NO20170381A1

NO20170381A1 - Forbindelser for Proteasom enzym-inhibering

Info

Publication number: NO20170381A1
Application number: NO20170381A
Authority: NO
Inventors: Mark S Smyth; Guy J Laidig
Original assignee: Onyx Therapeutics Inc
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2007-04-16
Also published as: HUS1600014I1; NO341015B1; SG155187A1; IL181127A; HUE038005T2; IL221572A0; US20060030533A1; ATE496062T1; US20190211058A1; IL181127A0; HK1103525A1; LT3101026T; US20050245435A1; US7232818B2; PL1781688T3; EP2266999B1; PT3101026T; HK1152716A1; CA2589765C; US20160222057A1

Description

FORBINDELSER FOR PROTEASOM ENZYM-INHIBERING

Relaterte søknader

Foreliggende søknad krever prioritet fra U.S. Provisional Application Serial nr. 60/599401 innlevert den 6. august, 2004 og U.S. Provisional Application Serial nr. 60/610001 innlevert den 14. september, 2004 og er en CIP av U.S. Patentsøknad nr. 11/106879 innlevert 14. april, 2005. Teoriene fra alle de omtalte søknadene er inntatt ved referanse i sin helhet.

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser og fremgangsmåter for enzymhemming. Spesielt angår oppfinnelsen terapeutiske metoder basert på enzymhemming.

Bakgrunn for oppfinnelsen

I eukaryoter blir nedbrytning av proteiner hovedsakelig mediert gjennom ubiquitin reaksjonsveien hvor proteiner målrettet for nebrytning blir ligert til polypeptidet ubiquitin som består av 76 aminosyrer. Så snart de er målrettet, tjener ubiquitinerte proteiner siden som substrater for 26S proteasomet, et multikatalytisk protease, som spalter proteiner til korte peptider gjennom virkningen av dens tre viktigste proteolytiske aktiviteter. Samtidig som den har en generell funksjon ved intracellulær proteinomsetning, har proteasom-mediert nedbrytning også en nøkkelrolle i mange prosesser slik som major histocompatibility complex (MHC) klasse I-presentasjon, apoptose, cellevekstregulering, NF-kB aktivering, antigen prosessering og transduksjon av proinflammatoriske signaler.

20 S proteasomet er et 700 kDa sylinderformet multikatalytisk proteasekompleks bestående av 28 subenheter organisert i fire ringer. I gjær og andre eukaryoter danner 7 forskjellige a-subenheter de ytre ringene og 7 forskjellige P-subenheter utgjør de indre ringene, a-subenhetene tjener som bindingsseter for de regulatoriske kompleksene 19S (PA700) og 11S (PA28), så vel som en fysisk barriere for det indre proteolytiske kammeret dannet av de to P subenhet-ringene. Følgelig er proteasomet, in vivo, antatt å eksistere som en 26S partikkel ("26S proteasomet"). In vivo-forsøk har vist at hemning av 20S-formen av proteasomet lett kan korreleres med hemning av 26S proteasomet. Kløyving av aminoterminale prosekvenser av P-subenheter under partikkeldannelse eksponerer aminoterminale treoninrester, som tjener som katalytiske nukleofiler. Subenhetene ansvarlig for katalytisk aktivitet i proteasomet har følgelig en aminoterminal nukleofil rest og disse subenhetene tilhører familien av N-terminale nukleofile (Ntn) hydrolaser (hvor den nukleofile N-terminale resten er for eksempel Cys, Ser, Thr og andre nukleofile grupper). Denne familien omfatter for eksempel penicillin G acylase (PGA), penicillin V acylase (PVA), glutamin PRPP amidotransferase (GAT) og bakteriell glykosylasparaginase. I tillegg til de ubiquitous uttrykte P-subenhetene, har høyere virveldyr også tre interferon-y-induserbare P-subenheter (LMP7, LMP2 og MECL1), som erstatter deres normale motstykker, X, Y og Z henholdsvis, og følgelig endrer de katalytiske aktivitetene av proteasomet. Gjennom anvendelse av forskjellige peptidsubstrater, har tre viktige proteolytiske aktiviteter blitt definert for det eukaryote 20S proteasomet: chymotrypsin-lignende aktivitet (CT-L), som spalter etter store hydrofobe rester; trypsin-lignende aktivitet (T-L), som spalter etter basiske rester; og peptidylglutamyl peptid hydrolyserende aktivitet (PGPH), som spalter etter sure rester. To ytterligere mindre karakteriserte aktiviteter har også blitt tilskrevet proteasomet: BrAAP-aktivitet, som spalter etter forgrenede aminosyrer; og SNAAP-aktivitet, som spalter etter små nøytrale aminosyrer. De viktigste proteolytiske aktivitetene av proteasom synes å komme fra forskjellige katalytiske seter, siden inhibitorer, punktmutasjoner i P-subenheter og veksling av y interferon-induserende P-subenheter endrer disse aktivitetene i forskjellig grad.

Det er mange eksempler på små molekyler som har blitt anvendt til å hemme proteasom-aktivitet; imidlertid mangler disse forbindelsene generelt spesifisiteten, stabiliteten eller potensen nødvendig for å utforske og utnytte proteasomets roller på cellulært og molekylært nivå. Derfor er syntese av småmolekyl inhibitor(er) med økt setespesifisitet, forbedret stabilitet og oppløselighet og økt potens nødvendig for å muliggjøre undersøkelse av proteasomets roller på cellulært og molekylært nivå.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen angår klasser av molekyler kjent som peptid <x',P'-epoksider og peptid <x',P'-aziridiner. De parentale molekylene er forstått å binde effektivt, irreversibelt og selektivt til N-terminale nukleofile (Ntn) hydrolaser og kan spesifikt hemme bestemte aktiviteter av enzymer som har multippel katalytisk aktivitet.

Mens det engang var antatt kun å avhende denaturerte og feilfoldete proteiner, er proteasomet nå kjent for å utgjøre proteolytisk maskineri som regulerer nivåene av ulike intracellulære proteiner gjennom deres nedbrytning på en signalavhengig måte. Følgelig er det stor interesse for identifikasjon av reagenser som spesifikt kan forstyrre aktivitetene av proteasomet og andre Ntn-hydrolaser og derved anvendes som prober for å undersøke rollen til disse enzymene i biologiske prosesser. Forbindelser som måler Ntn-hydrolasene er beskrevet, syntetisert og undersøkt heri. Peptid epoksider og peptid aziridiner som potent, selektivt og irreversibelt kan hemme bestemte proteasom-aktiviteter er beskrevet heri.

I motsetning til mange andre peptidbaserte inhibitorer, er peptid epoksidene og peptid aziridinene beskrevet her ikke forventet, i vesentlig grad, å hemme ikke-proteasomale proteaser slik som trypsin, chymotrypsin, cathepsin B, papain og calpain i konsentrasjoner opptil 50 uM. Ved høyere konsentrasjoner kan hemming observeres, men ville være forventet å være kompetitiv og ikke irreversibel, dersom inhibitoren bare konkurrerer med substratet. De nye peptid epoksidene og peptid aziridinene er også forventet å hemme NF-KB-aktivering og å stabilisere p53-nivåer i cellekultur. Videre ville disse forbindelsene være forventet å ha antiinflammatorisk aktivitet. Følgelig kan disse forbindelsene være unike molekylære prober, som har allsidigheten for undersøkelse av Ntn-enzym funksjon i normale biologiske og patologiske prosesser.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen inhibitorer omfattende en treleddet ring inneholdende heteroatom. Disse inhibitorene kan hemme katalytisk aktivitet av N-terminale nukleofile hydrolase enzymer (for eksempel 20S proteasomet eller 26S proteasomet) når nevnte inhibitor er til stede i konsentrasjoner under ca. 50 uM. Angående 20S proteasomet, hemmer bestemte hydrolase inhibitorer chymotrypsinlignende aktivitet av 20S-proteasomet når inhibitoren er til stede i konsentrasjoner under ca. 5 uM og hemmer ikke trypsinlignende aktivitet eller PGPH-aktivitet av 20S-proteasomet når den er til stede i konsentrasjoner under ca. 5 uM. Hydrolase inhibitoren kan for eksempel være et peptid a', P'-epoksy keton eller a',P'-aziridin keton og peptidet kan være et tetrapeptid. Peptidet kan omfatte forgrenede eller uforgrenede sidekjeder slik som hydrogen, Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl, Ci-6-aralkyl, Ci-6-alkylamid, Ci-6-alkylamin, Ci-6-karboksylsyre, Ci-6-karboksylester, Ci-6-alkyltiol eller Ci-6-alkyltioeter, for eksempel isobutyl, 1-naftyl, fenylmetyl og 2-fenyletyl. a'-karbonet av a',P'-epoksy ketonet eller a',P'-aziridin keton kan være et kiralt karbonatom, slik som et karbon med (R) eller P-konfigurasjon, som disse er definert her.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske blandinger, omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og en farmasøytisk effektiv mengde av hydrolase inhibitoren, som bedrer effektene av neurodegenerativ sykdom (slik som Alzheimers sykdom), muskelsvinnsykdommer, kreft, kroniske infeksiøse sykdommer, feber, muskel inaktivitet ("disuse"), denervering, nerveskade, faste og immunrelaterte tilstander, blant andre.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antiinflammatoriske blandinger.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for følgende: inhibering eller reduksjon av HIV infeksjon i et subjekt; påvirke nivået av viral genekspresjon i et subjekt; endre mangfoldet av antigene peptider produsert av proteasomet i en organisme; bestemme hvorvidt en cellulær, utviklingsmessig eller fysiologisk prosess eller ytelse i en organisme blir regulert av den proteolytiske aktiviteten av en bestemt Ntn hydrolase; behandle Alzheimers sykdom hos et subjekt; redusere hastigheten av nedbrytning av muskelprotein i en celle; redusere hastigheten av intracellulær proteindegradering i en celle; redusere hastigheten av p53 proteindegradering i en celle; hemme veksten av p53-relatert kreft hos et subjekt; hemme antigenpresentasjon i en celle; undertrykke immunsystemet hos et subjekt; hemme IkB-<x nedbrytning i en organisme; redusere innholdet av NF-kB i en celle, muskel, organ eller subjekt; påvirke cyklinavhengig eukaryot cellesyklus; behandle proliferativ sykdom hos et subjekt; påvirke proteasom-avhengig regulering av oncoproteiner i en celle; behandle kreftvekst i et subjekt; behandle p53-relatert apoptose hos et subjekt; og screening av proteiner prosessert av N-terminale nukleofile hydrolaser i en celle. Hver av disse fremgangsmåtene omfatter å administrere eller kontakte en effektiv mengde av en blanding omfattende hydrolase inhibitorene beskrevet her, til et subjekt, en celle, et vev, et organ eller en organisme.

Andre trekk og fordeler ifølge oppfinnelsen vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelsen og fra kravene.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen omfatter forbindelser anvendelige som enzyminhibitorer. Disse forbindelsene er generelt anvendelige for å hemme enzymer som har en nukleofil gruppe ved den N-terminale enden. For eksempel kan aktiviteter av enzymer eller subenheter av enzymer som har N-terminale aminosyrer med nukleofiler i deres sidekjeder, slik som treonin, serin eller cystein med godt resultat inhiberes av enzyminhibitorene beskrevet her. Aktiviteter av enzymer eller subenheter av enzymer som har ikke-aminosyre nukleofile grupper ved deres N-terminale ender, slik som for eksempel beskyttelsesgrupper eller karbohydrater, kan også med godt resultat inhiberes av enzyminhibitorene beskrevet her.

Uten å være bundet av noen som helst bestemt teori angående virkemåte, er det antatt at slike N-terminale nukleofiler av Ntn danner kovalente addukter med den funksjonelle epoksidgruppen av enzyminhibitorene beskrevet her. For eksempel er, i P5/Pre2 subenheten av 20S proteasomet, det N-terminale treoninet antatt å irreversibelt danne et morfolino eller piperazino addukt ved reaksjon med et peptid epoksid eller aziridin slik som de beskrevet nedenfor. Slik adduktdannelse ville omfatte ringåpning spalting av epoksidet eller aziridinet.

I utførelsesformer omfattende slike grupper bundet til <x'-karbonatomer, kan stereokjemien av a'-karbonet (det karbonet som danner en del av epoksid eller aziridin ringen) være (R) eller (S). Oppfinnelsen er basert, delvis, på struktur-funksjon informasjonen beskrevet her, som indikerer de følgende foretrukne stereokjemiske forhold. Legg merke til at en foretrukket forbindelse kan ha flere stereosentere som har det angitte opp-ned (eller P-a, hvor p som tegnet her er over planet for siden) eller (R)-(S) forholdet (det vil si at det er ikke nødvendig at hvert stereosenter i forbindelsen er i overensstemmelse med de angitte preferansene). I noen foretrukne utførelsesformer er stereokjemien av a' karbonet (R), dvs. X-atomet er P eller over planet av molekylet.

Angående stereokjemien, er Cahn-Ingold-Prelog reglene for å bestemme absolutt stereokjemi fulgt. Disse reglene er beskrevet, for eksempel i Organic Chemistry. Fox og Whitesell; Jones and Bartlett Publishers, Boston, MA (1994); Del 5-6, s 177-178, hvilken del herved inntas ved referanse. Peptider kan ha en repeterende struktur av ryggraden med sidekjeder som strekker seg ut fra enhetene i ryggraden. Generelt har hver enhet i ryggraden en sidekjede forbundet med den selv om sidekjeden, i noen tilfeller, er et hydrogenatom. I andre utførelsesformer har ikke hver enhet i ryggraden en assosiert sidekjede. Peptider anvendelige i peptid epoksider eller peptid aziridiner har to eller flere enheter i ryggraden. I noen utførelsesformer anvendelige for å hemme chymotrypsin-lignende (CT-L) aktivitet av proteasomet, er mellom to og åtte enheter i ryggrad til stede og i noen foretrukne utførelsesformer for CT-L-inhibering, er mellom to og seks enheter i ryggraden til stede.

Sidekj edene som strekker seg fra enhetene i ryggraden kan omfatte naturlige alifatiske eller aromatiske aminosyresidekjeder, slik som hydrogen (glysin), metyl (alanin), isopropyl (valin), sec- butyl (isoleucin), isobutyl (leucin), fenylmetyl (fenylalanin) og sidekjeden som inngår i aminosyren prolin. Sidekj edene kan også være andre forgrenede eller uforgrenede alifatiske eller aromatiske grupper slik som etyl, w-propyl, w-butyl, f-butyl og aryl-substituerte derivater slik som 1-fenyletyl, 2-fenyletyl, (l-naftyl)metyl, (2-naftyl)metyl, l-(l-naftyl)etyl, l-(2-naftyl)etyl, 2-(l-naftyl)etyl, 2-(2-naftyl)etyl og lignende forbindelser. Arylgruppene kan være ytterligere substituert med forgrenede eller uforgrenede Ci-6-alkylgrupper eller substituerte alkylgrupper, acetyl og lignende eller ytterligere arylgrupper eller substituerte arylgrupper, slik som benzoyl og lignende. Heteroarylgrupper kan også anvendes som sidekj ede-substituenter. Heteroarylgrupper omfatter nitrogen-, oksygen- og svovel- inneholdende arylgrupper slik som tienyl, benzotienyl, naftotienyl, tiantrenyl, furyl, pyranyl, isobenzofuranyl, kromenyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, pyridyl, pyrazinyl, indolyl, purinyl, kinolyl og lignende.

I noen utførelsesformer kan polare eller ladede rester innføres i peptid epoksidene eller peptid aziridinene. For eksempel kan naturlig forekommende aminosyrer slik som hydroksy-inneholdende (Thr, Tyr, Ser) eller svovel-inneholdende (Met, Cys) innføres, så vel som ikke-essensielle aminosyrer, for eksempel taurin, karnitin, citrullin, cystin, ornitin, norleucin og andre. Ikke-naturlig forekommende sidekjede substituenter med ladede eller polare grupper kan også være omfattet, slik som for eksempel Ci-6-alkylkjeder eller C6-i2-arylgrupper med én eller flere hydroksy, kort kjede alkoksy, sulfid, tio, karboksyl, ester, fosfo, amido eller aminogrupper eller slike substituenter substituert med ett eller flere halogenatomer. I noen foretrukne utførelsesformer er det minst én arylgruppe til stede i en sidekjede av peptidgruppen.

I noen utførelsesformer er enhetene i ryggraden amid enheter [-NH-CHR-C(=0)-], hvor R er sidekjeden. En slik angivelse utelukker ikke den naturlig forekommende aminosyren prolin eller andre ikke-naturlig forekommende sykliske sekundære aminosyrer, hvilket vil være kjent for fagfolk på området.

I andre utførelsesformer er enhetene i ryggraden N-alkylerte amid enheter (for eksempel N-metyl og lignende), olefiniske analoger (hvor én eller flere amidbindinger er erstattet av olefiniske bindinger), tetrazol analoger (hvor en tetrazol-ring påtvinger en cis-konfigurasjon på ryggraden) eller kombinasjoner av slike ryggrad-bindinger. I enda andre utførelsesformer blir aminosyre a-karbonet modifisert ved a-alkyl substitusjon, for eksempel aminoisosmørsyre. I noen ytterligere utførelsesformer blir sidekj eder lokalt modifisert, for eksempel ved ÅE eller ÅZ dehydro modifikasjon, hvor en dobbeltbinding er til stede mellom a og P-atomene i sidekjeden eller for eksempel ved AE eller AZ cyklopropyl modifikasjon, hvor en cyklopropylgruppe er til stede mellom a og P-atomene av sidekjeden. I enda ytterligere utførelsesformer hvor det anvendes aminosyregrupper, kan D-aminosyrer anvendes. Ytterligere utførelsesformer kan omfatte sidekj ede-til-ryggrad syklisering, dannelse av disulfidbinding, dannelse av laktam, azo binding og andre modifikasjoner beskrevet i "Peptides and Mimics, Design of Conformationally Constrained" ved Hruby og Boteju, i "Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference", ed. Robert A. Meyers, VCH Publishers (1995), s. 658-664, som herved inntas ved referanse.

I visse utførelsesformer har de foreliggende forbindelsene en struktur med formel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvor

L er fraværende eller er valgt fra -CO2eller -C(=S)0;

X er O, NH eller N-alkyl, fortrinnsvis O;

Y er NH, N-alkyl, O eller C(R<9>)2, fortrinnsvis N-alkyl, O eller C(R<9>)2;

Z er O eller C(R<9>)2, fortrinnsvis C(R<9>)2;

R<1>,R2,R<3>og R<4>uavhengig er valgt fra hydrogen og en gruppe med formel II, fortrinnsvis erR<1>,R<2>, R3 og R<4>alle like, mer foretrukket er R<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle hydrogen;

hver R<5>, R<6>, R7,R8ogR<9>uavhengig er valgt fra hydrogen, Ci-6-alkyl, C1-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl og Ci-6-aralkyl som hver eventuelt er substituert med en gruppe valgt fra alkyl, amid, amin, karboksylsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karboksylester, tiol og tioeter, fortrinnsvis er R<5>, R<6>, R<7>og R<8>uavhengig valgt fra C1-6-alkyl, C1-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl og hver R<9>er hydrogen, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl,R<5>og R<7>er uavhengig Ci-6-aralkyl og hver R<9>er H;

R10og R<11>uavhengig er valgt fra hydrogen og Ci-6-alkyl eller R<10>og R<11>sammen danner en 3- til 6-leddet karbosyklisk eller heterosyklisk ring;

R<12>og R<13>uavhengig er valgt fra hydrogen, et metallkation, Ci-6-alkyl og Ci-6-aralkyl ellerR12og R<13>sammen representerer Ci-6-alkyl, og danner derved en ring;

m er et helt tall fra 0 til 2; og

n er et helt tall fra 0 til 2, foretrukket 0 eller 1.

I visse utførelsesformer er X O ogR<1>,R<2>,R<3>ogR<4>er alle like, foretrukket er R<1>, R<2>,R<3>og R<4>alle hydrogen. I visse slike utførelsesformer, erR<5>,R6,R<7>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, C1-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig C1-6-alkyl ogR<5>og R<7>er uavhengig Ci-6-aralkyl.

I visse foretrukne utførelsesformer er X O, R<1>,R<2>,R<3>ogR<4>er alle hydrogen, R<6>ogR<8>er begge isobutyl, R<5>er fenyletyl og R<7>er fenylmetyl.

I visse utførelsesformer erR<5>,R6,R<7>ogR<8>uavhengig valgt fra hydrogen, Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl og Ci-6-aralkyl som hver eventuelt er substituert med en gruppe valgt fra alkyl, amid, amin, karboksylsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karboksylester, tiol og tioeter. I visse utførelsesformer er minst én av R<5>og R<7>Ci-6-aralkyl substituert med alkyl, mer foretrukket substituert med perhalogenalkyl. I visse slike utførelsesformer er R<7>Ci-6-aralkyl substituert med trifluormetyl.

I visse utførelsesformer er Y valgt fra N-alkyl, O og CH2.1 visse slike utførelsesformer er Z CH2og m og n er begge 0.1 visse alternative slike utførelsesformer er Z CH-2, m er 0 og n er 2 eller 3.1 enda en annen alternativ slik utførelsesform er Z O, m er 1 og n er 2.

I visse utførelsesformer er en forbindelse med formel I valgt fra

og I visse utførelsesformer har de foreliggende forbindelsene en struktur med formel HI eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvor X er O, NH eller N-alkyl, fortrinnsvis O;

R<1>, R<2>, R<3>og R<4>uavhengig er valgt fra hydrogen og en gruppe med formel II, fortrinnsvis erR<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle like, mer foretrukket er R<1>,R<2>,R3 ogR<4>alle hydrogen; og

R<5>,R6, R<7>og R<8>uavhengig er valgt fra hydrogen, Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl og Ci-6-aralkyl som hver eventuelt er substituert med en gruppe valgt fra

amid, amin, karboksylsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karboksylester, tiol og tioeter, fortrinnsvis erR<5>,R<6>,R<7>ogR<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl ogR<5>og R<7>er uavhengig Ci-6-aralkyl.

I visse utførelsesformer er X O ogR<1>,R2,R<3>og R<4>er alle like, fortrinnsvis er R<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle hydrogen. I visse slike utførelsesformer erR<5>,R6,R<7>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl ogR<5>og R<7>er uavhengig Ci-6-aralkyl.

I visse foretrukne utførelsesformer er X O, R<1>,R<2>,R<3>ogR<4>er alle hydrogen,R<6>ogR<8>er begge isobutyl, R<5>er fenyletyl og R<7>er fenylmetyl.

I visse utførelsesformer har en forbindelse med formel in følgende stereokjemi:

I foretrukne utførelsesformer har forbindelsen en struktur med formel IV eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvor

X er O, NH eller N-alkyl, fortrinnsvis O;

R<1>,R<2>,R<3>og R<4>uavhengig er valgt fra hydrogen og en gruppe med formel TJ, fortrinnsvis erR<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle like, mer foretrukket er R<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle hydrogen; og

R<6>og R<8>uavhengig er valgt fra hydrogen, Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl og Ci-6-aralkyl som hver eventuelt er substituert med en gruppe valgt fra amid, amin, karboksylsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karboksylester, tiol og tioeter, fortrinnsvis er R<6>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl.

I visse utførelsesformer er X O og R<1>, R<2>,R<3>ogR<4>er alle like, fortrinnsvis er R<1>, R<2>, R<3>og R<4>alle hydrogen. I visse slike utførelsesformer er R<6>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl.

I visse foretrukne utførelsesformer er X O, R<1>,R<2>,R<3>ogR<4>er alle hydrogen og R<6>og R<8>er begge isobutyl.

I visse utførelsesformer har en forbindelse med formel Ul følgende struktur:

I visse utførelsesformer har forbindelsene en struktur med formel V eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav

hvor

X er O, NH eller N-alkyl, fortrinnsvis 0;

R<1>,R<2>,R<3>og R<4>uavhengig er valgt fra hydrogen og en gruppe med formel TJ, fortrinnsvis erR<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle like, mer foretrukket er R<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle hydrogen;

R<5>,R<6>,R<7>og R<8>uavhengig er valgt fra hydrogen, Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl og Ci-6-aralkyl som hver eventuelt er substituert med en gruppe valgt fra amid, amin, karboksylsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karboksylester, tiol og tioeter, foretrukket er R<5>, R<6>, R<7>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl ogR5 og R<7>er uavhengig Ci-6-aralkyl; og

q er et helt tall fra 0 til 3.

I foretrukne utførelsesformer har forbindelsen en struktur med formel VI eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

hvor

X er O, NH eller N-alkyl, fortrinnsvis O;

R<1>,R2,R<3>og R<4>uavhengig er valgt fra hydrogen og en gruppe med formel n, foretrukket erR<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle like, mer foretrukket er R<1>,R<2>,R<3>og R<4>alle hydrogen;

R<6>og R<8>uavhengig er valgt fra hydrogen, Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl, Ci-6-alkoksyalkyl, aryl og Ci-6-aralkyl som hver eventuelt er substituert med en gruppe valgt fra amid, amin, karboksylsyre eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karboksylester, tiol og tioeter, foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl; og

q er et helt tall fra 0 til 3.

I visse utførelsesformer er X O ogR<1>,R<2>,R<3>ogR<4>er alle like, foretrukket er R<1>, R<2>, R<3>og R<4>alle hydrogen. I visse slike utførelsesformer er R<6>og R<8>uavhengig valgt fra Ci-6-alkyl, Ci-6hydroksyalkyl og Ci-6-aralkyl, mer foretrukket er R<6>og R<8>uavhengig Ci-6-alkyl.

I visse foretrukne utførelsesformer er X O,R<1>,R<2>,R<3>ogR<4>er alle hydrogen og R<6>og R<8>er begge isobutyl.

I visse utførelsesformer er en forbindelse med formel VI valgt fra

Ett aspekt ifølge oppfinnelsen angår en medisinsk anordning omfattende blanding beskrevet her som omfatter en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller Ul-VI. I én utførelsesform blir blandingen inkorporert i en medisinsk anordning. I visse utførelsesformer er den medisinske anordningen en gel omfattende en polymermatriks eller keramisk matriks og en inhibitor. Nevnte polymer kan være enten naturlig forekommende eller syntetisk. I en annen utførelsesform tjener nevnte gel som et medikamentdepot, et adhesiv, en sutur, en barriere eller et tetningsmiddel.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen angår en medisinsk anordning omfattende et substrat som har en overflate på hvilken en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller Ul-VI er plassert. I én utførelsesform er inhibitoren direkte anordnet på en medisinsk anordning. I en annen utførelsesform er et belegg anordnet slik, hvor belegget omfatter en polymermatriks eller keramisk matriks med en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller Ul-VI dispergert eller oppløst deri.

I én utførelsesform er den medisinske anordningen et koronar, vaskulært, perifert eller gallestent. Nærmere bestemt er stentet ifølge foreliggende oppfinnelse et ekspanderbart stent. Når det er belagt med en matriks inneholdende en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller Ul-VI, er matriksen fleksibel til å tilpasses sammenpressede og utvidede tilstander av et slikt ekspanderbart stent. I en annen utførelsesform av oppfinnelsen har stentet minst en del som er inserterbar eller implanterbar inn i kroppen til en pasient, hvor delen har en overflate som er tilpasset for eksponering for kroppsvev og hvor minst en del av overflaten er belagt med en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller III-VI, eller et belegg omfattende en matriks som har en inhibitor med en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller Ul-VI er dispergert eller oppløst deri. Et eksempel på et egnet stent er beskrevet i U.S. Pat. nr. 4,733,665, som er inntatt her ved referanse i sin helhet.

I en annen utførelsesform er den medisinske anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse et kirurgisk verktøy slik som et vaskulært implantat, en intraluminal anordning, kirurgisk tetningsmiddel eller en vaskulær støtte. Nærmere bestemt er den medisinske anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse et kateter, en implanterbar vaskulær tilgangsventil, et sentralt venøst kateter, et arterielt kateter, et vaskulært transplantat, en intraaortisk ballongpumpe, en sutur, en ventrikkel hjelpepumpe, en medikament-eluerende barriere, et adhesiv, en vaskulær innpakning, en ekstra/perivaskulær support, et blodfilter eller et filter tilpasset for anvendelse i et blodkar, belagt med en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller Ul-VI enten direkte eller ved en matriks inneholdende en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller III-VI.

I visse utførelsesformer er den intraluminale medisinske anordningen belagt med en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller III-VI eller et belegg omfattende biologisk tolerert matriks og en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller III-VI dispergert i polymeren, hvor nevnte anordning har en innvendig overflate og en utvendig overflate, hvor belegget er påført på minst en del av den innvendige overflaten, den utvendige overflaten eller begge.

I visse utførelsesformer kan den medisinske anordningen være anvendelig for å forhindre restenose etter angioplasti. Den medisinske anordningen kan også være anvendelig for behandling av forskjellige sykdommer og lidelser ved å tilveiebringe lokalisert administrering av en inhibitor som har en struktur ifølge hvilke som helst av formlene I eller HI-VI. Slike sykdommer og lidelser omfatter restenose, inflammasjon, revmatoid artritt, vevskade på grunn av inflammasjon, hyperproliferative sykdommer, alvorlig eller artritisk psoriasis, muskelsvinnsykdommer, kronisk infeksiøse sykdommer, unormal immunrespons, lidelser som omfatter vulnerable plakk, skader relatert til iskemiske tilstander og viral infeksjon og proliferasjon. Eksempler på sykdommer og lidelser som blir underlagt en behandling omfattende de medikamentbelagte medisinske anordningene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter aterosklerose, akutt koronar syndrom, Alzheimers sykdom, kreft, feber, muskel "disuse" (atrofi), denervering, vaskulær okklusjon, slag, HTV-infeksjon, nerveskade, nyresvikt forbundet med acidose og hepatisk svikt. Se, f.eks. Goldberg, US-patent nr. 5,340,736.

Betegnelsen "Cx-y-alkyl" refererer til substituerte eller usubstituerte mettede hydrokarbongrupper, omfattende rettkjedet alkyl og forgrenede alkylgrupper som inneholder fra x til y karbonatomer i kjeden, omfattende halogenalkylgrupper slik som trifluormetyl og 2,2,2-trifluoretyl, osv. Co-alkyl indikerer et hydrogen hvor gruppen er i en terminal stilling, en binding dersom indre. Betegnelsene "C2-y-alkenyl" og "C2-y-alkynyl" refererer til substituerte eller usubstituerte umettede alifatiske grupper analoge i lengde og mulig substitusjon med alkylene beskrevet ovenfor, men som inneholder minst én dobbelt eller trippelbinding henholdsvis.

Betegnelsen "alkoksy" refererer til en alkylgruppe som har et oksygen tilknyttet dertil. Representative alkoksygrupper omfatter metoksy, etoksy, propoksy, tert-butoksy og lignende. En "eter" er to hydrokarboner kovalent bundet av et oksygen. Følgelig, substituenten av et alkyl som gjør dette alkyl til en eter er eller ligner en alkoksy.

Betegnelsen "Ci-6-alkoksyalkyl" refererer til en Ci-6-alkylgruppe substituert med en alkoksygruppe, for derved å danne en eter.

Betegnelsen "Ci-6-aralkyl", som anvendt her, referer til en Ci-6-alkylgruppe substituert med en arylgruppe.

Betegnelsene "amin" og "amino" er kjent på området og refererer til både usubstituerte og substituerte aminer og salter derav, f. eks. en gruppe som kan representeres ved den generelle formelen:

hvor R9,R10og R10 hver uavhengig representerer et hydrogen, en alkyl, en alkenyl, -(CH2)m-R<8>eller R<9>og R<10>tatt sammen med N-atomet som de er bundet til kompletterer en heterosyklisk gruppe som har fra 4 til 8 atomer i ringstrukturen; R<8>representerer en aryl, et sykloalkyl, et sykloalkenyl, en heterocyklyl eller en polycyklyl; og m er null eller et helt tall fra 1 til 8.1 foretrukne utførelsesformer kan kun én av R<9>eller R<10>være et karbonyl, feks. R<9>, R<10>og nitrogenet sammen danner ikke en imid. I enda mer foretrukne utførelsesformer representerer R<9>og R<10>(og eventuelt R<10>') hver uavhengig et hydrogen, en alkyl, en alkenyl eller -(CH2)m-R<8>.1 visse utførelsesformer er aminogruppen basisk, hvilket betyr at den protonerte formen har en pKa> 7,00.

Betegnelsene "amid" og "amido" er kjent på området som et amino-substituert karbonyl og omfatter en gruppe som kan representeres ved den generelle formelen:

hvor Ry, R1U er som definert ovenfor. Foretrukne utførelsesformer av amidet vil ikke omfatte imider som kan være ustabile.

Betegnelsen "aryl" som anvendt her omfatter 5-, 6- og 7-leddete substituerte eller usubstituerte enkelt-ring aromatiske grupper hvor hvert atom i ringen er karbon. Betegnelsen "aryl" omfatter også polysykliske ringsystemer som har to eller flere sykliske ringer hvor to eller flere karbonatomer er felles for to tilstøtende ringer hvor minst én av ringene er aromatisk, f. eks. kan de andre sykliske ringene være sykloalkyl, sykloalkenyl, sykloalkynyl, aryler, heteroaryler og/eller heterosyklyl. Arylgrupper omfatter benzen, naftalen, fenantren, fenol, anilin og lignende.

Betegnelsene "karbosyklisk" og "karbosyklyl", som anvendt her, refererer til en ikke-aromatisk substituert eller usubstituert ring hvor hvert atom i ringen er karbon. Betegnelsene "karbosyklisk" og "karbosyklyl" omfatter også polysykliske ringsystemer med to eller flere sykliske ringer hvor to eller flere karbonatomer er felles for to tilstøtende ringer hvor minst én av ringene er karbosyklisk, f. eks. kan de andre sykliske ringene være sykloalkyl, sykloalkenyl, sykloalkynyl, aryl, heteroaryl og/eller heterosyklyl.

Betegnelsen "karbonyl" er kjent på området og omfatter slike grupper som kan representeres ved den generelle formelen:

hvor X er en binding eller representerer et oksygen eller en svovel og R<11>representerer et hydrogen, en alkyl, en alkenyl, -(CH-2)m-R8 eller et farmasøytisk akseptabelt salt, R<11>representerer et hydrogen, en alkyl, en alkenyl eller -(CH.2)m-R8, hvor m og R<8>er som definert ovenfor. Når X er et oksygen og R<11>eller R11 ikke er hydrogen, representerer formelen en "ester". Når X er et oksygen og R<11>er et hydrogen, representerer formelen en "karboksylsyre".

Som anvendt her kan "enzym" være hvilket som helst delvis eller fullstendig proteinaktig molekyl som utfører en kjemisk reaksjon på en katalytisk måte. Slike enzymer kan være native enzymer, fusjonsenzymer, proenzymer, apoenzymer, denaturerte enzymer, farnesylerte enzymer, ubiquitinerte enzymer, fett acylerte enzymer, "gerangeranylated" enzymer, GPI-bundne enzymer, lipid-bundne enzymer, prenylerte enzymer, naturlig forekommende eller kunstig dannede mutante enzymer, enzymer med modifikasjoner i sidekjede eller ryggrad, enzymer som har ledersekvenser og enzymer kompleksert med ikke-proteinaktig materiale, slik som proteoglykaner, proteoliposomer. Enzymer kan fremstilles ved hvilke som helst metoder, omfattende naturlig ekspresjon, fremmet ekspresjon, kloning, forskjellige løsningsbaserte og fast stoff-baserte peptidsynteser og lignende metoder kjent for fagfolk på området.

Betegnelsen "Ci-6hetero-aralkyl", som anvendt her, refererer til en Ci-6-alkylgruppe substituert med en heteroarylgruppe.

Betegnelsene "heteroaryl" omfatter substituerte eller usubstituerte aromatiske 5- til 7-leddete ringstrukturer, mer foretrukket 5- til 6-leddet ringer, hvis ringstrukturer omfatter én til fire heteroatomer. Betegnelsen "heteroaryl" omfatter også polysykliske ringsystemer som har to eller flere sykliske ringer hvor to eller flere karbonatomer er felles for to tilstøtende ringer hvor minst én av ringene er heteroaromatisk, f.eks. kan de andre sykliske ringene være sykloalkyl, sykloalkenyl, sykloalkynyl, aryl, heteroaryl og/eller heterosyklyl. Heteroarylgrupper omfatter for eksempel pyrrol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, triazol, pyrazol, pyridin, pyrazin, pyridazin og pyrimidin og lignende.

Betegnelsen "heteroatom" som anvendt her betyr et atom av hvilket som helst element forskjellig fra karbon eller hydrogen. Foretrukne heteroatomer er nitrogen, oksygen, fosfor og svovel.

Betegnelsene "heterosyklyl" eller "heterosyklisk gruppe" refererer til substituerte eller usubstituerte ikke-aromatiske 3- til 10-leddete ringstrukturer, mer foretrukket 3- til 7-leddete ringer, hvis ringstrukturer omfatter én til fire heteroatomer. Betegnelsen "heterosyklyl" eller "heterosyklisk gruppe" omfatter også polysykliske ringsystemer som har to eller flere sykliske ringer hvor to eller flere karbonatomer er felles for to tilstøtende ringer hvor minst én av ringene er heterosyklisk, f.eks. kan de andre sykliske ringene være sykloalkyl, sykloalkenyl, sykloalkynyl, aryl, heteroaryl og/eller heterosyklyl. Heterosyklylgrupper omfatter for eksempel piperidin, piperazin, pyrrolidin, morfolin, laktoner, laktamer og lignende.

Betegnelsen "Ci-6hydroksyalkyl" refererer til en Ci-6-alkylgruppe substituert med en hydroksygruppe.

Som anvendt her er betegnelsen "inhibitor" ment å beskrive en forbindelse som blokkerer eller reduserer en aktivitet av et enzym (for eksempel hemming av proteolytisk kløyving av standard fluorogene peptidsubstrater slik som suc-LLVY-AMC, Box-LLR-AMC og Z-LLE-AMC, hemming av forskjellige katalytiske aktiviteter av 20S-proteasomet). En inhibitor kan virke med kompetitiv, unkompetitiv eller nonkompetitiv hemming. En inhibitor kan binde reversibelt eller irreversibelt og betegnelsen omfatter derfor forbindelser som er selvmords ("suicid")-substrater" for et enzym. En inhibitor kan modifisere ett eller flere seter i eller nær det aktive setet for enzymet eller det kan bevirke en konformasjonell endring andre steder på enzymet.

Som anvendt her omfatter betegnelsen "peptid" ikke bare standard amidbinding med standard a-substituenter, men vanlig anvendte peptidomimetika, andre modifiserte bindinger, ikke-naturlig forekommende sidekj eder og sidekj ede-modifikasj oner, som beskrevet i detalj nedenfor.

Betegnelsene "polysyklyl" eller "polysyklisk" refererer til to eller flere ringer (f. eks. sykloalkyl, sykloalkenyl, sykloalkynyl, aryl, heteroaryl og/eller heterosyklyl) hvor to eller flere karbonatomer er felles for to tilstøtende ringer, feks. er ringene "kondenserte ringer". Hver av ringene i den polysykliske ringen kan være substituerte eller usubstituerte.

Betegnelsen "forebygging" er kjent på området og når den anvendes i forbindelse med en tilstand, for eksempel en lokal tilbakekomst (feks. smerte), en sykdom slik som kreft, et syndromkompleks slik som hjertesvikt eller hvilken som helst annen medisinsk tilstand, er velkjent på området og omfatter administrering av en blanding som reduserer frekvensen av eller forsinker oppstart av, symptomer på en medisinsk tilstand hos et subjekt relativt til et subjekt som ikke mottar blandingen. Følgelig omfatter forebygging av kreft for eksempel å redusere mengden av detekterbar kankrøs vekst i en populasjon av pasienter som mottar en profylaktisk behandling relativt til en ubehandlet kontrollpopulasjon og/eller forsinke opptreden av detekterbar kankrøs vekst i en behandlet populasjon versus en ubehandlet kontroll-populasjon, feks. med en statistisk og/eller klinisk signifikant mengde. Forebygging av en infeksjon omfatter for eksempel å redusere antallet diagnoser av infeksjonen i en behandlet populasjon versus en ubehandlet kontroll-populasjon og/eller forsinke oppstart av symptomer på infeksjonen i en behandlet populasjon versus en ubehandlet kontroll-populasjon. Forebygging av smerte omfatter for eksempel å redusere størrelsen av eller alternativt forsinke, smertefornemmelser erfart av subjekter i en behandlet populasjon versus en ubehandlet kontrollpopulasjon.

Betegnelsen "prodroge" omfatter forbindelser som, under fysiologiske betingelser, blir omdannet til terapeutisk aktive midler. En vanlig metode for fremstilling av en prodroge er å inkludere valgte grupper som blir hydrolysert under fysiologiske betingelser for å avsløre det ønskede molekylet. I andre utførelsesformer blir prodrogen omdannet ved en enzymatisk aktivitet hos vertsdyret.

Betegnelsen "profylaktisk eller terapeutisk" behandling er kjent på området og omfatter å administrere til verten én eller flere av de foreliggende blandingene. Hvis den blir administrert før klinisk manifestasjon av den uønskede tilstanden (feks. sykdom eller andre uønskede tilstander hos vertsdyret) så er behandlingen profylaktisk, (dvs. den beskytter verten mot utvikling av den uønskede tilstanden), mens dersom den administreres etter manifestasjon av den uønskede tilstanden, er behandlingen terapeutisk, (dvs. den skal redusere, forbedre eller stabilisere den eksisterende uønskede tilstanden eller bivirkninger derav).

Betegnelsen "proteasom" som anvendt her skal omfatte immuno- og konstitutive proteasomer.

Betegnelsen "substituert" refererer til grupper som har substituenter som erstatter et hydrogen på ett eller flere karbonatomer i ryggraden. Det vil forstås at "substitusjon" eller "substituert med" omfatter det underforståtte forbehold at slik substitusjon er i henhold til tillatt valens av det substituerte atomet og substituenten og at substitusjonen resulterer i en stabil forbindelse, feks. som ikke spontant gjennomgår transformasjon for eksempel ved omleiring, syklisering, eliminering, osv. Som anvendt her er betegnelsen "substituert" ment å omfatte alle tillatte substituenter for organiske forbindelser. I et bredt aspekt omfatter de tillatte substituentene asykliske og sykliske, forgrenede og uforgrenede, karbosykliske og heterosykliske, aromatiske og ikke-aromatiske substituenter av organiske forbindelser. De tillatte substituentene kan være én eller flere og like eller forskjellige for passende organiske forbindelser. For formål ifølge foreliggende oppfinnelse kan heteroatomene slik som nitrogen ha hydrogen-substituenter og/eller hvilke som helst tillatte substituenter av organiske forbindelser beskrevet her som tilfredsstiller valensene for heteroatomene. Substituenter kan for eksempel omfatte et halogen, et hydroksyl, et karbonyl (slik som et karboksyl, en alkoksykarbonyl, et formyl eller en acyl), et tiokarbonyl (slik som en tioester, et tioacetat eller et tioformat), en alkoksyl, et fosforyl, et fosfat, et fosfonat, et fosfinat, et amino, et amido, et amidin, en imin, et cyano, en nitro, en azido, et sulfhydryl, en alkyltio, et sulfat, et sulfonat, et sulfamoyl, et sulfonamido, et sulfonyl, en heterosyklyl, en aralkyl eller en aromatisk eller heteroaromatisk gruppe. Det vil forstås av fagfolk på området at gruppene substituert på hydrokarbonkjeden selv kan være substituerte, dersom passende.

En "terapeutisk effektiv mengde" av en forbindelse med hensyn til den aktuelle behandlingsmetoden, refererer til en mengde av forbindelsen(e) i en blanding som, når administrert som del av et ønsket doseregime (til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske) lindrer et symptom, forbedrer en tilstand eller saktner oppstart av sykdomstilstander i henhold til klinisk akseptable standarder for lidelsen eller tilstanden som skal behandles eller det kosmetiske formålet, feks. ved et rimelig nytte/risiko-forhold anvendbart for hvilken som helst medisinsk behandling.

Betegnelsen "tioeter" refererer til en alkylgruppe, som definert ovenfor, som har en svovelgruppe tilknyttet dertil. I foretrukne utførelsesformer er "tioeteren" representert ved -S-alkyl. Representative tioetergrupper omfatter metyltio, etyltio og lignende.

Som anvendt her omfatter betegnelsen "behandle" eller "behandling" å reversere, redusere eller stanse symptomene, kliniske tegn og underliggende patologi for en tilstand på en måte for å forbedre eller stabilisere et subjekts tilstand.

Selektivitet for 20S proteasom

Enzyminhibitorene beskrevet her er anvendelige delvis fordi de hemmer virkningen av 20S-proteasomet. I tillegg er forbindelsene beskrevet her, i motsetning til andre 20S proteasom inhibitorer, svært selektive mot 20S-proteasomet, med hensyn til andre protease enzymer. Det vil si at foreliggende forbindelser oppviser selektiviteter for 20S proteasomet fremfor andre proteaser slik som cathepsiner, calpainer, papain, chymotrypsin, trypsin, tripeptidyl pepsidase II. Selektivitetene for enzyminhibitorene for 20S proteasom er slik at enzyminhibitorene i konsentrasjoner under ca. 50 uM, oppviser hemming av den katalytiske aktiviteten av 20S proteasomet, mens den ikke oppviser hemming av den katalytiske aktiviteten av andre proteaser slik som cathepsiner, calpainer, papain, chymotrypsin, trypsin, tripeptidyl pepsidase II. I foretrukne utførelsesformer oppviser enzyminhibitorene hemming av den katalytiske aktiviteten av 20S proteasomet i konsentrasjoner under ca. 10 uM, mens de ikke oppviser hemming av den katalytiske aktiviteten av andre proteaser ved disse konsentrasjonene. I enda mer foretrukne utførelsesformer, oppviser enzyminhibitorene hemming av den katalytiske aktiviteten av 20S proteasomet i konsentrasjoner under ca. 1 \ iM, mens de ikke oppviser hemming av den katalytiske aktiviteten av andre proteaser ved disse konsentrasjonene. Enzymkinetikk-analyser er beskrevet i U.S. application serial number 09/569748, Eksempel 2 og Stein et al., Biochem. (1996), 35, 3899-3908.

Selektivitet for chymotrypsin- lignende aktivitet

Spesielle utførelsesformer av de enzymhemmende forbindelsene beskrevet her er videre anvendelige fordi de effektivt og selektivt kan hemme den chymotrypsin-lignende aktiviteten av 20S proteasomet, sammenlignet med de trypsinlignende og PGPH-aktivitetene. Den chymotrypsin-lignende aktiviteten av 20S proteasomet karakteriseres ved spaltning av peptider i umiddelbar nærhet av store hydrofobe rester. Spesielt kan den chymotrypsin-lignende aktiviteten av Ntn hydrolaser bestemmes ved spaltning av et standardsubstrat. Eksempler på slike substrater er kjent på området. For eksempel kan et leucylvalinyltyrosin-derivat anvendes. Enzymkinetikk-analyser er beskrevet i U.S. application serial number 09/569748, Eksempel 2 og Stein et al., Biochem. (1996), 35, 3899-3908.

Anvendelser av enzyminhibitorer

De biologiske konsekvensene av proteasom inhibering er tallrike. På cellulært nivå har akkumulering av poly-ubiquitinerte proteiner, cellemorfologiske endringer og apoptose blitt rapportert etter behandling av celler med forskjellige proteasom inhibitorer. Proteasom inhibering har også blitt foreslått som en mulig terapeutisk antitumor strategi. Det faktum at epoxomicin initielt ble identifisert ved en screening for antitumor forbindelser validerer proteasomet som et antitumor kjemoterapeutisk mål. Følgelig er disse forbindelsene anvendelige for behandling av kreft. Proteasom inhibering har også blitt forbundet med hemming av NF-kB aktivering og stabilisering av p53 nivåer. Følgelig kan forbindelser ifølge oppfinnelsen også anvendes for å hemme NF-kB aktivering og stabilisere p53-nivåer i cellekultur. Siden NF-kB er en viktig regulator for inflammasjon, er den et attraktivt mål for antiinflammatorisk terapeutisk intervensjon. Følgelig kan forbindelser ifølge oppfinnelsen være anvendelige for behandling av lidelser forbundet med kronisk inflammasjon, omfattende, men ikke begrenset til KOLS, psoriasis, bronkitt, emfysem og cystisk fibrose.

De beskrevne forbindelsene kan anvendes for å behandle lidelser mediert direkte ved den proteolytiske funksjonen av proteasomet slik som muskelsvinn eller mediert indirekte via proteiner som prosesseres ved proteasomet slik som NF-kB. Proteasomet deltar i den hurtige elimineringen og post-translasjonelle prosesseringen av proteiner (feks. enzymer) involvert i celleregulering (feks. cellecyklus, gentranskripsjon og metabolske reaksjonsveier), intercellulær kommunikasjon og immunresponsen (feks. antigenpresentasjon). Spesifikke eksempler beskrevet nedenfor omfatter fJ-amyloid protein og regulatoriske proteiner slik som cykliner, TGF-P og transkripsjonsfaktor NF-kB.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er anvendelse av forbindelsene beskrevet her for behandling av neurodegenerative sykdommer og lidelser, omfattende, men ikke begrenset til, slag, iskemisk skade på nervesystemet, nervetraume (feks. percussiv hjerneskade, ryggmargskade og traumatisk skade på nervesystemet), multippel sklerose og andre immunmedierte nevropatier (feks. Guillain-Barrés syndrom og dens varianter, akutt motor akson nevropati, akutt inflammatorisk demyeliniserende polynevropati og Fishers syndrom), HIV/AIDS demenskompleks, axonomy, diabetisk nevropati, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, multippel sklerose, bakteriell, parasittisk, fungal og viral meningitt, encefalitt, vaskulær demens, multi-infarkt-demens, diffus kortikal Lewy-klump-sykdom, frontallappdemens slik som Picks sykdom, subkortikal demens (slik som Huntington eller progressiv supranukleær parese), fokal kortikal atrofi syndromer (slik som primær afasi), metabolsk-toksisk demens (slik som kronisk hypotyreoidisme eller B12-mangel) og demens forårsaket av infeksjoner (slik som syfilis eller kronisk meningitt).

Alzheimers sykdom erkarakterisert vedekstracellulære avleiringer av P-amyloid protein (P-AP) i senile plakk og hjernekar. P-AP er et peptidfragment på 39 til 42 aminosyrer avledet fra et amyloid prekursorprotein (APP). Minst tre isoformer av APP er kjent (695, 751 og 770 aminosyrer). Alternativ spleising av mRNA genererer isoformene; normal prosessering påvirker en del av P-AP sekvensen, hvilket derved forhinder dannelsen av P-AP. Det er antatt at unormal proteinprosessering ved proteasomet bidrar til overflod av P-AP i hjernen hos pasienter med Alzheimer. APP-prosesseringsenzymet hos rotter inneholder ca. ti forskjellige subenheter (22 kDa-32 kDa). Subenheten på 25 kDa har en N-terminal sekvens med X-Gln-Asn-Pro-met-X-Thr-Gly-Thr-Ser, som er identisk med P-subenheten av human macropain (Kojima, S. et al., Fed. Eur. Biochem. Soc, (1992) 304:57-60). APP-prosesseringsenzymet spalter ved Gln<15>~Lys<16->bindingen; i nærvær av kalsiumion spalter enzymet også ved Met-1—Asp-bindingen og Asp^-ala<2>bindingene for å frigjøre det ekstracellulære domenet av P-AP.

En utførelsesform er, derfor, en fremgangsmåte for behandling av Alzheimers sykdom, omfattende å administrere til et subjekt en effektiv mengde av en forbindelse (feks. farmasøytisk blanding) beskrevet her. Slik behandling omfatter reduksjon av hastigheten av P-AP prosessering, reduksjon av hastigheten av dannelse av P-AP plakk, reduksjon av hastigheten av dannelse av P-AP og reduksjon av kliniske tegn på Alzheimers sykdom.

Andre utførelsesformer ifølge oppfinnelsen angår kakeksi og muskelsvinnsykdommer. Proteasomet degraderer mange proteiner i modnende retikulocytter og voksende fibroblaster. I celler deprivert for insulin eller serum, blir hastigheten av proteolyse nesten fordoblet. Inhibering av proteasomet reduserer proteolyse, hvilket derved reduserer både tap av muskelprotein og nitrogen load på nyrer eller lever. Inhibitorer ifølge oppfinnelsen er anvendelige for behandling av lidelser slik som kreft, kronisk infeksiøse sykdommer, feber, muskel disuse (atrofi) og denervering, nerveskade, faste, nyresvikt forbundet med acidose, diabetes og hepatisk svikt. Se, feks. Goldberg, U.S. Patent nr. 5,340,736. Utførelsesformer ifølge oppfinnelsen omfatter derfor fremgangsmåter for: å redusere hastigheten av degradering av muskelprotein i en celle; redusere hastigheten av intracellulær proteindegradering i en celle; redusere nedbrytningshastigheten av p53-protein i en celle; og hemme veksten av p53-relatert kreft. Hver av disse fremgangsmåtene omfatter å kontakte en celle (in vivo eller in vitro, feks. en muskel i et subjekt) med en effektiv mengde av en forbindelse (feks. farmasøytisk blanding) beskrevet her.

Fibrose er overskytende og vedvarende dannelse av arrvev som er et resultat av den hyperproliferative veksten av fibroblaster og er forbundet med aktivering av TGF-0 signaleringsveien. Fibrose omfatter omfattende avleiring av ekstracellulær matriks og kan forekomme innen praktisk talt hvilket som helst vev eller gjennom mange forskjellige vev. Normalt blir nivået av intracellulært signaleringsprotein (Smad) som aktiverer transkripsjon av målgener ved TGF-P-stimulering regulert av proteasom aktivitet (Xu et al., 2000). Imidlertid er akselerert nedbrytning av TGF-P signaleringskomponentene observert ved kreft og andre hyperproliferative tilstander. Følgelig angår visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av hyperproliferative tilstander slik som diabetisk retinopati, makuladegenerasjon, diabetisk nefropati, glomerulosklerose, lg A nefropati, cirrhose, gallevegsatresi, kongestiv hjertesvikt, sklerodermi, strålingsinduert fibrose og lungefibrose (idiopatisk pulmonalfibrose, kollagen vaskulær sykdom, sarkoidose, interstitiale lungesykdommer og ekstrinsiske lungelidelser). Behandling av brannofre blir ofte hemmet av fibrose, følgelig er en ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen topisk eller systemisk administrering av inhibitorene for å behandle brannsår. Sårlukning etter kirurgi er ofte forbundet med skjemmende arr, hvilket forhindres ved hemming av fibrose. Følgelig angår oppfinnelsen, i visse utførelsesformer, en fremgangsmåte for forebygging eller reduksjon av arrdannelse.

En annet protein prosessert av proteasomet er NF-kB, et medlem av Rel proteinfamilien. Rel-familien av transkripsjonsaktivator-proteiner kan deles opp i to grupper. Den første gruppen krever proteolytisk prosessering og omfatter p50 (NF-kB 1, 105 kDa) og p52 (NF-k2, 100 kDa). Den andre gruppen krever ikke proteolytisk prosessering og omfatter p65 (RelA, Rel (c-Rel) og RelB). Både homo- og heterodimerer kan dannes ved Rel familie-medlemmer; NF-kB, for eksempel, er en p50-p65 heterodimer. Etter fosforylering og ubiquitinering av IkB og pl05, blir de to proteinene nedbrutt og prosessert, henholdsvis, for å produsere aktiv NF-kB som translokeres fra cytoplasma til kjernen. Ubiquitinert pl05 blir også prosessert av rensede proteasomer (Palombella et al., Cell (1994) 78:773-785). Aktiv NF-kB danner et stereospesifikt enhancerkompleks med andre transkripsjonsaktivatorer og, feks., HMG I(Y), hvilket induserer selektiv ekspresjon av et bestemt gen.

NF-kB regulerer gener involvert i immun og inflammatorisk respons og mitotiske hendelser. For eksempel er NF-kB nødvendig for ekspresjon av immunglobulin lett kjede k-genet, IL-2 reseptor a-kjede-genet, klasse I major histocompatibility complex-genet og flere cytokingener som koder for, for eksempel IL-2, IL-6, granulocytt kolonistimulerende faktor og IFN-p (Palombella et al., Cell (1994) 78:773-785). Noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen omfatter fremgangsmåter for å påvirke ekspresjonsnivået av IL-2, MHC-I, IL-6, TNFa, IFN-P eller hvilke som helst av de andre tidligere nevnte proteinene, hvor hver fremgangsmåte omfatter å administrere til et subjekt en effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her. Komplekser omfattende p50 er raske mediatorer av akutte inflammatoriske og immunresponser (Thanos, D. og Maniatis, T., Cell (1995) 80:529-532).

NF-kB deltar også ved ekspresjon av celleadhesjonsgener som koder for E-selektin, P-selektin, ICAM og VCAM-1 (Collins, T., Lab. Invest. (1993) 68:499-508). En utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å hemme celleadhesjon (feks. celleadhesjon mediert av E-selektin, P-selektin, ICAM eller VCAM-1), omfattende å kontakte en celle med (eller administrere til et subjekt) en effektiv mengde av en forbindelse (eller en farmasøytisk blanding) beskrevet her.

Iskemi og reperfusjonsskade resulterer i hypoksi, en tilstand hvor det er en mangel på oksygen som når vevet i kroppen. Denne tilstanden forårsaker økt nedbrytning av Ik-B<x, hvilket derved resulterer i aktivering av NF-kB (Koong et al., 1994). Det har blitt vist at alvorlighetsgraden av skade som fører til hypoksi kan reduseres ved administrering av en proteasom inhibitor (Gao et al, 2000; Bao et al., 2001; Pye et al., 2003). Derfor angår visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en iskemisk lidelse eller reperfusjonsskade omfattende å administrere til et subjekt med behov for slik behandling en effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her. Eksempler på slike lidelser eller skader omfatter, men er ikke begrenset til, akutt koronarsyndrom (vulnerable plakk), arteriell okklusiv sykdom (hjerte-, cerebral, perifer arteriell og vaskulær okklusjon), aterosklerose (koronar sklerose, koronararteriesykdom), infarkt, hjertesvikt, pankreatitt, myokardial hypertrofi, stenose og restenose.

NF-kB binder også spesifikt til HIV-enhanceren/promoteren. Sammenlignet med Nef fra mac239, avviker det HIV regulatoriske proteinet Nef fra pbjl4 med to aminosyrer i regionen som kontroller proteinkinase-binding. Det er antatt at protein kinasen signaliserer fosforyleringen av IkB, som trigger IkB nedbrytning gjennom ubiquitin-proteasom reaksjonsveien. Etter nedbrytning blir NF-kB frigjort inn i kjernen, og fremmer følgelig transkripsjonen av HIV (Cohen, J., Science, (1995) 267:960). To utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for inhibering eller reduksjon av HTV-infeksjon i et subjekt og en fremgangsmåte for å redusere nivået av viral genekspresjon, hvor hver fremgangsmåte omfatter å administrere til subjektet en effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her.

Overproduksjon av lipopolysakkarid (LPS)-induserte cytokiner slik som TNFa er ansett for å være sentral for prosessene forbundet med septisk sjokk. Videre er det generelt kjent at det første trinnet ved aktivering av celler ved LPS er bindingen av LPS til spesifikke membranreseptorer. a- og P-subenhetene av 20S proteasom-komplekset er identifisert som LPS-bindende proteiner, hvilket indikerer at den LPS-induserte signaltransduksjonen kan være et viktig terapeutisk mål for behandling eller forebygging av sepsis (Qureshi, N. et al., J. Immun. (2003) 171: 1515-1525). Derfor kan forbindelser ifølge oppfinnelsen, i visse utførelsesformer, anvendes for inhibering av TNFa for å forebygge og/eller behandle septisk sjokk.

Intracellulær proteolyse produserer små peptider for presentasjon til T-lymfocytter for å indusere MHC klasse I-medierte immunresponser. Immunsystemet screener for autologe celler som er virusinfiserte eller har gjennomgått oncogen transformasjon. En utførelsesform er en fremgangsmåte for å hemme antigenpresentasjon i en celle, omfattende å eksponere cellen for en forbindelse beskrevet her. En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle immunrelaterte lidelser slik som allergi, astma, avstøtning av organ/vev (graft-versus-vert sykdom) og autoimmune sykdommer, omfattende, men ikke begrenset til, lupus, revmatoid artritt, psoriasis, multippel sklerose og inflammatoriske tarmsykdommer (slik som colitis ulcerosa og Crohns sykdom). Følgelig er en ytterligere utførelsesform en fremgangsmåte for å undertrykke immunsystemet hos et subjekt (feks. inhibere transplantatavstøtning, allergier, autoimmune sykdommer og astma), omfattende å administrere til subjektet en effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her.

En annen ytterligere utførelsesform er en fremgangsmåte for å endre repertoaret av antigene peptider produsert av proteasomet eller annen Ntn med multikatalytisk aktivitet. For eksempel, dersom PGPH-aktiviteten av 20S proteasomet blir selektivt hemmet, vil et ulikt sett av antigene peptider produseres av proteasomet og presenteres i MHC-molekyler på overflatene av celler enn de som ville bli produsert og presentert både uten noen enzymhemming eller med, for eksempel selektiv hemning av chymotrypsin-lignende aktivitet av proteasomet.

Visse proteasom inhibitorer blokkerer både nedbrytning og prosessering av ubiquitinert NF-kB in vitro og in vivo. Proteasom inhibitorer blokkerer også IkB-<x nedbrytning og NF-KB-aktivering (Palombella, et al. Cell (1994) 78:773-785; og Traenckner, et al., EMBO J. (1994) 13:5433-5441). En utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å hemme IkB- a nedbrytning, omfattende å kontakte cellen med en forbindelse beskrevet her. En ytterligere utførelsesform er en fremgangsmåte for å redusere det cellulære innholdet av NF-kB i en celle, muskel, organ eller subjekt, omfattende å kontakte cellen, muskelen, organet eller subjektet med en forbindelse beskrevet her.

Andre eukaryote transkripsjonsfaktorer som krever proteolytisk prosessering omfatter den generelle transkripsjonsfaktoren TFIJA, herpes simplex virus VP16 hjelpe ("accessory")-protein (vertscelle faktor), virus-induserbar IFN reguleringsfaktor 2 protein og det membran-bundede sterol regulatorisk element-bindende protein 1.

Andre utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er fremgangsmåter for å påvirke cyklinavhengige eukaryote cellesykluser, omfattende å eksponere en celle (in vitro eller in vivo) for en forbindelse beskrevet her. Cykliner er proteiner involvert i kontroll av cellecyklus. Proteasomet deltar i nedbrytningen av cykliner. Eksempler på cykliner omfatter mitotiske cykliner, Gl cykliner og cyklin B. Degradering av cykliner gjør en celle i stand til å gå ut av ett stadium av cellecyklus (feks. mitose) og gå inn i en annen (feks. deling). Det er antatt at alle cykliner er forbundet med p34.sup.cdc2 proteinkinase eller relaterte kinaser. Det proteolyse-målrettende signalet er lokalisert til aminosyrene 42-RAALGNISEN-50 (destruksjonsboks). Det finnes belegg for at cyklin blir omdannet til en form sårbar for en ubiquitin ligase eller at en cyklin-spesifikk ligase blir aktivert under mitose (Ciechanover, A., Cell, (1994) 79:13-21). Hemming av proteasomet hemmer cyklin-degradering og hemmer derfor celleproliferasjon, for eksempel ved cyklinrelatert kreft (Kumatori et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1990) 87:7071-7075). En utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for behandling av en proliferativ sykdom i et subjekt (feks. kreft, psoriasis eller restenose), omfattende å administrere til subjektet en effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her. Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for behandling av cyklinrelatert inflammasjon i et subjekt, omfattende å administrere til et subjekt en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her.

Ytterligere utførelsesformer er fremgangsmåter for å påvirke den proteasom-avhengige reguleringen av oncoproteiner og fremgangsmåter for behandling av eller hemming av kreftvekst, hvor hver fremgangsmåte omfatter å eksponere en celle (in vivo, feks. i et subjekt eller in vitro) for en forbindelse beskrevet her. HPV-16 og HP V-18 -avledede E6 proteiner stimulerer ATP-og ubiquitin-avhengig konjugering og nedbrytning av p53 i rå retikulocytt-lysater. Det recessive onkogenet p53 har blitt vist å akkumulere ved den ikke-permissive temperaturen i en cellelinje med en mutert termolabil El. Forhøyede nivåer av p53 kan føre til apoptose. Eksempler på proto-oncoproteiner nedbrutt av ubiquitin-systemet omfatter c-Mos, c-Fos og c-Jun. En utførelsesform er en fremgangsmåte for behandling av p53-relatert apoptose, omfattende å administrere til et subjekt en effektiv mengde av en forbindelse beskrevet her.

I en annen utførelsesform er de beskrevne forbindelsene anvendelige for behandling

av en parasittisk infeksjon, slik som infeksjoner forårsaket av protozoa parasitter. Proteasomet fra disse parasittene anses å medvirke primært i celledifferensiering og replikasjonsaktiviteter (Paugam et al., Trends Parasitol. 2003, 19(2): 55-59). Videre har arter av entamoeba blitt vist å miste evne til innkapsling ved eksponering for proteasom inhibitorer (Gonzales, et al., Arch. Med. Res. 1997, 28, Spee No: 139-140). I visse slike utførelsesformer er de beskrevne forbindelsene anvendelige for behandling av parasittiske infeksjoner hos mennesker forårsaket av en protozoa parasitt valgt fra Plasmodium sps. (omfattende P. falciparum, P. vivax, P. malariae og P. ovale, som forårsaker malaria), Trypanosoma sps. (omfattende T. cruzi, som forårsaker Chagas sykdom og T. brucei som forårsaker afrikansk sovesyke), Leishmania sps. (omfattende L. amazonensis, L. donovani, L. infantum, L. mexicana, osv.), Pneumocystis carinii (en protozo kjent å forårsake lungebetennelse hos AIDS- og andre immunsuppresserte pasienter), Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica, Entamoeba invadens og Giardia lamblia. I visse utførelsesformer er de beskrevne forbindelsene anvendelige for behandling av parasittiske infeksjoner hos dyr og husdyr forårsaket av en

protozoa parasitt valgt fra Plasmodium hermani, Cryptosporidium sps., Echinococcus granulosus, Eimeria tenella, Sarcocystis neurona og Neurospora crassa. Andre forbindelser anvendelige som proteasom inhibitorer ved behandling av parasitt-sykdommer er beskrevet i WO 98/10779, som inntas heri sin helhet.

I visse utførelsesformer inhiberer de beskrevne forbindelsene proteasom-aktivitet irreversibelt i en parasitt. Slik irreversibel hemming er vist å indusere avstegning av enzymaktivitet uten gjenvinning i røde blodceller og hvite blodceller. I visse slike utførelsesformer kan den lange halveringstiden av blodceller gi forlenget beskyttelse med hensyn til behandling mot tilbakevendende eksponering for parasitter. I visse utførelsesformer kan den lange halveringstiden av blodceller gi forlenget beskyttelse med hensyn til kjemoprofylakse mot fremtidig infeksjon.

Det har også blitt vist at inhibitorer som binder til 20 S proteasomet stimulerer bendannelse i ben organkulturer. Når slike inhibitorer har blitt administrert systemisk til mus, økte videre visse proteasom inhibitorer raten på benvolum og bendannelse over 70% (Garrett, I. R. et al., J. Clin. Invest. (2003) 111: 1771-1782), hvilket derfor indikerer at ubiquitin-proteasom-maskineriet regulerer osteoblast differensiering og bendannelse. Derfor kan de beskrevne forbindelsene være anvendelige ved behandling og/eller forebygging av sykdommer forbundet med bentap, slik som osteoporose.

Benvev er en utmerket kilde for faktorer som har evne til å stimulere benceller. Følgelig inneholder ekstrakter av bovint benvev ikke bare strukturelle proteiner som er ansvarlige for å opprettholde den strukturelle integriteten av ben, men også biologisk aktive benvekstfaktorer som kan stimulere benceller til å proliferere. Blant disse sistnevnte faktorene er en nylig beskrevet familie av proteiner betegnet beinmorfogenetiske proteiner (BMP'er). Alle disse vekstfaktorene har effekter på andre typer celler, så vel som på benceller, inkludert Hardy, M. H, et al., Trans Genet (1992) 8:55-61 fremstiller belegg for at beinmorfogenetiske proteiner (BMP'er), blir differensielt uttrykt i hårfollikler under utvikling. Harris, S. E., et al., J Bone Miner Res (1994) 9:855-863 beskriver virkningene av TGF-P på ekspresjon av BMP-2 og andre substanser i benceller. BMP-2-ekspresjon i modne follikler forekommer også under modning og etter perioden for celleproliferasjon (Hardy, et al. (1992, supra). Følgelig kan forbindelser ifølge oppfinnelsen også være anvendelige for stimulering av vekst av hårfollikler.

Endelig er de beskrevne forbindelsene også anvendelige som diagnostiske midler (feks. i diagnostiske kit eller for anvendelse i kliniske laboratorier) for screening for proteiner

(f.eks. enzymer, transkripsjonsfaktorer) prosessert av Ntn hydrolaser, omfattende proteasomet. De beskrevne forbindelsene er også anvendelige som forskningreagenser for spesifikk binding av X/MB 1-subenheten eller a-kjeden og inhibering av de proteolytiske aktivitetene forbundet med den. For eksempel kan aktiviteten av (og spesifikke inhibitorer for) andre subenheter av proteasomet bestemmes.

De fleste cellulære proteiner blir underlagt proteolytisk prosessering under modning eller aktivering. Enzyminhibitorer beskrevet her kan anvendes for å bestemme hvorvidt en cellulær, utviklingsmessig eller fysiologisk prosess eller ytelse blir regulert av den proteolytiske aktiviteten av en bestemt Ntn hydrolase. En slik fremgangsmåte omfatter å oppnå en organisme, et intakt cellepreparat eller et celleekstrakt; eksponere organismen, cellepreparatet eller celleekstraktet for en forbindelse beskrevet her; eksponere den forbindelse-eksponerte organismen, cellepreparatet eller celleekstraktet for et signal og overvåke prosessen eller ytelsen. Den høye selektiviteten av forbindelsene beskrevet her tillater rask og nøyaktig eliminering eller implikasjon av Ntn (for eksempel 20S proteasomet) i en gitt cellulær, utviklingsmessig eller fysiologisk prosess.

Administrering

Forbindelser fremstilt som beskrevet her kan administreres i forskjellige former, avhengig av lidelsen som skal behandles og alderen, tilstanden og kroppsvekten til pasienten, hvilket er velkjent på området. Når forbindelsene, for eksempel, skal administreres oralt, kan de formuleres som tabletter, kapsler, granuler, pulvere eller siruper; eller for parenteral administrering kan de formuleres som injeksjoner (intravenøs, intramuskulær eller subkutan), dråpeinfusjon preparater eller suppositorier. For anvendelse ved den oftalmiske mukosamembran-ruten, kan de formuleres som øyedråper eller øyesalver. Disse formuleringene kan fremstilles ved konvensjonelle metoder og om ønsket, kan den aktive bestanddelen blandes med hvilket som helst konvensjonelt additiv eller tilsetningsmiddel, slik som et bindemiddel, et desintegrasjonsmiddel, et glattemiddel, en korrigent, et solubiliserende middel, et suspensjonsmiddel, et emulgeringsmiddel, et belegningsmiddel, et cyklodekstrin og/eller en buffer. Selv om dosen vil variere avhengig av symptomene, alderen og kroppsvekten til pasienten, karakteren og alvorlighetsgraden av lidelsen som skal behandles eller forebygges, administreringsveien og formen av medikamentet, er generelt en daglig dose på fra 0,01 til 2000 mg av forbindelsen anbefalt for en voksen human pasient og dette kan administreres i en enkelt dose eller i oppdelte doser. Mengden av aktiv bestanddel som kan kombineres med et bærermateriale for å fremstille en enkelt doseringsform vil generelt være den mengden av forbindelsen som gir en terapeutisk effekt.

Det nøyaktige tidspunktet for administrering og/eller mengden av blandingen som vil gi de mest effektive resultatene når det gjelder effektivitet av behandling for en gitt pasient vil avhenge av aktiviteten, farmakokinetikken og biotilgjengeligheten av en bestemt forbindelse, den fysiologiske tilstanden til pasienten (omfattende alder, kjønn, sykdomstype og stadium, generell fysisk tilstand, mottagelighet for en gitt dose og type av medisinering), administreringsvei, osv. Imidlertid kan de ovennevnte retningslinjene anvendes som basis for finjustering av behandlingen, feks. bestemme det optimale tidspunkt og/eller mengde for administrering, hvilket ikke vil kreve mer enn rutinemessig eksperimentering bestående av overvåkning av subjektet og regulering av dosen og/eller tidsberegningen.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabel" anvendes her for å referere til de ligander, materialer, blandinger og/eller doseringsformer som er, innenfor omfanget av sikker medisinsk bedømmelse, egnet for anvendelse i kontakt med vev fra mennesker og dyr uten for høy toksisitet, irritasjon, allergisk respons eller andre problemer eller komplikasjoner, i samsvar med et rimelig nytte/risiko-forhold.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabel bærer" som anvendt her betyr et farmasøytisk akseptabelt materiale, blanding eller konstituent, slik som et flytende eller fast fyllmiddel, fortynningsmiddel, tilsetningsmiddel, løsningsmiddel eller innkapslende materiale. Hver bærer må være "akseptabel" i betydning av å være kompatibel med de andre bestanddelene av formuleringen og ikke skadelig for pasienten. Noen eksempler på materialer som kan tjene som farmasøytisk akseptable bærere omfatter: (1) sukkere, slik som laktose, glukose og sukrose; (2) stivelser, slik som maisstivelse, potetstivelse og substituert eller usubstituert 0-cyklodekstrin; (3) cellulose og derivater derav, slik som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose og celluloseacetat; (4) pulverisert tragant; (5) malt; (6) gelatin; (7) talkum; (8) tilsetningsmidler, slik som kakaosmør og suppositorium voks; (9) oljer, slik som jordnøttolje, bomullsfrøolje, fargetistelolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og soyaolje; (10) glykoler, slik som propylenglykol; (11) polyoler, slik som glyserin, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol;

(12) estere, slik som etyloleat og etyl-laurat; (13) agar; (14) buffermidler, slik som magnesiumhydroksid og aluminiumhydroksid; (15) alginsyre; (16) pyrogenfritt vann; (17) isotonisk saltoppløsning; (18) Ringer's løsning; (19) etylalkohol; (20) fosfatbufferløsninger; og (21) andre ikke-toksiske kompatible substanser anvendt i farmasøytiske formuleringer. I visse utførelsesformer er farmasøytiske blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse ikke-pyrogene, dvs. induserer ikke betydelige temperaturøkninger når administrert til en pasient.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer til de relativt ikke-toksiske, uorganiske og organiske syreaddisjonssaltene av inhibitoren(e). Disse saltene kan fremstilles in situ under den endelige isoleringen og rensningen av inhibitoren(e) eller ved separat å reagere en renset inhibitor(er) i dens fri baseform med en egnet organisk eller uorganisk syre og isolere det således dannede saltet. Representative salter omfatter hydrobromid, hydroklorid, sulfat, bisulfat, fosfat, nitrat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, laktat, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, naftylat, mesylat, glukoheptonat, laktobionat, laurylsulfonatsalter og aminosyresalter og lignende, (se for eksempel Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66: 1-19.)

I andre tilfeller kan inhibitorene anvendelige ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde én eller flere sure funksjonelle grupper og kan følgelig danne

farmasøytisk akseptable salter med farmasøytisk akseptable baser. Betegnelsen "farmasøytisk akseptable salter" i disse tilfeller refererer til de relativt ikke-toksiske uorganiske og organiske baseaddisjonssaltene av (en) inhibitor(er). Disse saltene kan likeledes fremstilles in situ under den endelige isoleringen og rensningen av inhibitoren(e) eller ved separat å reagere den

rensede inhibitoren(e) i dens fri syreform med en egnet base, slik som hydroksidet, karbonatet eller bikarbonatet av et farmasøytisk akseptabelt metall-kation, med ammoniakk eller med et farmasøytisk akseptabelt organisk primær, sekundær eller tertiært amin. Representative alkali eller alkaliske jord salter omfatter litium, natrium, kalium, kalsium, magnesium og aluminiumsalter og lignende. Representative organiske aminer anvendelige for dannelse av baseaddisjonssalter omfatter etylamin, dietylamin, etylendiamin, etanolamin, dietanolamin, piperazin og lignende (se for eksempel Berge et al., supra).

Fuktemidler, emulgeringsmidler og glattemidler, slik som natriumlaurylsulfat og magnesiumstearat, så vel som fargemidler, frigjøringsmidler, belegningsmidler, søtningsmidler, smaksstoffer og duftstoffer, konserveringsmidler og antioksidanter kan også være til stede i blandingene.

Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter omfatter: (1) vannløselige antioksidanter, slik som askorbinsyre, cystein-hydroklorid, natriumbisulfat, natrium-metabisulfitt, natriumsulfitt og lignende; (2) oljeløselige antioksidanter, slik som askorbyl palmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), leeitin, propyl gallat, alfa-tokoferol og lignende; og (3) metallchelatdannere, slik som sitronsyre, etylendiamin tetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre og lignende.

Formuleringer egnet for oral administrering kan være i form av kapsler, pulverkapsler, piller, tabletter, pastiller (ved anvendelse av en smakssatt basis, vanligvis sukrose og akasie

eller tragant), pulvere, granuler eller som en løsning eller en suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske eller som en olje-i-vann eller vann-i-olje flytende emulsjon eller som en eliksir eller sirup eller som pastiller (ved anvendelse av en inert matriks, slik som gelatin og glyserin eller sukrose og akasie) og/eller som munnvann og lignende, hver inneholdende en forutbestemt mengde av en inhibitor(er) som en aktiv bestanddel. En blanding kan også administreres som en bolus, latverge eller pasta.

I faste doseringsformer for oral administrering (kapsler, tabletter, piller, drageer, pulvere, granuler og lignende), blir den aktive bestanddelen blandet med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere, slik som natriumcitrat eller dikalsiumfosfat og/eller hvilke som helst av de følgende: (1) fyllmidler eller ekstender, slik som stivelser, cyklodekstriner, laktose, sukrose, glukose, mannitol og/eller kiselsyre; (2) bindemidler, slik som for eksempel karboksymetylcellulose, alginater, gelatin, polyvinyl pyrrolidon, sukrose og/eller akasie; (3) fuktighetsbevarende midler, slik som glyserol; (4) desintegrasjonsmidler, slik som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet eller tapiokastivelse, alginsyre, visse silikater og natriumkarbonat; (5) løsnings retarderende tilsetningsstoffer, slik som paraffin; (6) absorpsjon akseleratorer, slik som kvaternære ammoniumforbindelser; (7) fuktemidler, slik som for eksempel acetylalkohol og glyserol monostearat; (8) absorberende midler, slik som kaolin og bentonittleire; (9) glattemidler, slik som talkum, kalsiumstearat, magnesiumstearat, faste polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat og blandinger derav; og (10) fargemidler. I tilfellet av kapsler, tabletter og piller, kan de farmasøytiske blandingene også omfatte buffermidler. Faste blandinger av en lignende type kan også anvendes som fyllmidler i myke og harde fylte gelatinkapsler ved anvendelse av slike tilsetningsmidler som laktose eller melkesukkere, så vel som polyetylenglykoler med høy molekylvekt og lignende.

En tablett kan fremstilles ved sammenpressing eller forming, eventuelt med ett eller flere hjelpestoffer. Sammenpressede tabletter kan fremstilles ved anvendelse av bindemiddel (for eksempel gelatin eller hydroksypropylmetylcellulose), glattemiddel, inert fortynningsmiddel, konserveringsmiddel, desintegrasjonsmiddel (for eksempel natriumstivelse glykolat eller kryssbundet natriumkarboksymetylcellulose), overflateaktivt eller dispergeringsmiddel. Støpte tabletter kan fremstilles ved å forme, i en egnet maskin, en blanding av den pulveriserte inhibitoren(e) fuktet med et inert flytende fortynningsmiddel.

Tabletter og andre faste doseringsformer, slik som drageer, kapsler, piller og granuler, kan eventuelt oppnås eller fremstilles med belegg og skall, slik som enteriske belegg og andre belegg velkjent innenfor området farmasøytisk formulering. De kan også formuleres for å gi langsom eller kontrollert frigjøring av den aktive bestanddelen deri ved anvendelse av, for eksempel hydroksypropylmetylcellulose i varierende proporsjoner for å gi den ønskede frigjøringsprofilen, andre polymermatrikser, liposomer og/eller mikrokuler. De kan steriliseres ved, for eksempel, filtrering gjennom et filter som holder tilbake bakterier eller ved å inkorporere steriliseringsmidler i form av sterile faste blandinger som kan oppløses i sterilt vann eller annet annet sterilt, injiserbart medium umiddelbart før anvendelse. Disse blandingene kan også eventuelt inneholde opasitet dannende midler og kan være av en slik sammensetning at de frigjør den aktive bestanddelen(e) kun eller fortrinnsvis, i en viss del av mage-tarm-kanalen, eventuelt, på en forsinket måte. Eksempler på innstøpende blandinger som kan anvendes omfatter polymere substanser og vokser. Den aktive bestanddelen kan også være i mikroinnkapslet form, dersom passende, med ett eller flere av de ovenfor beskrevne tilsetningsmidlene.

Flytende doseringsformer for oral administrering omfatter farmasøytisk akseptable emulsjoner, mikroemulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. I tillegg til den aktive bestanddelen, kan de flytende doseringsformene inneholde inerte fortynningsmidler vanlig anvendt på området, slik som for eksempel vann eller andre løsningsmidler, solubiliseringsmidler og emulgeringsmidler slik som etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, oljer (spesielt, bomullsfrø, peanøtt, mais, kim, oliven, ricinus og sesamoljer), glyserol, tetrahydrofurylalkohol, polyetylenglykoler og fettsyreestere av sorbitan og blandinger derav.

Foruten inerte fortynningsmidler, kan de orale blandingene også omfatte adjuvantia slik som fuktemidler, emulgering og suspenderingsmidler, søtning, smak, farge, duft og konserveringsmidler.

Suspensjoner, i tillegg til den aktive inhibitoren(e) kan inneholde suspenderingsmidler som for eksempel etoksylerte isostearylalkoholer, polyoksyetylen sorbitol og sorbiten estere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminium metahydroksid, bentonitt, agar-agar og tragant og blandinger derav.

Formuleringer for rektal eller vaginal administrering kan presenteres som et suppositorium, som kan fremstilles ved blanding av én eller flere inhibitorer med ett eller flere egnede ikke irriterende tilsetningsmidler eller bærere omfattende for eksempel kakaosmør, polyetylenglykol, en suppositorium voks eller et salicylat, som er fast ved romtemperatur, men flytende ved kroppstemperatur og derfor, vil smelte i rektum eller vaginalhulen og frigjøre det aktive midlet.

Formuleringer som er egnet for vaginal administrering omfatter også pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller sprayformuleringer inneholdende slike bærere som er kjent på området for å være passende.

Doseringsformer for topisk eller transdermal administrering av en inhibitor(er) omfatter pulvere, sprayer, salver, pastaer, kremer, losjoner, geler, løsninger, plastere og inhalatorer. Den aktive komponenten kan blandes under sterile betingelser med en farmasøytisk akseptabel bærer og med hvilke som helst konserveringsmidler, buffere eller drivmidler som kan være nødvendig.

Salvene, pastaene, kremene og gelene kan inneholde, i tillegg til inhibitor(er), tilsetningsmidler, slik som animalsk og vegetabilsk fett, oljer, voks, paraffin, stivelse, tragant, cellulosederivater, polyetylenglykoler, silikoner, bentonitter, kiselsyre, talkum og sinkoksid eller blandinger derav.

Pulvere og sprayer kan inneholde, i tillegg til (en) inhibitor(er), tilsetningsmidler slik som laktose, talkum, kiselsyre, aluminiumhydroksid, kalsiumsilikater og polyamidpulver eller blandinger av disse substansene. Sprayer kan i tillegg inneholde vanlige drivmidler, slik som klorfluorhydrokarboner og flyktige usubstituerte hydrokarboner, slik som butan og propan.

Inhibitoren(e) kan alternativt administreres som aerosol. Dette blir gjennomført ved å fremstille en vandig aerosol, liposomalt preparat eller faste partikler inneholdende blandingen. En ikke-vandig (feks. fluorkarbon drivmiddel) suspensjon kunne anvendes. Soniske forstøvningsapparater er foretrukket fordi de begrenser eksponering av midlet for "shear", som kan føre til nedbrytning av forbindelsen.

Vanligvis blir en vandig aerosol fremstilt ved å formulere en vandig løsning eller suspensjon av midlet sammen med konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærere og stabiliseringsmidler. Bærerene og stabiliseringsmidlene varierer med kravet for den bestemte blandingen, men omfatter typisk ikke-ioniske surfaktanter (Tweens, Pluronics, sorbiten ester, lecitin, cremophor), farmasøytisk akseptable kosolventer slik som polyetylenglykol, uskadelige proteiner som serumalbumin, oljesyre, aminosyrer slik som glysin, buffere, salter, sukkere eller sukkeralkoholer. Aerosoler blir generelt fremstilt fra isotoniske løsninger.

Transdermale plastere har den ytterligere fordelen at de gir kontrollert levering av en inhibitor(er) til kroppen. Slike doseringsformer kan fremstilles ved oppløsning eller dispergering av midlet i det passende mediet. Absorpsjonsfremmere kan også anvendes for å øke fluks av inhibitoren(e) gjennom huden. Hastigheten av slik fluks kan kontrolleres ved enten å tilveiebringe en hastighetskontrollerende membran eller dispergere inhibitoren(e) i en polymermatriks eller gel.

Farmasøytiske blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse egnet for parenteral administrering omfatter én eller flere inhibitorer i kombinasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, dispersjoner, suspensjoner eller emulsjoner eller sterile pulvere som kan rekonstitueres til sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner like før anvendelse, hvilke kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske midler, oppløsninger som gjør formuleringen isotonisk med blodet til den tilsiktede mottageren eller suspenderings- eller fortykningsmidler.

Eksempler på egnede vandige og ikke-vandige bærere som kan anvendes i de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen omfatter vann, etanol, polyoler (slik som glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol og lignende) og egnede blandinger derav, vegetabilske oljer, slik som olivenolje og injiserbare organiske estere, slik som etyloleat. Riktig fluiditet kan opprettholdes, for eksempel ved anvendelse av belegningsmaterialer, slik som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfellet av dispersjoner og ved anvendelse av surfaktanter.

Disse blandingene kan også inneholde adjuvantia slik som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergeringsmidler. Forebygging av virkningen av mikroorganismer kan sikres ved å inkludere forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel paraben, klorbutanol, fenol sorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å inkludere tonisitetsjusterende midler, slik som sukkere, natriumklorid og lignende i blandingene. I tillegg kan forlenget absorpsjon av den injiserbare farmasøytiske formen foranlediges ved inkludering av midler som forsinker absorpsjon slik som aluminium-monostearat og gelatin.

I noen tilfeller er det, for å forlenge effekten av et medikament, ønskelig å forsinke absorpsjonen av medikamentet fra subkutan eller intramuskulær injeksjon. For eksempel blir forsinket absorpsjon av en parenteralt administrert medikamentform fullført ved å oppløse eller suspendere medikamentet i en olje-vehikkel.

Injiserbare depotformer blir fremstilt ved å danne mikrokapsel matrikser av inhibitor(er) i bionedbrytbare polymerer slik som polylaktid-polyglykolid. Avhengig av forholdet av medikament til polymer og typen av den bestemte polymeren anvendt, kan hastigheten av medikamentfrigjøring kontrolleres. Eksempler på andre bionedbrytbare polymerer omfatter poly(ortoestere) og poly(anhydrider). Depot-injiserbare formuleringer blir også fremstilt ved å innkapsle medikamentet i liposomer eller mikroemulsjoner som er kompatible med kroppsvev.

Preparatene av midler kan gis oralt, parenteralt, topisk eller rektalt. De blir selvfølgelig gitt ved former egnet for hver administreringsrute. For eksempel blir de administrert i tabletter eller kapselform, ved injeksjon, inhalering, øyelotion, salve, suppositorium, infusjon; topisk ved lotion eller salve; og rektalt ved suppositorier. Oral administrering er foretrukket.

Uttrykkene "parenteral administrering" og "administrert parenteralt" som anvendt her betyr administreringsmetoder forskjellig fra enteral og topisk administrering, vanligvis ved injeksjon og omfatter, uten begrensning, intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intratekal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardiell, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subkutan, subcuticular, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoidal, intraspinal og intrasternal injeksjon og infusjon.

Uttrykkene "systemisk administrering," "administrert systemisk," "perifer administrering" og "administrert perifert" som anvendt her betyr administrering av en ligand, medikament eller annet materiale forskjellig fra direkte inn i sentralnervesystemet, slik at det går inn i pasientens system og følgelig blir utsatt for metabolisme og andre lignende prosesser, for eksempel subkutan administrering.

Disse inhibitorene kan administreres til mennesker og andre dyr for behandling ved hvilken som helst egnet administreringsvei, omfattende oralt, nasalt, som ved, for eksempel en spray, rektalt, intravaginalt, parenteralt, intracisternalt og topisk, som ved pulvere, salver eller dråper, omfattende bukkalt og sublingvalt.

Uansett administreringsveien valgt, blir inhibitoren(e), som kan anvendes i en egnet hydratisert form og/eller de farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse, formulert til farmasøytisk akseptable doseringsformer ved konvensjonelle metoder kjent for fagfolk på området.

Reelle dosenivåer av de aktive bestanddelene i de farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan varieres for å oppnå en mengde av den aktive bestanddelen som er effektiv for å oppnå den ønskede terapeutiske responsen for en bestemt pasient, blanding og administreringsmetode, uten å være toksisk for pasienten.

Konsentrasjonen av en beskrevet forbindelse i en farmasøytisk akseptabel blanding vil variere avhengig av mange faktorer, omfattende dosen av forbindelsen som skal administreres, de farmakokinetiske egenskapene av forbindelsen(e) anvendt og administreringsveien. Generelt kan blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse gis i en vandig løsning inneholdende ca. 0,1-10% vekt/volum av en forbindelse beskrevet her, blant andre substanser, for parenteral administrering. Typiske doseringsområder er fra ca. 0,01 til ca. 50 mg/kg kroppsvekt pr. dag, gitt i 1-4 oppdelte doser. Hver oppdelte dose kan inneholde den samme eller forskjellige forbindelser ifølge oppfinnelsen. Dosen vil være en effektiv mengde avhengig av mange faktorer inkludert den totale helsen til en pasient og formulerings-og administreringsveien for de(n) valgte forbindelsen(e).

Et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer en kombinert behandling hvor ett eller flere andre terapeutiske midler blir administrert med proteasome inhibitoren. Slik kombinert behandling kan oppnås ved samtidig, sekvensiell eller separat dosering av de individuelle komponentene av behandlingen.

I visse utførelsesformer blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert i forbindelse med én eller flere andre proteasom inhibitorer.

I visse utførelsesformer blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert i forbindelse med et kjemoterapeutisk middel. Egnede kjemoterapeutika kan omfatte naturlige produkter slik som vinkaalkaloider (dvs. vinblastin, vinkristin og vinorelbin), paklitaksel, epidipodophyllotoksiner (dvs. etoposid, teniposid), antibiotika (daktinomycin (aktinomycin D) daunorubicin, doksorubicin og idarubicin), antracykliner, mitoksantron, bleomyciner, plikamycin (mitramycin) og mitomycin, enzymer (L-asparaginase som systemisk metaboliserer L-asparagin og depriverer celler som ikke har evne til å syntetisere sitt eget asparagin); antiblodplate midler; antiproliferative/antimitotiske alkyleringsmidler slik som nitrogen senneper (mekloretamin, cyklofosfamid og analoger, melflan, klorambucil), etyleniminer og metylmelaminer (heksametylmelamin og tiotepa), alkylsulfonater (busulfan), nitrosourea (karmustin (BCNU) og analoger, streptozocin), trazener - dakarbazinin (DTIC); antiproliferative/antimitotiske antimetabolitter slik som folinsyre-analoger (metotreksat), pyrimidinanaloger (fluoruracil, floxuridin og cytarabin), purinanaloger og relaterte inhibitorer

(merkaptopurin, tioguanin, pentostatin og 2-klordeoksyadenosin); aromatasehemmere (anastrozol, eksemestan og letrozol); og platina koordinasjonskomplekser (cisplatin, karboplatin), prokarbazin, hydroksyurea, mitotan, aminoglutetimid; histon deacetylase (HDAC) inhibitorer (trichostatin, natrium butyrat, apicidan, suberoyl anilid hydroamic syre); hormoner (dvs. østrogen) og hormon-agonister slik som luteiniserende hormonfrigjørende hormon (LHRH) agonister (goserelin, leuprolid og triptorelin). Andre kjemoterapeutiske midler kan omfatte mekloretamin, camptothecin, ifosfamid, tamoksifen, raloksifen, gemcitabin, navelbin eller hvilken som helst analog eller derivat-variant av de før nevnte.

I visse utførelsesformer blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert i forbindelse med et cytokin. Cytokiner omfatter, men er ikke begrenset til, interferon- y, -a og -P, interleukiner 1-8, 10 og 12, Granulocytt monocytt kolonistimulerende faktor (GM-CSF), TNF-a og -P og TGF-p.

I visse utførelsesformer blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert sammen med et steroid. Egnede steroider kan omfatte, men er ikke begrenset til, 21-acetoksypregnenolon, alclometason, algeston, amcinonid, beklometason, betametason, budesonid, klorprednison, klobetasol, klokortolon, kloprednol, kortikosteron, kortison, cortivazol, deflazakort, desonid, desoksimtason, deksametason, diflorason, diflukortolon, difuprednat, enoksolon, fluazacort, flucloronid, flumetason, flunisolid, fluocinolon acetonid, fluocinonid, fluokortin butyl, fluokortolon, fluormetolon, fluperolon acetat, flupredniden acetat, fluprednisolon, flurandrenolid, flutikason propionat, formokortal, halcinonid, halogenbetasol propionat, halogenmetason, hydrokortison, loteprednol etabonat, mazipredone, medryson, meprednison, metylprednisolon, mometason furoat, parametason, prednikarbat, prednisolon, prednisolon 25-dietylaminoacetat, prednisolon natriumfosfat, prednison, prednival, prednyliden, rimeksolon, tixocortol, triamcinolon, triamcinolon acetonid, triamcinolon benetonid, triamcinolon heksacetonid og salter og/eller derivater derav.

I visse utførelsesformer blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert sammen med et immunterapeutisk middel. Egnede immunterapeutiske midler kan omfatte, men er ikke begrenset til, MDR-modulatorer (verapamil, valspordar, biricodar, tariquidar, laniquidar), cyklosporin, talidomid og monoklonale antistoffer. De monoklonale antistoffene kan være enten bare eller konjugerte slik som rituksimab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, ibritumomab tiuksetan, gemtuzumab ozogamicin, bevacizumab, cetuximab, erlotinib og trastuzumab.

Eksempler

Syntese av ( A)

Til en løsning av NBoc leucin (19,81 g, 85,67 mmol, 1,0 ekv.) og fenylalanin benzylester (25,0 g, 85,67 mmol, 1,0 ekv.) i 900 ml MeCN ble det tilsatt DIEA (44,29 g, 60 ml, 342,68 mmol, 4,0 ekv.) og blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad. Til denne blandingen ble det tilsatt HOBT (18,52 g, 137,08 mmol, 1,6 ekv) etterfulgt av PyBOP (71,33 g, 137,08 mmol, 1,6 ekv) som ble tilsatt i mange porsjoner over fem minutter. Reaksjonen ble plassert under en atmosfære av argon og omrørt natten over. De flyktige stoffene ble fjernet under redusert trykk og det gjenværende materiale ble tatt opp i 500 ml EtOAc og vasket med mettet NaHCCb, H2O og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Til en 0 °C avkjølt løsning av 70% TFA/DCM (150 ml) ble det tilsatt BocNHLeuPheOBz (25,0 g, 53,35 mmol, 1,0 ekv.). Løsningen ble omrørt og fikk oppvarmes til romtemperatur over 2 timer ved hvilket tidspunkt blandingen ble konsentrert og plassert under høyvakuum i 2 timer hvilket gir TFA saltet av dipeptid aminet. Til den resulterende oljen ble det tilsatt BocNHhPheCOzH (14,68 g, 53,35 mmol, 1,0 ekv.), 550 ml MeCN og DIEA (27,58 g, 37,2 ml, 213,4 mmol, 4,0 ekv.) og blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad. Til den avkjølte blandingen ble det tilsatt HOBT (11,53 g, 85,36 mmol, 1,6 ekv.) etterfulgt av PyBOP (44,42 g, 85,36 mmol, 1,6 ekv.) som ble tilsatt i mange porsjoner over fem minutter. Reaksjonen ble plassert under argon og fikk oppvarmes til romtemperatur natten over ved hvilket tidspunkt et hvitt presipitat var blitt dannet. Reaksjonsblandingen ble avkjølt og de faste stoffene ble oppsamlet ved filtrering og deretter vasket med kald MeCN, hvilket gir (A) (24,86 g).

Syntese av ( B)

Intermediat (A) (23,0 mmol, 14,5 g) ble blandet med TFA/DCM (80%) og omrørt ved romtemperatur i én time ved hvilket tidspunkt blandingen ble konsentrert og plassert under høyvakuum i 2 timer hvilket gir (B).

Syntese av ( C)

Til en løsning av (B) (1,6 mmol, 1 ekv.) i MeCN (100 ml) ble det tilsatt 5-klorvalerylklorid (1,9 mmol, 0,24 ml, 1,2 ekv.) og DIEA (6,4 mmol, 1,2 ml, 4 ekv.). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over og deretter konsentrert, hvilket gir et fast stoff. Det faste stoffet ble oppsamlet og vasket med eter, hvilket gir alkylklorid. Til en løsning av alkylklorid (0,21 mmol, 0,134 g) i tørr aceton (100 ml) ble det tilsatt Nal (2,5 mmol, 0,387 g) og reaksjonen ble tilbakeløpskokt natten over. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert under vakuum og residuet oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (C).

Syntese av ( D)

Til en løsning av (C) (0,040 mmol, 30,0 mg) i THF (2 ml) ble det tilsatt piperidin (0,048 mmol, 5,0 mg) og DIEA (0,040 mmol, 0,5 mg). Etter omrøring i 2 timer ved romtemperatur, ble innholdet konsentrert og oppløst i EtOAc, vasket med vann, saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble oppløst i 1:1 EtOAc/ MeOH (10 ml), 5% Pd/C (30,0 mg) ble tilsatt og blandingen plassert under 1 atmosfære av hydrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celite og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (D) (11,0 mg).

Syntese av Forbindelse 1

Til en omrørt løsning av (E) [se: Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2283-2288]

(0,098 mmol, 5,2 ekv.) i DMF (3 ml) ble det tilsatt (D) (0,019 mmol, 0,014 g, 1 ekv.), DIEA (0,50 mmol, 88 ul, 20 ekv.) og HOBT (0,20 mmol, 0,0272 g, 10,5 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,20 mmol, 0,105 g, 10,5 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner. Blandingen ble deretter omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten

over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 1 (5,1 mg). IC5020S CT-L < 50 nM, ICso Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( F)

Til en løsning av (C) (0,040 mmol, 0,030 g) i THF (2 ml) ble det tilsatt morfolin (0,050 mmol, 5,0 mg) og DIEA (0,040 mmol, 0,5 mg). Etter omrøring 2 timer ved romtemperatur ble innholdet konsentrert og oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble oppløst i 1:1 EtOAc/ MeOH (10 ml), 5% Pd/C (30,0 mg) tilsatt og blandingen plassert under 1 atmosfære av hydrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celite og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (F) (19,0 mg).

Syntese av Forbindelse 2

(0,098 mmol, 3,2 ekv.) i DMF (3 ml) ble det tilsatt (F) (0,030 mmol, 0,018 g, 1 ekv.), DIEA (0,50 mmol, 88 ul, 17 ekv.) og HOBT (0,20 mmol, 27,2 mg, 6,7 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,20 mmol, 0,105 g, 6,7 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner. Blandingen ble deretter omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 2 (6,0 mg). IC5020S CT-L

< 50 nM, IC50Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( G)

Til en løsning av (C) (0,040 mmol, 30,0 mg) i THF (2 ml) ble det tilsatt N-metylpiperazin (0,050 mmol, 5,0 mg) og DIEA (0,040 mmol, 0,5 mg). Etter omrøring i 2 timer ved romtemperatur, ble innholdet konsentrert og oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble oppløst i 1:1 EtOAc/ MeOH (10 ml), 5% Pd/C (30,0 mg) ble tilsatt og blandingen ble plassert under 1 atmosfære av hydrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celite og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (G) (31,0 mg).

Syntese av Forbindelse 3

(0,098 mmol, 3,2 ekv.) i DMF (3 ml) ble det tilsatt (G) (0,030 mmol, 18,0 mg, 1 ekv.), DIEA (0,50 mmol, 88 ul, 17 ekv.) og HOBT (0,20 mmol, 27,2 mg, 6,7 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,20 mmol, 0,105 g, 6,7 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner. Blandingen ble deretter omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 3 (3,9 mg). IC5020S CT-L

< 50 nM, IC50Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( I)

Til en løsning av (B) (2,0 mmol, 1 ekv.) i MeCN (120 ml) ble det tilsatt 4-klorbutrylklorid (2,8 mmol, 0,32 ml, 1,2 ekv.) og DIEA (8 mmol, 1,4 ml, 4 ekv.). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over og deretter konsentrert, hvilket gir et fast stoff. Det faste stoffet ble oppsamlet og vasket med eter, hvilket gir alkylklorid (0,808 g). Til en løsning av alkylkloridet (0,09 mmol, 0,060 g) i tørr aceton (10 ml) ble det tilsatt Nal (0,86 mmol,

0,130 g) og reaksjonen ble tilbakeløpskokt natten over. Innholdet ble konsentrert under vakuum og residuet oppløst i DCM, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Rensning ved flash kromatografi ga (I) (0,050 g).

Syntese av ( J)

Til en løsning av (I) (0,040 mmol, 30,0 mg) i THF (2 ml) ble det tilsatt piperidin (0,050 mmol, 4,0 mg) og DIEA (0,040 mmol, 0,5 mg). Etter omrøring natten over ved romtemperatur, ble innholdet konsentrert og oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble oppløst i 1:1 EtOAc/ MeOH (10 ml), 5% Pd/C (0,020 g) ble tilsatt og blandingen plassert under 1 atmosfære av hydrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celite og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (J).

Syntese av Forbindelse 5

(0,098 mmol, 4,9 ekv.) i DMF (3 ml) ble det tilsatt (J) (0,020 mmol, 1 ekv.), DIEA (0,18 mmol, 31 ul, 9 ekv.) og HOBT (0,074 mmol, 10,0 mg, 3,7 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,07 mmol, 36,0 mg, 3,7 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner.

Blandingen ble omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 5 (18,2 mg). IC5020S CT-L < 50 nM, IC50Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( K)

Til en løsning av (I) (0,040 mmol, 30,0 mg) i THF (2 ml) ble det tilsatt morfolin (0,050 mmol, 5,0 mg) og DIEA (0,040 mmol, 0,5 mg). Etter omrøring natten over ved romtemperatur, ble innholdet konsentrert, oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene ble fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble oppløst i 1:1 EtOAc/ MeOH (10 ml), 5% Pd/C (20,0 mg) ble tilsatt og blandingen plassert under 1 atmosfære av hydrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celite og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (K).

Syntese av Forbindelse 6

(0,151 mmol, 1,2 ekv.) i DMF (3 ml) ble det tilsatt (K) (0,126 mmol, 0,075 g, 1 ekv.), DIEA (0,50 mmol, 88 ul, 4 ekv.) og HOBT (0,20 mmol, 27,0 mg, 1,6 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,202 mmol, 0,105 g, 1,6 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner.

Blandingen ble omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 6 (46,6 mg). IC5020S CT-L < 50 nM, IC50Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( L)

Til en løsning av (I) (0,040 mmol, 30,0 mg) i THF (2 ml) ble det tilsatt N-metylpiperazin (0,050 mmol, 5,0 mg) og DIEA (0,040 mmol, 0,5 mg). Etter omrøring natten over ved romtemperatur ble innholdet konsentrert og oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble oppløst i 1:1 EtOAc/ MeOH (10 ml), 5% Pd/C (20,0 mg) ble tilsatt og blandingen plassert under 1 atmosfære hydrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celite og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir (L).

Syntese av Forbindelse 7

(0,098 mmol, 1,5 ekv.) i DMF (3 ml) ble det tilsatt (L) (0,065 mmol, 0,075 g, 1 ekv.), DIEA (0,50 mmol, 88 ul, 8 ekv.) og HOBT (0,20 mmol, 27,0 mg, 3,1 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,20 mmol, 0,105 g, 3,1 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner. Blandingen ble deretter omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 7 (4,8 mg). IC5020S CT-L

< 50 nM, IC50Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( N)

Forbindelse (B) (0,39 mmol) ble oppløst i DMF (6 ml) og 4-morfolinoeddiksyre (0,507 mmol, 0,074 g) ble tilsatt fulgt av DIEA (3,90 mmol, 0,504 g, 0,68 ml). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,62 mmol, 0,32 g) ble tilsatt og omrørt under en atmosfære av argon under oppvarming til romtemperatur natten over. Blandingen ble fortynnet med saltoppløsning (50 ml) og ekstrahert med EtOAc (5x20 ml). Det organiske laget ble oppsamlet, vasket med mettet NaHC03(5x15 ml) og saltoppløsning (1x25 ml) og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk, hvilket gir intermediatet esteren (M) (0,195 g). Til (M) (0,150 g, 0,23 mmol) ble det tilsatt 10% Pd/C (0,05 g) fulgt av 5 ml 1:1 blanding av MeOH og EtOAc og blandingen ble plassert under en atmosfære av hydrogen. Etter 2 timer ble innholdet filtrert gjennom en plugg av celite og konsentrert under vakuum, hvilket gir (N) (0,12 g).

Syntese av Forbindelse 8

Til en omrørt løsning av (E) [se: Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2283-2288] (0,27 mmol, 0,083 mg, 1,3 ekv.) i MeCN (5 ml) ble det tilsatt (N) (0,17 mmol, 0,10 g, 1 ekv.), DIEA (1,73 mmol, 0,30 ml, 10 ekv.) og HOBT (0,27 mmol, 0,037 mg, 1,6 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,27 mmol, 0,14 g, 1,6 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner. Blandingen ble omrørt ved 5 °C under en atmosfære av argon natten over hvoretter reaksjonen ble fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en pasta. Det rå materialet ble oppløst i en minimumsmengde av MeOH og langsomt tilsatt til raskt omrørt, 0 °C avkjølt vann (100 ml). Forbindelse 8 ble deretter isolert ved filtrering (0,080 g). ICso 20S CT-L < 50 nM, ICsoCelle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( P)

Til en 0 °C løsning av (O) [fremstilt ved å følge samme fremgangsmåte som for syntese av (B) bortsett fra at fenylalanin benzylester erstattes av fenylalanin metylester] (1,8 mmol, 1 ekv.) i DMF (10 ml) ble det tilsatt kloracetylklorid (2,7 mmol, 0,22 ml, 1,5 ekv.) og DIEA (3,5 mmol, 1,4 ml, 3 ekv.). Blandingen fikk oppvarmes og omrøres ved romtemperatur natten over. Reaksjonen ble konsentrert under vakuum og oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over Na2S04. Na2S04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk, hvilket gir (P) (0,64 g).

Syntese av ( Q)

Til en løsning av (P) (0,188 mmol, 0,10 g) i THF (20 ml) ble det tilsatt N-metylpiperazin (0,226 mmol, 22,0 mg) og Kl (0,04 mmol, 6,4 mg). Etter omrøring natten over ved romtemperatur ble innholdet konsentrert og oppløst i EtOAc, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk hvilket gir den rå esteren (0,095 g). Den rå esteren (0,095 g) ble oppløst i 3:1 MeOH / H20 (8 ml), avkjølt til 0 °C og LiOH (1,6 mmol, 39,0 mg) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 5 °C natten over, behandlet med mettet NH4CI, fortynnet med vann (20 ml) og pH justert til 3 med IN HC1. Blandingen ble ekstrahert med kloroform og de organiske lagene kombinert og tørket over Na2S04. Na2S04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk, hvilket gir (Q) (20,0 mg).

Syntese av Forbindelse 9

(0,082 mmol, 2,4 ekv.) i DMF (1 ml) ble det tilsatt (Q) (0,034 mmol, 0,075 g, 1 ekv.), DIEA (0,29 mmol, 50 ul, 8,5 ekv.) og HOBT (0,13 mmol, 18,0 mg, 3,8 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og BOP (0,13 mmol, 0,058 g, 3,8 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner.

Blandingen ble deretter omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04, filtrert og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 9. IC5020S CT-L < 50 nM, IC50Celle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( R)

Til en løsning av benzyl 2-bromacetat (4,56 mmol, 0,715 ml) og 4-(2-hydroksyetyl)morfolin (3,8 mmol, 0,466 ml) i DMF (4 ml) ble det tilsatt NaH (5,7 mmol, 0,136 g) og blandingen ble omrørt natten over under en atmosfære av nitrogen. Reaksjonen ble fortynnet med saltoppløsning og ekstrahert med EtOAc. De organiske lagene ble samlet, vasket med vann og saltoppløsning og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Den rå esteren ble renset ved flash kromatografi. Den rensede esteren ble oppløst i 1:1 MeOH / EtOAc (10 ml), 5% Pd/C (0,100 g) ble tilsatt og blandingen plassert under en atmosfære av hydrogen natten over. Reaksjonen ble spylt, filtrert gjennom celite og konsentrert under vakuum hvilket gir (R) (0,107 g).

Syntese av ( S)

Til en løsning av (B) (0,56 mmol) i DMF (15 ml), ble forbindelse (R) (0,56 mmol, 0,107 g) tilsatt fulgt av DIEA (2,24 mmol, 0,391 ml). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og HOBT (0,90 mmol, 0,121 g) og PyBOP (0,90 mmol, 0,466 g) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt under en atmosfære av argon under oppvarming til romtemperatur natten over. Blandingen ble fortynnet med saltoppløsning (50 ml) og ekstrahert med EtOAc (5x20 ml). De organiske lagene ble samlet, vasket med mettet NaHC03(5x15 ml) og saltoppløsning (1x25 ml) og tørket over MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk, hvilket gir (S).

Syntese av ( T)

Til en løsning av (S) (0,56 mmol) i 1:1 MeOH / EtOAc (10 ml) ble det tilsatt 5% Pd/C (0,1 g) og blandingen ble plassert under en atmosfære av hydrogen natten over. Reaksjonen ble spylt, filtrert gjennom celite og konsentrert under vakuum, hvilket gir (T).

Syntese av Forbindelse 10

(0,164 mmol, 1,0 ekv.) i DMF (10 ml) ble det tilsatt (T) (0,16 mmol, 0,100 g, 1 ekv.), DIEA (0,64 mmol, 112 ul, 4,0 ekv.) og HOBT (0,25 mmol, 35,0 mg, 1,6 ekv.). Blandingen ble avkjølt til 0 °C i et isbad og PyBOP (0,25 mmol, 0,133 g, 1,6 ekv.) ble tilsatt i mange porsjoner. Blandingen ble omrørt ved 5 °C under en atmosfære av nitrogen natten over. Reaksjonen ble deretter fortynnet med mettet NaCl og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til en olje som ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir forbindelse 10 (19,0 mg). IC5020S CT-L < 50 nM, ICsoCelle-basert CT-L <50 nM.

Syntese av ( W)

Til en løsning av Fmoc-Phe (4-CF3)-OH (2,2 mmol, 1,0 g,) i DCM (20 ml) ble det tilsatt 1-metylimidizol (6,7 mmol, 0,370 ml). Når løsningen var homogen, ble l-(mesitylen-2-sulfonyl)-3-nitro-lH-l,2,4-triazol (MSNT) (2,9 mmol, 0,870 g,) tilsatt. Straks MSNT var oppløst, ble reaksjonsblandingen tilsatt til Wang resin (0,8 mmol, 1,0 g) og den resulterende løsningen ble ristet i 45 minutter. Resinen ble filtrert og vasket med DMF (50 ml), MeOH (50 ml) og DCM (50 ml). Den resulterende resinen fikk lufttørke, hvilket gir (W).

Syntese av ( X)

Til (W) (0,40 mmol, 0,5 g) ble det tilsatt 20% piperidin/DMF (10 ml) og den resulterende heterogene løsningen ble ristet i 20 minutter. Blandingen ble filtrert og resinen vasket med DMF (20 ml), MeOH (20 ml) og DCM (20 ml) og tillatt å lufttørke. Resinen ble underlagt de ovennevnte reaksjonsbetingelsene en gang til, hvilket gir (X).

Syntese av ( Y)

Til (X) (0,40 mmol) ble det tilsatt DMF (20 ml), Fmoc-Leu-OH (0,40 mmol, 0,143 g), DIEA (1,6 mmol, 0,12 ml), HOBT (0,64 mmol, 0,086 g) og BOP (0,64 mmol, 0,178 g) og reaksjonsblandingen ble ristet natten over. Reaksjonsblandingen ble filtrert og resinen vasket med DMF (40 ml), MeOH (40 ml) og DCM (40 ml) og tillat å lufttørke, hvilket gir (Y).

Syntese av ( Z)

Til (Y) (0,08 mmol, 0,10 g) ble det tilsatt 20% piperidin/DMF (2 ml) og den resulterende heterogene løsningen ble ristet i 20 minutter. Løsningen ble filtrert og resinen vasket med DMF (10 ml), MeOH (10 ml) og DCM (10 ml) og fikk lufttørke. Resinen ble underlagt ovennevnte reaksjonsbetingelse en gang til, hvilket gir (Z).

Syntese av ( AA)

Til (Z) (0,08 mmol, 0,10 g) ble det tilsatt DMF (20 ml), Fmoc-hPhe-OH (0,40 mmol, 0,143 g), DIEA (1,6 mmol, 0,12 ml), HOBT (0,64 mmol, 0,062 mg) og BOP (0,64 mmol, 0,178 g) og reaksjonsblandingen ble ristet natten over. Reaksjonsblandingen ble filtrert og resinen vasket med DMF (40 ml), MeOH (40 ml) og DCM (40 ml) og fikk lufttørke, hvilket gir (AA).

Syntese av ( BB)

Til (AA) (0,08 mmol, 0,10 g) ble det tilsatt 20% piperidin/DMF (2 ml) og den resulterende heterogene løsningen ble ristet i 20 minutter. Løsningen ble filtrert og resinen vasket med DMF (10 ml), MeOH (10 ml) og DCM (10 ml) og tillat å lufttørke. Resinen ble underlagt ovennevnte reaksjonsbetingelse en gang til, hvilket gir (BB).

Syntese av ( CC)

Til (BB) (0,08 mmol, 0,10 g) ble det tilsatt DMF (2 ml), 4-morfolinoeddiksyre (0,10 mmol, 0,015 g), DIEA (0,17 mmol, 0,029 ml), HOBT (0,11 mmol, 0,016 g) og BOP (0,11 mmol, 0,051 g) og reaksjonsblandingen ble ristet natten over. Reaksjonsblandingen ble filtrert og resinen vasket med DMF (15 ml), MeOH (15 ml) og DCM (15 ml) og fikk lufttørke, hvilket gir (CC).

Syntese av ( DD)

Til (CC) (0,08 mmol, 0,10 g) ble det tilsatt 50% TFA/DCM (2 ml) og blandingen ble ristet i 20 minutter (resinen ble fiolett). Reaksjonsblandingen ble filtrert og resinen vasket med DCM (10 ml). De flyktige stoffene ble fjernet under redusert trykk og den resulterende oljen ble fortynnet med DCM (10 ml) og inndampet totalt tre ganger, hvilket gir (DD).

Syntese av Forbindelse 13

Til en omrørt løsning av (E) [se: Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2283-2288] (0,11 mmol, 0,019 g) i MeCN (2 ml) ble det tilsatt (DD) (0,1 mmol), DIEA (2,9 mmol, 0,5 ml), HOBT (0,2 mmol, 0,032 g) og BOP (0,23 mmol, 0,103 g) og blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over. Reaksjonen ble fortynnet med saltoppløsning (15 ml) og ekstrahert med EtOAc. Det organiske laget ble vasket med vann, mettet NaHC03og saltoppløsning og tørket over vannfri MgS04. MgS04ble fjernet ved filtrering og de flyktige stoffene fjernet under redusert trykk. Det rå materialet ble renset ved flash kromatografi, hvilket gir 13 (12,6 mg). ICso 20S CT-L < 500 nM, ICso Celle-basert CT-L <50 nM.

Ekvivalenter

Fagfolk på området vil være klar over eller være i stand til å bestemme ved anvendelse av ikke mer enn rutinemessig eksperimentering, en rekke ekvivalenter til forbindelsene og fremgansgmåtene for anvendelse derav beskrevet her. Slike ekvivalenter anses å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse og omfattes av de følgende kravene.

Alle de ovenfor angitte referansene og publikasjonene inntas herved ved referanse.

Claims

1. Fremgangsmåte for syntetisering av forbindelse 8

omfattende (a) å blande forbindelse (B) eller et salt derav og 4-morfolineddiksyre for å danne forbindelse (M): (b) å reagere forbindelse (M) med hydrogen og palladium på karbon for å danne forbindelse (N): (c) å blande forbindelse (N) og forbindelse (E) eller et salt derav for å danne forbindelse 8

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, der forbindelse (B) er et trifluoreddiksyresalt.

3. Fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 2, der trinn (a) videre omfatter tilsats av benzotriazol-1 -yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).

4. Fremgangsmåte for fremstilling ifølge hvilket som helst av krav 1 til 3, der forbindelse (E) er et trifluoracetatsalt.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av krav 1 til 4, der trinn (c) videre omfatter tilsats av benzotriazol-l-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).

6. Fremgangsmåte for fremstilling ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5, som videre omfatter et trinn (d) å isolere forbindelse (8) via filtrering.