NO301476B1

NO301476B1 - N-£3-£2-(1H-imidazol-1-yl)etoksy|-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin og farmakologisk akseptable salter derav

Info

Publication number: NO301476B1
Application number: NO924760A
Authority: NO
Inventors: Rolf Paul; Robert Gerard Kelly; Lawrence W Torley
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1991-12-31
Filing date: 1992-12-09
Publication date: 1997-11-03
Also published as: CA2086357A1; FI925951A; NO924760L; ZA9210120B; US5162328A; EP0549880A1; AU651539B2; EP0549880B1; DE69227015D1; DK0549880T3; SG47556A1; HUT66943A; HU9204172D0; AU3046292A; ES2121809T3; FI925951A0; DE69227015T2; ATE171178T1; NO924760D0; KR930012761A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny forbindelse N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin og dets farmakologisk akseptable salter, som viser uventede fordelaktige biotilgjengelighetsegenskaper, noe som kan påvises ved en økende plasmahalveringstid. Forbindelsen og de nevnte salter kan anvendes ved behandling av astma og allergiske lidelser og sykdommer.

Den bronkospasme som oppleves ved allergisk astma er en konsekvens av at det frigjøres forskjellige typer forbindelser, såsom histamin og andre langsomt reagerende forbindelser fra mastceller. Visse 4,5,6-substituerte-N-(substituert fenyl)-2-pyrimidinaminer med antiastmatisk aktivitet er beskrevet i US-patentene 4.788.195 og 4.876.252. Skjønt de forbindelser som der er beskrevet samtidig som deres syntese er angitt, er meget aktive som midler mot astma og allergi i flere testsystemer, er det imidlertid meget vanskelig å forutsi fra disse testsystemer hvilken forbindelse som vil vise tilstrekkelig biotilgjengelighet til å kunne vise den forønskede farmakologiske effekt mot astma og allergi på en reproduserbar måte og over lengere perioder. Det er generelt kjent og akseptert at en forbindelses aktivitet er korrelert med dennes konsentrasjon i plasma, og at den beste behandlingen av astma oppnås ved at man har en aktiv forbindelse som viser forbedret biotilgjengelighet, noe som skjer ved en forlenget oppholdstid i plasma ved effektive konsentrasjoner. Det er således et stort behov for å kunne bruke effektive forbindelser ved behandling av astma og med tilstrekkelig biotilgjengelighet til å gi gjentagbare og langvarige plasmanivåer hos pasienter.

Det ble nå funnet at N-[3-[2-lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin og dets farmakologisk akseptable salter viser uventede fordelaktige biotilgjengelighetsegenskaper, slik dette kan påvises ved vedvarende høye plasmakonsentrasjoner og en lang halveringstid, noe som er tilstrekkelig til å gi vedvarende aktivitet mot astma og allergi. De uventede fordelaktige biotilgjengelighetsegenskapene ved forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, er meget viktige fordi forbindelsen har en lang halveringstid i blodplasma i en effektiv konsentrasjon,

og derved gir en effektiv behandling av astma og allergier.

I motsetning til dette har man forbindelser som ikke har den for-ønskede biotilgjengelighet, og disse er langt mindre egnet for bruk ved behandlingen.

Den nye forbindelsen N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin er utprøvet i den passive kutanøse rotteanafylaksemålingen (PCA) og i den immunologisk stimulerte humane basofilmålingen. Når man sammenligner resultatene fra disse målinger med de tilsvarende resultater for to nærstående forbindelser, dvs. 2-metyl-N4-4- [ (4-pyridinyl) -2-pyrimidinyl ] -1,4-benzendiamin-dihydroklorid og N-[4-[2-(dietylamino)etoksy]fenyl]-4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinamindihydro-klorid som er angitt i US-patent 4.788.195, er resultatene innenfor de eksperimentelle feilkilder ekvivalente med hensyn til aktivitet mot astma. De tester på antiastmatisk aktivitet som er beskrevet ovenfor, kan imidlertid ikke forutsi biotilgjengelighetsegenskaper, dvs. hvilken forbindelse som vil ha vedvarende plasmakonsentrasjon og den tilknyttede vedvarende farmakologiske aktivitet.

Den her beskrevne N-[3-[2-(lH-imidazol-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinaminforbindelse viser i alt vesentlig tilsvarende høy aktivitet som de to meget nærstående forbindelser fra US-patent 4.788.195 i den in vitro-basofile histaminfrigjørings-prøven og i in vivo-rotte-PCA-prøven. Imidlertid vil hverken in vitro-aktiviteten eller effektiviteten i gnagermodellen kunne forutsi riktig biotilgjengelighet eller farmakokinetikk. Ved å utprøve disse forbindelsene i hunder har man imidlertid uventet funnet at N-[3-[2-lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin har et øket plasmahalveringstid og er reproduserbart ved en sammenligning med de to nærstående forbindelsene fra US-patent 4.788.195, dvs. 2-metyl-N4-[4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]-1,4-benzendiamin-dihydroklorid og N-[4-[2-(dietylamino)etoksy]-fenyl]-4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinamindihydroklorid. Det er over-raskende at N-[3-[2-(lH-imidazol-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinaminforbindelsen viser slike overlegne biotilgjengelighetsegenskaper, såsom plasmakonsentrasjon og halveringstid, i forhold til de nærstående forbindelsene som 2-metyl-N4-[ 4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]-1,4-benzendiamindihydroklorid og N-[4-[2-(dietylamino)etoksy]fenyl]-4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinamin-dihydroklorid .

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 viser den midlere konsentrasjonen av N-[3-[2-(lH-imidazol-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i plasma hos hunder som fikk forbindelsen i en dose på 2 mg/kg/døgn oralt i 5 døgn. Fig. 2 viser den midlere konsentrasjonen av 2-metyl-N<4->[4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]-1,4-benzendiamindihydroklorid i plasma hos hunder som fikk en dose på 2 mg/kg/døgn oralt i 5 døgn. Fig. 3 viser den midlere konsentrasjonen av N-[4-[2-(dietyl-amino) etoksy]fenyl]-4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinamindihydroklorid i plasma hos hunder som fikk en dose på 2 mg/kg/døgn oralt i 5 døgn. Fig. 4 viser den midlere konsentrasjonen av prøveforbindelser i plasma hos hunder som fikk en dose på 2 mg/kg/døgn oralt.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRESLER

Den nye forbindelsen, N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin 1 og dets salter ifølge foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles som angitt på det følgende reaksjonsskjemaet.

I overensstemmelse med det ovennevnte reaksjonsskjemaet, ble [3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-guanidin-dihydro-klorid 2 (eksempel 332, US-patent nr. 4.788.195) reagert med 3-dimetyl-amino-1-(2-tienyl)-2-propen-l-on 3_ (eksempel 1, del A, US-patent nr. 4.374.988) i et inert oppløsningsmiddel, f.eks. N,N-dimetyl-formamid, og i nærvær av kaliumkarbonat ved temperaturer fra 100-155°C i fra 16 til 24 timer, hvorved man får fremstilt N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin 4. Reaksjon av forbindelse 4. med hydrogenklorid gir 1, monohydro-kloridsaltet.

Den organiske basen ifølge foreliggende oppfinnelse danner ikke-toksiske syreaddisjonssalter med en rekke farmako-logisk akseptable organiske og uorganiske saltdannende reagenser. Såldes kan syreaddisjonssalter dannes ved å blande den organiske frie basen med en eller flere ekvivalenter av en syre, fortrinnsvis i et nøytralt oppløsningsmiddel, og disse kan dannes ved hjelp av syrer som svovelsyre, fosforsyre, saltsyre, hydrobromsyre, sulfaminsyre, maleinsyre, melkesyre, malinsyre, ravsyre, vinsyre, eddiksyre, fumarsyre, glukonsyre, askorbinsyre og lignende. For det foreliggende formål er den frie basen ekvivalent med sine ikke-toksiske syreaddisjonssalter. Syreaddisjonssalter av den organisk frie basen ifølge foreliggende oppfinnelse er vanligvis faste krystallinske forbindelser.

Den nye forbindelsen N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin og dens farmakologisk akseptable syreaddisjonssalter ifølge foreliggende oppfinnelse, er meget aktive mot astma og allergi, slik det vil bli beskrevet i det etterfølgende.

Den bronkospasme man opplever ved allergisk astma, er en konsekvens av at det frigjøres såkalte styrende forbindelser, f.eks. histamin og andre langsomtreagerende forbindelser fra mastceller. Den rolle slike styrende forbindelser spiller ved en utløsning av et astmatisk anfall, er beskrevet og dokumentert flere steder, se f.eks. Kaliner, M. og Austen, K.F., Bronchial Asthma Mechanisms and Therapeutics, E.B. Weiss, Editor, Little, Brown and Company, Boston, 163 (1976); Lichtenstein, L.M., Asthma-Physiology, Immunopharmacology and Treatment, annet internasjonalt symposium, L.M. Lichtenstein og K.F. Austin, Editors, Academic Press, New York, 41, (1979); og Bell, S.C., et al., Annular Reports in Medicinal Chemistry, 14, 51, H.J. Hess, Editor, Academic Press, New York, (1979).

De nye forbindelsene ifølge denne oppfinnelse er blitt prøvet ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet av Lichtenstein, L.M. og Osler, A.G., J. Exp. Med., 120, 507-530 (1964), som måler forbindelsenes evne til å hemme frigjøringen av de styrende forbindelser (histamin) fra immunologisk stimulerte humane basofiler.

Reagenser

10X konsentrert Tris- buffer

Oppløs 140,3 g natriumklorid, 7,45 g Trizma-Tris Pre-Set, analysekvalitet, pH 7,6 ved 25"C (Sigma Chemical Co.) i tilstrekkelig vann til å gi et sluttvolum på 2 liter.

Humant albumin

(Sigma chemical Co.) (30 mg/ml).

Kalsium- og magnesiumløsninger

Fremstilt med en molaritet på 0,075 og 0,5 henholdsvis med kalsiumkloriddihydrat og magnesiumkloridheksahydrat.

Tris- A- buffer

En 10 ml porsjon av nevnte 10X Tris-buffer og 1,0 ml humant albumin blir fortynnet til 100 ml med vann.

Tris- ACM- buffer

En 10 ml porsjon av 10X Tris-buffer, 1,0 ml humant albumin, 0,8 ml av kalsiumløsningen og 0,2 ml av magnesiumløsningen ble fortynnet til 100 ml med vann.

Kanin- antihumant IgE

Behring Diagnostics (vanligvis brukt i en sluttkonsentrasjon på 10 iig protein/ml) .

Husstøvmiddekstrakt ( Dermatophagoides Farinae)

Styrke 1:100 (w:v) allergenisk ekstrakt, Hollister-Stier Labs. Vanligvis ble denne fortynnet 1:1000 til 1:10.000 (idet man anså ampullen som stamløsningen).

Andre allergener

Intradermale oppløsninger eller intramuskulære preparater for hyposensitivering, Hollister-Stier Labs. Sluttkonsentrasjonen var vanligvis i størrelsesorden 1 PNU/ml.

Separasjon av leukocytter fra humant blod og etterfølgende reaksjon

Ved å bruke fire 20 ml hepariniserte rør, ble 80 ml blod tatt ut fra pasienter med en kjent histaminfrigjøring overfor anti-IgE, burotantigen og andre spesifikke allergener. Disse 80 ml blod ble blandet med 2 0 ml saltoppløsning inneholdende 0,6 g dekstrose og 1,2 g dekstran. Man lot blodet sedimentere seg ved romtemperatur i to 50 ml polykarbonatsentrifugerør, inntil man fikk en skarp interfase mellom de røde cellene og plasmaet (60-90 minutter). Plasma inneholdende leukocyttene (topplaget) fra hvert rør, ble tatt ut ved hjelp av en pipette og overført til 50 ml polykarbonat-rør. Plasma ble sentrifugert i 8 minutter ved 110X G ved 4°C. Supernatanten ble forsiktig helt av så fullstendig som mulig, og cellene i bunnen ble resuspendert med 2-3 ml Tris-A buffer, idet man brukte en silikonisert Pasteur-pipette. Suspenderingen ble oppnådd ved å trekke væsken forsiktig inn og ut av pipetten, idet tuppet på pipetten alltid var under væskenivået, inntil man fikk en jevn cellesuspensjon. Tilstrekkelig Tris-A buffer ble så tilsatt til man fikk et volum i røret på ca. 4 5 ml, hvoretter røret ble sentrifugert ved 110X G 8 minutter ved 4°C. Super-natanten ble helt av, og cellene i bunnen ble resuspendert og sentrifugert som beskrevet ovenfor. Super-natanten ble igjen helt av, og cellene ble igjen suspendert i 2-3 ml Tris-ACM buffer til et sluttvolum som var tilstrekkelig til at man kunne utføre en tilsetning til reaksjonsrørene.

Reaksjonsrørene inneholdende anti-IgE eller anti-gener, enten alene eller sammen med prøveforbindelsen i et sluttvolum på 0,2 ml, ble fremstilt og plassert i et varmebad på 37°C. Cellene ble oppvarmet til denne temperatur og flere ganger ristet for å sikre en jevn suspensjon, hvoretter 1,0 ml porsjoner ble tatt ut av hvert reaksjonsrør. Rørene ble inkubert i 60 minutter ved 3 7°C og forsiktig virvlet rundt hvert 15 minutt for å holde cellene jevnt suspendert. Etter at reaksjonen var ferdig, ble rørene sentrifugert ved 4°C i 10 minutter ved 1500 opm. for å sedimentere cellene. 1 ml porsjoner av supernatanten ble overført til poly-etylenrør med en lengde på 7 5 mm og en diameter på 12 mm, og hvert rørt ble så tilsatt 0,2 ml 8% perklorsyre. I hver prøve inngikk det kontroller og rør med alle kjemikalier. Kontrollene hadde celler og alle reagenser unntatt antigen eller anti-IgE. I kontrollrørene med kjemikalier var det tilsatt 0,24 ml 8% perklorsyre, 1 ml celler og 0,2 ml buffer. Alle prøver ble så sentrifugert for å fjerne utfelt protein.

Undersøkelse av frigjort histamin ved den automatiserte fluorometriske metoden

Denne automatiserte metoden er beskrevet av Siraganian, R.P., i Anal. Biochem. 57, 383 (1974) og J. Immunol. Methods, 7, 283

(1975) og er basert på den manuelle metoden til Shore, P.A., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 217, 182 (1959).

Det automatiserte systemet består av følgende Technicon Autoanalyzer II komponenter: Prøvetager IV, dobbelthastighets-fordelingspumpe III, fluoronefelomter med et trangt primært filter 7-60 og et sekundært filter 3-74, registrerings-apparat og digital skriver. Den manifold man brukte er den som er beskrevet av Siraganian, se referanse ovenfor, med følgende modifikasjoner: dialysedelen er utelatt, og alle pumperor føres gjennom en enkelt utporsjoneringspumpe med stor kapasitet, og man tar ut for analyse dobbelt så stort volum som for prøven.

Den automatiserte kjemiske reaksjonsrekkefølgen består av følgende trinn: ekstraksjon av alkalisk saltoppløsning over i butanol, tilbakeekstraksjon med fortynnet saltsyre ved tilsetning av heptan, reaksjon melom histamin med ortoftaldialdehyd (OPT) ved høy pH, og omdannelse av OPT-adduktet til en stabil fluorofor med fosforsyre. Reaksjonsproduktet føres så gjennom fluorometeret. Det totale utslag blir så justert til 50 ng histaminbase med en terskelfølsomhet på ca. 0,5 ng.

Beregning av resultatene fra histaminfrigjøringsprøvene

Instrumentets egenverdi (bare vaskeoppløsning) ble subtrahert fra det målte ng histamin for hver prøve. Så ble ng histamin for hver prøve delt ved et middel på tre prøver med totalt celleinnhold (cellene ble oppløst med perklorsyre) for å oppnå prosentfrigjøring

Kontrollprøver inneholdt antigen, men ingen prøveforbindelse. De blanke prøvene (eller spontan frigjøring) inneholdt hverken antigen eller prøveforbindelsen. Middelet for de blanke prøvene (tre paralleller) ble subtrahert fra prosentfrigjøring for kontrollene og prøveforbindelsene.

Middelverdier for kontroll og prøveforbindelsesgruppene ble beregnet, og resultatet for en prøveforbindelse ble beregnet som prosent av kontrollen ved hjelp av følgende formel:

De verdier man oppnådde med forskjellige konsentrasjoner av prøveforbindelsen ble brukt for å beregne en IC50(den/xM konsentrasjon som gir en 50% hemming av histaminfrigjøringen) ved lineær regress jon. Man anså en forbindelse å være aktiv hvis IC50var større enn 48 jxM.

Resultatene av denne målingen er angitt i Tabell 1. Resultatene viser at disse forbindelsene er ekvivalente med hensyn til histaminfrigjøring. Resultatene viser ikke disse forbindelsenes egenskaper med hensyn til biotilgjengelighet.

Passiv kutan anafylaksemåling ( PCA) på rotter

Reagenser

Evans<1>Blue dye: ( Sigma Chemical Co.)

Oppløsninger ble fremstilt ved å oppløse 0,50 g i 100 ml normal saltoppløsning.

IgE

Musemonoklonalt IgE (ICN Biochemicals) klon SPE-7 rettet inn mot DNP, ble oppdelt i 50 ul porsjoner og lagret ved -70°C.

Allergen

DNP-ovalbumin ble fremstilt ved å reagere DNP sulfonsyre med ovalbumin oppløst i saltoppløsning over natten ved rom-temperatur. Den resulterende oppløsningen ble dialysert meget lenge ved 4'C for å fjerne uomsatt DNP sulfonsyre og så lagret som 1 ml porsjoner i en konsentrasjon på 100 mg/ml ved -70°C.

Dyr

Man brukte Wistar-hannrotter med sertifikat på at de var frie for virus, og de veide fra 250-300 g og ble levert fra Hilltop Laboratory Animals og oppbevart i overensstemmelse med AALAC standard i laboratoriet minst en uke før bruk.

Sensitivering

48 timer før reaksjonen ble rottene barbert på ryggen og returnert til burene. 2 4 timer før reaksjonen ble rottene gitt intradermale injeksjoner på 0,1 ml på hver side av kroppen av en saltoppløsning som inneholdt IgE i konsentrasjoner som varierte fra 1000 til 250 ng/ml. Disse injeksjoner ble gitt i lokale doser på 100 til 25 ng IgE. IgE binder seg spesifikt til reseptorer på mast-cellene i huden.

Tilførsel av forbindelse

Forbindelsene ble oppløst eller suspendert i destillert vann ved ultralydbehandling i konsentrasjoner som varierte fra 0,25 til 0,05 mg/ml umiddelbart før bruk. Rottene ble dosert oralt ved hjelp av et magerør i en mengde på 10 ml/kg enten med prøve-forbindelsesoppløsningen eller bare med vann.

Allercrenreaks j on

Evans<1>blue dye oppløsning ble tilsatt tilstrekkelig DNP-ovalbumin til at man fikk en oppløsning på 1 mg/ml. Denne allergenholdige fargestoffoppløsningen ble injesert intravenøst via en halevene til rottene i en dose på 10 ml/kg. Evans' blue farge-stoffet binder seg til plasmaalbumin og forblir i det vaksukære rom ved normal kapillær permeabilitet. Allergenet som kan diffundere inn i det ekstravaskukære rom, binder seg til IgE på overflaten av de kutanøse mast-cellene og starter den umiddelbare hyperfølsomme reaksjonen som fører til frigjøring av histamin fra de intra-cellulære granulater i mast-cellen. Histaminet gir umiddelbart en økning i den kapillære permeabilitet som gjør at plasmaproteiner inklusiv de fargestoffmerkede albuminmolekyler, diffunderer inn i det ekstracellulære rom, hvorved man får et blått punkt på huden. Størrelsen på dette punktet er proporsjonal med den mengde histamin som er frigjort. Denne prosessen når et optimum i løpet av 3 0 minutter.

Måling av reaksjonen overfor allergenet

30 minutter etter at rottene var utsatt for allergenet, ble rottene drept ved hjelp av C02. Huden ble bøyet ut fra ryggen, og man målte sårområdet som produktet av den største diameteren på det blå punktet og diameteren loddrett på over-flaten. En forbindelse som hemmer frigjøringen av histaminet eller den styrende forbindelsen, vil redusere overflatearealet på flekken.

Analyse

Forbindelsenes effektivitet ble bestemt ved en varians-analyse av sårområdet gruppert ved IgE-dose og forbindelse. Forbindelser ble ansett å være aktive ved et P-område som var større enn 0,05.

Analyse av resultatene

Tabell II inneholder resultatene fra eksperimentene uttrykt som overflateområdet av sårene i mm<2>. Man har også angitt kontrollmålene i disse eksperimentene. Fordi man undersøkte mer enn en forbindelse i hvert forsøk, er enkelte av kontrollverdiene gjentatt et par ganger i tabellen. Tabell III viser data uttrykt som prosent av passende kontroll. Det sår som ble brukt i denne tabellen er det som tilsvarer en dose på IgE som ga et kontrollsår som lå nær 100 mm<2>, og som man fant representerte den mest følsomme sårstørrelsen.

De viste data angir ekvivalensen av disse forbindelser med hensyn til histaminfrigjøring. Resultatene viser imidlertid ikke disse forbindelsers egenskaper med hensyn til biotil-gjengelighet.

Erfaring og sammenligninger med hensyn til farmakokinetikk og biotilgjengelighet av forbindelser mot astma i gnagere, hunder og mennesker, har vist at hunder gir en bedre forutsigelse av den humane reaksjon enn hos rotter. Skjønt man ikke ønsker å være bundet av teori, antar man at hovedårsaken til at hunder er bedre med hensyn til forutsigelse av humane reaksjoner, er at fordøyelsessystemet hos hunder reagerer overfor aktive ingredienser og preparater på en måte som ligner det man finner hos mennesker. Farmako-kinetikken for preparater og forbindelser ble derfor under-søkt på hunder.

Farmakokinetikk

Ettersom hunder brukes i undersøkelse av toksikologien til forbindelser som brukes mot astma, ble disse dyr valgt for bedømmelse av farmakokinetiske egenskaper. Bruken av hunder gjør det mulig å utføre en farmakokinetisk sammenligning av 2 eller flere forbindelser i samme forsøksdyr, en bedømmelse som ikke hensiktsmessig kan utføres i mindre dyr. For hver prøveforbindelse ble normale hunder gitt en dose på 2,0 mg/kg/døgn i 5 etterfølgende dager. Man hadde deretter en såkalt utvaskningsperiode på 1 måned mellom hver gang man undersøkte en ny prøveforbindelse i de samme fire hundene. Hver prøveforbindelse ble tilført som en oppløsning med en konsentrasjon på 5 mg/ml enten i 0,05 eller 0,1N HCl som ble ført inn i en gelatinkapsel umiddelbart før dosering.

Man tok ut hepariniserte blodprøver fra hvert dyr på første, tredje og femte dag av doseringen henholdsvis 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 7,0, 12,0 og 24,0 timer etter doseringen. Prøvene ble sentrifugert umiddelbart for å fremstille plasma som ble frosset umiddelbart inntil analysen ble utført.

Analyse av plasma ble utført ved å bruke høytrykksvæske-kromatografi (HPLC). Den analytiske fremgangsmåten er i alt vesentlig identisk for hver forbindelse. Den indre standard man brukte for N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin er 2-klor-ll-(4-metyl-l-piperazinyl)-dibenz[b,f]-[l,4]oksazepinsukcinat, mens for 2-metyl-N<4->[4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]-1,4-benzendiamindihydroklorid og N-[4-[2-(dietyl- amino)etoksy]fenyl]-4-(4-pyridinyl)-2-pyrimid-amindihydroklorid er den indre standarden 7-etoksykumarin. I den vanlige fremgangsmåten ble 0,4 ml acetonitril inneholdende den indre standarden tilsatt 0,2 ml serum. Prøvene ble blandet og så sentrifugert. Den klare proteinfrie supernatanten ble helt av over i et rent rør og fordampet til tørrhet. Den tørre fordampningsresten ble oppløst i 0,2 ml av den HPLC-mobile fasen, og man injeserte 50/Ltl av denne oppløsningen. Topper som tilsvarte prøveforbindelsen og den indre standard-forbindelsen ble målt og kvantifisert ved deres absorpsjon i ultrafiolett lys ved 280 nm. Hvert sett av analytiske prøver ble fulgt av en analyse av en gruppe av standardplasma fra hunder, fremstilt slik at det inneholdt mengder av den forbindelse som ble målt, som ligger innenfor konsentrasjonsområdet i prøvene.

Man brukte i denne undersøkelsen fire normale beagle-hunder som veide mellom 9,2 og 10,2 kg. Analytiske resultater man oppnådde for N-[3-[2-(lH-imidazol-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin er vist i Tabell IV. Disse data er også vist grafisk på Fig. 1. Farmakokinetiske parametere avledet av disse data er vist i Tabell V. Lignende informasjon for 2-metyl-N4- [4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]-1,4-benzendiamindihydroklorid er vist i Tabell VI. Disse data er vist grafisk på Fig. 2. Farmakokinetiske parametere avledet av disse data er vist i Tabell VII. Data for N-[4-[2-(dietylamino)etoksy]fenyl]-4-(4-pyridinyl)-2-pyrimidinamin-dihydro-klorid er vist i Tabell VIII. Selv om man brukte fire hunder i denne undersøkelsen, ga bare en hund målbare konsentrasjoner av forbindelsen i plasmaet. Midlere data er vist grafisk på

Fig. 3. De data som er vist på Fig. 4, viser plasmainnholdet av

prøveforbindelsene i hundene etter første dose. Konsentrasjonen av N-[3-[2-(lH-imidazol-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i plasmaet over en 12 timers periode, ligger på et høyere nivå over et lengere tidsrom enn for de andre prøveforbindelsene.

Ettersom forbindelsenes farmakologiske aktivitet vanligvis er korrelert med deres konsentrasjon i plasma, er det klart at denne forbindelsen har overlegne egenskaper med hensyn til biotilgjengelighet, og vil følgelig være den mest effektive av de prøvede forbindelsene.

De aktive forbindelser kan tilføres oralt, f.eks. sammen med et inert fortynningsmiddel eller med en assimilerbar spiselig bærer, eller de kan innkapsles i harde eller myke gelatinkapsler, eller de kan presses til tabletter, eller kan direkte inkorporeres i matvarer. For oral terapeutisk bruk kan disse forbindelser inkorporeres sammen med fortynningsmidler av den type som brukes i nedbrytbare tabletter, forsinkelsestabletter, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper og lignende. Slike preparater og blandinger bør inneholde minst 0,1% aktiv forbindelse. Prosentsatsen i preparatene eller blandingene kan selvsalgt varieres, og kan hensiktsmessig være mellom 2 og 60 vekt-% av enheten. Mengden av aktiv forbindelse i slike terapeutisk brukbare preparater bør være slik at man oppnår en egnet dosering. Foretrukne blandinger eller preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er fremstilt slik at en oral doseringsenhet inneholder mellom 5 og 2 00 mg aktiv forbindelse. Tablettene, pillene, kapslene og lignende preparater kan også inneholde det følgende: et bindemiddel såsom gummitragakant, akacia, maisstivelse eller gelatin; fortynningsmidler såsom dikalsiumfosfat; et nedbrytningsmiddel såsom maisstivelse, potet-stivelse, algininsyre og lignende; et smøremiddel såsom magnesium-sterat; et søtningsmiddel såsom sukrose, laktose eller sakkarin og et smaksstoff såsom peppermynte, olje av vintergrønn eller kirsebær. Når doseringsenheten er en kapsel, kan den i tillegg til det som er nevnt ovenfor, inneholde en flytende bærer eller fortynningsmiddel. Forskjellige andre materialer eller substanser kan også være tilstede som belegg eller på annen måte brukes for å modifisere doseringsenhetens fysiske form. F.eks. kan tabletter, piller og kapsler belegges med skjellakk, sukker eller begge deler. En sirup eller oppløsning kan inneholde den aktive forbindelsen, sukrose som søtningsmiddel, metyl- og propylparabener som konser-veringsmiddel, et fargestoff og et smaksstoff såsom kirsebær eller appelsinsmak. Alle materialer og stoffer som brukes for frem-stilling av doseringsenheter, må selvsalgt være farmasøytisk rene og være i alt vesentlig ikke-toksiske i de mengder som brukes.

I tillegg kan de aktive forbindelser inkorporeres i preparater og blandinger som gir en forsinket frigjøring.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse og preparater fremstilt derav har den forønskede klarhet, stabilitet og tilgjengelighet for parenteral bruk slik at de kan fremstilles i denne preparatform ved at man oppløser fra 0,10 til 10 vekt-% av den aktive forbindelsen i en væske bestående av en polyfunksjonell alifatisk alkohol eller blandinger av slike. Spesielt tilfreds-stillende er glycerol, propylenglykol og polyetylenglykoler. Polyetylenglykolene består av en blanding av ikke-flyktige, normalt flytende polyetylen-glykoler som er oppløselige i både vann og organiske væsker, og som har molekylvekter fra ca. 200 til 1500. Skjønt man kan bruke forskjellige blandinger av de forannevnte ikke-flyktige polyetylenglykoler, så er det foretrukket å bruke en blanding som har en midlere molekylvekt fra ca. 200 til ca. 400.

I tillegg til den aktive forbindelsen kan parenterale opp-løsninger også inneholde andre forskjellige konserveringsmidler som brukes for å hindre forurensninger med bakterier og sopp. Konserveringsmidler som kan brukes for dette formål er f.eks. myristylgamma-pikoliniumklorid, benzalkoniumklorid, fenetylalkohol, p-klorfenyl-alfa-glyceroleter, metyl og propylparabener og timerosal. Rent praktisk er det også hensiktsmessig å bruke et anti-oksydasjonsmiddel. Egnede midler i så henseende innbefatter natriumbisulfitt, natriummetabi-sulfitt og natriumformaldehyd-sulfoksylat. Vanligvis bruker man fra 0,05 til ca. 0,2% av anti-oksydasj onsmiddelet.

Disse forbindelser kan også tilføres ved inhalering ved å bruke vanlige kjente aerosol<R->blandinger.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet mer detaljert sammen med de følgende spesifikke eksempler.

Eksempel 1

N-[3-[2-(LH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4- ( 2- tienvl)- 2- pyrimidinamin

En blanding av 99,95 g [3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-guanidindihydroklorid (US-patent nr. 4.788.195) 36,24 g 3-dimetyl-amino-1-(2-tienyl)-2-propen-l-on (US-patent nr. 4.374.988) i 500 ml metoksyetanol, ble rørt og langsomt oppvarmet for å få en fullstendig oppløsning, hvoretter man tilsatte 41,4 g kaliumkarbonat. Reaksjonsblandingen ble rørt og oppvarmet under koking med tilbake-løp i 24 timer, filtrert, hvoretter filtratet ble fordampet i vakuum til et oljeaktig konsentrat som ble delt mellom kloroform og vann. Krystaller begynte å danne seg. Det vandige laget ble ekstrahert med 4 x 300 ml kloroform inneholdende 10 ml etanol. De samlede organiske lag ble tørket over natriumsulfat og ført gjennom en kake av vannfritt magnesiumsilikat. Filtratet ble fordampet i vakuum, og man fikk 61,6 g av en mørk olje. Produktet ble utkrystallisert tre ganger fra etylalkohol og deretter behandlet med aktivert karbon, noe som ga 34,31 g av et lysebrunt fast stoff.

Eksempel 2

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin hvdroklorid

En oppløsning av 1,8394 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 25 ml varm etyl-alkohol, ble tilsatt 1,3 3 ml av en 3,58N HC1 i etylalkohol. Oppløsningen ble gul og begynte å koke. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C, krystallene ble frafiltrert, vasket med 1 ml etylalkohol, og deretter med eter. De gule krystallene ble oppsamlet og vakuum-tørket, noe som ga 1,87 g, smp. 23 3-2 37°C.

Eksempel 3

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4- f 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin dihydroklorid

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,3 g HCl. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene fra frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, smp. 238-253 °C.

Eksempel 4

N- [3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin sulfat ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,27 g svovelsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket til det forønskede produkt.

Eksempel 5

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin fosfat ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,27 g fosforsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 6

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin hydrobromid

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,22 g hydrogenbromid. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 7

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pvrimidinamin monosulfamat

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,27 g sulfaminsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 8

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pvrimidinamin 2- butendioat ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,3 2 g maleinsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 9

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tieny1)- 2- pyrimidinamin mono( 2 - hydroksypropanoat)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,25 g melkesyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 10

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin 2- hydroksybutandioat ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,37 g malinsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Krystallene ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 11

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin butandioat ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,32 g ravsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Produktet ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, noe som ga det forønskede produkt.

Eksempel 12

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin 2, 3- dihydroksybutandioat ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,41 g tartarsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Produktet ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket til det forønskede produkt.

Eksempel 13

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienvl)- 2- pyrimidinamin monoacetat

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,17 g eddiksyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Produktet ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, hvilket ga det forønskede produkt.

Eksempel 14

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-( 2- tienyl)- 2- pyrimidinamin monoqlukonat

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,54 g glukonsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Produktet ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, hvilket ga det forønskede produkt.

Eksempel 15

N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin-

forbindelse med L- askorbinsyre ( 1:1)

En oppløsning av 1,0 g N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]-fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin i 10 ml varm etylalkohol, ble tilsatt 5 ml etylalkohol inneholdende 0,48 g askorbinsyre. Det begynte å danne seg krystaller, og reaksjonsblandingen ble avkjølt. Produktet ble frafiltrert, vasket med etylalkohol og tørket, hvilket ga det forønskede produkt.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert vedat den er N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl) etoksy ] f enyl ] -4- (2-tienyl) -2-pyrimidinamin og dens farmako-logisk akseptable salter.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedat de akseptable salter er valgt fra gruppen bestående av sulfat, fosfat, hydroklorid, hydrobromid, sulfamat, maleat, laktat, malinat, succinat, tartrat, acetat, fumarat, glukonat og askorbat.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedå være N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin monohydrokloridsalt; N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin dihydrokloridsalt; N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin sulfat (1:1); N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin fosfat (1:1); N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin hydrobromid; N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin monosulfamat; N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin 2-butendioat (1:1); N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin mono(2-hydroksypropanoat); N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin 2-hydroksybutandioat (1:1); N-[3-[2-(LH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin butandioat (1:1); N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin 2,3-dihydroksybutandioat (1:1); N-[3-[2-(1H-imidazol-1-y1)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin monoacetat; N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin monoglukomat; N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinaminforbindelse med L-askorbinsyre (1:1) og N-[3-[2-(lH-imidazol-l-yl)etoksy]fenyl]-4-(2-tienyl)-2-pyrimidinamin.