CZ286139B6

CZ286139B6 - Derivát L-prolin-L-argininaldehydu a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ286139B6
Application number: CZ19942220A
Authority: CZ
Inventors: Paul David Gesellchen; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1993-09-14
Filing date: 1994-09-12
Publication date: 2000-01-12
Also published as: ATE160574T1; UA32556C2; AU7294894A; CZ222094A3; PL305009A1; FI944231A0; IL110933A; CO4290364A1; CA2131982A1; FI944231A; NO310240B1; RU94034734A; KR950008534A; CA2131982C; YU54194A; NO943402L; RU2105010C1; NO943402D0; NZ264438A; CN1055698C

Abstract

Řešení se týká derivátu L-prolin-L-argininaldehydu, způsobu jeho přípravy a farmaceutického prostředku s jeho obsahem. (1R,4aR,8aR)-1,2,3,4,5,6,7,8-Perhydroisochinolin-1-karbonyl-(L)-prolinyl-(L)-argininaldehyd a jeho farmaceuticky vhodné soli a solváty, které jsou inhibitory thrombinu a jsou použitelné jakožto antikoagulanty a jakožto činidla pro thromboembolické poruchy.ŕ

Description

Derivát L-prolin-L-argininaldehydu, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká derivátu L-prolin-L-argininaldehydu, způsobu jeho přípravy a farmaceutického přípravku sjeho obsahem. Vynález navazuje na vynález podle přihlášky vynálezu číslo 07/756 091, podané 6. září 1991, která navazovala na přihlášku vynálezu číslo 07/589 553, podanou 8. 9. 1990, která však byla odvolána.

Vynález se týká inhibitorů thrombinu, které jsou užitečné jakožto antikoagulanty pro lidi a zvířata, a obzvláště se vynález týká derivátů dipeptidu L-prolin-L-argininaldehydu, které mají antithrombotickou účinnost.

Dosavadní stav techniky

Inhibice thrombinu se běžně dosahuje podáváním heparinů a kumarinů. Mechanismus působení těchto dvou činidel byl intenzivně studován. Hepariny se podávají toliko paranterálně a jejich množství musí být pečlivě monitorováno. Kumariny blokují nebo inhibují vytváření prothrombinu a vyžadují určitou dobu k dosažení maximální účinnosti. I když hepariny a kumariny jsou účinnými antikoagulanty, je stálá potřeba antithrombinových činidel, která působí rychle za účelem předcházení vytváření sraženin a která nenarušují působení plazmidu při rozpouštění již vytvořených sraženin.

Vynález je založen na překvapivém zjištění, že sloučenina podle vynálezu je mnohem mocnější jakožto inhibitor thrombinu než odpovídající 4aS, 8aS enantiomer.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je (lR,4aR,8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8-perhydroizochinolin-l-karbonyl-(L)-prolinyl-(L)-argininaldehyd a jeho farmaceuticky vhodné soli a solváty, který je překvapivě mocnějším inhibitorem thrombinu a je užitečný jakožto antikoagulant a jakožto činidlo proti thromboembolickým poruchám.

Sloučenina podle předloženého vynálezu, inhibující thrombin, odpovídá obecnému vzorci I

ve které A znamená skupinu vzorce

-1 CZ 286139 B6

a jsou také zahrnuty farmaceuticky vhodné netoxické soli a solváty uvedené sloučeniny.

Peptid obecného vzorce I je užitečným antithrombotickým činidlem a může se ho používat jako doplňku tkáňového plazminogenového aktivátoru (tPA), steptokinázové a urokinázové terapie.

Sloučenina obecného vzorce I se připravuje o sobě známými kopulačními způsoby, popsanými například v patentovém spise EP 0 479 489 A2, v US patentovém spise číslo 5 250 660 a v US patentovém spise číslo 5 252 566. Cbz-l,2,3,4,5,6,7,8-Perhydro-l-izochinolinkarboxylová kyselina se například kopuluje s esterem (L)-prolinu za získání Cbz-1,2,3,4,5,6,7,8,perhydroizochinolin-l-karbonyl-Pro-esteru. Esterová skupina se odstraní a Cbz-1,2,3,4,5,6,7,8, -perhydroizochinolin-l-karbonyl-Pro se kopuluje s laktamovou formou L-argininu za získání Cbz-l,2,3,4,5,6,7,8,-perhydroizochinolin-l-karbonyl-Pro-Arg laktamu v aminochráněné formě. Arg laktamový kruh se otevře redukcí a argininamino a Perhydroizochinolinový dusík, chránící skupiny, se odstraní, čímž se získá 1,2,3,4,5,6,7,8-perhydroizochinolin-l-karbonylPro-Arg aldehyd. Peptid se převede na vhodnou formu soli, jako například na acetát nebo sulfát.

1,2,3,4,5,6,7,8,-Perhydro-l-izochinolinkarboxyIová kyselina se snadno připraví hydrogenací 1izochinolinkarboxylové kyseliny v ethanolu nebo v jiném vhodném alkoholu v přítomnosti 5N kyseliny chlorovodíkové nebo jiné vhodné silné anorganické kyseliny na systému 5% Rh/AhCh jakožto katalyzátoru za tlaku přibližně 3450 až přibližně 6900 kPa a za teploty přibližně 30 až přibližně 80 °C.

Shora uvedeným způsobem se získá (lR,4aR,8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8,-perhydro-l-izochinolinkarboxylová kyselina a (lS,4aR,8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8,-perhydro-l-izochinolinkarboxylová kyselina ve formě racemické směsi. Jednotlivé enantiomery se mohou oddělit štěpením racemátu o sobě známými způsoby. Takové způsoby zahrnují vytváření solí s opticky aktivními kyselinami a také vysokotlakou kapalinovou chromatografií racemátu na chirálních sloupcích.

Termodynamické izomery (lR,4aR,8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8,-perhydro-l-izochinolinkarboxylové kyseliny a (lS,4aR,8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8,-perhydro-l-izochinolinkarboxylové kyseliny se získají při přípravě esterů racemické směsi, získané shora uvedeným způsobem, a reakcí těchto esterů s ethoxidem sodným v ethanolu a pak deesterifikací získané racemické směsi termodynamických izomerů.

Nebo se racemická směs izomerů a racemické směsi termodynamických izomerů ve formě kyselin chrání na aminoskupině a kopulují se s prolinem s chráněnou karboxyskupinou za získání dipeptidu. Diastereomery, získané kopulací L-prolinu, se pak rozdělí krystalizací.

Karboxy chráněná esterová skupina prolinového podílu dipeptidu se pak odstraní (deblokuje nebo deesterifikuje) a forma volné kyseliny dipeptidu se kopuluje s laktamovou formou argininu. Kopulovaný argininlaktamový produkt (s chráněnou aminoskupinou) se nechává reagovat s hydridovým redukčním činidlem, s výhodou s lithiumaluminiumhydridem nebo s lithium-triterc.-butoxyaluminohydridem, v inertním rozpouštědle nebo ve směsi rozpouštědel k redukci laktamového kruhu a k získání tripeptidu v argininaldehydové formě. Chrániči skupiny se pak

-2CZ 286139 B6 odstraní způsoby známými pracovníkům v oboru, jako je například hydrogenace na kovovém katalyzátoru.

Vynález se rovněž týká způsobu prevence vytváření sraženin v případě savců a farmaceutických prostředků pro tento účel.

Jak je zřejmé z obecného vzorce I, asymetrickým centrem prolinového a argininového aldehydového podílu je L.

Perhydroderiváty včetně D-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydroizochinolin-l-karboxylového derivátu (perhydroizochinolin-l-karbonyl nebo 1-Piq) a D-l,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-dekahydroizochinolin-3-karbonylového derivátu (perhydroizochinolin-l-karbonyl nebo 3-Piq) Pro-ArgH mají vzorce

O

II

C-L-Pro-L-Arg-H

II

1-Piq o 3-Piq

Perhydroderiváty mohou existovat, jakožto cis nebo trans stereoizomery. Například se mohou vytvářet následující dvojice stereoizomerů, identifikovaných jakožto cis pro D-perhydroizochinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-argininaldehyd:

[4aR,8aR]

C-Pro-Arg-H

II o

cis [4aS,8aS]

[4aR,8aS]

trans [4aS,8aR]

Farmaceuticky vhodné soli peptidu podle vynálezu zahrnují adiční soli s anorganickými nebo s karboxylovými kyselinami. Jakožto příklady anorganických solitvomých kyselin se uvádějí kyselina chlorovodíková, bromovodíková, fosforečná a sírová. Jakožto solitvomé karboxylové kyseliny se uvádějí příkladně kyselina octová, propionová, malonová, maleinová, citrónová, jantarová, jablečná, benzoová, fumarová a podobné karboxylové kyseliny. Adiční soli s kyselinou se připravují o sobě známým způsobem, například neutralizací volné zásady sloučeniny obecného vzorce I kyselinou. Jakožto výhodné adiční soli s kyselinou se uvádějí sulfáty a hydrochloridy.

Jak shora uvedeno, zahrnuje vynález rovněž solváty sloučenin obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodných solí. Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli mohou vytvářet solváty s vodou nebo s běžnými organickými rozpouštědly. Takové solváty jsou ve vynálezu rovněž zahrnuty.

Sloučeniny obecného vzorce I se připravují o sobě známými způsoby peptidové kopulace. Podle jednoho způsobu se kyselina A-COOH, kde A má shora uvedený význam u obecného vzorce I, a atom dusíku je chráněn vhodnou skupinou chránící aminoskupinu, kopuluje s prolinem s chráněnou karboxyskupinou za získání dipeptidu. Esterová skupina prolinového podílu produktu, chránící karboxyskupinu, se odstraní a volná forma kyseliny dipeptidu se kopuluje s laktamovou formou argininu. Tento reakční sled znázorňuje následující reakční schéma:

-4CZ 286139 B6

ACOOH + prolin ester

(a) deesterifikace

-----------A-(C=O)-Pro-OH (b) (b)

NHP

4**“ A-(C=O)=Pro-Arg(P)lactam (c) kde znamená P skupinu chránící aminoskupinu.

Kopulovaný Arg(P) laktamový produkt (c) se redukuje lithiumaluminiumhydridem v inertním rozpouštědle k otevření laktamového kruhu a získá se tripeptid v argininaldehydové formě obecného vzorce

A(C=O)-Pro-Arg(P)-H kde znamená Arg(P)-H argininaldehyd s chráněnou aminoskupinou.

Laktamová forma argininu se získá intramolekulovou kopulací argininu s chráněnou aminoskupinou (Arg-OH). Například Boc-Arg(Cbz)OH vzorce

Boc-NH-CH-(CH2)3-NH-C(=NH)-NHCbz

I

COOH se nejdříve převádí na formu aktivního esteru, například na aktivní směsný anhydrid, chlorformátovým esterem, například ethylchlorformátem na izobutylchlorformát. Vytváření esteru se provádí v přítomnosti terciárního aminu, například N-methylmorfolinu. Přidání silnější terciární aminové zásady, například triethylaminu, vede k vnitřní acylaci za vzniku laktamové formy argininu s chráněnou diaminoskupinou, jak znázorněno:

Před použitím při kopulaci s A(C=O)-Pro-OH, jak je ve schématu znázorněno, se Boc chránící skupina selektivně odstraní trifluoroctovou kyselinou, čímž se získá potřebná volná aminoskupina.

Kopulace sloučeniny obecného vzorce ACOOH s prolinesterem se provádí tak, že se nejdříve chrání aminoskupina aminokyseliny. Používají se běžně používané skupiny pro dočasné chránění nebo blokování aminoskupiny. Jakožto příklady takových chránících skupin se uvádějí alkoxyskupina, alkenyloxyskupina, cykloalkoxyskupina a aryloxykarbonylové skupiny, jako například skupina ethoxykarbonylová, terc.-butoxykarbonylová (Boc), cyklohexyloxykarbonylová, adamatyloxykarbonylová, trichlorethoxykarbonylová, benzyloxykarbonylová (Cbz) a difenylmethoxykarbonylová skupina. Esterovou skupinou, používanou ke chránění karboxyskupiny prolinu při kopulační reakci, může být jakákoliv běžně používaná a snadno odstranitelná esterová skupina, jako je například skupina terc.-butylová, benzylová, p-nitrobenzylová, pmethoxybenzylová, difenylmethylová, trichlorethylová, fenacylová nebo trialkylsilylesterová skupina. Při provádění kopulační reakce se používá esterové skupiny pro prolin, která je odstranitelná za podmínek, za kterých zůstává skupina, chránící aminoskupinu, nedotčena. Skupina, chránící aminoskupinu acylační kyseliny ACOOH, tak zůstává na místě pro chránění aminoskupiny v průběhu následné kopulace s argininlaktamovou sloučeninou na formu c.

Perhydrobicykloskupiny se připravují hydrogenací buď částečnou redukcí nebo nenasycenými kyselinami o sobě známým způsobem. Například se hydrogenuje 1,2,3,4-tetrahydro-lizochinolinkarboxylová kyselina na oxidu platiny v rozpouštědle, jako je ethanol nebo kyselina octová za získání perhydro(dekahydro)izochinolin-l-karboxylové kyseliny. Perhydrokyselina se pak používá shora popsaným způsobem pro acylaci prolinesteru. Jakožto příklady takových perhydroderivátů obecného vzorce I se uvádějí N-(E>-dekahydroizochinolin-l-karbonyl-Lprolyl-L-argininaldehyd aN-(D-dekahydroizochinolin-3-karbonyl-L-prolyl-L-arginin.

Uvedeným hydrogenačním postupem se získá směs cis a trans stereoizomerů, přičemž cis izomery se vytvářejí ve větším množství. Sloučeniny například zahrnují

D-l-(4aS, 8aS)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-l-(4aR, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-l-(4aS, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-l-(4aR, 8aS)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-3-(4aS, 8aS)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-3-(4aR, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, D-3-(4aS, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H, a D-31-(4aR, 8aS)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H.

Shora popsaná kopulační reakce se provádí za chladu, s výhodou při teplotě přibližně -20 až přibližně 15 °C. Kopulační reakce se provádí v inertním organickém rozpouštědle, jako jsou například dimethylformamid, dimethylacetamid, tetrahydrofuran, methylenchlorid a chloroform. Obecně se reakce provádí v bezvodém prostředí, pokud se při kopulační reakci používá aktivního esteru acylační kyseliny.

Sloučeniny podle vynálezu se izolují nejlépe ve formě adičních solí s kyselinou. Soli sloučenin obecného vzorce I vytvářejí s kyselinami, shora zmíněnými, farmaceuticky vhodné soli pro podávání antithrombotických činidel a pro přípravu farmaceutických prostředků. Mohou se připravovat také jiné adiční soli s kyselinami pro účely izolace a čištění peptidů. Mohou se například používat soli se sulfonovými kyselinami, jako jsou například kyselina methansulfonová, n-butansulfonová, p-toluensulfonová a naftalensulfonová.

Výhodný způsob izolace a čištění sloučenin obecného vzorce I za současné přípravy žádaných stabilních solí jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 5 250 660 a zahrnují

-6CZ 286139 B6 preparativní čištění na C_]8 reverzním fázovém chromatografu. Vodná fáze zahrnuje kyselinu sírovou nebo chlorovodíkovou v koncentraci přibližně 0,01 až přibližně 0,05% a acetonitril, tetrahydrofuran, methanol nebo jiné vhodné rozpouštědlo slouží jakožto organická složka. Hodnota pH kyselého elučního činidla se nastavuje na přibližně 4 až přibližně 6, přičemž přesná hodnota pH se řídí podle určitého peptidů bazickou pryskyřicí, například Bio-Rad AG-1X8 pryskyřicí v hydroxylové formě. Po nastavení hodnoty pH roztoku tripeptidové soli, například sulfátu nebo hydrochloridu, se čištěná sůl lyofilizuje za získání suché práškové formy. Podle příkladu se surový 1—(IR, 4aR, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H sulfát, znečištěný epimemím DArg-H sulfátem, rozpustí ve vodě a roztok se vnese na sloupec Vydac C_1S RPHPLC 5 cm x 50 cm. Po dobu 10 hodin se použije gradientu 2 až 20 % B (A = 0,01% kyselina sírová, B = acetonitril). Četné frakce se shromažďují a spojí se frakce, obsahující žádaný produkt podle stanovení RP-HPLC. Hodnota pH spojených frakcí se nastaví přibližně na 4 až přibližně 4,5 pryskyřicí Bio-Rad AG-1X8 v hydroxylovém cyklu. Po zfiltrování se roztok lyofilizuje, čímž se získá čistý 1—(1R, 4aR, 8aR)-Piq-(L)-Pro-(L)-Arg-H sulfát.

Sloučenina obecného vzorce I pravděpodobně selektivně inhibuje thrombin před jinými proteinázami a neenzymovými proteiny, podílejícími se na koagulaci krve bez podstatnější interference s přírodní lyzovou schopností těla (sloučeniny mají nízké inhibiční působení na fibrinolýzu)). Dále tato selektivita pravděpodobně umožňuje použití s trombolytickými činidly bez podstatnější interference s trombolýzou a fibrinolýzou.

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu selektivně inhibují působení thrombinu u lidí a zvířat (savců). Inhibice thrombinu se dokládá in vitro inhibicí amidázové aktivity thrombinu. Následující tabulka I uvádí zdánlivou rovnovážnou konstantu (Kass) pro vzájemné působení mezi zkoušenou sloučeninou (inhibitorem) a thrombinem. Hodnocení v tabulce se získají při zkoušce, při které thrombin hydrolyzuje chromogenní substrát, N-benzoyl-D-fenylalanyl-Lvalyl-L-arginyl-p-nitroanilid.

Zkouška se provádí v 50 μΐ pufru (0,03M Tris, 0,13M chlorid sodný, hodnota pH 7,4) s 25 μΐ lidského thrombinového roztoku (čištěný lidský thrombin, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana, za 8 NIH jednotek/ml) a v 25 μΐ zkoušené sloučeniny v rozpouštědle (50% vodný methanol (objem:objem)). Potom se přidá 150 μΐ vodného roztoku chromogenního substrátu (při 0,25 mg/ml) a měří se míra hydrolýzy substrátu monitorováním reakce při 405 nm pro uvolňování p-nitroanilinu. Konstruují se standardní křivky vynesením koncentrace volného thrombinu proti míře hydrolýzy. Míra hydrolýzy, pozorovaná se zkoušenou sloučeninou, se převádí na hodnoty „volného thrombinu“ při zkoušce za použití standardních křivek. Vázaný thrombin (vázaný na zkoušenou sloučeninu) se vypočte odečtením množství pozorovaného volného thrombinu při každé zkoušce od známého počátečního množství thrombinu při každé zkoušce. Množství volného inhibitoru při každé zkoušce se vypočte odečtením počtů mol vázaného thrombinu od počtu mol přidaného inhibitoru (zkoušené sloučeniny).

Hodnota Kass je hypotetická rovnovážná konstanta reakce mezi thrombinem a zkoušenou sloučeninou obecného vzorce I.

Thrombin +1 ---------> Thrombin - I <-------------[Thrombin I]

Kass = --------------[ (Thrombin) x (I) ]

Hodnota Kass se vypočte pro řadu koncentrací zkoušených sloučenin a střední hodnota se uvádí v jednotkách litru na mol.

-7CZ 286139 B6

V podstatě způsobem, popsaným shora pro lidský thrombin, a za použití jiného, lidskou krev koagulujícího systému serinproteáz a za použití fíbrinolytického systému serinproteáz se vhodnými chromogenními substráty, dále identifikovanými, se hodnotí selektivita sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu se zřetelem na koagulační faktor serinových proteáz a na fibrinolytické serinproteázy, jakož také jejich v podstatě neinterference s fibrinolýzou sraženin lidské krve.

Lidský faktor Xa je obchodním produktem společnosti Research Laboratories, South Bend, Indiana. Chromogenní substrát: N-benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (pro faktor Xa) je obchodním produktem společnosti Kabi Vitrum, Stockholm, Švédsko, nebo Midwest Biotech, Fishers, Indiana. Hovězí trypsin je obchodním produktem společnosti Worthington Biochemicals, Freeholm, New Jersey. Chromogenní substrát, N-benzoyl-Phe-Val-Arg-pnitroanilid, substrát pro lidský thrombin a pro trypsin, se syntetizují shora popsaným způsobem pro sloučeninu podle vynálezu za použití o sobě známých způsobů kopulace peptidů z obchodně dostupných reakčních složek nebo produktů společnosti Midwest Biotech, Fishers, Indiana.

Lidský plazmin je obchodním produktem společnosti Boehringer Mannheim, Indianopolis, Indiana, nt-Pa se provádí jakožto jednořetězcová aktivitní reference společnosti Američan Diagnostica, Greenwich, Connecticut. Plazminový chromogenní substrát H-D-Val-Leu-Lys-pnitroanilid a tkáňový plazminogenový aktivátorový (t-Pa) substrát H-D-Ile-Pro-Arg-pnitroanilid jsou obchodními produkty společnosti Kabi Vitrum, Stockholm, Švédsko.

Ve chromogenních substrátech shora popsaných se používají třípísmenné symboly Ile, Glu, Gly, Pro, Arg, Phe, Val, Leu a Lys k označení odpovídajících aminokyselin, izoleucin, glutamová kyselina, glycin, prolin, arginin, fenylalanin, valin, leucin a lysin. V tabulce I jsou uvedeny hodnoty Kass pro uvedené sloučeniny.

Tabulka 1

Hodnota Kass (pro všechny hodnoty v tabulce platí x 10⁶)

-8CZ 286139 B6

Příklad Struktura Lidský

thrombin	trypsin	plazmin	Xa	NtPa
1600	67	1,26	12,2

D-l-[4aR,8aR] Piq-Pro-Arg-H

140

0.74 j

4,73

D-l-[4aS,8aS]

358

1,45

1,44

0,03

L-l-[4aR,8aR] Piq-Pro-Arg-H

6,8

1.4

J

0.12 ✓

0,15

0,002

Sloučenina podle vynálezu obecného podstatnějšího narušování přirozené tělesné schopnosti lyže sraženin, to znamená, že sloučeniny mají nízké inhibiční působení na fibrinolýzu.

vzorce selektivně inhibuje vytváření sraženin bez

Vynález se týká způsobu inhibice vytváření krevních sraženin u lidí a zvířat (savců), při kterém se podává lidem nebo zvířatům účinná, vytváření krevních sraženin bránící, netoxická dávka sloučeniny obecného vzorce I. Antikoagulační sloučenina se podává orálně, parenterálně, například intravenózní infuzí (iv), intramuskulámím vstřikováním (im) nebo subkutánně (sc).

-9CZ 286139 B6

Účinnou dávkou k zábraně vytváření krevní sraženiny je přibližně 5 až přibližně 1000 mg. Dávkovači režim se mění podle profylaktického použití, přičemž se může podávat jedna denní obecného vzorce I podle vynálezu podává iv infuzí v dávce přibližně 0,1 až 1,0 mg/kg/h.

Pro orální podání je dávka sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu přibližně 0,1 až přibližně 20 mg/kg, přičemž se toto množství podává najednou nebo v několika dávkách za 24 hodin. Instantní sloučeniny se mohou podávat orálně v o sobě známých formách, jako jsou například tablety a kapsle.

Způsob podle vynálezu se provádí za současného podávání činidel, rozpouštějících krevní sraženiny, jako jsou například tkáňový plazminogenový aktivátor (tPA), modifikovaný (tPA), streptokináza nebo urokináza. V případě, kdy dojde k vytvoření krevních sraženin a jsou blokovány arterie nebo žíly buď částečně nebo úplně, používá se zpravidla činidel, která krevní sraženiny rozpouštějí. Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu se mohou podávat spolu s činidly rozpouštěcími, nebo následně k předcházení vytváření nových krevních sraženin.

Podstatou vynálezu jsou také farmaceutické prostředky pro shora popsaný léčebný režim. Farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují účinné, thrombin inhibující množství sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu spolu s farmaceuticky vhodným nosičem, excipientem nebo ředidlem. Pro orální podání antithrombotické sloučeniny se formulují želatinové kapsle nebo tablety, které mohou obsahovat excipienty, jako jsou například pojidla, mazadla a dezintegrační činidla. Pro parenterální podání se antithrombotické látky formulují s farmaceuticky vhodnými ředidly, například s fyziologickou solankou (0,9%), s 5% dextrózou nebo s Ringerovým roztokem.

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu se mohou formulovat na jednotkové dávkovači formy, obsahující přibližně 0,1 až přibližně 100 mg účinné látky. S výhodou je sloučenina obecného vzorce I podle vynálezu ve formě farmaceuticky vhodné soli. Příkladně dávkovači jednotka obsahuje 5 mg sloučeniny obecného vzorce I ve formě farmaceuticky vhodné soli v ÍOml sterilní skleněné ampuli. Jiným příkladem je dávkovači jednotka, obsahující 10 mg sloučeniny obecného vzorce I ve formě farmaceuticky vhodné soli ve 20 ml izotonické solanky ve sterilní ampuli.

Sloučeniny se mohou podávat různou cestou, například orálně, parenterálně, rektálně, transdermálně, subkutánně, intravenózně, intramuskulámě a intranasálně. Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu se s výhodou před podáváním formulují na farmaceutický prostředek. Vynález se proto také týká těchto farmaceutických prostředků, obsahujících účinné množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo solvátu spolu s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem.

Takové farmaceutické prostředky obsahují hmotnostně 0,1 až 99,9 % účinné látky. Výrazem „farmaceuticky vhodný“ se vždy míní nosič, excipient nebo ředidlo, které jsou kompatibilní s ostatními složkami a nejsou škodlivé pro ošetřovaného jedince.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se připravují o sobě známým způsobem ze snadno dostupných složek. Prostředky podle vynálezu se mohou formulovat tak, aby rychle, prodlouženě nebo odložené uvolňovaly účinnou látku po podání ošetřovanému jedinci o sobě známým způsobem. Při výrobě farmaceutických prostředků podle vynálezu se zpravidla účinná látka obecného vzorce I mísí s nosičem nebo se ředí nosičem, nebo se zapouzdřuje do nosiče, který může mít formu kapsle, sáčku, papírku nebo jiného obalu. Jestliže je nosič zároveň ředidlem, může být pevný, polopevný nebo kapalný a působí jako pojidlo, excipient nebo prostředí pro účinnou látku obecného vzorce I. Farmaceutické prostředky podle vynálezu mají proto formu

- 10CZ 286139 B6 například tablet, pilulek, prášků, roztoků, sirupů, aerosolů (jakožto pevné nebo kapalné prostředí), měkkých a tvrdých želatinových kapslí, čípků, sterilních vstřikovatelných roztoků a sterilních balených prášků.

Následující praktické příklady farmaceutických prostředků vynález toliko objasňují a nijak ho neomezují. Účinnou látkou se vždy míní sloučenina obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodná sůl nebo solvát.

Příklad farmaceutického prostředku 1

Tvrdé želatinové kapsle se připravují z následujících složek:

Množství (mg/kapsle)
účinná látka	250
škrob sušený	200
stearát hořečnatý	10
celkem	460 mg

Uvedené složky se smísí a plní se do tvrdých želatinových kapslí v množství 460 mg.

Příklad farmaceutického prostředku 2

Tablety se připravují z následujících složek:

Množství (mg/tableta)
účinná látka	250
celulóza mikrokrystalická	400
oxid křemičitý, sublimovaný	10
kyselina stearová	5
celkem	665 mg

Uvedené složky se smísí a slisují se na tablety vždy o hmotnosti 665 mg.

Příklad farmaceutického prostředku 3

Aerosolový roztok se připravuje z následujících složek:

účinná látka methanol hnací prostředek 22 (chlordifluormethan) celkem

Hmotnost

0,25

25,75

70,00

100,00

Účinná látka se smísí s ethanolem a směs se vnese do části hnacího prostředku, ochlazeného na teplotu -30 °C, a vše se převede do plnicího zařízení. Požadované množství se plní do nádobek z nerezavějící ocele a zředí se zbytkem hnacího prostředku. Obal se opatří ventilem.

- 11 CZ 286139 B6

Příklad farmaceutického prostředku 4

Tablety, obsahující vždy 60 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

Množství (mg/tableta) účinná látka60,0 škrob45,0 celulóza mikrokrystalická,3 5,0 polyvinylpyrrolidon (10% roztok ve vodě)4,0 natriumkarboxymethylovaný škrob4,5 stearát hořečnatý0,5 mastek1,0 celkem150,0

Účinná látka, škrob a celulóza se vedou sítem No. 45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a důkladně se promísí. Se získaným práškem se smísí roztok polyvinylpyrrolidonu a směs se vede sítem No. 14 mesh U.S. (průměr ok 1400 mikrometrů). Takto získané granule se suší při teplotě 50 °C, vedou sítem No. 18 mesh U.S. (průměr ok 1000 mikrometrů). Natriumkarboxymethylovaný škrob, stearát hořečnatý a mastek se vedou sítem No. 60 mesh U.S. (průměr ok 250 mikrometrů), přidají se do granulí, promísí se a směs se lisuje na tablety vždy o hmotnosti 150 mg.

Příklad farmaceutického prostředku 5

Kapsle, obsahující vždy 80 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

Množství (mg/kapsle) účinná látka80 škrob59 mikrokrystalická celulóza59 stearát hořečnatý2 celkem200

Účinná látka, škrob a stearát hořečnatý se smísí, vedou se sítem No. 45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a plní se do tvrdých želatinových kapslí v množství vždy 200 mg.

Příklad farmaceutického prostředku 6

Čípky, obsahující vždy 225 mg účinné látky, se připravují z následujících složek:

__________________________________________Množství (mg) účinná látka 225 glyceridy nasycených mastných kyselin do 2000

Účinná látka se vede sítem No. 60 mesh U.S. (průměr ok 250 mikrometrů) a suspenduje se v glyceridech nasycených mastných kyselin, předem roztavených za použití minimálně nutného tepla. Směs se lije do formy na čípky o nominální kapacitě 2,0 g a nechá se ochladit.

- 12CZ 286139 B6

Příklad farmaceutického prostředku 7

Suspenze, obsahující vždy 50 mg účinné látky v 5,0 ml, se připravuje z následujících složek:

účinná látka natriumkarboxymethylcelulóza sirup roztok kyseliny benzoové chuťová přísada barvivo čištěná voda do

50,00 mg

1,25 ml

0,10 ml

q.v.

5,0 ml

Účinná látka se vede sítem No. 45 mesh U.S. (průměr ok 355 mikrometrů) a smísí se s natriumkarboxymethylcelulózou a sirupem za vzniku hladké pasty. Přidá se za míchání roztok kyseliny benzoové, chuťové přísady a barviva, zředěná trochou vody. Pak se přidá dostatečné množství vody k dosažení požadovaného objemu.

Farmaceutický prostředek 8

Intravenózní prostředek se připravuje z následujících složek:

účinná složka 100 mg izotonická solanka 1000 ml

Shora uvedený roztok se podává intravenózně rychlostí 1 ml/min.

Jakožto příklad dávkovači jednotky se uvádí 5 mg (lR,4aR,8aR)-perhydroizochinolin-lkarbonyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfátové soli v lOml sterilní skleněné ampuli. Jiným příkladem dávkovači jednotky je přibližně 10 mg (lR,4aR,8aR)perhydroizochinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L—argininaldehydsulfátové soli ve 20 ml izotonické solanky ve sterilní skleněné ampuli.

Výhodným farmaceutickým prostředkem je dávkovači jednotková forma, obsahující 5 mg (1 R,4aR,8aR)perhydroizochinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfátové soli ve sterilní ampuli.

Následující příklady praktického provedení vynález dále objasňují bez jeho jakéhokoliv omezování.

Hodnoty Rf v následujících příkladech jsou stanovovány silikagelovou chromatografií v tenké vrstvě za použití křemeliny Kieselgel 60F-254 (Měrek, Darmstadt) v následujících rozpouštědlových systémech:

(A) chloroform-methanol-kyselina octová v objemovém poměru 135 : 15 : 1, (B) ethylacetát-kyselina octová-absolutní ethanol v objemovém poměru 90 : 10 : 10, (C) chloroform-methanol-kyselina octová v objemovém poměru 90:30: 5, (D) ethylacetát-hexan v objemovém poměr 30 : 70.

Analytické HPLC způsoby, používané v následujících příkladech jsou:

- 13 CZ 286139 B6

Způsob 1: Waters 600 E za použití kolony Vydac Cl8 s reverzní fází o rozměru 0,46 cm x 10 cm. Chromatogram se monitoruje na LDC při 220 nM za použití gradientu A = 0,01 M octanu amonného a B - acetonitrilu.

Způsob 2: Pharmacia FPLC za použití PepRPC měření 0,5 cm x 5,0 cm. Chromatogram se monitoruje na Pharmacia UV-M při 214 nM za použití gradientu A = 0,01 M octanu amonného a B = acetonitrilu.

V následujících příkladech praktického provedení používané zkratky mají tyto významy:

BOC	terc.-butyloxykarbonyl,
Bzl	benzyl,
Cbz (nebo z)	benzyloxykarbonyl,
DCC	dicyklohexylkarbodiimid,
DMF	dimethylformamid,
DMSO	dimethylsulfoxid,
FAB-MS	hmotové spektrum za bombardování rychlým atomem,
FD-MS	hmotové spektrum desorpčního pole,
THF	tetrahydrofuran,
TLC	chromatografie v tenké vrstvě.

Příklady provedení

Příklad 1

Příprava (IR, 4aR, 8aR)perhydroizochinolin-l-karbonyl-L-prolyl-L-argininaldehydu

Methylkarbamátfenethylamin (1)

Do míchaného roztoku fenetylaminu (75,2 ml, 0,6 mol) a triethylaminu (83 ml, 0,6 mol) v tetrahydrofuranu (500 ml) se pomalu přidá methylchlorformát (46,2 ml, 0,6 mol), rozpuštěný v tetrahydrofuranu (50 ml). Po reakci se míchá po dobu další jedné hodiny při teplotě místnosti a přidá se diethylether (2 1) a 1 N kyselina chlorovodíková (800 ml). Organická vrstva se promyje vodou, vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čistý methylkarbamátfenethylamin ve formě čirého oleje (102 g, 95 % teorie).

Methylkarbamát-DL-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-l-karboxylová kyselina (2)

Do roztoku methylkarbamátfenethylaminu (1) (102 g, 0,57 mol) v kyselině trifluoroctové (300 ml) se přidá kyselina glykolová (63 g, 0,68 mol) a zahříváním se udržuje na teplotě zpětného toku. Po 4 hodinách při teplotě zpětného toku se reakční směs ochladí na teplotu místnosti, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a do zbytku se přidá systém diethylether (800 ml)/voda (100 ml). Hodnota pH reakční směsi se zvýší na 12 5N roztokem hydroxidu sodného a vodná vrstva se oddělí. Do vodné vrstvy se přidá diethylether (500 ml) a roztok se okyselí na hodnotu pH 2,5 5N kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva se oddělí, vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čistá methylkarbamát-DL-l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-l-karboxylová kyselina ve formě oleje (107 g, 80 % teorie). FAB-MS 236 (MFf) terc.-Butylester methylkarbamát-DL-l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny (3)

Do míchaného chlazeného roztoku (o teplotě 0 °C) methylkarbamát-DL-l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-1-karboxylové kyseliny (2) (105 g, 0,45 mol) v methylenchloridu (200 ml) se přidá

- 14CZ 286139 B6 terc.-butanol (52 ml, 0,54 mol), 4-dimethylaminopyridin (10 g, 0,08 mol) a DCC (92 g, 0,45 mol). Po dvou hodinách při teplotě 0 °C a 24 hodinách při teplotě místnosti se rozpouštědlo odpaří ve vakuu a do zbytku se přidá systém ethylacetát (800 ml)/lN roztok hydrogenuhličitanu sodného (300 ml). Organická vrstva se oddělí, promyje se postupně vodou, kyselinou citrónovou a vodou. Organická vrstva se vysuší (síranem hořečnatým), zfíltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čistý terc.-butylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny ve formě oleje (106 g, 81 % teorie). FAB-MS 292 (MFF), TLC Rf(A) 0,61.

Elementární analýza pro C16H21NO4 vypočteno: C 65,96 H 7,27 N 4,81 nalezeno: C 66,24 H 7,28 N 4,73.

terc.-Butylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4,6,7,8-perhydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny (4)

Roztok terc.-butylesteru methylkarbamát-DL-1,2,3,4-tetrahydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny (3) (105 g, 0,36 mol) a terc.-butanolu (800 ml) se nechává reagovat na systému 5% Rh/Al₂O₃ (52,5 g) za tlaku 5520 kPa s vodíkem ve vysokotlaké aparatuře za teploty 50 °C po dobu 24 hodin. Reakční směs se zfíltruje přes vrstvu Celíte® a filtrát se zkoncentruje ve vakuu. Získaný olej se vysuší, čímž se získá čistý terc.-butylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4,6,7,8perhydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny (96,5 g, 90 % teorie). FD-MS 298 (MH⁺), TLC Rf (C) 0,63.

Ethylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karboxylové kyseliny + ethylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4,4aR, 6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-lkarboxylové kyseliny (5)

Do roztoku terc.-butylesteru methylkarbamát-DL-1,2,3,4,6,7,8-perhydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny (4) (81,2 g, 273 mmol) v ethanolu (500 ml) se přidá ethoxid sodný (21% v ethanolu) (88,4 ml, 273 mmol) a reakční směs se zahříváním udržuje na teplotě zpětného toku (po dobu 24 hodin). Organické rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a do zbytku se přidá ethylacetát (400 ml) a voda (100 ml). Organická vrstva se oddělí, promyje se dvakrát vodou, vysuší se (síranem hořečnatým), zfíltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čistý ethylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4,4aS, 6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karboxylové kyseliny + ethylester methylkarbamát-DL-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-lkarboxylové kyseliny (70 g, 95 % teorie). FAB-MS 270 (MH⁺), TLC Rf (A) 0,61.

Methylkarbamát-l,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karboxylová kyselina + methylkarbamát-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karboxylová kyselina (6)

Do roztoku ethylesteru methylkarbamát-DL-1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-lkarboxylové kyseliny + ethylesteru methylkarbamát-DL-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-l-karboxylové kyseliny (70 g, 260 mmol) v tetrahydrofuranu (250 ml) se přidá 2N roztok hydroxidu sodného (156 ml, 312 mmol) a reakční směs se míchá při teplotě místnosti (po dobu 30 hodin). Organické rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a do zbytku se přidá diethylether (400 ml) a voda (100 ml). Vodná vrstva se oddělí a přidá se ethylacetát (400 ml). Hodnota pH roztoku se nastaví na 2,0 5N kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva se vysuší (síranem hořečnatým), zfíltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čirý olej. Olej se překrystaluje z hexanu (200 ml), čímž se získá čistá methylkarbamát-1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aSperhydroizochinolin-S-l-karboxylová kyselina + methylkarbamát-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aRperhydroizochinolin-S-l-karboxylová kyselina (46,4 g, 74 % teorie). FAB-MS 242 (MH*), TLC Rf(A) 0,36.

- 15CZ 286139 B6

Elementární analýza pro C^H^NC^ vypočteno: C 59,74 H 7,94 N 5,81 nalezeno: C 59,95 H 7,88 N 5,54.

Cbz-l,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karboxylová kyselina + Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karboxylová kyselina (7)

Do míchaného roztoku methylkarbamát-1,2,3,4,4aS, 6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-lkarboxylové kyseliny + methylkarbamát-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-S-lkarboxylové kyseliny (46 g, 191 mmol) o teplotě místnosti v bezvodém methylkyanidu (200 ml) se v inertní atmosféře přidá roztok jodtrimethylsilanu (62,4 ml, 440 mmol) v methylkyanidu (60 ml). Reakční směs se míchá při teplotě 55 °C po dobu 30 minut a ochladí se na teplotu místnosti. Reakce se ukončí přidáním vody (100 ml) a metahydrogensulfitu sodného (1 g). Hodnota pH reakční směsi se zvýší na 10,0 5N roztokem hydroxidu sodného a po kapkách se přidává benzylchlorformát (27,3 ml, 191 mmol) za udržování hodnoty pH 10 2N roztokem hydroxidu sodného. Reakční směs se míchá po dobu dalších 30 minut při teplotě místnosti, načež se organické rozpouštědlo odpaří ve vakuu a přidá se diethylether (200 ml), reakční směs se nechá stát při teplotě místnosti (po dobu dvou hodin) a přidá se ethylacetát (200 ml). Vodný roztok se okyselí na hodnotu pH 2,5 5N kyselinou chlorovodíkovou a organická vrstva se oddělí, vysuší se (síranem hořečnatým) zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čistá Cbz-l,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karboxylová kyselina + Cbz-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karboxylová kyselina ve formě oleje (39,5 g, 65 % teorie) FAB-MS 318 (MK).

Elementární analýza pro C18H23NO4 vypočteno: C 68,12 H 7,30 N 4,41 nalezeno: C 66,37 H 7,52 N4,37.

Cbz-1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karbonyl-Pro-t-Bu + Cbz-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-t-bu (8)

Do míchaného chlazeného roztoku (o teplotě 0 °C) Cbz-1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karboxylové kyseliny + Cbz-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-lkarboxylové kyseliny (39 g, 123 mmol) v dimethylformamidu (200 ml) se přidá prolin-tbutylester (21,1 g, 123 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (16,6 g, 123 mmol) a DCC (25,3 g, 123 mmol). Reakční směs se míchá po dobu dvou hodin při teplotě 0 °C a po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Reakční sraženina se odfiltruje a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá olej. Olej se rozpustí v systému ethylacetát (200 ml/ voda (100 ml). Organická vrstva se promyje postupně IN roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 1,5 N kyselinou citrónovou a vodou. Organická vrstva se vysuší (síranem hořečnatým), zfiltruje se a filtrát se odpaří za získání Cbz1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karbonyl-Pro-t-Bu + Cbz-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-t-bu ve formě amorfní pevné látky (52,7 g, 91 % teorie). FAB-MS 471 (MH⁺).

Cbz-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-( 1 R)-karbonyl-Pro-OH (9)

Do míchaného roztoku Cbz-1,2,3,4,4aS,6,7,8,8aS-perhydroizochinolin-S-l-karbonyl-Pro-tBu + Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-t-bu (52,4 g, 111 mmol) v methylenchloridu (20 ml) se přidá trifluoroctová kyselina (70 ml) a anisol (5 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny a zkoncentruje se ve vakuu bez zahřívání. Reakční směs se zředí diethyletherem (400 ml) a vodou (100 ml) a hodnota pH roztoku se upraví na 10 5N roztokem hydroxidu sodného. Vodná vrstva se oddělí a přidá se ethylacetát (300 ml). Hodnota pH roztoku se nastaví na 2,5 5N kyselinou chlorovodíkovou.

-16CZ 286139 B6

Organická vrstva se oddělí, vysuší se (síranem hořečnatým), zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje ve vakuu, čímž se získá čirý olej. Olej se rozpustí v diethyletheru (500 ml) a do roztoku se přidá L-(-)a-methylbenzylamin. Roztok se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Získaná pevná látka se odfiltruje, promyje se diethyletherem a usuší se. Pevná látka se suspenduje v ethylacetátu, promyje se 1,5N kyselinou citrónovou a vodou. Organická vrstva se vysuší (síranem hořečnatým), zfiltruje se a filtrát se zkoncentruje, čímž se získá Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-(lR)-karbonyl-Pro-OH ve formě oleje (20,2 g, 44% teorie). FAB-MS 415 (MH⁺). [a]o = 3,2° (C, 0,5 methanol)

Elementární analýza pro C23H30N2O5 vypočteno: C 66,65 H 7,30 N 6,76 nalezeno: C 66,38 H 7,36 N 6,63.

(A) Boc-L-Arg(Cbz)-OH

N-Boc-argininhydrochlorid (Boc-Arg-OH.HCl) (82,1 g, 250 mmol) se rozpustí ve 240 ml 5N roztoku hydroxidu sodného v tříhrdlé baňce s kulatým dnem. Roztok se ochladí na teplotu -5 °C a po kapkách se přidává benzylchlorformát (143 ml, 1,0 mmol, 4 ekvivalenty) po dobu 55 minut za udržování hodnoty pH reakční směsi na 13,2 až 13,5 5N roztokem hydroxidu sodného (250 ml). Reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě -5 °C po ukončeném přidávání chlorformátu. Reakční směs se zředí 100 ml vody a 500 ml diethyletheru a vodná vrstva se oddělí a extrahuje se dvakrát vždy 40 ml diethyletheru. Vodná vrstva se okyselí na hodnotu pH 3,0 3N kyselinou sírovou (560 ml) a extrahuje se 550 ml ethylacetátu. Oddělená vodná vrstva se extrahuje jednou ethylacetátem a extrakt se spojí s již získaným ethylacetátovým extraktem. Spojené extrakty se promyjí vodou, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu. Zbytek se trituruje etherem a produkovaná sraženina se odfiltruje a vysuší se. Tak se získá 66,1 g (3) Boc-Arg(Cbz)-OH (65 % teorie). TLC Rf (C) 0,43, FD-MS 408 (M⁺). ’H NMR (CDCI3), δ 1,42 (s, 9H), 1,61 - 1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m, 2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1H), 7,30 - 7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1H) (B) Boc-Arg(Cbz)-laktam

Roztok Boc-Arg(Cbz)-OH (A), připraveného shora popsaným způsobem (66,0 g, 0,162 mol) ve 230 ml suchého tetrahydrofuranu se ochladí na teplotu -10 °C v lázni ledu a acetonu. Do ochlazeného roztoku se přidá N-methylmorfolin (18,7 ml, 1,05 ekvivalentu), pak izobutylchlorformát (22,5 ml, 1,05 ekvivalentu) a směs se míchá po dobu 5 minut při teplotě -10 °C. Pak se přidá triethylamin (23,5 ml, 1,05 ekv.) a směs se míchá podobu jedné hodiny při teplotě -10 °C a pak po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se vlije do jednoho litru směsi ledu a vody a Boc-Arg(Cbz)-laktam se vysráží. Sraženina se odfiltruje, promyje se studenou vodou, vysuší se ve vakuu a překrystaluje se z ethylacetátu. Tak se získá 38,05 g (60 % teorie) Boc-Arg(Cbz)-laktamu. TLC Rf (A) 0,77, FD-MS 291 (MH⁺) 'H NMR (CDCI3), δ 1,48 (s, 9H), 1,78 - 1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28 - 7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, 1H)

Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-Perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-Arg(Cbz)laktam (11)

V baňce 1 se rozpustí Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-(lR)-karbonyl-Pro-OH (sloučenina 9) (13,9 g, 33,5 mmol) v dimethylformamidu (50 ml), ochladí se na teplotu -15 °C a přidá se N-methylmorfolin (3,7 ml, 33,5 mmol) a pak izobutylchlorformát (4,4 ml, 33,5 mmol). Reakční směs se míchá při teplotě -15 °C po dobu jedné minuty. V baňce 2 se rozpustí HCI.Arg(Cbz)laktam (10,9 g, 33,5 mmol) v dimethylformamidu (50 ml). Roztok se ochladí na teplotu 0 °C a do roztoku se přidá diizopropylethylamin (14,6 ml, 83,8 mmol). Reakční směs se míchá po dobu jedné minuty při teplotě 0 °C. Obsah baňky 2 se přidá do baňky 1 a reakční směs

- 17CZ 286139 B6 se míchá po dobu dvou hodin (při teplotě -15 °C) a pak po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Do reakční směsi se přidá IN roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml), reakční rozpouštědlo se odpaří ve vakuu za získání oleje. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu (200 ml) a promyje se postupně 1,5 N kyselinou citrónovou, vodou, IN roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml) a vodou. Organický roztok se vysuší (síranem hořečnatým), zfiltruje se a odpaří se k suchu, čímž se získá surová pevná látka. Surová pevná látka se čistí chromatografií na silikagelu za použití jakožto elučního činidla gradientu hexan 100 až hexan/ethylacetát 30 : 70, čímž se získá čistý Cbz-1,2,3,4,4aR, 6,7,8,8aR-perhydroizochmolin-R-l-karbonyl-Pro-Arg(Cbz)laktam (9,0 g, 39 % teorie). FAB-MS 687 (MH⁺).

Elementární analýza pro C₃7H₄₆N₆O7 vypočteno: C 64,71 H 6,75 N 12,24 nalezeno: C 64,23 H 6,69 NI 1,88.

Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-Perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro—Arg(Cbz)-H (12)

Do míchaného a chlazeného roztoku (o teplotě -70 °C) Cbz-1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-Arg(Cbz)laktamu (9,0 g, 13,1 mmol) se v prostředí dusíku v bezvodém tetrahydrofuranu (100 ml) přidá lithiumaluminiumhydrid 1M v tetrahydrofuranu (13,1 ml, 13,1 mmol). Reakční roztok se míchá po dobu 30 minut při teplotě -70 °C. Roztok 5 ml tetrahydrofuranu a 5 ml 0,5N kyseliny sírové se přidá po kapkách do reakční směsi. Reakční směs se zředí ethylacetátem (175 ml) a vodou (100 ml). Organická vrstva se oddělí, vysuší se (síranem hořečnatým) a zfiltruje se. Organické rozpouštědlo se odstraní ve vakuu, čímž se získá Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-Arg(Cbz)-H (12) ve formě amorfní pevné látky (8,2 g, 91 % teorie). FAB-MS 689 (MH~).

l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-Perhydroizochinolin-R-l-karbonyl—Pro-Arg-H.H₂SO₄ (13)

Cbz-l,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-Arg(Cbz)-H (8,2 g, 11,9 mmol), rozpuštěný v ethanolu (50 ml), ve vodě (10 ml) a v IN kyselině sírové (30 ml, 29,7 mmol), se hydrogenuje v přítomnosti 5% Pd/C jakožto katalyzátoru (4,0 g) za teploty a tlaku okolí. Když je reakce ukončena, katalyzátor se odfiltruje. Filtrát se zkoncentruje na objem 40 ml ve vakuu a přidá se voda (50 ml). Hodnota pH roztoku se upraví na 4,2 pryskyřicí BioRad AG1X8 (hydroxidová forma). Pryskyřice se odstraní odfiltrováním a roztok se lyofilizuje za získání surového produktu (5,46 g). Pevný produkt (5,46 g) se rozpustí v 0,01% kyselině sírové a nanese se na sloupec 5x25 cm pryskyřice Vydac C_]8. Použije se gradientu vzrůstající koncentrace methylkyanidu (1 až 5 %) keluování peptidu ze sloupce. Frakce se shromažďují a spojují na základě analytického RP-HPLC profilu. Hodnota pH spojené frakce se upraví na 4,2 použitím pryskyřice AG1-X8 (Bio-Rad analytická anexová pryskyřice U.S. 50 až 100 mesh = 300 až 150 pm) v hydroxidové formě. Roztok se zfiltruje, filtrát se lyofilizuje, čímž se získá 1,2,3,4,4aR,6,7,8,8aR-perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-Pro-Arg-H.H₂SO₄ ve formě čisté sloučeniny (2,4 g, 39 % teorie). FAB-MS 421 (MFF). [a]_D ⁼ -102,8° (C, 0,5/0,01 N kyselina sírová) Elementární analýza pro C₂iH₃6N₆O₃. H₂SO₄.2H₂O vypočteno: C 45,47 H 7,63 N 15,16 nalezeno: C 45,05 H 7,44 N 15,02.

Průmyslová využitelnost (IR, 4aR, 8aR)-l,2,3,4,5,6,7,8-Perhydroizochinolin-R-l-karbonyl-(L)-prolinyl-(L)-argininaldehyd a jeho farmaceuticky vhodné soli a solváty jsou použitelné jakožto inhibitory thrombinu, inhibitory koagulace a thromboembolická činidla.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Derivát L-prolin-L-argininaldehydu obecného vzorce I a jeho farmaceuticky vhodné soli a solváty.
2. Derivát L-prolin-L-argininaldehydu podle nároku 1 obecného vzorce I ve formě sulfátové soli.
3.

I

Způsob přípravy derivátu L-prolin-L-argininaldehydu podle nároku 1 a 2 obecného vzorce (I), ve kterém A znamená skupinu vzorce

- 19CZ 286139 B6 a jeho farmaceuticky vhodných solí a solvátů, vyznačující se tím, že se odstraňuje chránící skupina ze sloučeniny obecného vzorce la (la) ve kterém A znamená skupinu vzorce

P znamená chránící skupinu, a produkt se popřípadě převede na farmaceuticky vhodné soli a solváty.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se připravuje sulfátová sůl chromatografii sloučeniny na reverzním fázovém vysokotlakém kapalinovém chromatografii při gradientově eluci, zahrnující organickou fázi, tvořící objemově 2 až 10% elučního acetonitrilu ve vodné fázi, obsahující kyselinu sírovou při hodnotě pH 2 až 3; upravením pH eluátu na hodnotu 4 až 6 bazickou pryskyřicí nerozpustnou ve vodě, oddělením pryskyřice od eluátu a odstraněním vody z eluátu.
5. Farmaceutický prostředek k inhibici thrombinu a koagulace, vyznačující se tím, že obsahuje jakožto účinnou látku derivát L-prolin-L-argininaldehydu podle nároků 1 až 2 obecného vzorce I spolu s jedním nebo několika farmaceuticky vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly.