NO310596B1 - Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for öking av trombomodulinekspresjon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en forbindelse med formel I for fremstilling av et medidkament for øking av trombomodulinekspresjon.

Blodkoagulasjonsprosessen, trombosen, er utløst av en kompleks proteolyttisk kaskade som fører til dannelsen av trombin. Trombin fjerner proteolyttiske aktiveringspeptider fra Aa- og Bp-kjedene i fibrinogen, som er oppløselige i blodplasma, for å initiere dannelsen av uoppløselig fibrin.

Antikoagulering blir for tiden oppnådd ved administrasjon av hepariner og koumariner. Parenteral farmakologisk kontroll av koagulering og trombose er basert på hemming av trombin gjennom anvendelsen av hepariner. Hepariner virker indirekte på trombin ved akselerering av den hemmende effekten av endogent antitrombin III (den viktigste fysiologiske hemmeren av trombin). Da antitrombin III-nivåer varierer i plasma, og da overflatebundet trombin synes resistent til denne indirekte mekanismen, kan hepariner være en ineffektiv behandling. Da visse koaguleringsanalyser er anttatt å være forbundet med effektivitet og sikkerhet, blir heparin-nivåer typisk overvåket med koaguleringsanalyser (spesielt aktivert partielt tromboplastin-tid (APTT) analyse). Koumariner vanskeliggjør dannelsen av trombin ved å blokkere den posttranslasjonelle gamma-karboksyleringen i syntesen av protrombin og andre proteiner av denne typen. På grunn av deres virkningsmekanisme, kan effekten av koumariner kun utvikles sakte, 6-24 timer etter administrasjon. Videre er de ikke selektive antikoagulanter. Doumariner krever også overvåking med koagulasjonsanalyser (spesielt protrombin-tid-analysen).

For bedre å forstå oppfinnelsen, er den følgende korte beskrivelsen av koaguleringsenzymsystemet gitt. Koagulerings-systemet, noen ganger referert til som "kaskaden", blir best sett på som en kjedereaksjon omfattende den sekvensielle aktiveringen av zymogener til aktive serinproteaser, som til sist fører til dannelsen av enzymet trombin. Trombin omdanner gjennom begrenset proteolyse plasmafibrinogen til den uoppløselige gelen fibrin. To nøkkelhendelser i koaguleringskaskaden er omdanningen av levringsfaktor X til Xa ved levringsfaktor IXa og omdanningen av protrombin til trombin ved levringsfaktor Xa.

Begge disse reaksjonene skjer på celleoverflater, mest merkbart blodplatenes endotele celleoverflater, og begge reaksjonene krever kofaktorer. De viktigste kofaktorene, faktorene V og VIII, sirkulerer som relativt inaktive forløpere, men når de første få molekylene av trombin blir dannet, aktiverer trombin ved begrenset proteolyse kofaktorene. De aktiverte kofaktorene, Va og Villa, akselererer ved en størrelsessorden på omkring tre, både omdanningen av protrombin til trombin og omdannelsen til faktor X til faktor Xa.

Aktivert Protein C har overveldende preferanser for to plasmaproteinsubstrater som den hydrolyserer og irreversibelt ødelegger. Disse plasmaproteinsubstratene er de aktiverte formene av levringskofaktorer V og VIII (henholdsvis kofaktorer Va og Villa). Aktivert Protein C nedbryter kun i minimal grad de inaktive forløperne, hemmingsfaktorene V og VIII. I hunder har aktivert Protein C blitt vist å kraftig øke sirkuleringsnivåene av det viktigste fysiologiske fibrinolyttiske enzymet, vevsplasminogenaktivatoren.

Aktiveringen av Protein C involverer imidlertid trombin, den endelige serinproteasen i koaguleringskaskaden og et endotelisk cellemembran-assosiert glykoprotein, trombomodulin. Trombomodulin danner et tett 1:1 støkiometrisk kompleks med trombin. Trombomodulin modifiserer betydelig de funksjo-nelle egenskapene til trombin når den danner kompleks med trombin. Trombin levrer normalt fibrinogen under koagulerin-gen, aktiverer blodplatene og omdanner levringskofaktorer V og VIII til deres aktiverte former, Va og Villa. Trombin alene virker ved å aktivere Protein C, men kun meget sakte og ineffektivt. Derimot, når trombin er i et 1:1 kompleks med trombomodulin, levrer den ikke fibrinogen, aktiverer ikke blodplater og omdanner ikke levringsfaktorene V og VIII til deres" aktiverte former. Trombin: trombomodul inkomplekset. fremmer aktiveringen av Protein C, slik at hastighetskonstan-ten til Protein C-aktiveringen er så mye som 20.000 ganger høyere for trombin:trombomodulinkomplekset enn hastig-hetskonstanten for trombin alene.

Aktivert Protein C er derfor et antitrombotisk middel med en videre terapeutisk indeks enn andre antikoagulanter, slik som heparin og oral hydroksykoumarintype-antikoagulanter, slik som warfarin. Hverken Protein C eller aktivert Protein C er effektivt før trombin blir generert ved noen lokale seter. Aktivert Protein C er stort sett ineffektivt uten trombin, da trombin er nødvendig for å omdanne levringsfaktorer V til Va og VIII til Villa. Som angitt er de aktiverte formene av disse to kofaktorene de foretrukne substratene for aktivert protein C. Protein C-zymogen vil, når det blir infusert i pasienter, forbli inaktivt intil trombin blir generert. Uten trombomodulin:trombinkomplekset blir Protein C-zymogen omdannet til aktivert Protein C ved en meget liten hastighet.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot oppdagelsen av at. forbindelsene ifølge oppfinnelsen, som definert nedenfor, øker trombomodulinekspresjonen og har oral biotilgjengelig-het.

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en forbindelse

med formelen

hvor

R<*> og R<3> uavhengig av hverandre er hydrogen,

-CHo, eller

hvor Ar er fenyl, som

eventuelt er substituert;

R<2> er valgt fra gruppen bestående av pyrrolidino og piperidino; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, i fremstillingen av et medikament som er nyttig for økning av trombomodulinekspresjon.

Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av en forbindelse med formelen

hvor

R<1> og R<3> uavhengig av hverandre er hydrogen,

-CH3, eller

hvor Ar er fenyl, som

eventuelt er substituert;

R<2> er valgt fra gruppen bestående av pyrrolidino og piperidino; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, i fremstillingen av et medikament som er nyttig for hemming av trombotiske forstyrrelser eller hendelser.

Også omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av en forbindelse med formelen hvor

R<1> og R<3> uavhengig av hverandre er hydrogen, -CH3, eller

hvor Ar er fenyl, som

eventuelt er substituert;

R<2> er valgt fra gruppen bestående av pyrrolidino og piperidino; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, i fremstillingen av et medikament som er nyttig for økning av Protein C-aktivering.

Foreliggende oppfinnelse angår oppdagelsen at den utvalgte gruppe av 2-fenyl-3-aroylbenzotiofener (benzotiofener), den med formel I, er nyttig for øking av trombomodulinekspresjon. Anvendelsene gitt i foreliggende oppfinnelse ble utført ved administrering til et menneske eller pattedyr som har behov for dette, av en dose av en forbindelse med formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, som er effektivt til å øke trombomodulinekspresjon.

Hemming er definert å omfatte dets generelt aksepterte betydning som omfatter forsinkelse, forhindring, tilbakehol-delse, senking eller reversering.

Raloksifen, en forbindelse beskrevet i foreliggende oppfinnelse, er hydrokloridsaltet av en forbindelse med formel I, hvor R1 og R3 er hydrogen og R<2> er 1-piperidinyl.

Generelt er forbindelsen formulert med vanlige eksipienter, fortynnere eller bærerer, og presset til tabletter eller formulert som eliksirer eller oppløsninger for bekvem oral administrasjon eller administrert ad intramuskulær eller intravenøs vei. Forbindelsene kan bli administrert transder-malt, og kan bli formulert som doseringsformer for vedvarende frigiving o.l.

Forbindelsene benyttet i foreliggende oppfinnelse, kan bli fremstilt ifølge etablerte og analoge prosedydrer, slik som de beskrevet i U.S. patenter nr. 4.133.814, 4.418.068 og 4.380.635, som alle er innlemmet her som referanse. Generelt starter prosessen med et benzo[b]tiofen med en 6-hydroksyl-gruppe og en 2-(4-hydroksyfenyl)-gruppe. Startforbindelsen blir beskyttet, alkylert og avbeskyttet for å gi forbindelser med formel I. Eksempler på fremstilling av slike forbindelser, er gitt i de ovenfor diskuterte U.S.-patentene, og i eksemplene i foreliggende søknad. Eventuelt substituert fenyl omfatter fenyl og fenyl substituert en eller to ganger med Ci-Cfc-alkyl, C^-C^alkoksy, hydroksy, nitro, klor, fluor eller tri(klor eller fluor)metyl.

Forbindelsene benyttet i foreliggende oppfinnelse, ' er farmasøytisk akseptable syre- og baseaddisjonssalter med en stor variasjon av organiske og uorganiske syrer og baser, og omfatter de fysiologisk akseptable saltene som ofte blir benyttet i farmasøytisk kjemi. Slike salter er også en del av foreliggende oppfinnelse. Typiske uorganiske syrer benyttet for å danne salter omfatter saltsyre, hydrogenbromid, hydrogenjodid, salpetersyre, svovelsyre, fosforsyre, hypofosforsyre o.l. Salter avledet fra organiske syrer, slik som alifatiske mono- og dikarboksylsyrer, fenylsubstituerte alkanosyrer, hydroksyalkansyre og hydroksyalkandioinsyrer, aromatiske syrer, alifatiske og aromatiske sulfonsyrer, kan også bli benyttet. Slike farmasøytisk akseptable salter omfatter således acetat, fenylacetat, trifluoracetat, akrylat, askorbat, benzoat, klorbenzoat, dinitrobenzoat, hydroksybenzoat, metoksybenzoat, metylbenzoat, o-acetoksyben-zoat, naftalen-2-benzoat, bromid, isobutyrat, fenylbutyrat, S-hydroksybutyrat, bytyn-1,4-dioat, heksyn-1,4-dioat, kaprat, kaprylat, klorid, cinnamat, sitrat, format, fumarat, glykolat, heptanoat, hippurat, laktat, malat, maleat, hydroksymaleat, malonat, mandelat, mesylat, nikotinat, isonikotinat, nitrat, oksalat, ftalat, teraftalat, fosfoat, monohydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, propiolat, propionat, fenylpropionat, salicylat, sebacat, suksinat, suberat, sulfat, bisulfat, pyrosulfat, sulfitt, bisulfitt, sulfonat, benzen-sulfonat, p-bromfenylsulfonat, klorbenzensulfonat, etansulfonat, 2-hydroksyetansulfonat, metansulfonat, naftalen-l-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, p-toluensulfonat, xylensulfonat, tartarat o.l. Et foretrukket salt er hydrokloridsaltet.

De farmasøytisk akseptable syreaddisjonssaltene blir typisk dannet ved å reagere en forbindelse med formel I med en likemolar eller overskuddsmengde av syre. Reaktanten ble vanlgivis blandet i et gjensidig oppløsningsmiddel slik som dietyleter eller benzen. Saltet utfelles normalt av oppløs-ningen i løpet av en time til 10 dager, og kan bli isolert ved filtrering, eller oppløsningsmidlet kan bli strippet av ved konvensjonelle midler.

Baser som vanligvis blir benyttet for dannelse av salter, omfatter ammoniumhydroksyd og alkali- og jordalkalimetall-hydroskyder og karbonater, såvel som alifatiske og primære, sekundære og tertiære aminer, alifatiske diaminer. Baser som er spesielt nyttige i fremstillingen av addisjonssalter omfatter ammoniumhydroksyd, kaliumkarbonat, metylamin, dietylamin, etylendiamin og cykloheksylamin.

De farmasøytisk akseptable saltene har generelt øket oppløselighetskarakteristikker sammenlignet med forbindelsen fra hvilke de er avledet, og er således ofte mer anvendelige for formulering som væsker eller emulsjoner.

Farmasøytiske formuleringer kan bli fremstilt ved prosedyrer som er kjent i teknikken. For eksempel kan forbindelsene bli formulert med vanlige eksipienter, fortynnere eller bærere, og formet til tabletter, kapsler, suspensjoner, pulvere o.l. Eksempler på eksipienter, fortynnere og bærer som passer for slike formuleringer, omfatter de følgende: Fyllstoffer og utvidere slik som stivelse, sukkere, mannitol og kiesel-syrederivater; bindemidler slik som karboksymetylcellulose og andre cellulosederivater, alginater, gelatin og polyvinylpyrrolidon; fuktningsmidler slik som glyserol; disintegrerings-midler slik som agaragar, kalsiumkarbonat og natriumbi-karbonat; midler for retardering av oppløsning slik som paraffin; resorpsjonsakseleratorer slik som kvaternære ammoniumforbindelser; overflateaktive midler slik som cetylalkohol, glyserolmonostearat; adsorptive bærere slik som kaolin og bentonitt; og smøremidler slik som talk, kalsium-og magnesiumstearat og faste polyetylglykoler.

Forbindelsene kan også bli formulert som eliksirer eller oppløsninger for bekvem oral administrasjon eller som oppløsninger som passer for parenteral administrasjon, for eksempel ad intramuskulær, subkutane eller intravenøs vei. I tillegg er forbindelsene vel tilpasset til formulering som doseringsformer for vedvarende frigiving o.l. Formuleringene kan være sammensatt slik at de frigir det aktive ingredienset kun eller fortrinnsvis i en bestemt del av intestinaltrakten, fortrinnsvis over en tidsperiode. Beleggene, konvoluttene og de beskyttende matrikser kan eksempelvis være fremstilt fra polymere stoffer eller vokser.

Den bestemte doseringen av en forbindelse med formel I ifølge foreliggende oppfinnelse, vil avhenge av alvoret av til-standen, administrasjonsvei og de relaterte faktorer som vil bli bestemt av den ansvarlige lege. Generelt er aksepterte og effektive daglige doser fra omkring 0,1 til omkring 1000 mg/dag, og mer typisk fra omkring 50 til omkring 200 mg/dag. Slike doseringer vil bli administrert til et individ som har behov for slik behandling fra en til tre ganger hver dag, eller oftere hvis nødvendig for effektivt å øke trombomodulinekspresjon, øke Protein C-aktivering eller hemme trombotiske forstyrrelser.

Det er vanligvis foretrukket å administrere en forbindelse med formel I i form av et syreaddisjonssalt, slik som vanlig i administrasjonen av farmasøytika som bærer en basisk gruppe, slik som piperidinoringen. For slike formål er de følgende doseringsformer tilgjengelige.

Formuleringer

I formuleringene nedenfor, betyr "aktivt ingrediens" en forbindelse med formel I.

Formulering 1: Gelatinkapsler

Harde gelatinkapsler blir fremstilt ved bruk av det følgende:

Ingrediensene ble blandet, ledet gjennom en nr. 45 mesh U-S.-sikt og fylt i harde gelatinkapsler.

Eksempler på spesifikke kapselformuleringer av forbindelsen raloksifen som er inkluder de vist nedenfor:

Formulering 2: Raloksifenkapsel Formulering 3: Raloksifenkapsel Formulering 4: Raloksifenkapsel

Formulering 5: Raloksifenkapsel

De spesifikke formuleringene ovenfor kan bli forandret i samsvar med de gitte naturlige variasjoner.

En tablettformulering ble fremstilt ved bruk av ingrediensene nedenfor:

Formulering 6: Tabletter

Komponentene ble blandet og presset for å danne tabletter.

Alternativt blir tabletter, hver inneholdende 0,1 til 1000 mg aktivt ingrediens, fremstilt som følger:

Formulering 7: Tabletter

Det aktive ingredienset, stivelsen og cellulosen ble ledet gjennom en nr. 45 mesh U.S.-sikt og blandet grundig. Oppløsningen av polyvinylpyrrolidon ble blandet med det resulterende pulveret som så ble ledet gjennom en nr. 14 mesh U.S.-sikt. De således produserte kornene ble tørket ved 50°-60°C og ledet gjennom en nr. 18 mesh U.S.-sikt. Natriumkar-boksymetylstivelsen, magneslumstearatet og talket, som på forhånd var ledet gjennom en nr. 60 mesh U.S.-sikt, ble så tilsatt til kornene som etter blanding ble presset på en

tabletteringsmaskin for å gi tabletter.

Suspensjoner, hver inneholdende 0,1 - 1000 mg medikament pr.

5 ml dose, ble fremstilt som følger:

Formulering 8: Suspensjoner

Medikamentet ble ledet gjennom en nr. 45 mesh U.S.-sikt og blandet med natriumkarboksymetylcellulose og sirup for å danne en glatt pasta. Benzosyreoppløsningen, smaken og farven ble fortynnet med noe av vannet og tilsatt under omrøring. Tilstrekkelig vann ble så tilsatt for å gi det ønskede volum.

En ytterligere utførelsesform av foreliggende oppfinnelse angår en anvendelse av en forbindelse med formel I for fremstilling av et preparat for hemming av en trombotisk forstyrrelse. Trombotiske forstyrrelser eller hendelser, eller tromboemboliske sykdommer, omfatter en stor variasjon av ervervede sykdomstilstander som omfatter intravaskulær koagulasjon, inkludert dyp venetrombose, pulmonar embolisme, myokardial ischemia, myokardial infarkt, cerebral trombose, generelle tilstander, lokaliserte hyperkoaguable tilstander og generaliserte vevskader som den frigir til inflammator-prosessen, mikrovaskulær arteriell trombose, perifer arteriell trombose, emboli som stammer fra hjertet eller perifere arterier, akutt myokardial infarkt, trombotiske slag og disseminert intravaskulær koagulering. Disseminert intravaskulær koagulering opptrer som en komplikasjon ved tallrike sykdomstilstander inkludert stort trauma, stor kirurgi, varmeslag, septicemia, akutt og kronisk leversykdom, maligne tilstander inkludert faste tumorer, leukemi og lymfomas, mange bakterielle, fungale, parasittiske og virale infeksjoner, obstetriske komplikasjoner, hemolyttiske prosesser, kardiogent sjokk, sirkulatorisk kollaps av en hvilken som helst årsak, alvorlig progressivt slag, slange-bitt, kollagene vaskulære forstyrrelser, purpura fulminans, akutt pancreatitis, allergisk vaskulitis, polycythemia vera, trombocyttemi og ulcerative colitis blant andre. Selv om det enda ikke er oppdaget, kan congenitale mangler i ekspresjonen av trombomodulin bli demonstrert i pasienter med tromboemboliske problemer. Akutte episoder hos slike pasienter kan være mottagelig for behandling med forbindelsene med formel

I.

Forbindelser med formel I er også antatt å være nyttig i behandlingen av trombotiske slag. Trombomodulin-nivåer er lave i kar i hjernen, slik at oppregulering vil være viktig ved trombotiske slag. Idag blir slag vanligvis ikke behandlet med konvensjonelle antikoagulanter. Behandling av slag med enten heparin eller orale antikoagulanter gir, selv om de av og til kan være fordelaktige, en høy risiko for blødning i infarktområdet i hjernen, og derved forværre den neurologiske svikten som følger slaget.

Videre er foreliggende forbindelser antatt å være nyttige i behandlingen av akutt myokardial infarkt, fordi det er bevis på at hovedvirkningsmekanismen til trombomodulin og deriva-ter, dvs. aktiveringen av Protein C-antikoaguleringsveien, utgjør en meget effektiv måte for å oppnå antitrombotiske effekter på den arterielle siden av sirkulasjonen, såvel som å redusere reperfusjonskade. Ved nåværende forsøk med trom-bolyttiske midler i akutt myokardialt infarkt og fra dyre-eksperimenter, ville det vise seg at heparin som hjelpe-terapi, er relativt ineffektiv som et antitrombotisk middel på den arterielle siden av sirkulasjonen.

Foreliggende forbindelser er også antatt å være nyttige i behandlingen av dissseminert intravaskulær koagulasjon ("DIC"). Det er eksperimentelle bevis på at inflammatoriske mediatorer slik som IL-1, TNF og LPS endotoksin skarpt nedregulerer ekspresjonen av trombomodulin i endotelial-celler, noe som igjen fører til mangelfull aktivering av Protein C-antikoagulantveiene. Heparin og de orale anti-koagulantene har blitt gitt til pasienter med disseminert intravaskulær koagulasjon i store kliniske tester, men resultatene av disse testene har vært skuffende. Karakte-ristisk har pasienten med disseminert intravaskulær koagulering med vidt spredt trombi som involverer mikrosirkulasjo-nen med ledsagende og ofte alvorlige blødningsproblemer, som er et resultat av "konsumpsjon" av essensielle levringsfaktorer, som først har blitt aktivert og så inaktivert under dannelsen av vidt spredt mikrosirkulatorisk fibirin trombi.

Da trombomodulin blir nedregulert av forskjellige inflammatoriske mediatorer, er en foretrukket anvendelse av forbindelsene en korreksjon av inflammatoriske tilstander forbundet med mikrovaskulær trombose. Dette ville kort sagt omfatte en hvilken som helst tilstand som er kjennetegnet ved dysfunskjonell vaskulær endothelium slik som det opptrer ved sepsis, skader som involverer stor vevskade og trauma, systemisk inflammatorisk responssyndrom, sepsissyndrom, septisk sjokk og multippel organdysfunksjonsyndrom, inkludert

DIC.

Det eksisterer bevise for at konvensjonell antikoagulantme-dikamenter, spesielt warfarin, er nyttig i behandlingen av invasive maligne tumorer. Mange tumorceller produserer stoffer som utløser aktiveringen av koaguleringsystemet og resulterer i lokal fibrinavsetning. Disse fibrinavsetningene fungerer som "reir" i hvilke cancerceller kan dele seg for å danne metastatiske lesjoner. I en klinisk studie ble det vist at pasienter som mottok warfarin i tillegg til cancerkjemoterapi for behandling av småcellecarcinoma i lungene, levde lenger og hadde færre store metastatiske lesjoner enn pasienter som kun fikk kjemoterapi. Imidlertid var cancerkjemoterapi benyttet i denne studien mindre intensiv enn den som blir ansett optimal i klinisk oncologi idag. De mer intensive formene for cancerkjemoterapi gir nesten alltid en skarp reduksjon i blodplatetellingen, og trombocyttopenia kombinert med warfarinterapi, setter pasienten i en uaksepta-bel høy risiko for alvorlige blødningskomplikasjoner.

Forbindelsene er antatt å være nyttige for andre sykdommer hvor blodkoagulering synes å være en fundamental bidragende prosess eller kilde for sekundær patologi, slik som cancer inkludert metastaser, inflammatoriske sykdommer inkludert arthritis, og diabetes. Antikoagulantforbindelsen blir administrert oralt, parenteralt f.eks. ved intravenøs infusjon (iv), intramuskulær injeksjon (im) eller subkutant (sc).

Fremgangsmåten ble utført i sammenheng med et levrihgs-lyserende middel, f.eks. vevsplasminogenaktivator (tPA), modifisert tPA, streptokinase eller urokinase for å redusere reperfusjonskade. Hvis levringsdannelse har opptrådd, og en arterie eller vene er blokkert enten delvis eller totalt, blir et levringslyserende middel vanligvis benyttet. Forbindelsen med formel I kan bli administrert før eller sammen med det lyserende midlet eller etter dets anvendelse alene eller sammen med det lyserende midlet, og fortrinnsvis blir det administrert videre sammen med aspirin for å forhindre gjenopptreden av levringsdannelse.

Fremgangsmåten ble også utført i sammenheng med en blod-plateglykoprotein Ilb-IIIa-reseptorantagonist som hemmer blodplateaggregering. Forbindelsen kan bli administrert før eller sammen med Ilb-IIIa-reseptorantagonisten eller påfølgende dets anvendelse for å forhindre opptreden eller gjenopptreden av levringsdannelse.

Fremgangsmåten ble også utført i sammenheng med aspirin. En forbindelse med formel I ble administrert før eller sammen med aspirin eller påfølgende dets anvendelse for å forhindre opptreden eller gjenopptreden av levringsdannelse. Som angitt ovenfor, blir fortrinnsvis en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert sammen med et levringslyserende middel og aspirin.

ANALYSE

Analyse 1

For ytterligere å forstå virkningen(e) av forbindelsene med formel I, indre glattmuskelceller og dets rolle i økning av antikoagulasjonen av blod, er det nødvendig å undersøke forandringer i trombomodulin (TM) aktiviteten på overflaten på disse celletypene. Forbindelsene med formel I kan også bli benyttet for å reversere/korrigere eventuelle effekter av mediatorer som har en tendens til å nedregulere TM-aktiviteten på overflaten av disse cellene.

Omkring 40.000-80.000 nydyrkede endoteliale (arterielle, venøse eller mikrovaskulære) eller indre glattmuskelceller ble utsådd og dyrket til sammenvoksing i 24-brønners cellekulturplater. Cellemonolaget ble deretter vasket 2-3 ganger med enten Hank's buffret saltvannsoppløsning (HBSS) eller serumfritt medium (SFM). I en periode på 24 timer ble varierende konsentrasjoner av en forbindelse med formel I (varierende fra mikromolar til subpikomolar) tilsatt til cellene i triplikat. Cellene i negative kontroll-brønner ble opprettholdt på serumfritt medium med en mengde bærere ekvivalente til de andre brønnene.

Den eksisterende fremgangsmåten for å måle celleoverflate TM aktivitet, ble utført ved bruk av en to-fase-amidolyttisk analyse. Under den første fasen av analysen ble etter rensing av cellene med HBSS eller SFM, 0,4 ml SFM inneholdende humant Protein C (endelig konsentrasjon 11,2 ug/ml) og humant alfa-trombin (endelig konsentrasjon 0,1 NIHU/ml) tilsatt til monolaget og inkubert ved 37°C og 5% C02- Ved 15, 30 og 45 minutter, ble 100 ul medium fjernet fra hver brønn og tilsatt til 50 pl av overskudd av hirudin (20 anti-trombin U/ml) i mikrotiterbrønner i 5 minutter ved 37°C for å stanse ytterligere trombinaktivitet. I fravær av celler ble SFM pluss Protein C og alfa-trombin, som beskrevet ovenfor, benyttet i en negativ kontroll og behandlet tilsvarende.

I den andre fasen av analysen ble 50 ul 3 mM 2366, et kromogent substrat av Protein C, tilsatt til det kondisjoner-te medium/kirudinblandingen og OD405 ble målt ved automatisk plateleser for å følge kinetikken til TM-aktiviteten i løpet av 4 minutter. For fullførelse av denne kinetiske analysen, ble målinger av totalt protein utført ved bruk av BCA-metoden. Den endelige TM-aktiviteten er uttrykt som # økning. Forbindelse A er en forbindelse med formel I, hvor R<1> og R<3 >er hydrogen og R<2> er 1-pyrrolidino.

Analyse 2

Bavian-modellen av E. coli-indusert sepsis som beskrevet i U.S. patent 5.009.889 (innlemmet her som referanse) ble benyttet for å illustrere effekten til forbindelsene med formel I som antitrombotika og deres evne til å korrigere inflammasjon-indusert endotelial dysfunksjon.

Evnen til forbindelsene blir illustrert ved den positive påvirkning på trombomodulin-ekspresjon, trombotisk forstyrrelse eller Protein C-aktiveringsratekarakteristikker vist ved hvilken som helst av analysene ovenfor.

Claims (9)

1. Anvendelse av en forbindelse med formelen hvor R<1> og R<3> uavhengig av hverandre er hydrogen, -CH3, el ler hvor Ar er fenyl, som eventuelt er substituert; R<2> er valgt fra gruppen bestående av pyrrolidino og piperidino; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, i fremstillingen av et medikament som er nyttig for økning av trombomodulinekspresjon.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte forbindelse er dets hydrokloridsalt.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte forbindelse er eller dets hydrokloridsalt.

4 . Anvendelse av en forbindelse med formelen hvor R<1> og R<3> uavhengig av hverandre er hydrogen, -CH3, eller hvor Ar er fenyl , som eventuelt er substituert; R<2> er valgt fra gruppen bestående av pyrrolidino og piperidino; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, i fremstillingen av et medikament som er nyttig for hemming av trombotiske forstyrrelser eller hendelser.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor nevnte forbindelse er dets hydrokloridsalt.

6. Anvendelse ifølge krav 4, hvor nevnte forbindelse er eller dets hydrokloridsalt.

7. Anvendelse av en forbindelse med formelen hvor R<*> og R<3> uavhengig av hverandre er hydrogen, -CH3, eller hvor Ar er fenyl, som eventuelt er substituert; R<2> er valgt fra gruppen bestående av pyrrolidino og piperidino; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, i fremstillingen av et medikament som er nyttig for økning av Protein C-aktivering.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor nevnte forbindelse er dets hydrokloridsalt.

9. Anvendelse ifølge krav 7, hvor nevnte forbindelse er eller dets hydrokloridsalt.