter trening. Injeksjoner av BA seks timer etter trening resulterte ikke i en økning i antall feil i forhold til kontrollgruppen. Ingen negative helseeffekter som kunne skyldes administrering av BA ble observert i testmusene.

Claims (17)

1. Forbindelse med formelen: hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<*>, -SH, -NR<2>R<2>, og et karbonyloksygen; R 1 er et C\ til C4 alkyl; og R 0 er hydrogen.

2. Forbindelse med formelen: hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<*>, -SH, -NR<2>R<2>, og et karbonyloksygen; R er et Ci til C4 alkyl; og R er hydrogen og R' er uavhengig av hverandre et Ci til C4 alkyl.

3. Forbindelse med formelen: hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<*>, -SH, -NR^R<2>, og et karbonyloksygen; R<1> er et Ci til C4 alkyl; og R<2> er hydrogen og R' er uavhengig et Ci til C4 alkyl.

4. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

5. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for å bedre læring i et pattedyr ved perifer administrering av en terapeutisk mengde som induserer langtidspotensiering, hvor forbindelsen har en struktur valgt blant: hvor hver R uavhengig av hverandre er valgt blant -OH, -OR<1>, -SH, -SR<1>, -NR2R2 og et karbonyloksygen; R<*> er hydrogen eller -OH; R<1> er et Cj til C4 alkyl; R<2> er hydrogen eller et Ci til C4 alkyl; hver R' er uavhengig av hverandre et Ci til C4 alkyl, hver R" er uavhengig av hverandre valgt blant -H, -OH-, -OR<1> og -NR<2>R<2> og R"' er uavhengig av hverandre valgt blant

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor forbindelsen har formelen

7. Anvendelse ifølge krav 5 eller 6, hvor mengden av forbindelsen som administreres er fra 1,0 til 15,0 mg/kg kroppsvekt.

8. Anvendelse ifølge krav 5,6 eller 7 hvor forbindelsen administreres intraperitonelt eller intravenøst.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 8, hvor pattedyret har en frisk hjerne.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 9, hvor forbindelsen administreres opptil syv dager før læringen.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 9, hvor forbindelsen administreres opptil 2 timer etter læringen.

12. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for behandling av hukommelsesdysfunksjon i et pattedyr ved perifer administrering av en terapeutisk mengde som induserer langtidspotentiering, hvor forbindelsen har en struktur som definert i krav 5 eller 6.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor hukornmelsesdysfunksjonen er forbundet med en økning i effektiviteten til synapsetransmisjon eller tap av fungerende synapse i hippocampus.

14. Anvendelse ifølge krav 12 eller 13, hvor mengden av forbindelsen som administreres er fra 1,0 til 15,0 mg/kg kroppsvekt.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvor mengden av forbindelsen som administreres er fra 3,0 til 10,0 mg/kg kroppsvekt.

16. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 15, hvor forbindelsen administreres intraperitonelt.

17. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for økning av synaptisk effektivitet ved indusering av langstidspotentiering i et pattedyr, hvor nevnte forbindelse har en struktur som definert i krav 5 eller 6.