NO314301B1

NO314301B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av IL-8-reseptor-antagonister

Info

Publication number: NO314301B1
Application number: NO20016067A
Authority: NO
Inventors: Deborah Lynn Bryan; John Gerald Gleason; Katherine Louisa Widdowson
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1996-08-15
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2003-03-03
Also published as: CZ46799A3; JP2000516619A; EP0929302A4; TW461878B; CO5031286A1; BR9711140A; WO1998006397A1; KR20000030003A; NO990668D0; PL331539A1; NO312458B1; CA2263388A1; AR008290A1; NO20016067L; IL128501A0; CN1152675C; AU723816B2; TR199900318T2; CN1232398A; ZA977301B

Description

Denne oppfinnelse angår fremgangsmåter for fremstilling av guanidinholdige forbindelser. Disse forbindelsene kan anvendes for behandling av IL-8-, GROa, GROp, GROy, ENA-78 og Nap-2-bevirkede sykdommer.

Mange forskjellige navn er blitt anvendt for Interleukin-8 (IL-8), så som nøytrofil-tiltrekkende/aktiverende protein-1 (NAP-1), monocytt-avledet nøytrofil-kjemotaktisk faktor (MDNCF), nøytrofil-aktiverende faktor (NAF) og T-celle-lymfocytt-kjemotaktisk faktor. Interleukin-8 er et kjemotiltrekkende middel for nøytrofile celler, basofile celler og et undersett av T-celler. Det dannes av et flertall av kjemeholdige celler innbefattende makrofager, fibroblaster og endotel- og epitel-celler som eksponeres for TNF, IL-la, IL-1 p eller LPS, og av de nøytrofile celler selv, når de eksponeres for LPS eller kjemotaktiske faktorer så som FMLP. M. Baggiolini et al, J. Clin. Invest. 84, 1045 (1989); J. Schrøder et al, J. Immunol. 139,3474 (1987) og J. Immunol. 144,2223 (1990) ; Strieter, et al, Science 243,1467 (1989) og J. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatella et al, J. Immunol. 148, 3216(1992).

GROa, GROp, GROy og NAP-2 hører også til kjemokin-cc-familien. I likhet med IL-8 er disse kjemokiner også blitt omtalt med forskjellige navn. For eksempel er GROa,

p, y blitt omtalt som henholdsvis MGSAa, P og y (melanomvekst-stimulerende aktivitet),

se Richmond et al, J. Cell Physiology 129, 375 (1986) og Chang et al, J. Immunol 148,451

(1992). Alle kjemokinene i a-familien hvor ELR-mønsteret er like foran CXC-mønsteret, bindes til IL-8 B-reseptoren. IL-8, Groa, GROp, GROy og NAP-2 stimulerer en rekke funksjoner in vitro. De er alle blitt vist å ha kjemotiltrekkende egenskaper for nøytrofile celler, mens IL-8 og GROa har vist kjemotaktisk virkning overfor T-lymfocytter og basofile celler. Dessuten kan IL-8 bevirke histaminfrigjøring fra basofile celler både fra normale og atopiske individer. GRO-a og IL-8 kan dessuten bevirke lysozomal-enzymfrigjøring og respiratorisk anfall («respiratory burst») pga. nøytrofile celler. IL-8 er også blitt vist å øke overflate-ekspresjonen av Mac-1 (CD1 lb/-CDl 8) på nøytrofile celler uten ny proteinsyntese. Dette kan bidra til øket adhesjon av de nøytrofile celler til vaskulære endotelceller. Mange kjente sykdommer er karakterisert ved massiv infiltrasjon av nøytrofile celler. Slik som IL-8, Groa, GROp, GROy og NAP-2 befordrer opphoping og aktivering av nøytrofile celler, har disse kjemokiner vært innblandet ved en lang rekke akutte og kroniske inflammatoriske forstyrrelser innbefattende psoriasis og reumatoid artritt, Baggiolini et al, FEBSLett. 307, 97 (1992); Miller et al, Crit. Rev. Immunol. 12, 17 (1992); Oppenheim et al, Annu. Rev. Immunol. 9,617 (1991); Seitz et al., J. Clin. Invest. 87,463 (1991); Miller et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146,427 (1992); Donnely et al, Lancet 341, 643 (1993). Dessuten har ELR-kjemokinene (slike som inneholder aminosyre-ELR-mønsteret like foran CXC-mønsteret) også vært innblandet ved angiostase. Strieter et al, Science 258,1798 (1992). In vitro bevirker IL-8, GROa, GROp, GROy og NAP-2 formforandring hos nøytrofile celler, kjemotakse, granul-frigjøring og respiratorisk anfall («respiratory burst»), ved at de bindes til og aktiverer reseptorer hos syv-transmembran-, G-protein-bundet-familien, spesielt ved at de bindes til IL-8 reseptorer, særlig B-reseptoren. Thomas et al., J. Biol. Chem. 266, 14839 (1991); og Holmes et al., Science 253, 1278 (1991). Utviklingen av småmolekylære ikke-peptid-antagonister for medlemmer i denne reseptorfamilie har presedens. For en oversikt, se R. Freidinger i: Progress in Drug Research, Vol. 40, s. 33-98, Birkhauser Verlag, Basel 1993. Følgelig representerer IL-8-reseptoren et lovende mål for utvikling av nye anti-inflammatoriske midler. To høyaffinitets human-IL-8-reseptorer (77% homologi) er blitt karakterisert: IL-8Ra, som bare binder IL-8 med høy affinitet, og IL-8RP, som har høy affinitet for IL-8 samt for GRO-a, GROP, GROy og NAP-2. Se Holmes et al., som ovenfor; Murphy et al., Science 253,1280 (1991); Lee et al., J. Biol. Chem. 267,16283 (1992); LaRosa et al.,

J. Biol. Chem. 267,25402 (1992); og Gayle et al., /. Biol Chem. 268, 7283 (1993).

Det er på dette felt behov for behandling med forbindelser som kan bindes til IL-8 a- eller -p-reseptoren. Tilstander forbundet med en økning i IL-8-dannelse (som er ansvarlig for kjemotakse for nøytrofile celler og undersett av T-celler til det inflammatoriske sted) vil ha nytte av forbindelser som er inhibitorer for IL-8-reseptorbinding.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (II)

hvor W er

hvor R er OH,

Ri er valgt blant N02, CN, Ci-Cealkyl og C|-C6alkoksy, og m er 1 eller; og

Wi er

hvor Y er halogen,

n er 1 eller 2, eller

2Y på nabostilte karbonatomer danner en Ci-C3alkyIendioksygruppe; kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter at en forbindelse med formelen

hvor W og W<*> omsettes med et overskudd av metansulfonylklorid i nærvær av en tert.-aminbase.

Oppfinnelsen er videre kjennetegnet ved at basen er trietylamin. Oppløsnings-midlet som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse er metylenklorid.

Oppfinnelsen utføres ved at reaksjonstemperaturen er fra -10° til 50°.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen: hvor W og W] er som definert ovenfor, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter at en forbindelse med formel (IV)

hvor W er som definert ovenfor;

omsettes med 2 eller flere ekvivalenter base i nærvær av et passende isotiocyanat (Wj-NCS) i et aprotisk eller halogenen oppløsningsmiddel.

Oppfinnelsen er kjennetegnet ved at basen er natriumhydrid, kaliumhydrid eller kalsiumhydrid.

Oppløsningsmidlet som anvendes er et aprotisk oppløsningsmiddel.

Foreliggende oppfinnelse er videre kjennetegnet ved at det aprotiske oppløsnings-middel er dimetylformamid, dioksan eller toluen.

Reaksjonstemperaturen som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse er fra -10° til 50°.

Det er følgelig mulig å behandle en kjemokin-bevirket sykdom, hvor kjemokinet er ett som bindes til en IL-8 a- eller -p-reseptor. En effektiv mengde av en forbindelse ifølge formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav administreres. Kjemokinet er spesielt IL-8.

Man er klar over at forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan eksistere som stereoisomerer, regioisomerer eller diastereomerer. Disse forbindelser kan inneholde én eller flere asymmetriske karbonatomer og kan eksistere i racemiske og optisk aktive former. Alle disse forbindelser er innbefattet innenfor foreliggende oppfinnelses ramme.

Man er klar over at guanidin-funksjonaliteten kan ha flere forskjellige tautomerer, så som Wi-N -C(=NZ) -NW; ZN =C(NW]) -NW; W]-N -C(=NW) -NZ.

I eksemplene er alle temperaturer i grader celcius (°C). Massespektra ble utført på et VG Zab-massespektrometer ved anvendelse av hurtig atombombardering, dersom ikke annet er angitt. <l>H-NMR-(nedenfor "NMR")-spektra ble registrert ved 250 MHz eller 400 MHz ved anvendelse av et spektrometer henholdsvis av typen Bruker AM 250 eller AM 400. Angitte multiplisiteter er: s=singlett, d=dublett, t=triplett, q=kvartett, m=multiplett og br angir et bredt signal. Sat. angir en mettet løsning, ekviv. angir andelen av en mol-ekvivalent av reagens i forhold til hovedreaktanten.

Flash-kromatografi kjøres over Merck Silikagel 60 (230 - 400 mesh).

SYNTESE-EKSEMPLER

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ved henvisning til følgende eksempler. Alle temperaturer er gitt i grader celcius, alle oppløsningsmidler som anvendes i det foreliggende, er av høyest tilgjengelige renhet, og alle reaksjoner kjøres under vannfrie betingelser i argon-atmosfære dersom ikke annet er angitt.

Eksempel 1

Fremstilling av N- f2- hvdroksv- 4- nitrofenvl)- N'-(' 2- klorfenyl)- >r'- cyanoguanidin.

a) Natriumsalt av N-(2-klorfenyl)-N"-cyanotiourea

Natrium (1,64 g, 71,3 mmol) ble oppløst i etanol til all gassutvikling hadde

opphørt. Deretter ble cyanamid (1,685 g, 40 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 15 minutter, 2-klorfenylisotiocyanat (7,21 g, 42,66) ble tilsatt, og blandingen ble holdt ved tilbakeløp i 6 timer. Reaksjonen ble avkjølt og fortynnet med metylenklorid. Et hvitt faststoff ble utfelt, og dette ble filtrert og tørret, hvilket ga natriumsaltet av N-(2-klor-fenyl)-N"-cyanotiourea. ( 8,26 g, 87,5%). MS(ES<+>) m/e 210,212 [M+H]<+>

b) N-(2-Hydroksy-3-nitrofenyl)-N'-(2-klorfenyl)-N"-cyanoguanidin

Til en omrørt løsning av natriumsaltet av N-(2-klorfenyl)-N'-cyanotiourea (234 mg, 1 mmol) og 2-hydroksy-3-nitro-anilin (156 mg, 1 mmol) i 2 ml tørt DMF ble det tilsatt EDC- hydroklorid (384 mg, 2 mmol) under Ar, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 d. Reaksjonsblandingen ble fordelt mellom EtOAc og 1 N HC1, og de organiske ekstrakter ble vasket med vann og saltvann. Etter tørring (Na2S04) og inndamping av oppløsningsmidlet under redusert trykk, ble det isolert en rød olje. Kromatografi (silikagel, 3% aceton/CHCh) ga et klart gult faststoff (30 mg, 9%), som ble omkrystallisert fra t-butylmetyleter, hvorved man fikk tittelforbindelsen. <i>H-NMR (400 MHz, CDC13) 810,93 (s, 1H), 8,53 (s, 1H), 7,92 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,61 (d, J=7,8 Hz, 2H), 7,38-7-50 (m, 2H), 7,22 (s, 1H), 7,08 (t, 1H); IR(KBr) 2181 cm"<1>; MS(ES") m/e 330[M-H]"; Sm.p.. 163-164°.

Eksempel 2

Fremstilling avN-( 2- hvdroksv- 4- cvanofenvl)- N'-( 2- bromfenyl)- N"- cyanoguanidin.

a) l-Allyloksy-5-cyano-2-nitrobenzen

En blanding av 5-cyano-2-nitro-fenol (3,0 g, 18,9 mmol), allylbromid (1,82 ml,

21,0 mmol) og cesiumkarbonat (7,39 g, 22,7 mmol) i DMF (20 ml) ble omrørt ved romtem-peratur i 18 timer under Ar. Reaksjonsblandingen ble fordelt mellom t-butyl-metyleter og vann. Fasene ble separert, og den vandige porsjon ble ekstrahert ytterligere (x3). De samlede organiske ekstrakter ble vasket to ganger med vann og deretter med saltvann, tørret over MgSC>4 og filtrert. Fjerning av oppløsningsmiddel ved redusert trykk

ga tittelfor-bindelsen (3,89 g, 100%). <1>H-NMR(400 MHz, CDC13) 5 7,87 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,35 (dd, J=8,4 Hz J=l,2 Hz 1H), 7,35 (d, J=l,5 Hz, 1H), 6,02 (m, 1H), 5,52 (d, 1H), 5,43 (d, 1H), 4,73 (dd, J=3,6 Hz J=l ,2 Hz 2H);

b) 2-AUyloksy-4-cyanoanilin

En blanding av l-allyloksy-5-cyano-2-nitrobenzen (3,6 g, 17,46 mmol) og tinn-(Il)klorid (19,7 g, 87,3 mmol) i etanol (100 ml) ble omrørt over natten ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk. Reaksjonsblandingen ble fordelt mellom 5% NaHC03 og etylacetat. Blandingen ble filtrert for fjerning av tinnsaltene, og den vandige fase ble ekstrahert videre med etylacetat (x4). De samlede organiske faser ble vasket med vann og saltvann og tørret over MgSC>4. Fjerning av oppløsningsmiddel ved redusert trykk ga et brunt faststoff (2,82 g), som ble omkrystallisert fra t-butyl-metyleter/ heksan, hvilket ga tittelforbindelsen som et lysebrunt faststoff. (2,63 g, 93%) MS(ES+) m/e 175 [M+H]+; MS(ES-) m/e 173 [M-H]";

c) N-(2-AllyIoksy-4-cyanofenyl)-N'-(2-bromfenyl)-tiourea.

Til natriumhydrid (60% oljedispersjon, 240 mg, 6,0 mmol), på forhånd vasket med

heksaner, i DMF (10 ml), ble det ved 0° tilsatt 2-allyloksy-4-cyanoanilin (522 mg, 3 mmol) i DMF (1,5 ml). Etter omrøring i 15 minutter ved 0°C under Ar, ble 2-bromfenyl isotiocyanat tilsatt dråpevis ved 0° og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonen ble brå-avsluttet ved tilsetting av 0,5 M natriumdihydrogenfosfat. Blandingen ble ekstrahert med etylacetat, vasket med vann og tørret over natriumsulfat. Det ubearbeidede faststoff ble omkrystallisert fra metanol, hvorved man fikk tittelforbindelsen som et hvitt faststoff (911 mg, 78%) MS(ES<+>) m/e 388, 390 [M+H]<+>

d) N-(2-Allyloksy-4-cyanofenyl)-N'-(2-bromfenyl)-karbodiimid

Til en omrørt løsning av N-(2-allyloksy-4-cyanofenyI)-N'-(2-bromfenyl)-tiourea

(900 mg, 2,32 mmol) og trietylamin (1 ml, 6,95 mmol) i metylenklorid ble det dråpevis ved

0° tilsatt metansulfonylklorid (360 ul, 4,64 mmol) under Ar. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 15 minutter ved 0° og TLC viste intet tilstedeværende utgangsmateriale.

Reaksjonsblandingen ble kromatografert på silikagel under eluering med metylenklorid, hvorved man fikk tittelforbindelsen som et gult faststoff (1,2 g, >100%). Dette ble anvendt i neste reaksjon uten ytterligere rensing.

e) N-(2-Allyloksy-4-cyanofenyl)-N'-(2-bromfenyl)-]Sr'-cyanoguariidiri.

Til en omrørt blanding av cyanamid (560 mg, 13,33 mmol) og Huinig's base (2,6

ml) i acetonitril ble det dråpevis tilsatt en oppløsning av N-(2-allyloksy-4-cyanofenyl)-N'-(2-bromfenyl)-karbodiimid (600 mg, 1,69 mmol) i acetonitril (30 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 min, og deretter ble oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk og residuet hydrolysert med 0,5 M natriumdihydrogenfosfat. Etylacetat-ekstraksjoner av den vandige blanding ble vasket med 0,5 M natriumdihydrogenfosfat og saltvann. Etter tørring (MgSCXO, filtrering og inndamping under redusert trykk, fikk man et ubearbeidet, gulbrunt faststoff (500 mg). Dette ble kromatografert på silikagel (50/50 etylacetat/heksan), hvilket ga tittelforbindelsen (455 mg, 95%). MS(ES") m/e 394, 396 [M-H]"

f) N-( 4-Cyano-2-hydroksyfenyl)-N'-(2-bromfenyl)-N"-cyanoguanidin.

Til en blanding av N-(2-allyloksy-4-cyanofenyl)-N<*->(2-bromfenyl)-N"-cyanoguanidin (100 mg, 0,25 mmol) og natrium-borhydrid (20 mg, 0,52 mmol) i THF (3 ml) ble det ved romtemperatur tilsatt tetrakistrifenylfosfin-palladium[0] (21 mg, 7 mol%). Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur inntil TLC viste at det ikke var tilstede noe utgangsmateriale. Blandingen ble fordelt mellom etylacetat og 0,5 M natriumdihydrogenfosfat. Etter tørring over MgSC>4, ga filtrering og inndamping under redusert trykk et ubearbeidet, gulbrunt faststoff (100 mg). Kolonnekromatografi på silikagel under eluering med 5% metanolAkloroform ga tittelforbindelsen som et lysegult faststoff (64 mg), som ble omkrystallisert fra kloroform (42mg, 47%),1H-NMR(400 MHz,DMSO) 8 10,93 (s, 1H), 9,57 (s, 1H), 8,74(s, 1H), 7,84 (d, J=8,3 Hz, 1H),7,71 (d, J=7,8 Hz, 2H), 7-50- 7,42 (m, 2H), 7-30- 7,26 (m, 2H 7,17 (s, 1H), 7,08 (t, 1H); IR(KBr) 2224,2193 cm"<1>; MS(ES") m/e 354,356 [M-H]-; MS(ES<+>) m/e 356,358 [M+H]<+>; Sm.p. 175-176°.

Eksempel 3

Fremstilling av N-( 4- cyano- 2- hydroksyfenyl)- N'-( fenvl) - N"- cvanoguanidin

a) 5-Cyano-1 -metoksymetyloksy-2-nitrobenzen

Til natriumhydrid (60% olje dispersjon, 260 mg, 6,5 mmol), på forhånd vasket med

heksaner, i THF (5 ml) ble det dråpevis ved romtemperatur tilsatt 5-cyano-2-nitro-fenol

(978 mg, 5,96 mmol) i THF (10 ml). Løsningen fikk en klar oransje farge, og det ble dannet rikelig utfelning. Etter omrøring i 15 minutter ved romtemperatur, ble brommetyl-metyleter tilsatt dråpevis til denne omrørte oppslemning, og reaksjonen ble omrørt i 18 timer ved romtemperatur. Den gulfargede blanding ble deretter fordelt mellom t-butyl-O-metyleter og vann, og den vandige porsjon ble ekstrahert (X3) og vasket med 5% natriumbikarbonat-Iøsning (X4) og saltvann. Etter tørring (MgSO,*), filtrering og inndamping under redusert trykk, fikk man tittelforbindelsen som et lysegult faststoff (1,05 g, 85%), 1H-NMR(400 MHz, CDC13) 07,84 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,66 (d, J=l,4 Hz 1H), 7,35 (dd, J=8,4 Hz J=l,5 Hz, 1H), 5,34 (s, 2H), 3,55 (s, 3H).

b) 4-Cyano-2-metoksymetyloksyanilin

En blanding av 5-cyano-l-metoksymetyloksy-2-nitrobenzen (0,5 g, 2,4 mmol) og

10% palladium på karbon (0,05 g) i etylacetat (50 ml) ble omrørt ved romtemperatur under 1 atm. hydrogen i 72 timer. Blandingen ble filtrert gjennom Celite for fjerning av palladiumet, og residuet ble kromatografert på silikagel (under eluering med 25% etylacetat/- heksan), hvorved man fikk tittelforbindelsen (250 mg, 58%). MS(ES<+>) m/e 179 [M+H]<+>

c) N-(4-cyano-2-metoksymetyloksyfenyl)-N'-(2-fenyl)-N"-cyanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel l(c)-l(e), bortsett fra at 2-brom-fenylisotiocyanat ble erstattet med fenylisotiocyanat og 2-allyloksy-4-cyanoanilin ble erstattet med 2-metoksymetyloksy-4-cyanoanilin, ble tittelforbindelsen fremstilt (24% totalt). IR(KBr) 2226,2198 cm'<1>; MS(ES-) m/e 320 [M-H]"

d) N-(4-Cyano-2-hydroksyfenyl)-N'-(fenyl) -N"-cyanoguanidin

Forbindelsen ifølge eksempel 2(b) (47 mg, 0,146 mmol) ble oppløst i etylacetat (20

ml), behandlet med 6 N HC1 (10 ml) og omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Deretter ble 6 N HC1 (5 ml) tilsatt, og omrøringen fortsatte i ytterligere 2 timer. Blandingen ble fortynnet med etylacetat og saltvann og den vandige porsjon ekstrahert videre med etylacetat (X5).

De samlede organiske porsjoner ble tørret over natriumsulfat og inndampet i vakuum,

hvilket ga tittelforbindelsen (64 mg), som ble omkrystallisert fra t-butyl-O-metyleter,

hvorved man fikk tittelforbindelsen som et hvitt faststoff (2 mg, 5%). 'H-NMR (400 MHz, DMSO de) 5 9,70 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 7,62 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,55 (d, J=l,2 Hz, 1H), 7,49

(dd, J=l,2 Hz, J=8,l Hz, 1H), 7,36 (m, 4H), 7,18 (m, 1H); IR(KBr) 2233,2192 cm"<1>; MS(ES<+>) m/e 278 [M+H]<+>; MS(ES") m/e 276 [M-H]"; Sm.p. 270-271°C.

Eksempel 4

Fremstilling avN-( 4- cyano- 2- hvdroksvfenvn- N'-( 2J- diklorfenvl)- N''- cyanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel l(a)-l(e), bortsett fra at 2-brom-fenylisotiocyanat ble erstattet med 2,3-diklorfenylisotiocyanat, ble tittelforbindelsen fremstilt (17% totalt). IR(KBr) 2231,2197 cm"<1>; MS(ES<+>) m/e 346, 348, 350 [M+H]<+>; MS(ES-) m/e 344, 346, 347, 348 [M-H]"; Sm.p. 155-156°C.

Eksempel 5

Fremstilling av N-( 2- bromfenvn- Nl-( 4- cvano- 2- hvdroksv- 3- propvlfenvl)- N"- cvanoguanidin

a) 2-Amino-5-cyano-6-prop-l -en-3-yl-fenol

Forbindelsen fremstilt i eksempel 2(b) (1,88 g, 1,29 mmol) ble behandlet med N,N-dimetylanilin (20 ml) under Ar og holdt i 314 time ved 175° (oljebadtemperatur). Løsnings-midlet ble fjernet i vakuum, og residuet ble omkrystallisert fra metyl-t-butyleter med 10-20% av hver av metylenklorid og heksan, hvorved man fikk tittelforbindelsen som et klart faststoff (1,67 g, 89%). MS(ES<+>) m/e 175 [M+H]<+>; MS(ES~) m/e 173 [M-H]";

b) 2-Amino-5-cyano-6-propyl-fenol

En blanding av 2-amino-5-cyano-6-prop-l-en-3-yl-fenol (0,5 g, 2,4 mmol) og 10%

palladium på karbon (0,05 g) i etylacetat (50 ml) ble omrørt ved romtemperatur under 1 atm hydrogen i 2 timer. Blandingen ble filtrert gjennom Celite for fjerning av palladiumet, og filtratet ble konsentrert under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen som et rosa-hvitt faststoff (1,2 g, 78%). MS(ES<+>) m/e 177 [M+H]<+>; MS(ES") m/e 175[M-H]".

c) N-(2-bromfenyl)-N'-(4-cyano-2-hydroksy-3-propylfenyl)-N"-cyanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel 2(a)-l(e), bortsett fra at 5-cyano-2-nitro-fenol ble erstattet med 2-amino-5-cyano-6-propyl-fenoI, ble tittelforbindelsen fremstilt (37 % totalt). <!>H-NMR(400 MHz, DMSO d6) 8 9,72 (s, 1H), 9,45 (s, 1H), 8,66 (s, 1H), 7,71 (d, J=7,0 Hz, 1H), 7,56 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,28 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,26 (t, 1H), 2,76 (t, J=7,5, 2H), 1,55 (hekstett, J=7,6,2H), 0,93(t, J=7,3,3H);

IR(KBr) 2224, 2184 cm-<1>; MS(ES<+>) m/e 398,400 [M+H]<+>; MS(ES") m/e396, 398

[M-H]";

Eksempel 6

Fremstilling av N- f4- cyano- 2- hydroksv- 3- propvlfenyl')- N'- f2. 3- diklorfenvn- N"- cvanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel l(b)-l(e), bortsett fra at 2-brom-fenylisotiocyanat ble erstattet med 2,3-diklorfenylisotiocyanat og 2-allyloksy-4-cyanoanilin ble erstattet med 2-allyloksy-4-cyano-3-propylanilin, ble tittelforbindelsen fremstilt (7 % totalt). IR(KBr) 2236,2182 cm"<1>; MS(ES<+>) m/e 388,390,391 [M+H]<+>; MS(ES") m/e 386,388,390 [M-H]"; Sm.p. 143-147°C.

Eksempel 7

Fremstilling avN-( 2- klorfenvn- N'- f4- cvano- 2- hydroksy- 3- propvlfenvl')- N"- cvanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel l(b)-l(e), bortsett fra at 2-brom-fenylisotiocyanat ble erstattet med 2-klorfenyIisotiocyanat og 2-allyloksy-4-cyanoanilin ble erstattet med 2-allyloksy-4-cyano-3-propylanilin, ble tittelforbindelsen fremstilt ( 26 % totalt). IR(KBr) 2225,2187 cm"<1>; MS(ES<+>) m/e 354, 356 [M+H]<+>; MS(ES") m/e 352, 354 [M-H]-; Sm.p. 159-160° C.

Eksempel 8

Fremstilling av N- f2- bromfenyl)- N'- f4- cvano- 2- hvdroksv- 3- isobutvlfenvl)- N"- cvanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel 4(a)-l(c), bortsett fra at allylbromid ble erstattet med 3-brom-2-metyl- 1-propen, ble tittelforbindelsen fremstilt (16% totalt). IR(KBr) 2231,2189 cm"<1>; MS(ES<+>) m/e 412,414 [M+H]<+>; MS(ES~) m/e 410,412

[M-H]";

Eksempel 9

Fremstilling av N-( 2- bromfenvl')- N'-( 3- brom- 4- cvano- 2- hvdroksvfenvn- N"- cvanoguanidin

i a) 2-Brom-3-hydroksy-4-nitrobenzonitril.

Til en oppløsning av 3-hydroksy-4-nitrobenzonitril (3,03 g, 18,4 mmol) i metylenklorid (660 ml) ble heksametylentetraamin-forbindelse med hydrogentribromid (1:1)

(9,9lg, 26,0 mmol) tilsatt. Den resulterende løsning fikk omrøres i 1 uke ved romtem-peratur. Reaksjonsblandingen ble surgjort med IN HC1 og deretter ekstrahert med en 1/1 blanding av EtOAc/heksan. De organiske faser ble samlet, tørret over MgSC>4 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble avdampet, og kromatografering av det resulterende faststoff på silikagel (50/50: heksan/ EtOAc) ga det ønskede produkt (1,47 g, 35,0%). MS(ES") m/e 241,243 [M-H]".

b) N-(2-bromfenyl)-N'-(3-brom-4-cyano-2-hydroksyfenyl)-N"-cyanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel 2(a)-l(e), bortsett fra at 5-cyano-2-nitro-fenol ble erstattet med 2-brom-3-hydroksy-4-nitrobenzonitril, ble tittelforbindelsen fremstilt som et varmhvitt faststoff.( 44% totalt etter krom., 15% omkrystallisert). ^H-NMR(400 MHz, DMSO de) 5 10,66 (s, 1H), 9,56 (s, 1H), 8,92 (s, 1H), 7,71 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,48-7,41 (rn, 3H), 7,26 (t, 1H); IR(fCBr) 2228,2186cm-l; MS(ES<+>) m/e 434,436,438 [M+H]<+>; MS(ES") m/e 432,434,436 [M-H]"; Sm.p. 142°C.

Eksempel 10

Fremstilling avN-( 3- brom- 4- cyano- 2- hvdroksvfenvlVN'-( 2, 3- metvlenedioksvfenylVN"-cvanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel 8(a)-l(b), bortsett fra at 2-brom-fenylisocyanat ble erstattet med metylenedioksyfenylisotiocyanat, ble tittelforbindelsen fremstilt (14% totalt) IR(KBr) 2230,2196cm-l; MS(ES<+>) m/e 400,402 [M+H]<+>; MS (ES") m/e 398,400[M-H]-; Sm.p. 164-165°C

Eksempel 11

Fremstillin<g> av N-( 2- bromfenvn- N'-( 4- cvano- 2- hvdroksv- 3- metoksvkarbonvlfenvl)- N"-cyanoguanidin

a) Metyl-2,6-dihydroksybenzoat.

En oppløsning av 80% NaH (10,00 g, 333,3 mmol) i DMF (45ml) ble avkjølt til

0°C under Ar. Til denne blanding ble 2,6-dihydroksybenzosyre (48,88 g, 317,1 mmol) i DMF (50ml) langsomt tilsatt i løpet av 45 min. Oppløsningen fikk omrøres i 45 min, og

deretter ble Mel (21,0 ml, 337 mmol) tilsatt i løpet av 20 min. Den resulterende løsning fikk omrøres ved romtemperatur i 70 timer. Blandingen ble fortynnet med metylenklorid og filtrert gjennom en propp av silikagel ved anvendelse av metylenklorid som vaskevæske.

Oppløsningsmidlet ble avdampet, hvilket ga det ønskede produkt (35,22 g, 66,1%). ^H-NMR(250 MHz, DMSO de) 5 9,91 (s, 2H), 7,09 (t, J= 1,2 Hz, J= 2,5 Hz, 1H), 6,37 (d, J= 1,1 Hz, 2H), 3,78 (s, 3H).

b) Metyl-2-benzyloksy-6-hydroksybenzoat.

Til en blanding av metyl-2,6-dihydroksybenzoat (20,00 g, 118,9 mmol) i DMF (100

ml) under Ar ble det tilsatt 80% NaH (3,9144 g, 130,5 mmol), fulgt av tilsetting av benzyl-bromid (25,5ml, 214,5mmol). Løsningen ble oppvarmet ved 70°C i 20 timer. Blandingen ble avkjølt, fulgt av tilsetting av mettet natriumbikarbonat, ekstrahert med EtOAc, tørret over MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble avdampet, og kromatografi av det

resulterende faststoff på silikagel (95/5: heksan/EtOAc) viste det ønskede produkt (16,71g, 54,4%). MS(ES") m/e 257 [M-H]".

c) Metyl-2-benzyloksy-6-cyanobenzoat.

En oppløsning av metyl-2-benzyloksy-6-hydroksybenzoat (2,730 g, 10,6 mmol) i

metylenklorid (28,5ml) ved 0°C under Ar ble behandlet med Af-fenyltrifluormetansulfon-imid (4,5424g, 12,7mmol) og trietylamin (l,62ml, 1 l,6mmol). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 14 timer. Løsningen ble fortynnet med dietyleter og vasket med vann, 5% natriumhydroksid og saltvann. Den organiske fase ble tørret over MgS04, filtrert og inndampet, hvilket ga det ubearbeidede triflat (4,476 g, 108%). ^H-NMR(250 MHz, CDC13) 8 7,35 (m, 6H), 6,95 (m, 2H), 5,16 (s, 2H), 3,94 (s, 3H). Det ubearbeidede triflat ble oppløst i DMF (23ml) og behandlet med palladium[0]-tetrakistrifenylfosfin (0,3036 g, 0,260 mmol) og Zn(CN)2 0,1027g, 9,39 mmol). Blandingen ble oppvarmet til 80°C i 10 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og hellet

i en oppløsning av mettet natriumbikarbonat. Blandingen ble ekstrahert med EtOAc, tørret over MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble avdampet, og kromatografering av det

resulterende faststoff på silikagel (80/20 : heksan/EtOAc) ga det ønskede produkt (2,20 g,

78% for to trinn). iH-NMRCSO MHz, CDCI3) 8 7,5-7,2 (m, 8H), 5,19 (s, 2H), 4,00 (s, 3H).

d) Fremstilling av metyl-6-cyano-2-hydroksybenzoat.

Til en oppløsning av metyl-2-benzyloksy-6-cyanobenzoat (10,0 g, 37,4 mmol) i

EtOAc (330ml) under Ar ble det tilsatt 10% Pd på karbon (4,72 g). Reaksjonsbeholderen ble gjennomblåst med hydrogen, og reaksjonsblandingen fikk omrøres ved romtemperatur under hydrogenatmosfære ved ballongtrykk. Etter 3 timer ble reaksjonen gjennomblåst med Ar, og oppløsningen ble filtrert gjennom celite. Oppløsningsmidlet ble avdampet, noe som resulterte i det ønskede produkt (6,12 g, 92,2%). Anal. beregnet for C9H7NO3 : C, 61,02; H, 3,98; N, 7,91. Funnet C, 60,74; H, 3,99: N, 7,65.

e) Fremstilling av metyl-6-cyano-2-hydroksy-3-nitrobenzoat.

En suspensjon av metyl-6-cyano-2-hydroksybenzoat (l,1428g, 6,45mmol) i

eddiksyreanhydrid (21 ml) ved 0°C ble behandlet dråpevis med konsentrert salpetersyre (0,41 ml, 6,44 mmol). Blandingen fikk oppvarmes til romtemperatur, og i løpet av dette tidsrom ble alt utgangsmateriale oppløst. Løsningen ble omrørt i 36 timer og deretter hellet i vann og ekstrahert med EtOAc. De samlede organiske faser ble tørret over MgS04 og filtrert. Oppløsningsmidlet ble avdampet, og kromatografering av det resulterende faststoff på silikagel (70/30/1 : heksan/ EtOAc/ HOAc) ga det ønskede produkt (0,50 g, 35,7%). MS(ES-)m/e221 [M-H]".

f) Metyl-3-amino-6-cyano-2-hydroksybenzoat.

Til en oppløsning av metyl-6-cyano-2-hydroksy-3-nitrobenzoat (402 mg,

I, 81mmol) i EtOAc (40ml) under Ar ble det tilsatt 10% Pd på karbon (0,23 g). Reaksjonsbeholderen ble gjennomblåst med hydrogen, og reaksjonsblandingen fikk omrøres ved romtemperatur under hydrogenatmosfære ved ballongtrykk. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen gjennomblåst med Ar, og deretter ble oppløsningen filtrert gjennom celite. Oppløsningsmid-let ble avdampet, hvilket resulterte i det ønskede produkt (334 mg, 96,0%). MS(ES-) m/e 192 [M-H]".

g}N-(2-bromfenyl)-N,-(4-cyano-2-hydroksy-3-metoksykarbonylfenyl)-N"-cyanoguanidin

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel 2(a)-l(e), bortsett fra at 5-cyano-2-nitro-fenol ble erstattet med metyl-3-amino-6-cyano-2-hydroksybenzoat, ble tittelforbindelsen fremstilt (19% totalt,). tø-NMR^OO MHz, DMSO d6) 8 11,08 (s, 1H), 9,69 (s, 1H), 8,89 (s, 1H), 7,99 (d, J=8,40 Hz, 1H), 7,73 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,50-7,42 (m, 3H), 7,28 (t, 1H); IR(KBr) 2228, 2186cm-1IR(KBr) 2225,2177 cm"<1>; MS(ES") m/e 412,414 [M-H]-; Sm.p. 210-211°C

BEHANDLINGSMETODE

Forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved fremstilling av et medikament for profylaktisk eller terapeutisk behandling av hvilken som helst sykdomstilstand hos et menneske eller annet pattedyr, som forverres eller forårsakes av for høy eller uregulert IL-8-cytokindannelse av slike pattedyrs celler, så som, men ikke begrenset til, monocytter og/eller makrofager eller andre kjemokiner som bindes til IL-8o> eller -(3-reseptoren, også omtalt som type I- eller type H-reseptoren.

Forbindelsene som fremstilles kan administreres i en mengde som er tilstrekkelig til hemming av cytokinfunksjon, spesielt IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2, slik at de biologisk reguleres ned til normale nivåer for fysiologisk funksjon, eller i noen tilfeller til subnormale nivåer, slik at sykdomstilstanden bedres. Unormale nivåer av IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2, for eksempel, i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, utgjør: (i) nivåer av fritt IL-8 med mer enn eller lik 1 pikogram pr. ml; (ii) hvilket som helst celle-IL-8- GROa, -GROp, -GROy, -ENA-78 eller -NAP-2 over normale fysiologiske nivåer; eller (iii) tilstedeværelse av IL-8, GROa, GROP, GROy, ENA-78 eller NAP-2 over basalnivåer i celler eller vev hvor det dannes henholdsvis IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2.

Det er mange sykdomstilstander hvor for høy eller uregulert IL-8-dannelse er innblandet ved forverring og/eller bevirking av sykdommen. Kjemokin-bevirkede sykdommer omfatter psoriasis, atopisk dermatitt, artritt, astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, åndenød-syndrom hos voksne, inflammatorisk tarmsykdom, Crohn's sykdom, ulcerøs kolitt, slag, septisk sjokk, endotoksisk sjokk, gramnegativ-sepsis, toksisk sjokk-syndrom, hjerte- og nyre-reperfusjonsskade, glomerulonefritt, trombose, transplantat-mot-vert-reaksjon, Alzheimers sykdom, allotransplantatforkastninger, malaria, restinose, angiogenese eller uønsket hematopoietisk stamcelle-frigjøring.

Disse sykdommer er først og fremst karakterisert ved massiv infiltrering av nøytrofile celler, T-celle-infiltrering eller neovaskulær vekst, og er forbundet med øket IL-8-, GROa-, GROP-, GROy- eller NAP-2-dannelse som er ansvarlig for kjemotakse av nøytrofile celler til det inflammatoriske sted eller retningsbestemt vekst av endotelceller.

I motsetning til andre inflammatoriske cytokiner (IL-1, TNF og IL-6), har IL-8, GROa, GROP, GROy eller NAP-2 den unike egenskap at den befordrer nøytrofil kjemotakse, enzymfrigjøring, innbefattende, men ikke begrenset til, elastasefirgjøring så vel som superoksid-dannelse og aktivering. a-Kjemokinene, men spesielt GROa, GROp, GROy eller NAP-2, som virker gjennom IL-8 type I- eller H-reseptoren, kan befordre neovaskula-risering av tumorer ved befordring av retningsveksten av endotelceller. Inhibering av IL-8-bevirket kjemotakse eller aktivering vil derfor føre til en direkte reduksjon i nøytrofilin-filtrering.

Nylige bevismaterialer innebærer også kjemokiners rolle ved behandling av HIV-infeksjoner, Littleman et al., Nature 381, s. 661 (1996) og Koup et al., Nature 381, s. 667

(1996).

TNF-a er et cytokin med proinflammatoriske virkninger, innbefattende endotel-leukocyttadhesjons-molekylekspresjon. Leukocytter infiltrerer ischemiske hjernelesjoner, og følgelig vil forbindelser som inhiberer eller reduserer nivåer av TNF, være nyttige for behandling av ischemisk hjerneskade. Se Liu et al., Stoke, Vol. 25., nr. 7, s. 1481-88

(1994), hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse.

Modeller av lukkede hodeskader og behandling med blandede 5-LO/CO-midler er omtalt i Shohami et al., J. of Vaisc & Clinical Physiology og Pharmacology, Vol. 3, nr. 2, s. 99-107 (1992), hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse. Behandling som reduserer ødemdannelse, ble funnet å forbedre funksjonelt utfall hos behandlede dyr.

Forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres i en mengde som er tilstrekkelig til inhibering av IL-8, som bindes til IL-8 alfa- eller beta-reseptorene, og som bindes til disse reseptorer, så som vist ved en reduksjon i nøytrofil-kjemotakse og -aktivering. Oppdagelsen av at forbindelsene som fremstilles er inhibitorer for IL-8-binding er basert på virkningene av forbindelsene med formlene (I) i in vitro-reseptorbindingsforsøkene som er beskrevet i det foreliggende. Forbindelsene med formel (I) er i noen tilfeller blitt vist å være dobbeltmhibitorer både for rekombinante type I- og type II-IL-8-reseptorer. Fortrinnsvis er forbindelsene inhibitorer for bare én reseptor, mer foretrukket type II.

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "IL-8-bevirket sykdom eller sykdomstilstand " hvilken som helst av alle sykdomstilstander hvor IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2 spiller en rolle, enten ved dannelse av IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2 selv eller ved at IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2 bevirker frigjøring av et annet monokin, så som, men ikke begrenset til, IL-1, IL-6 eller TNF. En sykdomstilstand hvor for eksempel IL-1 er en hovedkomponent og hvis dannelse eller virkning forverres eller utsondres som svar på IL-8, vil derfor bli ansett som en sykdomstilstand bevirket av IL-8.

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "kjemokin-bevirket sykdom eller sykdomstilstand" hvilken som helst av alle sykdomstilstander hvor et kjemokin som bindes til en IL-8a- eller -p-reseptor spiller en rolle, så som, men ikke begrenset til IL-8, GROa, GROp, GROy, ENA-78 eller NAP-2. Dette vil innbefatte en sykdomstilstand hvor IL-8 spiller en rolle, enten ved dannelse av IL-8 selv eller ved at IL-8 bevirker at et annet monokin frigjøres, så som, men ikke begrenset til, IL-1, LL-6 eller TNF. En sykdomstilstand hvor for eksempel IL-1 er en hovedkomponent og hvis dannelse eller virkning forverres eller utsondres som svar på IL-8, vil derfor bli ansett som en sykdomstilstand bevirket ved IL-8.

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "cytokin" hvilket som helst utsondret polypeptid som påvirker funksjonene hos celler, og som er et molekyl som modulerer interaksjoner mellom celler ved immun-, infiammatorisk eller hematopoietisk respons. Cytokiner innbefatter, men er ikke begrenset til, monokiner og lymfokiner, uansett hvilke celler som danner dem. For eksempel omtales et monokin vanligvis som å dannes og utsondres av en mononukleær celle, så som en makrofag og/eller monocytt. Imidlertid danner også mange andre celler monokiner, så som naturlige dreperceller, fibroblaster, basofile celler, nøytrofile celler, endotelceller, hjerne-astrocytter, benmarg-stomaceller, epidermale keratinocytter og B-lymfocytter. Lymfokiner omtales vanligvis som å dannes av lymfocytt-celler. Eksempler på cytokiner innbefatter, men er ikke begrenset til, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-a) og tumornekrosefaktor beta (TNF-fi).

Anvendt i det foreliggende angir betegnelsen "kjemokin" hvilket som helst utsondret polypeptid som påvirker cellers funksjoner og er et molekyl som modulerer vekselvirkninger mellom celler ved immun-, inflammatorisk eller hematopoietisk respons, i likhet med betegnelsen «cytokin» ovenfor. Et kjemokin utsondres hovedsakelig gjennom celle-transmembranene og bevirker kjemotakse og aktivering av spesifike hvite blodceller og leukocytter, nøytrofile celler, monocytter, makrofager, T-celler, B-celler, endotelceller og glattmuskelceller. Eksempler på kjemokiner innbefatter, men er ikke begrenset til, IL-8, GRO-a, GRO-P, GRO-y, ENA-78, NAP-2, IP-10, MIP-la, MIP-P, PF4, samt MCP 1,2 og 3.

For anvendelse av en forbindelse som fremstilt heri eller et farmasøytisk godtagbart salt derav til behandling, vil den normalt bli utformet i et farmasøytisk preparat i henhold til farmasøytisk standardpraksis.

De farmasøytiske preparatene kan hensiktsmessig administreres på hvilken som helst av de måter som vanligvis anvendes for medikamentadministrering, for eksempel oralt, topisk, parenteralt eller ved inhalering. De kan videre administreres i konvensjonelle doseformer fremstilt ved kombinering av en forbindelse med formel (I) med farmasøytiske standardbærere i henhold til konvensjonelle metoder og også administreres i konvensjonelle doseringer i kombinasjon med en kjent andre terapeu-tisk aktiv forbindelse. Disse metoder kan innbefatte blanding, granulering og komprimering eller oppløsing av bestand-delene etter som det er passende for det ønskede preparat. Det vil forstås at formen og egenskapene hos den farmasøytisk godtagbare bærer eller fortynningsmiddel dikteres av mengden av aktiv bestanddel som skal kombineres, administreirngsmåten og andre vel-kjente variabler. Bæreren (bærerne) må være "godtagbare" i den betydning at de er forenlige med de andre bestanddeler i preparatet og ikke uheldige for resipienten.

Den anvendte farmasøytiske bærer kan for eksempel enten være et faststoff eller en væske. Eksempler på faste bærere er laktose, terra alba, sakkarose, talk, gelatin, agar, pektin, akasie, magnesiumstearat, stearinsyre og lignende. Eksempler på flytende bærere er sirup, jordnøttolje, olivenolje, vann og lignende. Likeledes kan bæreren eller fortynnings-midlet innbefatte tidsforsinkelsesmateriale velkjent på området, så som glycerylmono-stearat eller glyceryldistearat alene eller med en voks.

Det kan anvendes mange forskjellige farmasøytiske former. Hvis det således anvendes en fast bærer, kan preparatet dannes til tabletter, anbringes i en hard gelatinkapsel i pulver- eller pelletform eller i form av en pastill eller drops. Mengden av fast bærer vil variere sterkt, men vil fortrinnsvis være fra ca. 25 mg til ca. lg. Når det anvendes en væskeformig bærer, vil preparatet være i form av en sirup, emulsjon, myl gelatinkapsel, steril injiserbar væske så som en ampulle eller ikke-vandig væskesuspensjon.

Forbindelser som fremstilles heri kan administreres topisk, det vil si ved ikke-systemisk administrering. Dette innbefatter påføring av forbindelsene eksternt på epidermis eller kinnhulen og inndrypping av en slik forbindelse i øret, øyet og nesen, slik at forbindelsen ikke i noen betydelig grad kommer inn i blodstrømmen. I motsetning til dette angir systemisk administrering oral, intravenøs, intraperitoneal og intramuskulær administrering.

Preparater egnet for topisk administrering innbefatter flytende eller halvflytende preparater egnet for inntrenging gjennom huden til inflammasjonsstedet, så som linimenter, losjoner, kremer, salver eller pastaer og dråper egnet for administrering til øyet, øret eller nesen. Den aktive bestanddel kan for topisk administrering omfatte fra 0,001 til 10 vekt%, for eksempel fra 1 til 2 vekt%, basert på preparatet. Det kan imidlertid omfatte så mye som 10 vekt%, men vil fortrinnsvis omfatte mindre enn 5 vekt%, mer foretrukket fra 0,1 til 1 vekt%, basert på preparatet.

Losjoner innbefatter slike som er egnet for påføring på hud eller øye. En øyelosjon kan omfatte en steril vandig løsning som eventuelt inne-holder et baktericid, og kan fremstilles ved metoder i likhet med metodene for fremstilling av dråper. Losjoner eller linimenter for påføring på huden kan også innbefatte et middel for påskynding av tørring og for avkjøling av huden, så som en alkohol eller aceton, og/eller et fuktighetsgivende middel så som glycerol eller en olje så som ricinusolje eller arakisolje.

Kremer, salver eller pastaer er halvfaste preparater av den aktive bestanddel for ekstern påføring. De kan fremstilles ved blanding av den aktive bestanddel i findelt eller pulverform, alene eller i løsning eller suspensjon i et vandig eller ikke-vandig fluid, ved hjelp av egnet maskineri, med fett- eller ikkefett-basis. Basisen kan omfatte hydrokarboner så som hard, myk eller flytende paraffin, glycerol, bivoks, en metallisk såpe; en klebe-gummi; en olje av naturlig opprinnelse så som mandel-, mais-, arakis-, ricinus- eller olivenolje; ullfett eller dets derivater, eller en fettsyre så som stearinsyre eller oljesyre sammen med en alkohol så som propylenglykol, eller en makrogel. Preparatet kan innbefatte hvilket som helst egnet overflateaktivt middel så som et anionisk, kationisk eller ikke-ionisk overflateaktivt middel så som en sorbitanester eller et polyoksylenderivat derav. Suspenderingsmidler så som naturgummityper, cellulose-derivater eller uorganiske materialer så som silisiumholdige si lika-typer og andre bestand-deler så som lanolin, kan også innarbeides.

Dråper kan omfatte sterile vandige eller oljeaktige løsninger eller suspensjoner og kan fremstilles ved oppløsing av den aktive bestanddel i en egnet vandig løsning av et baktericid og/eller fungicid middel og/eller hvilket som helst annet egnet konserverings-middel, og som fortrinnsvis innbefatter et overflateaktivt middel. Den resulterende løsning kan så klares ved hjelp av filtrering, overføres til en egnet beholder som så forsegles og steriliseres ved autoklavering eller ved at den holdes ved 98-100°C i en halv time. Alternativt kan løsningen steriliseres ved filtrering og overføres til beholderen ved hjelp av en aseptisk teknikk. Eksempler på baktericide og fungicide midler egnet for innarbeidelse i dråpene, er fenylkvikksølv(II)nitrat eller -acetat (0,002%), benzalkoniumklorid (0,01%) og klorheksidinacetat (0,01%). Egnede oppløsningsmidler for fremstilling av en oljeaktig løsning innbefatter glycerol, fortynnet alkohol og propylenglykol.

Forbindelsene som fremstilles heri kan administreres parenteralt, det vil si ved intravenøs, intramuskulær, subkutan, intranasal, intrarektal, intravaginal eller intraperitoneal administrering. Subkutan og intramuskulær form for parenteral administrering er generelt foretrukket. Passende doseformer for slik administrering kan tillages ved hjelp av konvensjonelle teknikker. Forbindelsene kan også administreres ved inhalering, det vil si ved intranasal og oral inhaleringsadministrering. Passende doseformer for slik administrering, så som et aerosolpreparat eller en målt-dose-inhalator, kan tillages ved hjelp av konvensjonelle teknikker.

For alle anvendelsesmetoder vil den daglige orale doseringsmengde fortrinnsvis være fra ca. 0,01 til ca. 80 mg pr. kg total kroppsvekt. Den daglige parenterale doseringsmengde vil være fra ca. 0,001 til ca. 80 mg pr. kg total kroppsvekt. Den daglige topiske doseringsmengde vil fortrinnsvis være fra 0,1 mg til 150 mg, administrert fra én til fire, fortrinnsvis to eller tre ganger daglig. Den daglige inhaleringsdoseringsmengde vil fortrinnsvis være fra ca. 0,01 mg/kg til ca. 1 mg/kg pr. dag. En fagperson på området vil også være klar over at den optimale mengde og avstand mellom individuelle doseringer av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk godtagbart salt derav vil bestemmes ved beskaffenheten og omfanget av den tilstand som behandles, administreirngsformen, -måten og -stedet, samt den spesielle pasient som behandles, og at slike optimum kan bestemmes ved hjelp av konvensjonelle teknikker. En fagperson på området vil også være klar over man kan skaffe seg kjennskap til det optimale behandlingsforløp, dvs. antallet doser av en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk godtagbart salt derav gitt pr. dag for et definert antall dager, ved anvendelse av konvensjonelle behandlingsforløpbestemmelses-tester.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ved henvisning til følgende biologiske eksempler, som kun er illustrerende og ikke skal forstås som noen begrensning for foreliggende oppfinnelses ramme.

BIOLOGISKE EKSEMPLER

IL-8- og Gro-a-kjemokin-inhiberingseffektene til forbindelser som fremstilles heri ble bestemt ved følgende in Wfrø-forsøk:

Reseptorbindingsforsøk:

[<125>tj IL-8 (human rekombinant) ble anskaffet fra Amersham Corp., Arlington Heights, EL, med spesifikk aktivitet 2000 Ci/mmol. Gro-cc ble anskaffet fra NEN- New England Nuclear. Alle andre kjemikalier var av analytisk kvalitet. Høye nivåer av rekombinant human IL-8 type a- og -p-reseptorer ble individuelt eksprimert i ovarieceller fra kinesisk hamster, som beskrevet tidligere (Holmes, et al., Science, 1991, 253, 1278). Ovariemembranene fra kinesisk hamster ble homogenisert i henhold til en tidligere beskrevet protokoll (Haour, et al., JBiol Chem., 249 s. 2195-2205 (1974)), bortsett fra at

homogeniseringsbufferen ble forandret til lOmM Tris-HCL, ImM MgS04,0,5 mM EDTA (etylendiaminetetraeddiksyre), 1 mM PMSF (□-toluensulfonylfluorid), 0,5 mg/l Leupeptin, pH 7,5. Membranprotein-konsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Pierce Co. mikro-forsøkssett ved anvendelse av bovint serurnalbumin som standard. Alle forsøk ble utført i et 96-brønns mikroplateformat. Hver reaksjonsblanding inneholdt <125>j jL_<g> (<q>,25 nM) eller <125>I Gro-D og 0,5 ug/ml IL-8RD eller 1,0 ug/ml IL-8RD-membraner i 20 mM bis-Trispropan og 0,4 mM Tris-HCl-buffere, pH 8,0, inneholdende 1,2 mM MgS04,0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl og 0,03% CHAPS. I tillegg ble det aktuelle medikament eller forbindelse, som på forhånd var blitt oppløst i DMSO for oppnåelse av en sluttkonsentrasjon

på mellom 0,01 nM og 100 \ iM, tilsatt. Forsøket ble igangsatt ved tilsetting av H^ l- TL- S. Etter 1 time ved romtemperatur ble platen høstet ved anvendelse av en høsteinnretning av typen Tomtec 96-brønner, på en glassfiber-filtermatte blokkert med 1% polyetylenimin/ 0,5% BSA, og vasket 3 ganger med 25 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgSC-4,0,5 mM EDTA, 0,03 % CHAPS, pH 7,4. Filteret ble deretter tørret og tellet på Betaplate-væskescintillasjons-telleren. Den rekombinante IL-8 Ra-, eller Type I-, reseptor er også omtalt i det foreliggende som den ikke-tillatte reseptor, og den rekombinante EL-8 RB-ellerType II-, reseptor er omtalt som den tillatte reseptor.

De eksemplifiserte forbindelsene, eksempler 1-11, angitt i det foreliggende i avsnittet syntetisk kjemi, oppviste en IC50 fra ca. 5 til ca. 100 nM i de tillatte modeller (IL-8b) for IL-8-reseptoirnhibering. En forbindelse uten noe ioniserbart proton i

2-stillingen, N-(2-Allyloksy-4-cyano-fenyl)-N'-(2-bromfenyl)-N"-cyanoguanidinJ ble funnet å være inaktiv i dette forsøk.

Kjemotakse-forsøk:

De in v/frø-hemmende egenskaper hos disse forbindelser bestemmes ved nøytrofil-kjemotakse-forsøket som beskrevet i Current Protocols in Immunology, vol I, Suppl 1, enhet 6,12,3., hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse i sin helhet. Nøytrofile celler ble isolert fra humant blod som beskrevet i Current Protocols in Immunology Vol I, Suppl 1 Enhet 7,23,1, hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse i sin helhet. De kjemotiltrekkende midler IL-8, GRO-a, GRO-P, GRO-y og NAP-2 anbringes i bunnkammeret i et 48-multibrønnskammer (Neuro Probe, Cabin John, MD) i en konsentrasjon mellom 0,1 og 100 nM. De to kamre er atskilt med et 5 um polykarbonatfilter. Når forbindelser ifølge denne oppfinnelse testes, blir de blandet med cellene (0,001 - 1000 nM) like før tilsettingen av cellene til det øvre kammer. Inkubering får foregå i mellom ca. 45 og 90 min. ved ca. 37°C i en fuktig inkubator med 5% CO2. Ved slutten av inkuberings-tidsrommet uttas polykarbonatmembranen, og toppsiden vaskes, og deretter farges membranen under anvendelse av fargeprotokollen Diff Quick (Baxter Products, McGaw Park, EL, USA). Celler som er blitt tiltrukket til kjemokinet, telles visuelt ved anvendelse av et mikroskop. Vanligvis telles fire felter for hver prøve; det beregnes gjennomsnitt av disse tall under oppnåelse av det gjennomsnittliglige antall celler som har vandret. Hver prøve undersøkes in triplo, og hver forbindelse gjentas minst fire ganger. Til visse celler (positive kontrollceller) tilsettes ingen forbindelse; disse celler representerer den maksimale kjemotaktiske respons hos cellene. I det tilfelle hvor en negative kontroll (ustimulert) er ønsket, tilsettes intet kjemokin i bunnkammeret. Forskjellen mellom den positive kontroll og den negative kontroll representerer cellenes kjemotaktiske aktivitet.

Elastasefrigjøringsforsøk:

Forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse blir undersøkt med hensyn til sin evne til forhindring av elastasefrigjøring fra humane nøytrofile celler.

Nøytrofile celler blir isolert fra humant blod som beskrevet i Current Protocols in

Immunology Vol I, Suppl 1 Enhet 7,23,1. PMN'er 0,88 x IO<6> celler suspendert i Ringer's løsning (NaCl 118, KC14,56, NaHC03 25, KH2P04 1,03, glukose 11,1, HEPES 5 mM, pH

7,4) anbringes i hver brønn i en 96-brønns plate i et volum på 50 ul Til denne plate til-

settes testforbindelsen (0,001 - 1000 nM) i et volum på 50 ul, Cytochalasin B i et volum på

50 ul (20 fig/ml) og Ringers buffer i et volum på 50 (al. Disse celler får oppvarmes (37°C,

5% C02, 95% RH) i 5 minutter før EL-8, GROa, GROp, GROy eller NAP-2 tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 0,01-1000 nM. Reaksjonen får forløpe i 45 minutter før 96-brønns-platen blir sentrifugert (800 xg 5 min), og 100 ul av supematanten fjernes. Denne super- . natant tilsettes til en andre 96-brønnspIate, fulgt av et kunstig elastasesubstrat (MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC, Nova Biochem, La Jolla, CA) til en sluttkonsentrasjon på 6 ug/ ml oppløst i fosfatbufret saltvann. Platen anbringes straks i en fluorescerende 96-brønnsplate-avlesningsinnretning (Cytofluor 2350, Millipore, Bedford, MA), og data oppsamles med 3 minutters mellomrom i henhold til metoden ifølge Nakajima et al J. Biol Chem 254 4027

(1979). Mengden av elastase frigjort fra PMN'ene beregnes ved måling av hastigheten av MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC-nedbrytning.

TNF-a i traumatisk hjerneskadeforsøk

Foreliggende forsøk tilveiebringer undersøkelse av ekspresjonen av tumornekrosefaktor-mRNA i spesifikke hjerneregioner som følger eksperimentelt indusert lateral traumatisk fluid-perkusjons-hjemeskade (TBI) hos rotter. Voksne rotter av typen Sprague-Dawley (n=42) ble bedøvet med natriumpentobarbital (60 mg/kg, i.p.) og underkastet lateral fluid-perkusjons-hjemeskade i moderat grad (2,4 atm.) sentrert over venstre temporaparietale cortex (n=l 8) eller "sham"-behandling (bedøvelse og kirurgi uten skade, n=18). Dyrene avlives ved dekapitering 1,6 og 24 etter påføring av skade, hjernene fjernes og vevsprøver av venstre (skadede) parietal-cortex (LC), tilsvarende område i den kontralaterale høyre cortex (RC), cortex i nabostilling til skadet parietal-cortex (LA), tilsvarende i nabostillingsområde i høyre cortex (RA), venstre hippocampus (LH) og høyre hippocampus (RH) prepareres. Total-RNA isoleres og Northern blot-hybridisering blir utført og kvantifisert i forhold til en TNF-a-positiv kontroll RNA (makrofag = 100%). Det observeres en markert økning i TNF-a-mRNA-ekspresjon i LH (104±17% av positiv kontroll,

p < 0,05 sammenlignet med sham), LC (105±21%, p< 0,05) og LA (69±8%, p < 0,01) i den traumatiserte hemisfære 1 time etter påføring av skade. En øket TNF-a-mRNA-ekspresjon observeres også i LH (46±8%, p < 0,05), LC (30±3%, p < 0,01) og LA (32±3%, p < 0,01) etter 6 timer, som oppløses 24 timer etter påføring av skade. I den kontralaterale hjernehalvdel økes ekspresjonen av TNF-a-RNA i RH (46±2%, p < 0,01), RC (4±3%) og RA (22±8%) etter 1 time, og i RH (28±11%), RC (7±5%) og RA (26±6%, p < 0,05) etter 6 timer, men ikke 24 timer etter skade. I sham (kirurgi uten skade) eller naturlige dyr observeres ingen tilsvarende forandringer i ekspresjon av TNF-a-mRNA i noen av de 6 hjerneområder i noen hemisfære noen ganger. Disse resultater viser at etter parasagittal fluidperkusjons-hjemeskade forandres den midlertidige ekspresjon av TNF-a-mRNA i spesifikke hjerneregioner, innbefattende regionene i den ikke-traumatiserte hjernehalvdel. Siden TNF -a kan indusere nervevekstfaktor (NGF) og stimulerer frigjøring av andre cytokiner fra aktiverte astrocytter, spiller denne post-traumatiske forandring i genekspresjon av TNF-a en viktig rolle både ved akutt og regenerativ response overfor CNS-traumer.

CNS-skademodell for IL-p mRNA

Dette forsøk karakteriserer den regionale ekspresjon av interleukin-lB (IL-1B)-

mRNA i spesifikke hjerneregioner etter eksperimentell lateral traumatisk fluid-perkusjons-hjemeskade (TBI) hos rotter. Voksne Sprague-Dawley-rotter (n=42) bedøves med natriumpentobarbital (60 mg/kg, i.p.) og underkastes lateral fluid-perkusjons-hjerneskade i moderat grad (2,4 atm.) sentrert over den venstre temporaparietale cortex (n=18), eller "sham"-behandling (bedøvelse og kirurgi uten skade). Dyrene avlives 1, 6 og 24 timer etter påføring av skade, hjernene fjernes og vevsprøver av venstre (skadede) parietal-cortex (LC), tilsvarende område i den kontra-laterale høyre cortex (RC), cortex i nabostilling til skadet parietal-cortex (LA), tilsvarende nabostillingsområde i høyre cortex (RA), venstre hippocampus (LH) og høyre hippocampus (RH) prepareres. Total-RNA isoleres og Northern blot-hybirdisering utføres, og mengden av hjernevev-IL-lB-mRNA er vist som

prosent relativ radioaktivitet i EL-lB-positivt makrofag-RNA som ble påført på samme gel. Én time etter påføring av hjerneskade observeres en markert og betydelig økning i ekspresjonen av EL-lB-mRNA i LC (20,0±0,7% av positiv kontroll, n=6, p < 0,05 sammenlignet med sham-dyr), LH (24,5±0,9%, p < 0,05) og LA (21,5±3,1%, p < 0,05) i den skadede

hemisfære , som forble forhøyet i inntil 6 timer etter skade i LC (4,0±0,4%, n=6, p < 0,05) og LH (5,0±1,3%, p < 0,05). I sham eller naturlige dyr observeres ingen ekspresjon av IL-lB-mRNA i noen av de respektive hjemeområder. Disse resultater viser at etter TBI stimuleres den midlertidige ekspresjon av EL-lB-mRNA regionalt i spesifikke hjerneregioner. Disse regionale forandringer i cytokiner, så som IL-1B, spiller en rolle post-traumatisk.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel (H) hvor W er hvor R er OH, Ri er valgt blant N02, CN, Ci-C6alkyl og Ci-C6alkoksy, og m er 1 eller; og Wj er hvor Y er halogen, n er 1 eller 2, eller 2Y på nabostilte karbonatomer danner en Ci-C3aIkylendioksygruppe; karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter at en forbindelse med formelen hvor WogW<*> omsettes med et overskudd av metansulfonylklorid i nærvær av en tert.-aminbase.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at basen er trietylamin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oppløsningsmidlet er metylenklorid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonstemperaturen er fra -10° til 50°.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen: hvor W og Wi er som definert ovenfor, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter at en forbindelse med formel (TV) hvor W er som definert ovenfor; omsettes med 2 eller flere ekvivalenter base i nærvær av et passende isotiocyanat (W\-NCS) i et aprotisk eller halogenert oppløsningsmiddel.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at basen er natriumhydrid, kaliumhydrid eller kalsiumhydrid.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at oppløsningsmidlet er et aprotisk oppløsningsmiddel.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det aprotisk oppløsningsmiddel er dimetylformamid, dioksan eller toluen.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at reaksjonstemperaturen er fra -10° til 50°.