NO301563B1 - Fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens, samt et diagnostisk sett til bruk ved fremgangsmåten - Google Patents
Fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens, samt et diagnostisk sett til bruk ved fremgangsmåten Download PDFInfo
- Publication number
- NO301563B1 NO301563B1 NO902158A NO902158A NO301563B1 NO 301563 B1 NO301563 B1 NO 301563B1 NO 902158 A NO902158 A NO 902158A NO 902158 A NO902158 A NO 902158A NO 301563 B1 NO301563 B1 NO 301563B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- igg
- serum
- determining
- galactose
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 title claims abstract description 18
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 6
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 claims description 9
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 5
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 108091008400 carbohydrate binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000023852 carbohydrate binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Molds, Cores, And Manufacturing Methods Thereof (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens i karbohydratkjeden i serum IgG, samt et diagnostisk sett til bruk ved den nevnte fremgangsmåte for bestemmelse av reumatoid artritt.
Det er kjent at et autoantistoff benevnt "reumatoid faktor" forekommer i serum av en pasient med reumatoid artritt (i det følgende forkortet til "RA pasient") og gjenkjenner antigenet tilstede i Fc-regionen av humant immunoglobulin G (i det følgende forkortet til "IgG") (Ref. 1) . Nylig er karbohy-dratkj edene av Fc-regionen av serum IgG av en RA pasient blitt analysert i detalj. Noen av oppfinnerne ved den foreliggende oppfinnelse fant tidligere at galaktose-innholdet av karbohydratkjedene av Fc-regionen av serum IgG med hensyn til en RA pasient er ekstremt lavere enn for en frisk person (Ref. 2). Det vil si at det er funnet at karbohydratkjedene av Fc-regionen av serum IgG av en frisk person utgjøres av forskjellige typer av karbohydratdeler med mikroheterogenitet uten noen individuell forskjell i mengdene av dem (Ref. 3). På den annen side har karbohydratkjeden av Fc-regionen av serum IgG av en RA pasient et bemerkelsesver-dig nedsatt galaktoseinnhold totalt, selv om det utgjøres av forskjellige typer av karbohydratkjeder med mikroheterogenitet uten noen individuell forskjell i mengdene av dem, så vel som friske frivillige. Mer spesielt er det funnet at tre typer av kjeder som hver er i kontakt med to, ett eller ingen galaktosemolekyler forekommer i Fc-regionen av serum IgG av friske frivillige i et forhold på 2 : 2 : 1, mens innholdet av karbohydratkjeder inneholdende to galaktosemolekyler av serum IgG fra pasient med RA reduseres betydelig og det totale innhold av galaktose-defisiente karbohydratkjeder øker ekstremt (Ref. 2). Disse resultater antyder at karbohydrat-kj edene av serum IgG fra pasient med RA strukturmessig bevir-ker abnormalitet, slik at IgG vil tjene som en markør for RA, hvis den strukturelle abnormalitet kan klarlegges (Ref. 4) .
De følgende referanser 1 til 4 omhandler de ovennevnte funn i detalj og utgjør bakgrunnen for den foreliggende oppfinnelse.
Referanser:
1) Kunkel, H. G. og Tan, E. M. (1964):
Autoantibodies and disease. Adv. Immunol., 4 : 351.
2) Mizuochi, T., Taniguchi, T., Matsuta, K. et al (1985): Association of rheumatoid arthritis and primary osteo-arthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature, 316, 452-457.
3) Mizuochi, T. et al (1982): J. Immunol. 129,
2016-2020. 4) Mizuochi, T. et al (1985): Reactant to rheumatoid factor: abnormality in the sugar chains of IgG in patients with rheumatoid arthritis, Clin. Immunol. 17, 977-984.
Som beskrevet i det foregående er det allerede kjent at diagnose av RA vil være mulig hvis galaktose-defisiensen i karbohydratkjedene av Fc-regionen av serum IgG kan bestemmes. Intet praktisk diagnostisk middel for å bestemme galaktose-def isiensen er imidlertid hittil funnet.
Under disse forhold er det i oppfinnelsens sammenheng tenkt at det problem som skulle løses ved oppfinnelsen beror i å tilveiebringe en metode for å bestemme galaktose-defisiensen i karbohydratkjedene av IgG tilstede i humant serum.
For å komme frem til den foreliggende oppfinnelse ble det foretatt omfattende undersøkelser for å løse det ovennevnte problem og det ble funnet at formålet oppnås ved å tilsette protein A eller G til serum, etterfulgt av tilsetning av et merket lektin og deretter måling av fargeutvikling. Den foreliggende oppfinnelse ble fullført på basis av dette funn.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens i karbohydrat-kj eden i serum IgG, som er kjennetegnet ved at den omfatter trinnene
-å reagere protein A eller protein G med serum,
-å reagere den resulterende blanding med concanavalin A eller
Lens culinaris agglutinin som et merket lektin, og
å måle en fargeutvikling.
Videre vedrører den foreliggende oppfinnelse et diagnostisk sett til bruk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av reumatoid artritt, som er kjennetegnet ved at det i alt vesentlig består av (a) et protein A eller G i en første del, og (b) concanavalin A eller Lens culinaris agglutinin som et merket lektin i en andre del for gjenkjennelse av galaktose-defisiente sukkerkjeder.
Oppfinnelsen skal nå beskrives mer detaljert.
Betegnelsen "reumatoid artritt" anvendt i den foreliggende fremstilling refererer til autoimmune sykdommer og et spesielt symptom på disse viser seg som stivhet om morgenen.
Betegnelsen "protein A" anvendt i denne fremstilling refererer til et protein isolert fra cellemembranen av Staphylococcus aureus som utgjøres av et enkelt polypeptid med en molekylvekt på 42 000 og sammensatt av noen deler som har likhet med hverandre med hensyn til intrastruktur.
Protein A har egenskapen med binding med Fc-regionen av IgG, slik at det er nyttig for rensing av IgG på grunn av denne egenskap, som i seg selv er tidligere kjent.
I likhet med protein A er protein G et protein isolert fra Staphylococcus aureus og har egenskapen med å binde med Fe-delen av IgG slik at det er nyttig for rensing av IgG på grunn av denne egenskap, som også er kjent fra tidligere.
Betegnelsen "lektin" er en generell betegnelse for karbo-hydratbindende proteiner. Selv om et lektin først var tilgjengelig fra kastor-frø er lektiner omfattende fordelt i dyr inkluderende bakterier, slik at forskjellige typer av lektiner som fremkommer fra forskjellige kilder nå er tilgjengelig. Et hvilket som helst lektin som skriver seg fra en hvilken som helst kilde kan binde med forskjellige typer av sukkerkjeder som er forskjellige fra hverandre i struktur for gjenkjennelse. For eksempel kan mange av lektinene som skriver seg fra forskjellige kilder gjenkjenne en galaktose-defisient mannosekjede. Det lektin som anvendes i den foreliggende oppfinnelses sammenheng er concanavalin A eller Lens culinaris agglutinin.
Merkingen av lektinet som probe for deteksjon av karbohydrat kan gjennomføres ved hjelp av konvensjonelle metoder. Det vil si at merkingen kan gjennomføres ved hjelp av en prosess passende selektert fra prosesser for merking av enzym, for radioisotop og så videre. Den foreliggende oppfinnelse er således ikke begrenset med hensyn til merkingsmetoden. Ved enzymmerkingen kan et enzym bindes til et lektin enten direkte eller gjennom passende molekyler som for eksempel biotin og avidin.
Bestemmelsen av galaktose-defisiensen i samsvar med oppfinnelsen kan fundamentalt gjennomføres på følgende måte. Først immobiliseres protein A på en nitrocellulosemembran, etterfulgt av tilsetningen av serum fortynnet med buffer. Deretter tilsettes biotin-concanavalin A-oppløsning til den resulterende membran for å detektere karbohydratdelene. Videre tilsettes avindin-peroksydaseoppløsning dertil for å gjennomføre en ytterligere reaksjon. Den resulterende membran vaskes og behandles med en oppløsning av et substrat mot peroksydfargen. Selv om et diagnostisk middel omfattende protein A og biotin-concanavalin A (merket lektin) som essensielle bestanddeler anvendes i den ovennevnte prosess, kan et slikt diagnostisk middel passende kombineres med andre komponenter som anvendes i løpet av gjennomføringen av bestemmelsen for å lette bruken i et diagnostisk sett, og eksempler på slike inkluderer fosfatbuffer, blokkerende oppløsning, nitrocellulosemembran, avidinperoksydase, tris-buffer, substratoppløsning og reaksjonsstopperoppløsning. Selv om det er tidligere kjent at IgG kan renses ved hjelp av protein A eller G og at et lektin kan gjenkjenne en karbohy-dratkj ede, er trekket med å kombinere protein A eller G med et lektin til et diagnostisk middel nytt, og en grei og nøyaktig diagnose av RA er blitt realisert ved hjelp av dette trekk, hvilket vil nærmere forklares i de etterfølgende forsøkseksempler, selv om noe slikt hittil har vært ansett vanskelig å oppnå. Fig. 1 viser sammenligningen av styrken av signalet generert etter fargingen av serum IgG av en pasient med RA med Con A med signalet for en frisk frivillig. Styrken av signalet ble bestemt ved bruk av en Flying spotscanner CS 9000. Fig. 2 viser sammenligningen av styrken av signalet utviklet etter fargingen av serum IgG fra en pasient med RA med LCA med signalet for en frisk person. Styrken av signalet ble bestemt ved bruk av en Flying spotscanner CS 9000. Fig. 3 viser mengden av serum Agalactocyl - IgG av en pasient med hver lidelse oppnådd ved prosedyren under anvend-else av mikroplatebrønner på den horisontale akse for å fremkalle en farge, etterfulgt av måling av styrken ved 405 nm og 490 nm. Navnene på sykdommene er beskrevet i eksempel 2. Tabell 1 viser positivitets-prosenter i samsvar med resultatene som vist i fig. 3.
EKSEMPEL
1. Et kommersielt tilgjengelig protein A (et produkt fra f.eks. Sigma eller Pharmacia) eller protein G (et produkt fra f.eks. Sigma eller Pharmacia) ble kombinert med et merket lektin (som for eksempel peroksydasemerket eller biotin-merket) (kommersielt tilgjengelig som et produkt fra f.eks. Sigma eller Seikagaku Kogyo) for oppnåelse av et diagnostisk middel. 2. Komponentene beskrevet i det foregående ble videre kombinert med en fast komponent for immobilisering (binding) av protein A (som for eksempel en nitrocellulosemembran eller mikroplate av polystyren), en blokkerende buffer (for eksempel fosfatbuffer eller tris-buffer inneholdendeBSAeller gelatin), et merket enzym (for eksempel streptoavidin-peroksydase) og et substrat mot enzym (som for eksempel4-klornaftol) for å oppnå et diagnostisk middel. 3. Protein A eller G bundet til eller immobilisert på over-flaten av en fast komponent omsettes med humant plasma eller serum for spesifikt å selektere immunoglobulin (IgG). Kar-bohydratstrukturen tilstede i IgG merkes med et merket lektin (som for eksempel peroksydase-lektin) for å detektere den strukturelle abnormalitet i karbohydratkjeden av IgG ved å utnytte aktiviteten av lektinet til spesifikt å gjenkjenne karbohydratkjedestrukturen. Deteksjonen gjennomføres ved å bestemme mengden av lektinet bundet til IgG-kjeden basert på styrken av signalet som for eksempel utviklet farge. Mer spesifikt, etter som analysen av strukturen av karbohydrat-kj edene av serum IgG av pasient med RA viste at galaktoseinn-holdet av karbohydratkjedene var betydelig redusert, ble lektiner reaktive med slikt agalaktosyl IgG underkastet screening. Som resultater ble det funnet at mannosegjen-kj ennende lektiner som for eksempel concanavalin A (ConA) eller Lens culinaris agglutinin (LCA) er ytterst reaktive overfor agalaktosyl IgG. Serum IgG av pasient med RA ble således undersøkt ved bruk av disse lektiner.
Eksempel 1
Prøve: Sera ble fremstilt fra pasienter med RA og fra friske frivillige for bruk ved de etterfølgende forsøk.
Metode: Protein A (250/zg/ml) ble oppløst i en fosfatbuffer (50 mM fosfat, 0,15 M NaCl, pH: 7,4), 10 pil av denne oppløsning ble tilført til en nitrocellulosemembran (flekkplotting). Den resulterende membran ble tørket og blokkert med en blokkerende buffer (50 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 % NP-40, 2,5 % gelatin (vekt/volum), pH: 7,4).
Den resulterende membran (IgG-fangende membran, i det følgende benevnt "IGGTM") ble anvendt ved analysen av sukkerkjeden av serum IgG av pasient med RA eller friske frivillige. Serum av pasient med RA eller friske frivillige ble fortynnet med en blokkerende buffer og tilsatt til IGGTM for å binde IgG med membranen (i 60 min. ved romtemperatur) . Etter reaksjonen ble IGGTM forsiktig renset og vasket i 5 min. Deretter ble 500/xg/ml biotin-Con A (20 ptg/ml) tilsatt til det resulterende IGGTM for å gjennomføre en reaksjon (i 60 min. ved romtemperatur). Etter reaksjonen ble det resulterende IGGTM forsiktig renset og vasket to ganger, hver gang i 5 min. Deretter ble 500 fil streptoavidin-peroksydase tilsatt til det resulterende IGGTM for å gjennomføre en ytterligere reaksjon. Etter reaksjonen ble det resulterende IGGTM forsiktig renset og vasket to ganger, hver gang i 5 min. Etter vaskingen ble det resulterende IGGTM forsiktig renset med TBS (2 0 mM tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH: 7,4). En substratoppløsn-ing mot peroksydase (500 ug/ ml) ble tilsatt til IGGTM for å initiere fargeutvikling (i 5 til 10 min.) Etter fullført utvikling ble det resulterende IGGTM tilstrekkelig vasket med destillert vann og tørket for å måle styrken av det utviklede signal på IGGTM med en Flying spotscanner CS 9000 med dobbelt bølgelengde (produsert av Shimadzu) (A. = 540 nm) .
Resultat
1. Serum IgG av hver av fire RA pasienter og fire friske frivillige ble undersøkt med hensyn til reaktivitet med Con A. Det gjennomsnittlige resultat for den friske gruppe var 7603,85, mens resultatet for RA gruppen var 43 906,22. RA gruppen fremviste således et høyere resultat enn for den friske gruppe (fig. 1).2. Serum IgG av hver av ti pasienter med RA og fire friske personer ble undersøkt med hensyn til reaktivitet med LCA. Det gjennomsnittlige resultat for den friske gruppe var0, mens resultatet for RA gruppen var 24501,8. RA gruppen fremviste således et høyere resultat enn for den friske gruppe (fig- 2).
Eksempel 2
(Prøve) : Sera ble fremstilt fra pasienter med sykdommer vist i det følgende og fra friske frivillige, for bruk ved de følgende forsøk.
Metode: Hver mikroplate-brønn ble fylt med 100 fil protein A
(2,5/zg/ml) og belagt. Den ble blokkert med 100 fil av en blokkerende buffer (1 % BSA, 50 mM fosfatbuffer, 0,15 M NaCl, pH: 7,4). 100 fil gelat inbuf f er (50 mM tris - HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 % NP-40, 2,5 %
(vekt/volum) gelatin, pH: 7,4) ble tilsatt til hver brønn, etterfulgt av tilsetning av 1 fil av prøve. Deretter ble det til hver brønn tilsatt ytterligere 100 fil av gelatinbufferen. Alle brønner ble inku-bert ved 2 5°C i 60 min. Etter reaksjonen ble hver brønn vasket med vaskebuffer (50 mM tris - HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 % NP-40, pH: 7,4). Deretter ble 100 fil av biotin-Con A oppløsning (0,0625/xg/ml) tilsatt dertil og reaksjonen ble gjennomført ved 25°C i 60 min. Reaksjonsproduktet ble vasket med vaskebufferen. Deretter ble 100 fil streptoavidin-peroksydase-oppløsning tilsatt. En reaksjon ble
gjennomført ved 25°C i 60 min. Reaksjonsproduktet ble vasket med vaskebufferen, etterfulgt av tilsetning av 100 fil substratoppløsning (3 % H202, 10 fil + ABTS 6 mg/4 ml, en sitronsyrebuffer, pH: 4,2) for gjennomføring av en reaksjon ved 3 7°C i 60 min.
Til hver brønn ble det tilsatt 100/il natriumazid-oppløsning for å avslutte reaksjonen og absorbans ved 4 05 nm og 4 90 nm,av den resulterende prøve ble målt ved bruk av et dobbeltbølgelengde-spektrofotometer.
Resultat
Fig. 3 viser følgende:
1. Absorbans 0,14 defineres som grenseverdi. Reumatoid artritt fremstår som RA når den målte absorbans av en prøve er større enn grenseverdien. Positivitetsforholdet for hver sykdom er vist i tabell 1. 2. Et høyt positivitetsforhold sees med hensyn til andre sykdommer enn RA, dvs. SLE, OA og LD, ved hjelp av en konvensjonell RA test, som for eksempel hemagglutinasjons-metoden og lateks-koaggultinasjonsmetoden, i henhold til Tatsu ABE, General Clinic (Sogo Rinsho) 34, 1915 (1985). Assay-metoden i samsvar med den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et meget lavt positivt forhold for disse sykdommer, men en meget høy selektivitet for RA sykdommen.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens i karbohydratkjeden i serum IgG,
karakterisert vedat den omfatter trinnene -å reagere protein A eller protein G med serum, -å reagere den resulterende blanding med concanavalin A eller
Lens culinaris agglutinin som et merket lektin, og å måle en fargeutvikling.
2. Diagnostisk sett til bruk ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for bestemmelse av reumatoid artritt,karakterisert vedat det i alt vesentlig består av (a) et protein A eller G i en første del, og (b) concanavalin A eller Lens culinaris agglutinin som et merket lektin i en andre del for gjenkjennelse av galaktose-def isiente sukkerkjeder.
3. Diagnostisk sett for bestemmelse av reumatoid artritt som angitt i krav 2,
karakterisert vedat det i tillegg omfatter en fosfatbuffer, en blokkerende oppløsning, en nitrocellulosemembran, en avadinperoksidase, en tris-buffer, en substratoppløsning og/eller en reaksjonsstopperoppløsning.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12617789 | 1989-05-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO902158D0 NO902158D0 (no) | 1990-05-15 |
| NO902158L NO902158L (no) | 1990-11-20 |
| NO301563B1 true NO301563B1 (no) | 1997-11-10 |
Family
ID=14928591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO902158A NO301563B1 (no) | 1989-05-19 | 1990-05-15 | Fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens, samt et diagnostisk sett til bruk ved fremgangsmåten |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0398292B1 (no) |
| JP (1) | JP2945075B2 (no) |
| KR (1) | KR920007202B1 (no) |
| CN (1) | CN1036156C (no) |
| AT (1) | ATE126598T1 (no) |
| CA (1) | CA2016125A1 (no) |
| DE (1) | DE69021631T2 (no) |
| DK (1) | DK0398292T3 (no) |
| ES (1) | ES2076254T3 (no) |
| FI (1) | FI97649C (no) |
| GR (1) | GR3017345T3 (no) |
| NO (1) | NO301563B1 (no) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2133772A1 (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-20 | Yuji Yamada | Method for assaying glycoconjugate and reagent thereof |
| JP3537535B2 (ja) * | 1994-07-14 | 2004-06-14 | 株式会社中埜酢店 | 免疫グロブリンｇ結合糖鎖構造に基づく臨床検査方法 |
| WO2000075313A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for judging rheumatoid arthritis |
| GB2362211A (en) * | 2000-05-08 | 2001-11-14 | Leuven K U Res & Dev | Detecting circulating immune complexes using protein G |
| CN112924671A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-06-08 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0058780B1 (de) * | 1981-02-19 | 1987-03-04 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Antigen/Antikörper-Bestimmungsmethode |
| US4617262A (en) * | 1983-07-22 | 1986-10-14 | Cooperbiomedical, Inc. | Assaying for circulating immune complexes with labeled protein A |
| US4659659A (en) * | 1985-01-22 | 1987-04-21 | Monsanto Company | Diagnostic method for diseases having an arthritic component |
| US4863874A (en) * | 1986-07-11 | 1989-09-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for detecting phosphatidylinositol through binding to Concanavalin A |
| GB8726271D0 (en) * | 1987-11-10 | 1987-12-16 | Univ London | Protein glycosylation assay |
-
1990
- 1990-05-04 CA CA002016125A patent/CA2016125A1/en not_active Abandoned
- 1990-05-09 FI FI902322A patent/FI97649C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-05-14 JP JP12376690A patent/JP2945075B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-15 NO NO902158A patent/NO301563B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-05-16 EP EP90109242A patent/EP0398292B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-16 DK DK90109242.9T patent/DK0398292T3/da active
- 1990-05-16 ES ES90109242T patent/ES2076254T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-16 AT AT90109242T patent/ATE126598T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-16 DE DE69021631T patent/DE69021631T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-19 KR KR1019900007225A patent/KR920007202B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-05-19 CN CN90103723A patent/CN1036156C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-09-08 GR GR950401869T patent/GR3017345T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO902158L (no) | 1990-11-20 |
| DE69021631D1 (de) | 1995-09-21 |
| CN1036156C (zh) | 1997-10-15 |
| CA2016125A1 (en) | 1990-11-19 |
| JP2945075B2 (ja) | 1999-09-06 |
| ES2076254T3 (es) | 1995-11-01 |
| FI97649B (fi) | 1996-10-15 |
| FI97649C (fi) | 1997-01-27 |
| DE69021631T2 (de) | 1996-02-22 |
| KR900017608A (ko) | 1990-12-19 |
| FI902322A0 (fi) | 1990-05-09 |
| NO902158D0 (no) | 1990-05-15 |
| KR920007202B1 (ko) | 1992-08-27 |
| CN1047392A (zh) | 1990-11-28 |
| ATE126598T1 (de) | 1995-09-15 |
| EP0398292B1 (en) | 1995-08-16 |
| GR3017345T3 (en) | 1995-12-31 |
| DK0398292T3 (da) | 1995-09-25 |
| EP0398292A2 (en) | 1990-11-22 |
| EP0398292A3 (en) | 1991-11-13 |
| JPH0373857A (ja) | 1991-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4621268B2 (ja) | 癌発生及び転移に関与するタンパク質の糖鎖変化を測定して癌を診断する方法及びそれを利用した診断キット | |
| US7195881B2 (en) | Method and kit for following neurodegenerative diseases | |
| WO2003031971A1 (fr) | Reactif pour detecter un facteur de risque de la maladie d'alzheimer, necessaire de detection a cet effet, et procede de detection du facteur de risque de la maladie d'alzheimer au moyen de ce necessaire | |
| KR0126236B1 (ko) | 완전 세포에 적용할 수 있는 면역측정분석 키트 및 방법 | |
| NO20110895A1 (no) | Kompetitive S100A9 immunoanalyser | |
| JP4290424B2 (ja) | タンパク質ｅｓｍ−１を検出するためのキット及び前記キットを使用する検出方法 | |
| NO20110896A1 (no) | ELISA for kalprotektin | |
| WO2007145362A1 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエのグリセロ型糖脂質抗原 | |
| US6242197B1 (en) | Use of urinary trypsin inhibitor for the diagnosis of the onset of AIDS | |
| EP0313244B1 (en) | Method for increasing the sensitivity of assays for mucin | |
| KR19980701608A (ko) | 심장 트로포닌 1의 초감도 분석방법 | |
| NO301563B1 (no) | Fremgangsmåte for bestemmelse av galaktose-defisiens, samt et diagnostisk sett til bruk ved fremgangsmåten | |
| EP1947460B1 (en) | Method of measuring ptx3 with high sensitivity | |
| EP0782863B1 (en) | Antibody reagent for detecting dissecting aortic aneurysm and use thereof | |
| EP0101886A2 (de) | Antikörper gegen bakterielle Peptidoglycane, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden zu ihrer quantitativen Bestimmung | |
| US8841084B2 (en) | Methods for the detection and monitoring of acute myocardial infarction | |
| Saile et al. | Quantification of serum amyloid P by enzyme-linked immunosorbent assay | |
| CN107022028B (zh) | 特异性抗CitH3单克隆抗体及其酶联免疫吸附试验试剂盒在脓毒症诊断中的应用 | |
| JP2002071695A (ja) | エイズ関連脳疾患の診断剤、診断方法および診断用キット | |
| US5593898A (en) | Diagnostic method for the immunological determination of NCAM | |
| JPH09311132A (ja) | ＩｇＡ腎症の診断法 | |
| Ali et al. | Profile of patients with thrombosis evaluated in a tertiary care centre | |
| JPH06109730A (ja) | Ｔー抗原とｈー抗原を同時に検出する方法 | |
| JP2726500C (no) | ||
| DK161098B (da) | Antistoffer mod modificeret beta2-mikroglobulin, fremgangsmaader til detektering af modificeret beta2-mikroglobulin samt farmaceutiske praeparater indeholdende saadanne antistoffer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN NOVEMBER 2003 |