NO310240B1 - Tripeptidforbindelser med antitrombotisk aktivitet, farmasöytisk formulering inneholdende slike forbindelser, oganvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår trombinhemmere som er nyttige som antikoagulanter hos mennesker og dyr. Spesielt angår den nye derivater av dipeptidet L-prolin-L-arginin-aldehydet med høy antitrombotisk aktivitet. Oppfinnelsen angår også farmasøytisk formulering inneholdende slike derivater, og anvendelse derav.

Trombinhemming blir nå oppnådd ved administrering av hepariner og kumariner. Mekanismen ved hvilken disse midlene virker, har blitt grundig studert. Hepariner blir kun administrert parenteralt, og nivåene må bli fulgt nøye. Kumoriner virker ved blokkering eller hemming av dannelsen av protrombin, og krever en viss tid for å oppnå maksimal effektivitet.

Selv om både heparinene og kumarinene er effektive antikoagulanter, eksisterer det et behov for antitrombinmidler som virker hurtig for å hindre klumpdannelse og som ikke forstyrrer plasminets virkning i oppløsning av eksisterende klumper.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot den uventede opp-dagelsen at forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er betydelig kraftigere som trombinhemmer enn den tilsvarende 4aS, 8aS enantiomeren.

Følgelig er det et primært mål for foreliggende oppfinnelse å fremskaffe (IR, 4aR, 8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8-perhydroisokino-lin-l-karbonyl-(L)-prolinyl-(L)-argininaldehyd og farmasøy-tisk akseptable salter og solvater derav som er overraskende mer kraftige trombinhemmere, og er nyttige som en antikoagu-lant og middel for tromboemboliske forstyrrelser.

Ifølge oppfinnelsen er det således tilveiebragt en ny forbindelse, som er kjennetegnet ved at den har formel 1. hvor A er og de farmasøytisk akseptable ikke-toksiske saltene og solvatene derav.

Forbindelsene av formel 1 er ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis i form av sulfatsaltet.

Peptidet representert ved formel 1, er et nyttig antitrombotisk middel og kan bli benyttet som en supplant til vevsplasminogenaktivatoren (tPA), streptokinase eller urokinaseterapi.

Forbindelsen blir fremstilt ved konvensjonelle koblings-metoder slik som de beskrevet i EP 0 4.79.489 A2; U.S. 5.250.660; og U.S. 5.252.566. Eksempelvis blir Cbz-1,2,3,4,5-,6,7,8-perhydro-l-isokinolinkarboksylsyre koblet med en ester av L-prolin for å danne Cbz-1,2,3,4,5,6,7,8-per-hydroisokinolin-l-karbonyl-Pro-ester. Estergruppen blir fjernet og Cbz-1,2,3,4,5,6,7,8-perhydroisokinolin-l-karbonyl-Pro blir koblet med laktamformen av L-arglnin for å gl Cbz-1,2,3,4,5,6,7,8-perhydroisokinolin-l-karbonyl-Pro-Arg-laktam i aminobeskyttet form. Arg-laktamrlngen blir åpnet ved reduksjon og argininamino og perhydroisokinolin-nitrogen-beskyttende grupper fjernet for å gi 1,2,3,4,5,6,7,8-perhydroisokinolin-l-karbonyl-Pro-Arg-aldehyd. Peptidet blir omdannet til passende saltformer slik som acetater og sulfater.

1,2,3,4,5,6,7,8-perhydro-l-isokinolinkarboksylsyre blir på enkel måte fremstilt ved hydrogenering av 1-isokinolinkarboksylsyre i etanol eller annen passende alkohol i nærvær av 5N saltsyre, eller annen passende sterk uorganisk syre, over 5 prosent RI1/AI2O3 eller annen passende katalysator ved et trykk fra 35 til 70 kg/cm<2> og en temperatur fra 30°C til 80°C.

Denne prosedyren gir (IR, 4aS, 8aS)-l,2,3,4,5,6,7,8-perhydro-1-isokinolinkarboksylsyre og (IS, 4aR, 8aR)-l,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8-perhydro-l-isokinolinkarboksylsyre som en racemisk blanding. De individuelle enantiomerene kan bli separert ved oppløsning av racematene ved klassiske metoder. Slike metoder omfatter dannelsen av salter med optisk aktive syrer, og også høytrykksvæskekromatografi av racematet over chirale kolonner.

De termodynamiske isomerene (IR, 4aR, 8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8-perhydro-l-isokinolinkarboksylsyre og (IS, 4aS, 8aS)-1,2,3,4,5,6,7,8-perhydro-l-isoguinolinkarboksylsyre blir fremskaffet ved fremstilling av estrene av den racemiske blandingen gitt ved prosedyrene ovenfor, og reagerer disse esterne med natriumetoksyd i etanol og så de-esterifisering av den resulterende racemiske blandingen av termodynamiske isomerer.

Den racemiske blandingen av isomerer og racemiske blandinger av termodynamiske isomerer, blir alternativt aminobeskyttet som syre koblet med en karboksybeskyttende prolin for å gi dipeptidet. Diastereomerene som er resultat fra koblingen med L-prolin, blir så oppløst ved krystallisering.

Den karboksybeskyttende estergruppen av prolindelen av dipeptidet blir så fjernet (avblokket eller de-esterifisert) og den frie syreformen av dipeptidet blir koblet med laktamformen av arginin. Det koblede argininet (aminobeskyttet) laktamproduktet blir reagert med et hydridreduserende middel, fortrinnsvis litiumaluminiumhydrid eller litium-tri-tert-butoksyaluminohydrid i et inert oppløsningsmiddel eller en blanding av oppløsningsmidler for å redusere laktamringen og gi tripeptidet i argininaldehydformen. De beskyttende gruppene blir så fjernet ved prosedyrer som er kjent for fagmannen, slik som hydrogenering over en metallkatalysator.

Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebragt anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av de medfølgende krav 1 og 2 til fremstilling av et farmasøytisk preparat som et antitrombotisk middel.

Dessuten er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en farma-søytisk formulering, som er kjennetegnet ved at den som aktiv ingrediens inneholder en forbindelse ifølge et hvilket som helst av de medfølgende krav 1 og 2 sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynnere.

Som vist i formel 1, er det asymmetriske senteret til prolin og argininaldehyd-delene L.

Perhydroderivatene omfatter D-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahy-droisokinolin-1-karbonyl (perhydroisokinolin-1-karbonyl eller 1 Piq) og D-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydroisokinolin-3-karbonyl (perhydroisokinolin-3-karbonyl eller 3-Piq) derivater av Pro-Arg-H angitt nedenfor.

Perhydroderivatene kan eksistere som cis eller trans stereoisomerer. For eksempel kan de følgende par av stereoisomerer identifisert som cis, bli dannet for D-perhydroiso-kinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-argininaldehyd:

Farmasøytisk akseptable salter av oppfinnelsens peptider omfatter syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer og karboksyl syrer. Eksempler på uorganiske syrer som danner salter, er hydrohalogensyrene saltsyre og hydrogenbromid; fosforsyre og svovelsyre. Karboksylsyresalter dannes med syrer slik som eddiksyre, propionsyre, malonsyre, maleinsyre, sitronsyre, ravsyre, eplesyre, benzosyre, fumarsyre og lignende karboksylsyrer. Syreaddisjonsaltene blir fremstilt på konvensjonell måte, f.eks. ved nøytralisering av den frie baseformen av forbindelse 1 med syren. Foretrukne syreaddisjonssalter er sulfahydrokloridsalter.

Som nevnt ovenfor, omfatter oppfinnelsen solvater av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse og dens farmasøytisk akseptable salter. Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, kan danne solvater med vann eller vanlige organiske oppløsningsmidler. Slike solvater er inkludert innen rammen av foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsen representert ved formel 1, fremstilles ved kjente peptidkoblingsmetoder. Ifølge en slik metode blir syren A-COOH, hvor A har den samme betydning som definert for formel 1 og nitrogenatomer er beskyttet med en passende aminobeskyttende gruppe, koblet med en karboksybeskyttet prolin for å danne dipeptidet. Den karboksybeskyttende estergruppen av prolindelen ifølge produktet fjernes, og den frie syreformen av dipeptidet kobles med laktamformen av arginln. Reaksjonssekvensen ovenfor er illustrert ved det følgende skjema.

hvor P står for en aminobeskyttende gruppe.

Det koblede Arg(O) laktamproduktet (c) reduseres med litiumaluminiumhydrid i et inert oppløsningsmiddel for å spalte laktamringen og gl trlpeptldet i argininaldehydformen representert ved formelen

hvor Arg(P)-H står for aminobeskyttet argininaldehyd. Laktamformen av arginin fremstilles ved intramolekylær kobling av aminobeskyttet arginin [Arg-OH]. For eksempel blir Boc-Arg(Cbz)0H representert ved formelen

først omdannet til en aktiv esterform, slik at et aktivt blandet anhydrid med en kloroformatester, f.eks. etylkloro-format til isobutylkloroformat. Esterdannelsen utføres i

nærvær av et tertiært amin slik som N-metylmorfolin. Tilsetting av en sterkere tertiær aminbase slik som trietylamin, påvirker den inerte acyleringen for å gi laktamformen av det diaminobeskyttede arginin som vist under.

Før anvendelse i koblingen med A(C=0) -Pro-OH som vist i skjemaet ovenfor, ble den Boc-beskyttende gruppen selektivt fjernet med trifluoreddiksyre for å gi den nødvendige frie aminogruppen.

Koblingen av en ACOOH-forbindelse med et prolinester, utføres ved først å beskytte aminogruppen i aminosyren. Konvensjonelle aminobeskyttende grupper som vanligvis anvendes for beskyttelse eller blokkering av aminogruppen, blir benyttet. Eksempler på slike beskyttende grupper omfatter alkoksy, alkenyloksy, cykloalkoksy og aryloksykarbonylgrupper slik som etoksyakarbonyl, t-butyloksykarbonyl (Boe), cykloheksyloksy-karbonyl, adamantyloksykarbonyl, trikloretoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl (Cbz), difenylmetoksykarbonyl og lignende grupper. Estergruppen benyttet for å beskytte karboksygruppen av prolin under koblingsreaksjonen, kan være en hvilken som helst vanlig benyttet enkel fjernbar estergruppe slik som t-butyl, benzyl, p-nitrobenzyl, p-metoksybenzyl, difenylmetyl, trikloretyl, fenacyl eller trialkylsilylestere. I utførelsen av koblingsreaksjonen benyttes en estergruppe for prolin som kan fjernes ved betingelser under hvilke den aminobeskyttende gruppen forblir intakt. Den aminobeskyttende gruppen av acyleringssyren ACOOH forblir således på plass for beskyttelse av aminogruppen under den påfølgende koblingen med argininlaktamforbindelsen for å danne c. Perhydrobicyklogruppene blir fremstilt ved hydrogenering av enten de delvis reduserte eller umettede syrene ved konvensjonelle prosedyrer. For eksempel blir 1,2,3,4-tetrahydroiso-kinolin-l-karboksylsyre hydrogenert over platinaoksyd i et oppløsningsmiddel slik som etanol eller eddiksyre for å gi perhydro(dekahydro)isokinolin-1-karboksylsyren. Perhydro-syrene blir så benyttet som beskrevet ovenfor i acyleringen av en prolinester. Eksempler på slike perhydroderivater representert ved formel 1, er n-(D-dekahydroisokinolin-l-karbonyl)-L-prolyl-L-argininaldehyd og N-(D-dekahyroisokino-lin-3-karbonyl)-L-prolyl-L-arginin.

Den ovenfor beskrevne hydrogeneringsprosessen gir en blanding av de ovenfor omtalte cis- og trans-stereoisomerer idet cis-stereoismerene oppnås i størst mengde. For eksempel omfatter forbindelsene D-l-(4aS)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-l-(4aR, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-l-(4aS, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H,D-l-(4aR, 8aS)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-A, D-3-(4aS, 8aS)-Pic-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-3-(4aR, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-3-(4aS), 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H og D-3-(4aR, 8aS)-Piq-(L)-Arg-H.

Koblingsreaksjonene beskrevet ovenfor ble utført kaldt, fortrinnsvis ved en temperatur mellom -20°C og 15° C. Koblingsreaksjonene ble utført i et inert organisk oppløs-ningsmiddel slik som dimetylformamid, dimetylacetamid, tetrahydrofuran, metylenklorid, kloroform og lignende vanlige oppløsningsmidler. Generelt blir vannfrie betingelser benyttet når en aktiv ester av acyleringssyren blir benyttet i koblingsreaksjonen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen blir best isolert i form av syreaddisjonssalter. Salter av forbindelsene med formel 1, er dannet med syrer slik som de nevnt ovenfor, som er nyttige som farmasøytisk akseptable salter for administrasjon av antitrombotiske midler og for frremstilling av formuleringer av disse midlene. Andre syreaddisjonssalter kan fremstilles og benyttes i isoleringen og rensingen av peptidene. Således kan f.eks saltformer med sulfonsyrer slik som metansulfon-syre, n-butansulfonsyre, p-toluensulfonsyre og naftalensul-fonsyre benyttes.

En foretrukket fremgangsmåte for isolering og rensing av forbindelsene representert ved formel 1, samtidig som det oppnås en ønsket stabil saltform, er beskrevet i U.S. patent 5.250.660 og omfatter preparativ rensing over C-^g reversfase-kromatografi. Den vandige fasen omfatter svovelsyre eller saltsyre ved en konsentrasjon mellom 0,01 og 0,05$ og acetonitril, THF, metanol eller andre passende oppløsnings-midler, tjener som den organiske komponent. pH til det sure elueringsmidlet blir justert til mellom pH 4 og pH 6, den eksakte pH er en funksjon av det bestemte peptidet, med en basisk harpiks f.eks. Bio-Rad AG-1X8 harpiks i hydroksyl-formen. Etter pH-justering blir oppløsningen av tripeptid-saltet, f.eks. sulfatet eller hydrokloridet, lyofilisert for å gi det rensede saltet i tørr pulverform. I et eksempel på fremgangsmåten blir urent 1-(1R, 4aR, 8aR)-Piq-L-Pro-L-Arg-H sulfat, kontaminert med det epimere D-Arg-H sulfat oppløst i vann, og oppløsningen blir lastet på en Vydac C18 RPHPLC 5 cm x 50 cm kolonne. En gradient på 2-20$ B (A = 0,0156 H2S04; B = acetonitril) i løpet av 10 timer benyttes. Flere fraksjoner oppsamles, og de som inneholder det ønskede produkt som bestemt ved analytisk RP-HPLC, forenes. pH til de oppsamlede fraksjonene ble justert til pH 4,0 til 4,5 med Bio-Rad AG-1X8 harpiksen i hydroksylsyklusen. Etter filtrering ble opp-løsningen lyofilisert for å gi ren 1-(1R, 4aR, 8aR)-Piq-L-Pro-L-Arg-H sulfat.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen er antatt selektivt å hemme trombin i forhold til andre proteinaser og ikke-enzymatiske proteiner involvert i blodkoagulasjon uten nevnbar interferens med kroppens naturlige levringslyserende evne (forbindelsene har lav hemmende effekt på fibrinolyse). Videre er slik selektivitet antatt å tillate anvendelsen med trombolyttiske midler uten betydelig interferens med trombolyse og fibrinolyse.

Forbindelsen gitt ved oppfinnelsen (formel 1) hemmer selektivt virkningen av trombin hos menneske og dyr (pattedyr). Hemmingen av trombin ble demonstrert ved in vitro-hemming av amidaseaktivitet av trombin. Den følgende tabell 1 angir den tilsynelatende likevektskonstanten (Kass) for interaksjonen mellom testforbindelsen (hemmer og trombin). Dataene i tabellen ble oppnådd i en analyse hvor trombin hydrolyserte det kromogene substratet, N-benzoyl-D-fenylala-nyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid.

Analysen ble utført i 50 pl buffer (0.03M Tris, 0,15M NaCl, pH 7,4) med 25 pl human trombinoppløsning (renset human trombin, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana, ved 8 NIH enheter/ml) og 25 pl av testf orbindelsen i et oppløsningsmiddel ( 50% vandig metanol (v:v)). Derpå ble 150 pl av en vandig oppløsning av det kromogene substratet (ved 0,25 mg/ml) tilsatt, og hydrolysehastigheten til substratet ble målt ved måling av reaksjonene ved 405 nm for frigiving av p-nitroanilin. Standard-kurver ble konstruert ved plotting av fri trombinkonsentrasjon mot hydrolysehastighet. Hydrolysehastigheten observert med testforbindelsene ble så omdannet til "frie trombin"-verdier i de respektive analysene ved hjelp av standardkurvene. Bundet trombin (bundet til testforbindelse) ble beregnet ved å trekke mengden av fritt trombin observert i hver analyse fra den kjente initielle mengden trombin observert i hver analyse. Mengden fri hemmer i hver analyse ble beregnet ved å trekke antallet mol av bundet trombin fra antallet mol av tilsatt hemmer (testforbindelse ).

Kass-verdien er den hypotetiske likevektskonstant for reaksjonen mellom trombin og testforbindelsen (I).

Kass ble beregnet for et område av konsentrasjoner av testforblndelser, og den gjennomsnittlige verdien rapportert i enheter på liter pr. mol.

Ved hovedsakelig å følge prosedyrene beskrevet ovenfor for humant trombin, og anvendelse av humant blodkoagulasjons-system-serinproteaser og anvendelse av fibrinolytiske systemserinproteaser med de passende kromogene substratene som blir identifisert nedenfor, blir selektiviteten til forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse hva angår koaguleringsfaktoren serinproteaser og de fibrinolytiske serinproteasene, evaluert såvel som deres substansielle mangel på interferns med human plasma blodlevringsfibrinoly-se.

Human faktor Xa ble anskaffet fra en Enzym Research Laboratories, South Bend, Indiana. Kromogent substrat; N-benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (for faktor Xa) ble anskaffet fra KabiCitrum, Stockholm, Sverige, eller fra Midwest Biotech, Fishers, Indiana. Bovint trypsin ble anskaffet fra Worthing-ton Biochemicals, Freehold, New Jersey. Kromogent substrat, N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid, substratet for human trombin og for trypsin, blir syntetisert ifølge prosedyren beskrevet ovenfor for forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, ved bruk av kjente fremgangsmåter for peptid-kobling fra kommersielt tilgjengelige reaktanter, eller ble anskaffet fra Midwest Biotech, Fishers, Indiana.

Humant plasmin ble anskaffet fra Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana; nt-PA ble anskaffet som en singel kjede aktivitetsreferanse fra American Diagnostica, Green-wich, Connecticut. Plasmin kromogent substrat H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid og vevsplasminogenaktivator (t-PA) substrat H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid ble anskaffet fra Kabl Vitrum, Stockholm, Sverige.

I de kromogene substratene beskrevet ovenfor, er trebokstav-symbolene Ile, Glu, Gly, Pro, ARg, Phe, Val, Leu og Lys benyttet for å indikere den tilsvarende aminosyregruppen isoleucin, glutaminsyre, glycin, prolin, arginin, fenylala-nin, valin, leucin og lysin.

Tabellen nedenfor viser Kass-verdiene oppnådd med den angitte forbindelse.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen hemmer selektivt blod-levringsdannelse uten merkbar interferens med kroppens naturlige levringlyserende evne, dvs. forbindelsene har lav hemmende effekt på fibrinolyse.

For hemming av dannelsen av blodlevringer hos menneske og dyr (pattedyr) foretas administrasjon til nevnte menneske eller dyr av en effektiv blodlevringshemmende ikke-toksisk dose av en forbindelse representert ved formel 1. Antikoagulantfor-bindelsen administreres oralt, parenteralt, dvs. ved intra-venøs infusjon (iv), intramuskulær injeksjon (im) eller subkutant (sc)

En effektiv blodlevringshemmende dose er mellom 5 mg og 1000 mg. Doseregimet kan variere, f.eks. for profylaktisk anvendelse kan en enkel daglig dose bli administrert eller multiple doser, slik som 3 eller 5 ganger hver dag, være passende. I kritiske pleiesituasjoner kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen administreres ved iv-infusjon ved en hastighet mellom 0,1 mg/kg/t og 1,0 mg/kg/t.

For oral administrasjon kan en dose av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse bli administrert i området fra 0,1 mg/kg til 20 mg/kg en eller flere ganger pr. 24 timer. Fortrinnsvis er dosen i området fra 0,5 mg/kg til 5 mg/kg og blir administrert opptil 4 ganger pr. 24 timer. Foreliggende forbindelser kan bli administrert oralt ved bruk av standard-former, slik som tabletter, kapsler o.l., som angitt nedenfor.

Foreliggende forbindelse kan også anvendes sammen med et levringslyserende middel, f.eks. vevsplasminogenaktivator (tPA), modifisert tPA, streptokinase eller urokinase. I tilfeller når levringsdannelse har inntruffet og en arterie eller vene er blokkert, enten delvis eller totalt, blir et levringslyserende middel vanligvis benyttet. En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan bli administrert sammen med det lyserende midlet eller etter dets anvendelse for å forhindre gjenopptreden av levringsdannelse.

Oppfinnelsen fremskaffer som nevnt også farmasøytiske formuleringer for bruk i den ovenfor beskrevne terapeutiske anvendelsen. Farmasøytiske formuleringer ifølge oppfinnelsen omfatter en effektiv trombin-hemmende mengde av en forbindelse med formel I sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer, eksipiens eller fortynner. For oral administrasjon formuleres den antitrombotiske forbindelsen i gelatinkapsler eller tabletter, som kan inneholde eksipienser slik som bindemidler, smøremidler, disintegratorer o.l. For parenteral administrasjon blir det antitrombotiske midlet formulert i farmasøytisk akseptabel fortynner, f.eks. fysiologisk saltvann (0,956), 556 dekstrose, Ringer's oppløsning o.l.

Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli formulert i enhetsdoseringsformuleringer inneholdende en dose mellom 0,1 mg og 1000 mg. Fortrinnsvis er forbindelsen i form av et farmasøytisk akseptabelt salt slik som for eksempel sulfatsaltet, acetatsaltet eller et fosfatsalt. Et eksempel på en enhetsdoseringsf ormulering omfatter 5 mg av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som et farma-søytisk akseptabelt salt i en 10 ml steril gassampulle. Andre eksempler på en enhetsdoseringsformulering omfatter omkring 10 mg av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, som et farmasøytisk akseptabelt salt i 20 ml isotont saltvann inneholdt i en steril ampulle.

Forbindelsene kan bli administrert på forskjellige måter inkludert oralt, rektal, transdermalt, subkutant, intra-venøst, intramuskulært og intranasalt. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ble fortrinnsvis formulert før administrasjon. En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er en farmasøytisk formulering ommfattende en effektiv mengde av en forbindelse med formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynner eller eksipient.

Den aktive ingrediensen i slike formuleringer utgjør fra 0,1 vekt-# til 99,9 vekt-# av formuleringen. Ved "farmasøytisk akseptabel" er det ment at bæreren, fortynneren eller eksipienten må være forenelig med de andre ingrediensene i formuleringen og ikke skadelige for mottakeren.

Foreliggende farmasøytiske formuleringer blir fremstilt ved kjente prosedyrer ved bruk av velkjente og enkelt tilgjengelige ingredienser. Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan bli formulert slik at de gir hurtig, vedvarende eller forsinket frigiving av den aktive ingrediensen etter administrasjon til pasienten, ved å anvende prosedyrer som er velkjente i teknikken. Ved fremstilling av sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse, vil den aktive ingrediensen vanligvis bli administrert med en bærer, eller fortynnet med en bærer, eller innekapslet i en bærer som kan være i form av en kapsel, pose, papir eller annen beholder. Når bæreren tjener som en fortynner, kan den være et faststoff, halv-fast eller flytende materiale som virker som en bærer, eksipiens eller medium for den aktive ingrediensen. Sammensetningene kan således være i form av tabletter, piller, pulvere, pastiller, poser, eleksirer, suspensjoner, emulsjoner, oppløsninger, siruper, aerosoler (som fast eller i et flytende medium), myke eller harde gelatinkapsler, stikkpiller, sterile injiserbare oppløsninger, sterilt pakkede pulvere o.l.

I det følgende beskrives eksempler på formuleringer. "Aktiv ingrediens" betyr naturligvis forbindelsene ifølge formel 1 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

Formulering 1

Harde gelatinkapsler ble fremstilt ved bruk av de følgende ingredienser:

Formulering 2

En tablett ble fremstilt ved bruk av Ingrediensen nedenfor:

Komponentene ble blandet og sammenpresset for å danne

tabletter, hver med en vekt på 665 mg

Formulering 3

En aerosoloppløsning ble fremstilt inneholdende de følgende komponentene:

Den aktive forbindelsen ble blandet med etanol, og blandingen tilsatt til en del av propellant 22, avkjølt til -30"C og overført til en påfyllingsanordning. Den ønskede mengden ble så tilført en rustfri stålbeholder og fortynnet med resten av drivmidlet. Ventilenhetene ble så satt på beholderen.

Formulering 4

Tabletter, hver inneholdende 60 mg aktiv ingrediens, ble fremstilt som følger:

Den aktive ingrediensen, stivelse og cellulose ble ledet gjennom en nr. 45 mesh U.S.-sikt og blandet grundig. Den vandige oppløsningen inneholdende polyvinyl-pyrrolidon ble blandet med det resulterende pulver, og blandingen ble ledet gjennom en nr. 14 mesh U.S.-sikt. De således produserte kornene ble tørket ved 50° C og ledet gjennom en nr. 18 mesh U.S.-sikt. Natriumkarboksymetylstivelsen, magnesiumstearatet og talken, som på forhånd var ledet gjennom en nr. 60 mesh U.S.-sikt, ble så tilsatt til kornene, som etter blanding ble presset på en tabletteringsmaskin for å gi tabletter, hver med en vekt på 150 mg.

Formulering 5

Kapsler, hver inneholdende 80 mg aktiv ingrediens, ble fremstilt som følger:

Den aktive ingrediensen, cellulosen, stivelsen og magnesiumstearatet ble blandet, ledet gjennom en nr. 45 mesh U.S.-sikt og fylt i harde gelatinkapsler i mengder på 200 mg.

Formulering 6

Stikkpiller, hver inneholdende 225 mg aktiv ingrediens, ble fremstilt som følger:

Den aktive ingrediensen ble ledet gjennom en nr. 60 mesh U.S.-sikt og suspendert i de mettede fettsyreglyseridene som på forhånd var smeltet ved bruk av minimal nødvendig varmemengde. Blandingen ble så helt i en stikkpilleform med nominelt 2 g kapasitet og avkjølt.

Formulering 7

Suspensjoner, hver inneholdende 50 mg aktiv ingrediens pr. 5 ml dose, ble fremstilt som følger:

Den aktive ingrediensen ble ledet gjennom en nr. 45 mesh U.S.-sikt og blandet med natriumkarboksymetylcellulosen og sirupen, for å danne en glatt pasta. Benzosyreoppløsningen, smaken og farven ble fortynnet med en del av vannet og tilsatt under omrøring. Tilstrekkelig vann ble så tilsatt for å produsere det ønskede volum.

Formulering 8

En intravenøs formulering kan bli fremstilt som følger:

Oppløsningen av ingrediensene ovenfor ble generelt administrert intravenøst til et individ med en hastighet på 1 ml pr. minutt.

Et eksempel på en enhetsdoseringsformulering omfatter 5 mg (IR, 4aR, 8aR )-perhydroisokinolin-l-karbonyl-L-propyl-L-argininaldehyd-sulfatsalt i en 10 ml steril glassampulle. Et annet eksempel på en enhetsdoseringsformulering omfatter omkring 10 mg (IR, 4aR, 8aR)-perhydroisokinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat i 20 ml isoton saltvanns-oppløsning inneholdende en steril ampulle.

En foretrukket formulering er en enhetsdoseringsform om-fattende mellom 5 mg og 50 mg (IR, 4aR, 8aR)-perhydroiso-kinolin-l-karbonyl)-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat i sterile ampuller.

De følgende eksempler beskriver oppfinnelsen ytterligere.

Rf-verdien i de følgende eksempler ble bestemt ved silikagel-tynnsjiktskromatografi ved bruk av Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstradt) i de følgende oppløsningsmiddelsystemene:

A) Kloroform-metanol-eddiksyre, 135:15:1, v:v:v

B) Etylacetat-eddiksyre-absoluttetanol, 90:10:10, v:v:v

C) Kloroform-metanol-eddiksyre, 90:30:5, v.v:v

D) Etylacetat-heksaner, 30:70, v:v

Den analytiske HPLC-metoden benyttet i eksemplene, var som følger: Metode 1. Waters 600 E ved bruk av Vydac C18 revers fasekolonne på 0,46 cm x 10 cm. Kr ornat ogr ammet ble overvåket på en LDC ved 220 nM ved bruk av en gradient på A = 0.01M ammoniumacetat og B = acetonitril.

Metode 2. Farmacia FPLC ved bruk av PepRPC som måler 0,5 cm x 5,0 cm. Oppfølging ble gjort på en Pharmacia UV-M ved 214 nM ved bruk av en gradient av enten A = 0.01M ammoniumacetat eller B = acetonitril.

De benyttede forkortningene har følgende betydninger. Aminosyrer: Arg = arginin, Pro = prolin, Phg = fenylglycin Boe = t-butyloksykarbonyl

Bzl = benzyl

Cbz (eller z) = benzyloksykarbonyl

DCC = dicykloheksylkarbodiimid

DMF = dimetylformamid

DMS0 = dimetylsulfoksyd

FAB-MS = fast atom bombardment masse-spektrum THF ■= tetrahydrofuran

TLC = tynnsjiktskromatografi

EKSEMPEL 1

Fremstilling av (IR, 4aR, 8aR)-perhydroisokinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-argininaldehyd

Til en omrørt oppløsning av fenetylamin (75,1 ml, 0,6 mol) og trietylamin (83 ml, 0,6 mol) i THF (500 ml) ble det sakte tilsatt metylkloroformat (46,2 ml, 0,6 mol) oppløst i THF (50 ml). Etter at reaksjonen ble omrørt i ytterligere 1 time ved romtemperatur, ble dietyleter (2 liter) og 1 N HC1 (800 ml) tilsatt. Det organiske laget ble vasket med vann, tørket (MgS04), filtrert, og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi en klar olje av den rene forbindelsen ifølge tittelen (102 g, 95*).

Metylkarbamat-DL-1,2,3, 4-tetrahydroisokinolin-l-karboksyl-syre (2)

Til en oppløsning av metylkarbamat-fenetylamin (1) (102 g, 0,57 mol) i trif luoreddiksyre (300 ml) ble det tilsatt glykosylsyre (63 g, 0,68 mol) og oppvarmet til tilbakeløps-tempratur. Etter 4 timer ved tilbakeløpskjølingstemperatur ble reaksjonen avkjølt til romtemperatur, oppløsningsmidlet fjernet under vakuum og dietyleter (800 ml)/vann (100 ml) ble tilsatt til resten. Reaksjonsblandingens pH ble hevet til 12 med 5 N NaOH, og det vandige laget separert. Til det vandige laget ble det tilsatt dietyleter (500 ml), og oppløsningen ble surgjort til pH 2,5 med 5 N HC1. Det organiske laget ble separert, tørket (MgSO^, filtrert og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi en olje av den rene forbindelsen ifølge tittelen (107 g, 8056); FAB-MS 236 (MH<+>).

M£lHbniÆ4^4id^^ t-butylester (3)

Til en omrørt, avkjølt (0°C), oppløsning av metylkarbamat-DL-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-karboksylsyre (2) (105 g, 0,45 mol) i CH2CI2 (200 ml) ble det tilsatt t-butanol (52 ml, 0,54 mol), 4-dimetylaminopyridin (10 g; 0,08 mol) og DCC (92 g, 0,45 mol). Etter 2 timer ved 0°C og 24 timer ved romtemperatur, ble oppløsningsmidlet fjernet under vakuum, og etylacetat (800 ml) / IN NaHC03 (300 ml) ble tilsatt til resten. Det organiske laget ble separert, vasket i rekkefølge med vann, 1,5 N sitronsyre og vann. Det organiske laget ble tørket (MgS04), filtrert og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi en olje av den rene forbindelsen ifølge tittelen (106 g, . 81%) ; F AB-MS 292 (MH<+>); TLC Rf (A) 0,61; elementanalyse (beregnet) Ck,<H>2i<N>04: C, 65,96; H, 7,27; N, 4,81, Funnet: C, 66,24, H, 7,28, N, 4,73.

Metylkarbamat-DL-1,2,3,4,6,7,8-perhydroisokinolin-l-karboksyl-t-butylester (4)

En oppløsning av metylkarbamat-DL-1,2,3,4-tetrahydroisokino-lin-l-karboksyl-t-butylester (3) (105 g, 0,36 mol) i t-butanol (800 ml) ble reagert med 59é Rh / A1203 (52,5 g) ved 56,2 kg/cm<2> med hydrogen i et høytrykksapparat ved 50°C i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble så filtrert gjennom en Celite® pute, og filtratet ble konsentrert under vakuum. Den resulterende oljen ble tørket for å gi den rene forbindelsen i tittelen (96,5 g, 90%) FD-MS 298 (MH<+>); TLC Rf (C) 0,63.

Metylkarbamat-l,2,3,4,4aS,6,7,8aS-perhydroisokinolin-S-1-karboksyletylester +

Metylkarbamat-l , 2 , 3 ,4 , 4aR,6 ,7 ,8,8aR-perhydro i sokinol in-R-1-karboksyletylester (5)

Til en oppløsning av metylkarbamat-DL-,2,3,4,6,7,8-perhydro-isokinolin-l-karboksyl-t-butylester (4) (81,2 g, 273 mmol) i EtOH (500 ml) ble det tilsatt natriumetoksyd (21* i etanol), (88,4 ml, 273 mmol) og reaksjonen ble oppvarmet med til-bakeløpskjøling (24 timer). Det organiske oppløsningsmidlet ble avdampet tinder vakuum, etylacetat (400 ml) og vann (100 ml) ble tilsatt til resten. Det organiske laget ble separert, vasket to ganger med vann, tørket (MgS04), filtrert, og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi olje av de rene forbindelsene ifølge tittelen (70 g, .95*); FAB-MS 270 (MH<+>); TLC Rf (A) 0,61.

Metylkarbamat-l,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroksyisokinolin-S-1-karboksylsyre +

Metylkarbamat-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroisokinolin-R-1-karboksylsyre (6)

Til en oppløsning av 5 (70 g, 260 mmol) i THF (250 ml) ble det tilsatt 2 N NaOH (156 ml, 312 mmol), og reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur (30 timer). Det organiske oppløs-ningsmidlet ble avdampet under vakuum, dietyleter (400 ml) og vann (100 ml) ble tilsatt til resten. Det vandige laget ble separert og etylacetat (400 ml) ble tilsatt. pH til oppløs-ningen ble justert til 2,0 med 5 N HC1. Det organiske laget ble tørket (MgS04), filtrert, og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi en klar olje. Oljen ble krystallisert fra heksan (200 ml) for å gi ren forbindelse ifølge tittelen (46,4 g, .74*); FAB-MS 242 (MH<+>=; TLC Rf (A) 0,36; elementanalyse (beregnet) C12HigN04: C, 59,74; H, 7,94; N, 5,81, Funnet: C, 5 9,95, H, 7,88, N, 5,54.

Cbz-1 ,2,3,4,4aS,6,7,8 , 8aS-perhydroi sokinol in-S-l-karboksyl -

syre +

Cbz-1 ,2,3,4,4aR,6,7,8 , 8aR-perhydroi sokinol in-R-1 -karboksyl -

syre (7)

Til en omrørt oppløsning av 6 (46 g, 191 mol) ved romtemperatur i vannfri CH3CN (200 ml) under en inert atmosfære, ble det tilsatt en oppløsning av jodtrimetylsilan (62,4 ml, 440 mmol) i CH3CN (60 ml). Reaksjonen ble omrørt ved 550 C i 30 min. og avkjølt til romtemperatur. Reaksjonen ble stanset med vann (100 ml) fulgt av natrium-metabisulfitt (1 g). pH til reaksjonen ble øket til 10,0 med 5 N NaOH, og benzylklorfor-mat (27,3 ml, 191 mmol) ble tilsatt dråpevis mens pH ble opprettholdt ved 10 med 2 N NaOH. Etter at reaksjonen var omrørt i ytterligere 30 min. ved romtemperatur, ble det organiske oppløsningsmidlet avdampet under vakuum, og dietyleter (200 ml) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen fikk stå ved romtemperatur (2 timer) og etylacetat (200 ml) ble tilsatt. Den vandige oppløsningen ble surgjort til pH 2,5 med 5 N HC1, det organiske laget ble separert, tørket (MgS04), filtrert og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi den rene forbindelsen i tittelen som en olje (39,5 g, 65*); FAB-MS 318 (MH<+>); elementanalyse (beregnet) C18<H>23N04: C, 68,12; H, 7,30; N, 4,41. Funnet; C, 66,37, H, 7,52, N, 4,37.

Cbz-l,2,3,4,4a-s,6,7,8aS-perhydroi sokinolin-S-1-karbonyl-Pro4;-Bu +

Cbz-1 ,2 ,3,4,4aR,6,7,8aR-perhydroisokinolin-R-1-karbonyl-Pro-t-Bu (8)

Til en omrørt, avkjølt (0°C) oppløsning av 7 (39 g, 123 mmol) i DMF (200 ml) ble det tilsatt prolin-t-butylester (21,1 g, 123 mmol), 1-hydroksybenzotriazol (16,6 g, 123 mmol) og DCC (25,3 g, 123 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer ved 0°C og 24 timer ved romtemperatur. Utfellingen fra reaksjonen ble filtrert fra og filtratet konsentrert under vakuum til en olje. Oljen ble oppløst i EtOAc (200 ml) og vann (100 ml). Det organiske laget ble vasket i rekkefølge med 1 N NaHCOs, vann, 1,5 N sitronsyre og vann. Det organiske laget ble tørket (MgSO^, filtrert, og filtratet avdampet til et amorft faststoff av forbindelsen ifølge tittelen (52,7 g, 91*) FAB-MS 471 (MH<+>).

Cbz-1 ,2,3,4 ,4aR ,6 ,7 ,8 ,8aR-perhydroisokinolin-(IR)-karbonyl-Pro-OH (9)

Til en omrørt oppløsning av 8 (52,4 g, 111 mmol) i CH2CI2 (20 ml) ble det tilsatt trifluoreddiksyre (70 ml) og anisol (5 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og konsentrert under vakuum under oppvarming. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med dietyleter (400 ml), vann (100 ml), og pH til oppløsningen ble justert til 10,0 med 5 N NaOH. Det vandige laget ble separert og etylacetat (300 ml) ble tilsatt. pH til oppløsningen ble justert til 2,5 med 5 N HC1. Det organiske laget ble separert, tørket (MgSO^, filtrert, og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi en klar olje. Oljen ble oppløst i dietyleter (500 ml) og L(-) alfa-metylbenzylamin ble tilsatt til oppløsningen. Oppløs-ningen fikk stå ved romtemperatur (24 timer). Det resulterende faststoffet ble filtrert, vasket med dietyleter og tørket. Faststoffet ble suspendert i etylacetat, vasket med 1,5 N sitronsyre og vann. Det organiske laget ble tørket (MgS04), filtrert, og filtratet avdampet for å gi forbindelsen i tittelen som en olje (20,2 g, 44*) FAB-MS 415 (MH<+>); [a]D = 3,2° (C, 0,5 MeOH); elementanalyse (beregnet) C23H30N205: C, 66,65; H, 7,30; N, 6,76. Funnet; C, 66,38, H, 7,36, N, 6,63.

(A) Boc-L-Arg

N-Boc-argininhydroklorid (Boc-Arg-OH«HC1).

(82,1 g, 250 mmol) ble oppløst 1 240 ml 5N NaOH i en 3-halset rundbunnet flaske. Oppløsningen ble avkjølt til -5°C og benzylklorof ormat (143 ml, 1,0 mol, 4 ekv. ) ble tilsatt dråpevis over 55 min. mens pH til blandingen ble holdt ved 13,2-13,5 med 5N NaOH (250 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt i en time ved -5°C etter tilsetting av kloroformatet var fullstendig. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 100 ml vann og 500 ml dietyleter og det vandige laget ble separert og ekstrahert to ganger med 40 ml porsjoner av dietyleter. Det vandige laget ble surgjort til pH 3,0 med 3N H2S04 (560 ml) og ekstrahert med 550 ml etylacetat. Det separerte vandige laget ble ekstrahert en gang med etylacetat og ekstraktet slått sammen med etylacetatekstraktet ovenfor. De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04 og avdampet til tørrhet under vakuum. Resten ble finfordelt med eter og det utfelte produktet ble filtrert og tørket. Det ble oppnådd 66,1 g av (3) Boc-Arg(Cbz)-0H (65* av teoretisk): TLC Rf (C) 0,43; FD-MS 408 (M<+>).

<i>H NMR (CDC13), S 1,42 (s, 9H), 1,61-1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m, 2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H),

5,62 (d, 1H), 7,30-7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1H).

(B) Boc-Arg(Cbz)-laktam

En oppløsning av Boc-Arg(Cbz)-0H (A) fremstilt som beskrevet

ovenfor (66,0 g, 0,162 mol) i 230 ml tørr THF, ble avkjølt til -10°C i et is-acetonbad. Til den kolde oppløsningen ble det tilsatt N-metylmorfolin (18,7 ml, 1,05 ekv.) etterfulgt av isobutylkloroformat (22,5 ml, 1,05 ekv.) og blandingen ble omrørt i 5 minutter ved -10°C. Deretter ble trietylamin (23,5 ml, 1,05 ekv.) tilsatt, og blandingen ble omrørt i 1 time ved -10° C og ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonsblandingen ble helt i en liter isvannblanding og forbindelsen i tittelen ble utfelt. Utfellingen ble filtrert, vasket med kaldt vann,

tørket under vakuum og ble krystallisert fra etylacetat. De ble oppnådd 38,05 g (60* av teoretisk) av forbindelsen i tittelen, Boc-Arg(Cbz)-laktam: TLC Rf (A) 0,77; FD-MS 291

(MH<+>).

% NMR (CDC13), 5 1,48 (s, 9H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H),

4,90 (m, lh), 4,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, lh).

Cbz-1 ,2,3,4,4aR,6,7,8 , 8aR-per hy dr oi sokinol in-R-l-karbonyl -

Arg(Cbz) laktam (11)

I flaske 1 ble forbindelse 9 (13,9 g, 33,5 mmol) oppløst i DMF (50 ml), avkjølt til -15° C og N-metylmorf olin (3,7 ml, 33,5 mmol) ble tilsatt fulgt av isobutylkloroformat (4,4 ml, 33,5 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -15°C i 1 min. I flaske 2 ble HC1-Arg(Cbz)-laktam (10,9 g, 33,5 mmol) oppløst i DMF (50 ml), avkjølt til 0°C og diisopropyletylamin (14,6 ml, 83,8 mmol) ble tilsatt til oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 1 min.

Innholdet i flaske 2 ble tilsatt til flaske 1, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer (-15<*>c) fulgt av 24 timer ved romtemperatur. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt 1 N NaHC03 (10 ml) og reaksjonsoppløsningen ble fjernet under vakuum til en olje. Resten ble oppløst i EtOAc (200 ml) og vakset i rekkefølge med 1,5 N sitronsyre, vann, 1 N NaHC03 (100 ml) og vann. Den organiske oppløsningen ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert til tørrhet under vakuum for å gi et rått faststoff. Det råe faststoffet ble renset ved kromatografi på silikagel ved bruk av en trinngradient-eluering (heksan 100 til heksan-EtOAc 30:70) for å gi ren forbindelse 10.(9,0 g, 39*): FAB-MS 687 (MH+); elementanalyse (beregnet) C37<H>46<N>607: C, 64,71; H, 6,75; N, 12,24, Funnet: C, 64,23, H, 6,69, N, 11,88.

Cbz-lm2m3m4m4aR ,6,7,8 ,8aR-perhydroisokinolin-R-l-karbonyl-Pro-ARg(Cbz)-H (12)

Til en omrørt avkjølt (-7C<P>C) oppløsning av 11 (9,0 g, 13,1 mmol) under nitrogenatmosfaere i vannfri THF (100 ml) ble det tilsatt litiumaluminiumhydrid 1 M i THF (13,1 ml, 13,1 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 min. ved -70" C. En oppløsning av 5 ml THF og 5 ml 0,5 N H2SO4 ble tilsatt dråpevis til reaksjonsblandingen. Reaksjonen ble fortynnet med EtOAc (175 ml) og vann (100 ml). Det organiske laget ble separert, tørket (MgSC^) og filtrert. Det organiske oppløs-ningsmidlet ble fjernet under vakuum for å gi et amorft faststoff med.forbindelsen i tittelen (8,2 g, 91*): FAB-MS 689 (MH<+>).

l,2,3,4,4aR,6,7,8,8 aR-per hy dr oi sokinol in-R-1-karbonyl-Pro-Arg-H'H2S04 (12)

Forbindelsen 12 (8,2 g, 11,9 mmol) oppløst i etanol (50 ml), vann (10 ml) og 1 N H2SO4 (30 ml, 29,7 mmol) ble hydrogenert i nærvær av 5* Pd/C-katalysator (4,0 g) ved omgivelses-temperatur og trykk. Etter at reaksjonen var fullstendig, ble katalysatoren fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert ned til 40 ml under vakuum og vann (50 ml) ble tilsatt. pH i oppløsningen ble justert til 4,2 med BioRad AG1-X8 harpiks (hydroksydform). Harpiksen ble fjernet ved filtrering og oppløsningen lyofilisert for å gi den rå forbindelsen ifølge tittelen (5,46 g). Faststoffet (5,46 g) ble oppløst i 0,01* H2SO4 og satt på en 5 x 25 cm kolonne med Vydac C^g-harpiks. En gradient med økende konsentrasjoner av CH3CN (1* til 5*) ble benyttet for å eluere peptidet fra kolonnen. Fraksjoner ble oppsamlet og slått sammen på basis av analytisk RP-HPLC-profil. De kombinerte fraksjonene ble justert til pH 4,2 ved bruk av AGl-X8-harpiks (Bio-Rad analytisk anionutbytteharpiks 50-100 mesh) i hydroksydform. Oppløsningen ble filtrert, og filtratet ble lyofilisert for å gi ren forbindelse ifølge tittelen (2,4 g, 39*): FAB-MS 421

(MH+), [a]]) = -102,8° (C, 0,5 / 0,01 N H2S04); elementanalyse (beregnet) C21H36N603-B^SC^ •2H20: C, 45,47; H, 7,63; N, 15,16. Funnet: C, 45,05, H, 7,44, N, 15,02.

Claims (4)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen hvor A er og farmasøytisk akseptable salter og solvater derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at det er sulfatsaltet av forbindelsen.

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2 til fremstilling av et farmasøytisk preparat som et antitrombotisk middel.

4. Farmasøytisk formulering, karakterisert ved at den som aktiv ingrediens inneholder en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2 sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynnere.