NO175642B - - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et hovedsakelig

rent humant tumor gp580 antigen for in vitro diagnose, en fremgangsmåte for fremstilling derav, et antistoff mot det og en kontinuerlig cellelinje som fremstiller antistoffet, samt anvendelse av antistoffer ved en in vitro anvendelse av nevnte antistoff som har en spesifisitet for antigenet ovenfor ved en in vitro diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av nærvær av metastatiske mennesketumorceller i en prøve, hvori man bringer prøvene i kontakt med dette, og påviser materialer bundet av antistoffet.

Brystkreft utgjør en hovedårsak til dødsfall blant kvin-

ner i Nord-Amerika og Nord-Europa. Selvom nylige fremskritt betraktelig har forbedret graden av påvisning og utryddelse av primær brystkreft, vil en stor prosent av brystkreftpasienter utvikle metastatiske skader og til slutt dø.

Prosessen ved tumormetastase foregår gjennom en rekke sekvensielle og høyt selektive trinn. Mange av disse trinn krever en rekke komplekse vekselvirkninger mellom tumor-celle-

ne og vertscellene rundt dem, og majoriteten av disse vekselvirkninger viser seg å være formidlet ved celleoverflatekomponenter. For å undersøke de mulige funksjonelle roller av visse celleoverflatekomponenter i den metastatiske prosess,

har forsjellige forskere korrelert ekspresjonen eller de enzymatiske aktiviteter til disse komponenter med det metastatiske potensial av tumorcellesublinjer eller kloner. Alternativt er overflater av tumorceller blitt modifisert metabolsk eller enzymatisk, og de metastatiske egenskaper til de modifiserte celler undersøkt.

For eksempel er celleoverflatekomponenter av sponant metastaserende adenokarcinom i melkekjertel hos rotte tidlige-

re blitt undersøkt etter mulige biokjemiske markører som kan assosieres med melkekjerteltumormetastase i rotte. Et system som er blitt funnet å være en anvendbar modell for tumormetastase i melkekjertel hos rotte, er rotte 13762NF melkekjertel-adenokarcinom beskrevet i Neri et al. (1982), J. Natl. Cancer Inst., 68: 507-517. Forskjellige cellekloner og linjer

fra 13762NF-systemet ble funnet å være forskjellige når det

gjaldt deres evne til spontant å metastasere til regionale lymfeknuter og fjerntliggende organer. I tillegg viser de forskjeller i celle- og vevsmorfologisk utseende, karyotyper og responser på terapeutiske forbindelser.

Ekspresjonen av spesielle celleoverflateglykoproteiner ble funnet å samsvare med de metastatiske egenskaper til disse celler. For eksempel uttrykkes sialoglykoproteiner som har molekylvekter mellom 175.000 og 250.000, på metastase-deriver-te celler, mens hovedsialoglykoproteiner har molekylvekter mellom 80.000 og 120.000 i celler oppnådd fra en primær rottetumor. Et sialoglykoprotein som har en molekylvekt på omtrent 80.000 ble redusert i ekspresjon i mere metastatiske rottetumorceller; et annet glykoprotein som hadde en molekylvekt på omtrent 580:000, syntetisert av rottetumorceller, ble økt i ekspresjon i de mere høyt metastatiske rottetumorceller. Imidlertid er ikke noe metastaseassosiert 580 kilodalton glyko-protein tidligere blitt identifisert i, eller funnet å være assosisert med, mennesketumorceller.

Identifiseringen av mennesketumor-assosierte antigene proteiner på mennesketumorcelleoverflater kan føre til produksjon av antistoffer som er istand til å immunodiagnostisere mennesketumorceller. Dessverre er mange mennesketumorcelle-overf latekomponenter enten svakt eller ikke antigene, eller er også assosiert med forskjellige normale menneskevev. Der hvor celleoverflateantigener er felles både for normale og tumorceller, er immunodiagnostiske koder rettet direkte mot slike antigener utilfredsstillende i og med at de utøver et høyt antall falskt positive reaksjoner.

Cancerimmunodiagnostiske koder har derfor vært upresise i og med at de enten påviser høye antall falskt positive reaksjoner og/eller falskt negative reaksjoner. Følgelig vil en tumordiagsnostisk kode som utøver en høy grad av korrelasjon med cancer-tilstand i mennesket være anvendbar i tidlig diagnostikk og behandling av mennesketumorer. I tillegg vil en imunodiagnostisk kode som korrelerer med metastatiske tumorer på samme måte være anvendbar for den behandlende onkolog eller kirurg.

Gp580 antigenet ifølge oppfinnelsen omfatter et gluko-protein som har en molekylvekt som er identifiserbar på SDS-PAGE på omtrent 550 kilodalton, er isolerbart fira celle-membranfraksjoner av melkekjertelkarcinomceller; i det vesentlige resistent mot behandling med trypsin eller hyaluronidase og i det vesentlige følsomt for behandling med pronase; eller ved at det viser vesentlig binding til peanøttagglutinin etter behandling med neuraminidase, og er et hgp580 antigen som har omtrent det følgende antall av hver av de angitte aminosyrerester pr. 1000 aminosyrerester av glykoproteinet:

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer, både polyklonale og monoklonale, fremstilt mot et 580 kilodalton glykoprotein tumor antigen, betegnet gp580, som er anvendbare i identifikasjon av metastatiske mennesketumorceller. En form av gp580 antigenet som er funnet å være isolerbar fra rottetumorceller, spesielt rottemelkekjertel karcinomceller, er blitt betegnet rgp580; et beslektet antigen som er kjemisk adskillbart fra rgp58 0 er blitt isolert og karakterisert fra en mennesketumorkilde, hvor antigenet blir betegnet hgp580. Som anvendt her betyr betegnelsen "isolerbar" at det spesielle antigen kan karakteriseres ved å være isolerbart fra en spesiell kilde. Imidlertid er denne beteg-nelse ikke ment å medføre at en slik kilde er den eneste kilde for isolasjon av det således betegnede antigen.

Gp580 antigenene av den foreliggende oppfinnelse er glykoproteiner som har en molekylvekt som er identifiserbar ved gelelektroforese, på omtrent 580 kilodalton. Som anvendt her, betyr betegnelsen "identifiserbar" at gp580 antigener vil ha en omtrentlig molekylvekt på 580 kilodalton når den underkastes gelelektroforese under betingelser som er identiske med de som er beskrevet her.

Imidlertid, som det vil forstås av fagfolk på området, er slike størrelsesbestemmelser ikke på noen måte nøyaktige, og slike forandringer eller variasjoner i molekylstørrelsesut-formingsteknikker kan resultere i variasjoner i størrelsen av et spesielt antigen.

I en foretrukket utførelsesform er antistoffet et monoklonalt antistoff fremstilt ved standard teknikker som er velkjente for fagfolk på området. Slike monoklonale antistoffer fremstilles fortrinnsvis ved en sammenføring av immu-niserte rottemiltceller med rottemyelomceller. Imidlertid er det funnet at full fordel av den foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved sammenføring av andre celletyper, inkludert celler av museslektopprinnelse.

Det er videre et mål for den foreliggende oppfinnelse å frembringe en hybrid kontinuerlig cellelinje som produserer antistoffer som reagerer med hgp580 antigen eller rgp580 antigen ved en prosess hvor man sammenfører pattedyrmilt-celler med ^yelomceller fra en homolog art, hvor organismen som gir miltcellene er blitt immunisert med en antigenblanding som omfatter et gp580 antigen; dyrking av cellene i et selektivt medium; testing på nærvær av det ønskede antistoff; og kloning av celler som produserer det ønskede antistoff. Kontinuerlige hybrid cellelinjer som produserer antistoffer som er reaktive mot human hgp580 antigen, kan dannes ved å bruke miltceller som er blitt immunisert mot enten hgp580 eller rgp580 antigen, i og med at slike antistoffer er blitt funnet å kryssreagere.

Hovedsakelig rene tumor gp580 antigener anvendbare i produksjon av mennesketumor-rettede antistoffer, fremstilles ved en prosess som inkluderer trinn hvor man ekstraherer løselige proteiner, inkludert gp580 fra en tumor som inneholder gp580; underkasting av ekstraktet for geleksklusjonskromatografering; oppsamling av ekskludatet; underkasting av ekskludatet for anionisk utvekslingskromatografering; eluering av fraksjonene som binder seg til de anioniske utvekslings-harpikser; underkasting av eluenten for geleksklusjonskromatografering; og oppsamling av de ekskluderte fraksjoner. Fagfolk på området vil oppdage at det eksisterer mange variasjoner for proteinisolasjonsteknikker.

Hovedsakelig rent rpg580 antigen, også anvendbart i produksjon av mennesketumor-rettede antistoffer, kan fremstilles på lignende måter. I tillegg kan gp580 fremstilles ved en prosess som inkluderer trinn hvor man ekstraherer løselige proteiner, inkludert gp580, fra en rotte- eller mennesketumor som inneholder antigenet; underkaster ekstraktet geleksklusjonskromatografering; samler opp ekskludatet; underkaster ekskludatet densitetsgradientsentrifugering; fraksjonerer den ekvilibrerte densitetsgradient; underkaster de gp580-holdige fraksjoner geleksklusjonskromatografering; og oppsamler de ekskluderte fraksjoner. Nærmere bestemt er fremgangsmåten særpreget ved at den omfatter

A.

(a) ekstrahering av løselige proteiner, inkludert gp580, fra en tumor som inneholder gp580; (b) ekstraktet underkastes geleksklusjonskromatografi på Sephadex G-50; (c) oppsamling av ekskludatet; (d) eksludatet underkastes anionbytte-kromatografi på

DEAE-Sephacel; (e) eluering av fraksjonene som binder seg til anionbytterharpiksen, (f) eluenten underkastes geleksklusjonskromatografi på

Sepharose CL-2B,

og

(g) samling av de ekskluderte fraksjoner; eller

B.

(a) ekstrahering av løselige proteiner, inkludert gp580, fra en tumor som inneholder gp580; (b) ekstraktet underkastes geleksklusojnskromatografi på Sephadex G-50; (c) oppsamling av ekskludatet; (d) ekskludatet underkastes densitetsgradient-sentrifugering på cesiumklorid; (e) fraksjonering av den ekvilibrerte densitetsgradient; (f) de gp580-inneholdende fraksjoner underkastes gel-eksklusj onskromatograf i på Sepharose CL-2B; og

(g) oppsamling av de ekskluderte fraksjoner.

Denne prosess inkluderer et tilleggstrinn med densitetsgradientsentrifugering som er funnet ikke å være vesentlig i fremstillingen av hovedsakelig rene gp580 antigener.

Et videre mål for den foreliggende oppfinnelse er en diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelse av metastatiske mennesketumorceller i prøven, hvor man bringer prøven i kontakt med et antistoff som har en spesifisitet for enten hgp580 eller rgp580 antigen, og påviser materialer bundet til antistoffet. Full fordel av denne fremgangsmåten kan fåes ved å blande prøven med antistoffet under betingelser som vil fremme spesifikke antigen/antistoff-reaksjoner og påvisning av antigen/antistoff-reaksjonene. Det er funnet at slike diagnostiske fremgangsmåter er generelt anvendbare på prøver som er oppnådd fra tallrike biologiske kilder, inkludert, men ikke begrenset til, blod, plasma, melk, brystsekre-sjoner, urin, spytt, svette, serum og vevsprøver.

Det er et videre mål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av nærvær av metastatiske mennesketumorceller i en ikke-vandig prøve som består av trinn hvor man legger prøven lagvis med et rgp580 eller hgp580 antistoff; inkubering av den lagvise prøven under betingelser som vil fremme spesifikke antigen/- antistoff interaksjoner; og påvisning av antigen/antistoff interaksj onen. Fig. 1. Skjematisk diagram over prosedyrene anvendt i isolasjonen av rgp580. Fig. 2. Gelfiltrering av radioaktivt merkede makromolekyler, syntetisert med MTLn3 celler etter dissosiativ CsCl densitetsgradient ultrasentrifugering. A, [<3>~H] Glukosamin-(-) og [<35>~S] sulfat. (...); og B, [<3>"H]-serinmerkede cellulære ekstrakter fra de forskjellige densitetsgradient-fraksjonene ble underkastet Sepharose CL-2B kolonnekromatografering i 4 M guanidin HC1 (GdnHCl) og 0,1 M natriumacetat, alle med pH 5,8. Gjennomsnittsdensiteten av fraksjonene er anført (p-verdier), og pilene representerer hulromsvolum (V0) og totalvolum (VT) av elueringsfraksjoner av kolonnene. Fig. 3. Ionebyttekromatografering på DEAE Sephacel kolonner av metabolsk radiomerkede, oppsamlede hulromsvolum-fraksjoner fra Sepharose CL-2B eluering. Elueringsprofiler av A, [<3>"H) glukosamin-, B, [<3>~H) fucos-, og C, [<U>~C] serin-merkede prøver fra dyrkede MTLn3 celler er vist. Den tykke linjen representerer konsentrasjonen av natriumklorid-eluering. De forskjellige fraksjoner I, II, III og IV ble oppsamlet for videre analyse. Radioaktive topper ble angitt ved deres elueringsposisjon sammenlignet med [<3>~H] glukosaminprøven. Fig. 4. Dietylaminoetyl (DEAE) Sephacel elueringnsprofil for rottetumorekstrakt-densitetsgradientfraksjoner (A). Den tykke linjen representerer konsentrasjonen av natriumklorid anvendt i elueringen. De forskjellige topper (I-IV) ble oppsamlet hver for seg, og så ble alikvote mengder underkastet

SDS-PAGE.

Fig. B, Autoradiogram av binding av 125 i-merket peanøtt-agglutinin (PNA) til de rensede DEAE oppsamlede topper etter

SDS-PAGE på en 7,5% akrylamidgel. Feltene A-D tilsvarer topper I-IV fra DEAE kolonnen. Bindingen av PNA ble vist å være spesifikk ved kontrollgel, hvor laktose gikk inn i inku-beringen. Proteinstandardene inkluderer myosin, B-galactosi-dase, fosforylase, bovinserumalbumin og ovalbumin med Mr(X10<3>) på henholdsvis 200, 130, 92, 68 og 45. Fig. 5. Binding av MAb GP21:56 til glutaraldehydfikserte og ufiksterte, levende 13762NF adenokarcinomceller. <1>25i-merket MAb GP21:56 ble inkubert i 1 time, og den reaktivt bundede celle bestemt direkte etter lysing av cellene. Fikserte celler (skraverte); ufikserte celler (åpne søyler). Fig. 6. SDS-PAGE av radiomerkede og rensede fraksjoner. Figur A, [<3>"H] glukosamin-merkede Sephacel DEAE-cellulose-fraksjoner I til IV som tilsvarer felt A til D. Figur B,

["C] serin-merket renset gp580 (felt A), og trifluormetyl-sulfonsyrebehandlet gp580 (felt B) er vist. Elektroforese ble utført på en 2 til 17,5% DATD akrylamidgel fulgt av fluorografering. Proteinstandardene inkluderer myosin, fosforylase a, bovinserumalbumin og ovalbumin, med Mr(X 10<3>) på henholdsvis 200, 94, 68 og 45.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører humane tumor-immunodiagnostiske reagenser som er anvendbare i identifikasjon og diagnostikk av kreft, og nærmere bestemt diagnostikk av metastatisk kreft i mennesker. Det er blitt funnet at monoklonale antistoffer fremstilt mot et rottetumorcelleover-flateglykoprotein, betegnet rgp58 0, eller et mennesketumor-celleoverflateglykoprotein, betegnet hgp580, er anvendbare mennesketumordiagnostiske reagenser. Videre er terapeutiske sammensetninger som inkluderer slike antistoffer blitt funnet å inhibere utviklingen av metastatiske skader.

Selvom rotte rgp580 protein tidligere er blitt vist å uttrykkes på celleoverflater av forskjellige rottetumorer, er det aldri blitt påvist å være antigent.

På samme måte er aldri 580 kilodalton glykoprotein noen gang funnet i forbindelse med mennesketumorceller. Derfor muliggjør den foreliggende oppfinnelse at antistoffer rettet mot rottetumorantigen rgp580, pålitelig kan immunodiagnostisere mennesketumorer. I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse antistoffer rettet mot et tidligere ubeskre-vet menneske-580 kilodalton glykoprotein antigen som på samme måte er anvendbart i immunodiagnostikk av menneskecancer. Begge de beskrevne antistofftyper viser seg å reagere sterkt med metastatiske menneskebrysttumorer.

Den foreliggende oppfinnelse er beskrevet som teknikker, hvilke av oppfinnerne er bestemt å være spesielt anvendbare ved 1) isolasjon og delvis rensing av rgp580 antigenet; 2) fremstilling av monoklonale antistoffer med spesifisitet for rgp580 antigenet; 3) isolasjon og delvis rensing av hgp580 antigenet; og 4) fremstilling av monoklonale antistoffer med spesifisitet for hgp580 antigenet. Antigenrensingstrinnet benytter antigenenes relative store molekylvekt, deres opp-flytende densitet i forhold til andre proteiner og deres elektrostatiske ladninger i forhold til andre proteiner. Monoklonale antistoffer ble fremstilt ved å bruke både rotte/- rotte- og muse/muse-fusjoner, med rotte/rotte-hybrider som de foretrukne.

Eksperimenter utført av de foreliggende oppfinnere har demonstrert den potensielle nytte av anti gp580 antistoffer i påvisning av kreft som et immunoselekterende antistoff. Immunopåvisningsteknikkene som er beskrevet her er unike ved at de anvender spesielle antistoffer med spesielle spesifisi-teter for proteiner som tidligere ikke er kjent å være anti-geniske og tidligere ikke er kjent i forbindelse med mennesketumorer. Imidlertid er den grunnleggende immunoseleksjonstek-nologi vel kjent for fagfolk på området.

I dens mest generelle utførelsesform innebærer immuno-seleksjonen at man bringer et gp580 antistoff i kontakt med en prøve som er mistenkt for å ha enten tumorceller eller tumor-celleprodukter (for eksempel tumorantigener) i seg. Derfor vil en positiv immunoreaksjon mellom en mistenkt prøve og gp580 antistoffet være indikativ på tiltedeværelse av cancer-celler i orgnismen som prøven ble tatt fra. Tallrike teknikker for påvisning av en positiv immunoreakson er kjent innen faget, inkludert radioaktaive markører, fargedannelsesforbind-eiser, aktivering ved enzymer (for eksempel peroksidase) bundet til enten antigenet eller antistofer, radioimmunoassays (RIA) enzymbundede immunosorbent assays (ELISA) eller andre ligander bundet til antigenet eller antistoffer, slik som ferritin eller avidin/biotin.

Det er også funnet at gp580 antigener i den foreliggende oppfinnelse kan vise seg anvendbare som kreftpåvisnings-reagenser selv. For eksempel kan slike antigener inngå i en egnet ELISA for å påvise tilstedeværelse av sirkulerende anti-gp580 antistoffer i en pasients serum, idet nærvær av slike sirkulerende antistoffer er indikativ for kreft. Teknikker for anvendelse av antigener for å påvise sirkulerende antistofer er stort sett vel kjent på fagområdet.

Alternativt kan antistoffpreparater av anti-gp580 bindes til toksygene molekyler, slik som kolera, rivin abrin, eller modeccin toxin for å produsere spesifikke "draps"-antistoffer. Slike toxin-konjugerte antistoffer vil derved ha spesifisitet både for måltumorcellene og evne til å drepe slike celler med én gang de er målmerket. Slike antistoffer vil derfor ha evne til både å søke ut og ødelegge tumorcellepopulasjoner og forhindre utvikling av slike populasjoner i første omgang.

Det er funnet at antistoffer i den foreliggende oppfinnelse kan inngå i et kreftpåvisningssett. Slike sett vil inneholde det egnede anti-gp580 antistoff sammen med et immunoreaksjonspåvisningsreagens. Her betyr et immunoreaksjonspåvisningsreagens et reagens som er istand til å indikere eller påvise en spesifikk immunoreaksjon mellom antistoffet og gp580 antigenet. Eksempler på slike reagenser er peroksidase-bærende eller radiomerkede antigener eller antistoffer. Slike reagenser og deres anvendelse er vel kjent for fagfolk på området.

Eksempel I: Isolasjon og karakterisering av rotte rgp58Q

Rotte 580 kilodalton glykoprotein rgp580 kan isoleres

fra tallrike rottetumorer eller rottetumorcellelinjer. Faktisk vil enhver rottetumor som er funnet å kryssreagere med anti-rgp580 rotteantistoffet, tjene som utgangsmateriale for isolasjon av dette rottetumorantigen. Imidlertid har de nåværende oppfinnere bestemt at et foretrukket materiale for rgp580 er rottemelkekjertel adenokarcinomceller, da disse celler viser seg å ha et høyt nivå av rgp580 assosiert med membranene. Spesielt en cellelinje, rotte 13762NFtumorcelleklon MTLn3

er anvendt som et foretrukket utgangsmateriale. Slike celler ble klonet fra spontane lungemetastaser som beskrevet av Neri et al (1982), J. Nati. Cancer Inst.; 68; 507-157.

Figur 1 er et skjematisk diagram over prosedyrene,

beskrevet i mere detalj nedenfor, anvendt i isolasjonen av rgp580, i korte trekk blir, etter ekstrahering av løselige proteiner fra en passende tumorcelle, ekstraktet passert over en Sephadex G-50 kolonne og hulromsfraksjonene blir oppsamlet.

De oppsamlete hulromsfraks joner blir så sentrifugert i en

CsCl flytende tetthetsgradient fulgt av Sepharose C1-2B kromatografering. Sepharose C1-2B fraksjonene blir så satt på en DEAE Sepha-el kolonne, eluert med NaCl; og fraksjonene analysert for nærvær av rgp580.

a. Kjemikalier

De følgende kjemikalier representerer en delvis liste over eksempelvise reagenser anvendt i både isolasjonen av rgp580 og dens karakterisering. Imidlertid vil fagmenn på området oppdage at tallrike egnete erstatninger kan anvendes uten å fjerne seg fra oppfinnelsens område. D-[6-<3>h)glukosamin (20 til 30 Ci/mmol), D- "l-3Hj galaktose (1 til 5 Ci/mmol, L- (6-<3>h] fukose (20til 35 Ci/mmol), L-[4, 5-3h) leucin (30 til 50 Ci/mmol), L [6-3h] serin

(5 til 10 Ci/mmol), L-ju-<14>Cj serin (135 til 165 mCi/mmol) og J~<35>sJ Na2S04 ble kjøpt fra ICN Pharmaceuticals (Irvine, CA);

D- |2-3HJ mannose (10 til 20 Ci/mmol var fra New England Nuclear (Boston, MA); Streptomyces hyaluronidase og chondroitinase ABC var fra Miles Laboratories (Elkhart, IN); kollagenase type VII var fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); trypsin (krystallisert tre ganger) var fra Worthington (Freehold, NJ); prognase var fra Calbiochem (San Diego, CA); Alpha modifisert eagle's medium (AMEM) var fra GIBCO (Grand Island, NY); fetal bovin serum (FBS) var fra Sterile Systems (Logan, UT); og cesium klorid var fra Bethesda Research Laboratories (Rockville, MD).

b. Celler

Rotte 13762NF tumorcelleklon MTLn3 med høy metastatisk potensial gir høye nivåer av rgp580 og er derfor et foretrukket utgangsmateriale for isolasjon av denne. Celler anvendt til isolasjonen ble klonet fra spontane lungemetastaser som beskrevet i Neri et al. (1982), J. Nati. Cancer Inst., 68: 507-517, og lagret som frosen lagret stamme. MTLn3 celler ble dyrket ved 37°C i en 5% CC>2-fuktig luftblanding på 100 mm vevkulturpiater (Corning Glass, Corning, N.Y.) i AMEM media som inneholdt 10%

FBS og ikke noe antibiotika. Cellene som'ble anvendt i dette eksempel var i eksponentiel vekstfase og var fra in vitro passasjer T14 til T20. Cellene ble rutinemessig selektert og funnet å være fra mykoplasma og viral forurensning ved fremgangsmåten til Chen (1976), In Vitro, 3: 229-232.

Brysttumorer ble oppnådd ved subkutan injeksjon av omtrent

1 x 10^ levende MTLn3 celler inn i inguinal melkekjertelfettpute av lett anesteserte, seksuelt reproduserende Fischer 344 hunn-rotter (Charles River Breeding Laboratories, Portage, MI). Denne prosedyre resulterte i en tumor med en diameter på 11,7 4,6 mm 30 dager etter injeksjon av tumorcellene med 100% og 50% av tumor-bærende dyr med henholdsvis lymfeknute og lungemetastatiske skader. Fordi tumorens sentrum var nekrotisk etter 30 dager,

ble majoriteten av de anvendte tumorer innhøstet ved 14 dager.

For tumor innhøstning ble rottene drept ved inhalering av Metofan (Pitman-Moore), Inc., Washington, NJ), og tumorene ble forsiktig fjernet fra omgivende vev, vasket i fosfat-buffret saltvann (PBS) og finhakket. Tumorstykkene ble så ekstrahert som beskrevet nedenfor.

c. Radioaktiv merking av tumorceller

Metabolsk radiomerking av i_n vitro dyrkete celler ble anvendt for å merke rgp580 antigenet radioaktivt. Hovedsakelig ble dette på en passende måte utført ved å dyrke cellene i komplett medium

(AMEM pluss 10% FBS; 5 ml i en 100 mm kulturplate) som inneholdt 10u Ci/ml avl3H J glukoseamin, L<3>H~j galaktose eller[3h1 fukose i 24 timer for å merke karbohydratdelene. I eksperimenter hvor celler ble merket med mannose, ble 200u Ci/ml funnet å være til-strekkelig når det ble tilsatt til komplett medium hvor AMEM inneholdt halvparten av den normale konsentrasjon av dextrose

(1 gram/liter). For å fremstille celler merket med leucin,

'14 '3 "<4 >.. C. serin eller i. Hi serin, inneholdt mediet 10u Ci/ml av den radioaktive forløper og en tiendedel av den vanlige konsentrasjon av aminosyren (henholdsvis 5,25 mg/l og 2,5 mg/l). MTLn3 cellene ble merket med 50u Ci/ml av Na2L<35>s]o4 i AMEM hvor MgS04 (80,9 mol) var erstattet med MgCl2. Etter :en 24 timers merkingsperiode kan mediet samles, sentrifugeres ved 4°C i 10 minutter ved 2.000 x g for å fjerne cellulære rester og fryses ved -80°C. Kulturplatene ble vasket to ganger med PBS og rgp580, ekstrahert fra cellene som beskrevet nedenfor.

d. Isolasjon av rgp580 fra metabolsk merkete tumorceller

Celler som er blitt metabolsk merket med radioisotoper,

kan anvendes i isolasjon av rgp580 for å gi et middel for måling av isolasjonen og renheten som beskrevet ovenfor. Det merkete protein migrerer nær hulromsvolumet av Sepharose CL-4B kolonner.

125

I tillegg b<a>nder rgp580 I-merket peanuttagglutinin etter d3sialisering, og dedesialiserte rgp580 kan identifiseres etter SDS polyakrylamidgel elektroforese (SDS-PAGE) som et høymolekyl-vekt PNA-bindende glykoprotein. Disse to teknikker, beskrevet

nærmere nedenfor, ble anvendt for å måle renheten av

rgp580 fra både dyrkete MTLn3 celler og MTLn3 tumorer.

Ekstraksjonen av rgp580 utføres ved først å løse cellene

(0,5 x IO<6> celler pr. plate) i ekstraksjonsbuffer (lml pr.

fem plater med 4% Zwittergent 3-12, 4 M guanidin HC1, 0,1 M 6-aminoheksanoisk syre, 10 mM Na2 EDTA, 5 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid 5 mM benzamidin-HCl, 10 millienheter/:r.l aprotinin og 0,1 M natriumacetat; pH 6,0). Platene ble skrapet, ekstrakter kombinert og oppløsningsprosessen fortsatt ved 4°C i 18 timer med røring. Det var ingen synlig økning i frigjøringen av høymolekylvekt [3ri]glukosamin- eller [3h] serin-merket materiale fra cellene hvis de ble sekvensielt ekstrahert med 8% Zwittergent fulgt av tilsetning av 8 M guanidin HCl (GdnHCl) (begge med proteaseinhibitorer). Ekstraktene som fortrinnsvis filtreres

over Whatman 1 papir settes på Sephadex G-50 kolonne for å

fjerne lavmolekylvekt oppløste stoffer, og hulromsvolumfraksjonene oppsamlet.

De oppsamlete ekskluderte fraksjoner fra Sephadex G-50 kolonnene ble fremstilt for isopyknisk dissosiativ tetthets-gradientsentrifugering ved blanding i 0,55 g cesiumklorid (CsCl) prv gram løsning og sentrifugert ved 9°C i 48-72 timer ved 35.000 rpm i enten en Beckman SW 50,1 eller TI 50,2 rotor. Gradientene ble delt i 8 like fraksjoner, og tettheten og radioaktiviteten, hvis det var noen, av hver fraksjon ble bestemt. Fraksjonene ble så oppsamlet for å gi 4 like-volum fraksjoner betegnet Dl til D4, og hver fraksjon ble så analysert ved gelfiltrerings-kromatcgrafering. Visse radiomerkete alikvote mengder av renset rgp580 ble underkastet isopyknisk sentrifugering ved

ri 4 -) 4

blanding av\_ Cj ser m-merket rgp580 (1 xlO cpm) med 4 M GdnHCl og 4,3 M CsCl (eller 0,5 M GdnHCl og 6,5 M CsCl) i 10 mM Tris, alle ved pH 7,2. Prøvene ble sentrifugert ved 4°C i 60 timer ved 35.000 rpm i en Beckman SW50.1 rotor og så separert til 20 like fraksjoner.

De fire lik-volum cesiumkloridfraks joner, Dl til D4, ble funnet å minke i cesiumkloridkonsentrasjon fra 1,58 g/ml for Dl til 1,37 g/ml for D4. Aliquote mengder av de forskjellige tetthetsfraksjoner ble dialysert, lyofilisert og underkastet SDS-PAGE for identifisering av hovedproteinene inneholdt i hver fraksjon. Glykoproteinene i gelene kan desialyseres ved mild syrebehandling ved fremgangsmåten til Burridge, K. (1976), Proe. Nati. Acad. Sei.

1 7 5

USA, 7 7; 4457-4481, og gelene ble merket med I-merket PNA. Rgp580 ble påvist hovedsakelig i D2 fraksjonen (P=l,48 - 0,03 g/ml)

med noen små mengder i Dl og D3 fraksjonene. Omtrent 50% av L3h]. glukosamin-, men mindre enn 8% av de [3hJ serin-merkete makromolekyler ble funnet i fraksjoner Dl til D3.

Deler av Dl til D4 fraksjonene ble satt på kalibrert Sepharose CL-2B kolonne (115 x 0,8 cm), ekvilibrert med 4 M GdnHCl i 0,1 M natriumacetat, pH 5,8. Radioaktiviteten i hver fraksjon ble bestemt ved tilsetning av 200 ul etanol til 100 ul alikvote mengder av fraksjoner som så ble tilsatt til 3 ml LiquidScint (National Diagnostics; Somerville, NJ), Fraksjonene ble oppsamlet, nøye dialysert mot vann, og så lyofilisert.

Visse oppsamlete fraksjoner ble gjenløst i 8 M urea, 0,2% CHAPS,

i 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, og satt på en DEAE Sephacel kolonne (5x1 cm) i den samme buffer. Kolonnen ble vasket og eluert

med en lineær natriumkloridgradient på 0 til 1 M. Etter full-føring av gradienten ble kolonnen vasket med 8 M urea som inneholdt 3 M natriumklorid. Gjenvinning av radioaktivitet var større enn 90%. Fraksjonene ble samlet i henhold til deres radioaktivitet, dialysert mot vann og lyofilisert. Fraksjonene ble analysert som beskrevet nedenfor. Noen fraksjoner ble videre fraksjonert på Sepharose CL-2B kolonner (115 x 0,8 cm), ekvilibrert og eluert med 1% SDS og 5 mM B-merkaptoetanol i 10 mM Tris-HCl.

Sepharose CL-2B kolonnene ble standardisert ved å bruke

6 ^ 5 4 dextraner ( henholdsvis M3 = 2 x 10 , 5 x 10", 1,5 x 10 , 7 x 10 ) . Prøvene som ble anvendt til karbohydratanalyse, ble satt på en slik BioGel PG kolonne (115 x 0,8 cm), ekvilibrert med 50 mM pyridiumacetat, pH 5,3. Kolonnene ble standardisert med oligosakkarider fremstilt fra fetuin, som beskrevet av Spiro og Bhoyroo (1974), J. Biol. Chem., 249; 5709-5717.

Fig. 2 illustrerer Sepharose CL-2B elueringsprofilen av radioaktivt merkete makromolekyler syntetisert av MTLn3 celler, etter dissosiativ CsCl-tetthetsgradient ultrasentrifugering. Celler som ble merket med13h]galaktose, glukosamin, eller serin, ga elueringsprofiler som inneholdt to radioaktive topper (K av=0,22 og 0,60). Den første elueringstopp inneholdt 18,6% av Pil glukosamin, 0,45% av C3h] galaktose, og 0,1% av L3h3 serin inkorporert i makromolekylært materiale. MTLn3 cellene som var metabolsk merket med L3h1 leucin, L3h1 mannose, eller C<3>h] fucose, resulterte i en lignende profil med to topper, men rom-volumsfraksjonen inneholdt mindre enn 0,05 til 0,002% av inkorporert radioaktivitet. Bare én radioaktiv topp ble observert

35

hvis cellene ble inkubert med Na~ SO„(K = 0,60).

^ 4 cl V

Analyse av D2 toppene åpenbarte at romvolumsfraksjonene inneholdt majoriteten (>90%) av rgp580, som påvist ved <1>25I-merket PNA binding etter desialylering og SDS-PAGE.

Sepharose CL-2B romvolumsfraks joner fra tetthetsfraksjoner Dl til D3 som ble oppsamlet, desialylert, og så underkastet ioneutvekslingskromatografering på Sephacel DEAE-cellulose kolonner ved :å bruke en Na Cl eluer ingsgradient, er vist i figur 3. Celler merket med i.3H] glukosamin eller L3h] galaktose resulterte i kolonneprofiler som inneholdt fire topper (Fig. 3A, topp I til IV). Radioaktiviteten assosiert med topper I til IV tilsvarte henholdsvis 2,0%, 7,8%, 8,1% og 0,9% av L3h] glukosamin inkorporert. I kontrast ble bare tre radioaktive topper observert når MTLn3 celler ble merket med L3h] mannose eller fucose (Fig. 3B; topper I, III, og IV). Bare de sistnevnte to topper (III og IV) ble funnet med L14c] serin-merket materiale (Fig. 3C).

e. isolasjon av rgp580 fra faste tumorer

MTLn3 tumorer anvendt til isolasjon av rgp580 ble høstet, vasket og så homogenisert i 5 volumer av ekstraksjonsbuffer pr. gram vevsvåtvekt. Ekstraktene ble frosset ved -80°C eller umiddelbart anvendt etter filtrering gjennom Whatman 1 papir. Filtratet ble så underkastet gelfiltrering på Sephadex G-50 kolonner (enten 10 x 1 cm eller 50 x 4 cm) ekvilibrert med ekstraksjonsbuffer minus Zwittergent. Romvolumsfraksjonene ble oppsamlet for videre analyse.

Ekstraktene ble underkastet dissosiativ tetthetsgradient-sentrifugering som beskrevet ovenfor, og tetthetsfraksjonene som tilsvarte p=l,48 - 0,07 gel/ml, ble oppsamlet. Passende porsjoner ble satt på en kalibrert Sepharose CL-2B kolonne, og romvolumsfraksjonene ble oppsamlet. Som tidligere bestemt for de in vitro dyrkete MTLn3 celler ble majoriteten av et høymole-125

kylvekt glykoprotem som bandt I-merket PNA etter desialylering, og hadde en lav migrering i 7,5% SDS-PAGE geler, funnet i Sepharose CL-2B romvolumsfraksjonene av tetthetsgradientfraksjon D2 preparater. Aliquote mengder av de oppsamlete, dialyserte og lyofiliserte romvolumsfraksjoner ble merket med <125>I ved å anvende kloramin-T metoden som beskrevet av Hunter og Greenwood (1962), Nature, 194; 495-496, for proteinholdig materiale eller periodat-<3>H borhydrid for sialinsyredeler som beskrevet av Mashborn et al

(1974), Biochem. Biophys. Acta, 362; 366-374. Deler av de umerkete og merkete ekstrakter ble kombinert og så satt på en DEAE Sephacel kolonne. Detl<3>H]-merkete materiale eluerte i fire radioaktive topper lik det L<3>h]glukosamin-merkete ekstrakt, med unntak av at den andre topp inneholdt mindre radioaktivitet. Det <125>I-merkete ekstrakt eluerte med en profil som var mest

lik det L3h]serin-merkete materiale (jfr. Figur 2 og 3A).

f. SDS- PAGE karakterisering av rgp580

SDS-PAGE ble utført i henhold til fremgangsmåten til Laemmli

(1973), Nature, 227; 680-685, ved å anvende en 7,5% akrylamid flytende gel og en 3% akrylamid overlagsgel. For glykoprotein påvisning ble gelene utsatt for 12 5I-merket PNA som beskrevet av Burridge (1976), Proe. Nati. Acad. Sei., 77: 4457-4461, og så overlagt til mild syrebehandling for å fjerne sialinsyre-rester som beskrevet i Steck et al. (1983) Exp. Cell Res., 147: 255-267. Alternativt ble SDS-PAGE utført ved å anvende det samme system, med unntak av at en 2,0 til 17,5% lineær akrylamid gradientgel som anvendte DATD (diallyltartardiamid) i stedet for BIS (bisakrylamid) som det kryssbindende stoff og en overlagsgel på 2% DATD akrylamid b]e anvendt. Gelen ble konstruert fra en 37,8% akrylamid, 1,6% DATD stammeløsning, som økte porøsiteten av gelen og muliggjorde migrering av rgp580 inn den flytende

125

gelmatrix. Geler som inneholdt I-merket materiale, ble vasket, tørket og underkastet autoradiografering som anvendte Kodak X-omat AR film med intensiveringsskjermer. For geler som inne-3 14

holdt H-merkete eller C-merkete prøver, ble de avfargete geler behandlet for fluorografering ved behandling med Enchance (New England, Nuclear Boston, MA), fulgt av tørking og eksponering av røntgenfilm mot gelen. Densitometrisk kartlegging av den eks-ponerte røntgenfilm ble gjennomført ved å bruke et Beckman DU-8 spektrofotometer med gelkartleggingsutstyr. Isoelektrisk fokusering i en sukrosetetthetsgradient ble utført som beskrevet av Behnta et al. (1975), Anal. Biochem., 69: 1-9, med unntak av at en lik blanding (V/V) av amfoliner (pH 2,5 til 5,0 og 3,0 til 10,0, Pharmacia, Uppsala, Sweden ble anvendt.

Alikuote mengder av de forskjellige mengder av DEAE Sephacel ble satt på 7,5% eller 5% polyakrylamidgeler, desialylert og merket med <125>I-merket PNA. Bare topper III og IV bandt I-merket PNA (fig. 4B, felt C og D). Fordi rgp580 knapt

går inn i en 5% polyakrylamidgel, ble elektroforese utført på gradientgeler ved å anvende DATD som det kryssbindende stoff i stedet for BIS akrylamid. Anvendelse av en 2,0 til 17,5%

DATD akrylamid gradient muliggjorde inngangen av merkete materialer inn i gelen. Undersøkelse av disse fire <3>H glukosamin-merkete topper DEAE Sephacel kromatografering etter elektroforese og fluorografering viste at topp I inneholdt bare lav-molekylærvektmateriale. Topper II til IV ble observert å inneholde høymolekylærvektmateriale som migrerte som diffuse, men homogene bånd (molekylvekter på omtrent 350.000 til 800.000

(fig. 6A)). Ingen andre lavmolekylvektbånd ble påvist i verken metabolsk eller kjemisk merkete fraksjoner, selv med over-eksponering av røntgenbilmene, hvilket antyder at i det vesentlige alle komponentene ble påvist med disse teknikker.

Når 3 H serin eller 12 5I-merkete topper ble analysert, ble lignende resultater oppnådd, med unntak av at topp II materiale var umerket. Estimering av gjennomsnittsmolekylvekt av rgp580 ved densitometrisk analyse av fluorogrammet og sammenligning med standardproteiner, ga en omtrentlig verdi på 550.000 (Pig. 6B). Rensing av rgp580 kunne demonstreres ved SDS-PAGE ved å

14

anvende C serin-merkete cellulære lysater av MTLn3 celler som startmateriale. Etter rensing ble rgp580 funnet å være homogen ved SDS-PAGE analyse og å inneholde omtrent 0,08% av det totale <14>C senn inkorporert i syre-precipiterbar radioaktivitet.

For å bestemme sammensetningen av de forskjellige DEAE Sephacel topper ble aliquote mengder inkubert med forskjellige medvirkningsenzymer, og de ble videre analysert ved SDS-PAGE.

Vi fant at det <3>H glukosamin-merkete materiale i topp II viste seg å være ufølsomt for pronase og for trypsin, men det kunne nedbrytes ved Streptomyces hyaluronidase (Tabell I), hvilket antyder at denne komponent er hyaluronsyre. Komponenter fra topper III og IV hadde identiske følsomheter for forskjellige enzymer og ble nedbrutt bare av pronase (Tabell I). Videre

125

bandt materialer i topper III og IV I-merket PNA til høy-molekylvektkomponenter etter mild syrebehandling, hvilket antyder at disse topper inneholdt rgp580. Analyse av DEAE Sephacel fraksjoner fra kjemisk merket MTLn3 tumorvev viste identiske karakteristika .

g. Kjemisk karakterisering av rgp580

Enzymatiske behandlinger - Følsomheten av rgp580 for forskjellige nedbrytningsenzymer ble bestemt ved inkubering i 1 time ved 37°C medL3Hjglukosamin-, [ ?h] serin-, eller kjemisk merket rgp580 i 100 ml Dulbeccos PBS som inneholdt renset trypsin, pronase, papain, alfachymotrypsin, Subtilopeptidase A ( 1 eller 10 mg/ml), kolagenase type VI (1000 enheter/ml), chondroitinase ABC (1 enhet/ml), Streptomyces hyaluronidase (100 turbiditetsreduserende enheter pr. milliliter), Vibrio cholerae neuraminidase (100 m enheter/ml), eller/3-galaktosidase (1000 enheter/ml). Prøvene og ubehandlet kontroll ble analysert ved SDS-PAGE på en 2,0 til 17,5% DATD akrylamid gradientgel, fulgt av densitometrisk kvanti-sering av det fremstilte fluorogram.

Kjerneproteinbestemmelse - Umerket rgp580 eller rgp580 metabolsk merket med l<14c>] cerin ble tilsatt til 100 mg bovinserumalbumin anvendt som bærerprotein; blandingen ble behandlet med trifluorometylsulfonsyre i anisol (2:1 w/w) i en nitrogen-renset Reacti-vial i 10 eller 30 minutter ved 4°C som beskrevet av

Edge et al. (1981), Anal. Biochem., 118; 131-137. Prøvene ble ekstrahert ved dietyleter, dialysert og lyofilisert. Det umerkete, behandlete materiale ble kjemisk merket med <125>I ved å anvende kloramin-T metoden. Prøvene ble analysert på SDS-PAGE ved å anvende 2,0 til 17,5% DATD akrylamidgeler.

Aminosyreanalyser - Prøver av rgp580 ble lyofilisert i syrevaskete rør og hydrolysert med 6 N eller 4 N HC1 i 4, 10, eller 24 timer ved 110°C. Analyse ble utført ved å bruke en LKB modell 401 aminosyreanalysator med norleucin som tilsatt indre standard.

Alkalinsk borhydridbehandling - Lyofiliserte prøver av

isolert rgp580 med radioaktivt merket karbohydrat ble behandlet med 50 mM NaOH, 1,0 M NaBH^ ved 45°C i 24 timer. Prøvene ble nøytralisert med eddiksyre, passert gjennom en Dowex 50 (H<+>) kolonne og eluert med destillert vann, og fraksjonene ble tørket gjentatte ganger i nærvær av metanol. Oligosakkaritolprøvene ble løst på nytt i 5 mM Tris-HCl (pH 7,5) og satt på en QAE Sephadex (5x1 cm) kolonne i den samme buffer. Kolonnen ble vasket med 25 ml 5 mM Tris-HCl, fulgt av en lineær gradient-eluering til 120 ml 0,2 M Tris-HCl (pH 7,5). De radioaktive topper ble samlet og så satt på en BioGel P6 kolonne som beskrevet av Carlson (1968), J. Biol. Chem., 243: 616-622.

Kjemisk sammensetning av rgp580 - Aminosyresammenset-ningen av renset rgp580 er vist i tabell II. Som fagfolk på området vil oppdage, er de verdier som er vist i tabell II, som ble oppnådd for gp580 isolert fra dyrkede MTLn3 celler og en MTLn3 tumor, innenfor eksperimentell feil. En ekspeti-mentell feil på omtrent ± 10% er forventet for slike aminosyreanalyser. Verdiene vist i tabell II er gjennomsnitt fra fire separate eksperimenter. Glutamat, aspartat og serin var hovedaminosyrene tilstede, med treonin, glycin og lysin som også var representert i betraktelige mengder. Disse amino-syrer utgjorde mer enn halvparten av den totale sammensetning av rgp580. Aminosukrene glukosamin og galaktosamin, utgjorde omtrent 20% av sammensetningen av rgp580 (tabell II).

Verdier representerer gjennomsnitt av duplikatanalyser for rgp580 renset fra dyrkete MTLn3 celler og tumorvev. Karbohydratverdiene ble bestemt ved ekstrapolering av verdiene ved forskjellige hydro-lysetider til nulltid for hydrolyse. Tryptofan ble ikke påvist.

Rgp580 ble deglykosylert med trifluormetylsulfonsyre for å produsere proteink jernen. ir _ 14 C~] iserin-merket rgp580 ble behandlet med syre og så analysert ved SDS-PAGE. Proteinkjernen migrerte som et enkelt bånd med en estimert molekylvekt på 150.000

dalton. Ingen andre merkete bånd ble påvist. Proteink jernen-.

av rgp580 isolert fra tumorvev og videre radioaktivt merket.

125

med I var av identisk størrelse ved SDS-PAGE.

Alikvote mengder av renset[^Cjserin-merket rgp580 ble underkastet isopyknisk sent rifugering for å bestemme dens tett-

het. Sentrifugering i nærvær av 4 M GdnHCl åpenbarte en tetthet på rundt 1,432 g/ml (>90% mellom 1,475 til 1,398 g/ml). Imidlertid, i nærvær av en assosiert konsentrasjon av GdnHCl (0,5 M)

var den fremkomne tetthet 1,615 g/ml (2>90% mellom 1,671 til 1,563 g/ml). Denne økning i fremkomne, tetthet under svakere denaturerende betingelser er også blitt observert for hyaluron-

syre og andre sterkt sure molekyler. Den sure natur av rgp580

ble bekreftet ved dens høye sammensetning av anioniske amino-

syrer og store mengder av sialinsyre. Et estimat for innholdet av sialinsyre på rgp580 ble oppnådd ved behandling av[<3>H]glukosamin-merket rgp580 med mild syre (50 mM H2S04, 1 time, 80°C),

fulgt av kromatografer ing på en BioGel P4 kolonne. Omtrent 25,5%

av radioaktiviteten som var inkorporert i rgp580, ble frigjort ved denne behandling, hvilket antyder at sialinsyre er en hoved-komponent av rgp580. Videre migrerte rgp580 som et diffust bånd på sukrosetetthetsgradient isolelektrisk fokusering med et isoelektrisk punkt på 3,2 - 0,5, som således bekrefter dens sure sammensetning.

Data antydet at rgp580 hadde sialomucin-lignende karakteristika, og dette funn ble bekreftet ved inkubering av [<3>h] serin-merket rgp580 med forskjellige nedbrytningsenzymer. Følsomhet ble testet ved å underkaste det behandlete rgp580 SDS-PAGE og densitometrisk analyse av de resulterende bånd. Renset rgp580

var resistent for en rekke proteaser, kondrotinase ABC og hyaluronidase (tabell III). Digestion ble observert bare med pronase, subtilopeptidase A og en kombinasjon av neuraminidase og B-galakto-

sidase. Lignende resultater ble oppnådd når <125>I-merket MTLn3 tumor rgp580 ble underkastet nedbrytningsenzymene. Disse data antyder at rgp580 er et sialomucin, og at det derfor skulle inneholde en rekke forskjellige O-bundete oligosakkarider.

aEtter enzyminkubering ble de forskjellige prøver underkastet PAGE på 2 til 17% DATD kryss-bundete geler og fluorografering.

bDen relative tetthet ble normalisert til området under de densitometriske kartlegginger av fluorogrammene fra SDS-PAGE gelene ved å anvende det ubehandlete felt som 1. Områder ble oppnådd på et Beckman DU-8 spektrofotometer ved å anvende det laveste verdiprogramm.

c ikke påvist.

Borhydridfrigjøring av rgp580 oligosakkarider - Et antall oligosakkarider bli frigjort ved alkalinsk borhydridbehandling av rgp580, som ble radioaktivt merket med glukosamin, galaktose og [ HJ fucose. L HJ glukosamin-merket oligosakkarider ble satt på en QAE Sephadex kolonne og separert til nøytrale (passert gjennom fraksjoner som representerte 22,5% av total radioaktivitet) og sure (tilbakeholdte fraksjoner, 76,3% av radioaktiviteten) komponenter. De sure fraksjoner ble eluert under betingelser hvor mono- og di-sialylerte oligosakkari-

toler er oppnådd (10 til 40 mM Tris-HCl, pH 7,5). Videre fraksjonering ble utført ved gelfiltreringskromatografering på BioGel P6 kolonner. Flere relativt store radioaktive topper

ble observert for de sure oligosakkaritoler. Majoriteten av de nøytrale oligosakkarider ble funnet å være assosiert med en radioaktiv topp. Oligosakkarider frigjort fra rgp580 som hadde blitt isolert fra tumorvev, og dens kjemisk merkete sialinsyredeler viste en lignende profil.

Eksempel II: Utvikling og karakterisering av et monoklonalt antistoff fremstilt mot rgp580

Et rottehybridom er blitt dannet, som produserer monoklonalt antistoff (GP21:56) med spesifisitet for rgp580 antigen tilstede i store mengder på høyt metastatiske 13762NF rottemelkekjertel-adenokarcinomceller. Hybridomet ble dannet ved sammenføring av rotte Y3 AGl.2.3 myelomceller med miltceller fra en rotte immunisert i.d. med renset rgp580. Rgp580 viste seg å være av lav immunogenisitet i seksuelt reproduserende F344 rotter fordi totalt 27 fusjoner krevdes for å produsere et hybridom med spesifisitet for dette glykoprotein. I en forsøk på å øke frekvensen av hybridomer som sekreterte antistoffer med spesifisitet for rgp580, ble en rekke forskjelligecimmuniseringsprogrammer anvendt, slik som i.d. og i.p. veier for antigen administrering, in vitro immunisering og anvendelse av både milt og lymfeknuter som kilder for B celle blåster.

Enzymbundete immunoabsorbent assays (ELISA) og direkte bindingsmålinger demonstrerte at hybridomer produsert i henhold til den foreliggende oppfinnelse, dannet monoklonale antistoffer som spesifikk bandt seg til klonete målcellelinjer av 13762NF rotteadenokarcinom i relasjon til deres spontane metastatiske potensialer. Tre ganger antallet av GP21:56 antistoffmolekyler bandt seg til høyt metastatiske MTLn3 celler i forhold til lave metastatiske MTC celler, men GP:21:56 viste liten eller ingen reaktivitet med andre cellelinjer av gnager" eller menneskeopp-rinnelse. Direkte antistoffbindende målinger hvor man brukte renset rgp580 bundet til mikrotiter-plater og immunoblotting hvor man brukte lysater av forskjellige 13762NF cellesubkloner, bekreftet at GP21:56 bandt seg spesifikt til rgp580.

Kinetiske studier indikerte at GP21-.56 ikke har høy affinitet for rgp580, men den viser sterk tilknytning til dette glykoprotein. Med en gang de var bundet til MTLn3 celler in vitro , ble GP21:56 molekyler fjernet med en halveringstid på 24 timer. Lokali-ser ingsstudier hvor man brukte frosne vevssnitt fra 13762NF tumorer, indikerte at GP21:56 reagerer med tumorceller dyrket in vivo, på en lignende måte som med in vitro dyrkete celler. Mere enn 50% av de' høyt metastatiske MTLn3 celler var positive når man brukte immunoperoxidaseteknikker, omtrent 20% av de intermediat metastatiske MTF7 og MTLn2 celler og <10% av lav-metastatiske MTC og MTPa celler var posititze for rgp580. Ekspresjon av rgp580 var heterogen blant cellene og ble assosiert hovedsakelig med tumorcelleoverflaten.

a. Materialer og fremgangsmåter

De følgende materialer og fremgangsmåter representer teknikker som de nåværende oppfinnere har funnet egnet i fremstilling av monoklonale stoffer rettet mot rgp580. Selv om de følgende utførelsesformer anvender rottemilt/rottemyelomhybrider til hybridomproduksjon, har de nåværende oppfinnere funnet at andre hybridomteknikker, slik som de som anvender muse/musehybrider, virker like godt.

Dyr. Innavlete 8 uker gamle Fischer (F344/CDL) rotter (RT1<1>) ble tilført av Charles River Breeding Laboratories. Dyr ble satt i karantene i 7' dager før anvendelse og foret med standard gnagerfor og uklorert springvann ad libitum. De ble opprettholdt under rettningslinjer fremsatt av The University of Texas System Cancer Center og the Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council.

Celler og cellelinjer. Rottemyelom Y3 Agl.2.3. (RT1<V>) cellelinje ble oppnådd fra C. Milstein, MRC Laboratories, Cambridge,

England og ble opprettholdt i spinnerkultur i antibiotikafri

DMEM og 20 mM Hepes med høyt glukoseinnhold pluss 10% FBS (Hyclone, Logan, UT).

Klonete underlinjer av det 13762NF rottemelkekjerteladenokarcinom (MTLn3, MTLn2, MTF7, MTC) og uklonete foreldrelinjer MTLY (fra en lymfeknutemetastase) og MTPa (fra den opprinnelige tumor) ble oppnådd og dyrket som beskrevet i Neri et al. (1982),

J. Nati. Cancer Inst., 68: 507. Alle cellelinjer og kloner ble selektert rutinemessig og funnet å være frie for Mycoplasma og gnagervirus kontaminering. Cellelinjene MTLn3, MTF7, MTC, MTLY

og MTPa ble anvendt mellom in vitro passasjer 10-18 og MTLn2 celler ved passasjer 38-40.

Tilleggscellelinjer ble opprettet fra tumor eksplantasjoner

av rottemelkekjerteladenokarcinomer R32-30AC (RTl<1>) CSE og MNU-F344 (Mason Research Institute, Worcester, MA). Tumorstykker ble implantert subkutant i den seksuelt reproduserende vert og passert to ganger in vivo før fjerning av tumorene. Tumor-eksplantater ble enzymatisk behandlet i 1 time ved romtemperatur med 0,25% trypsin (GIBCO, Grand Island? NY) og 1% kollagenase (Sigma chemical Co., St. Louis, MO) for å opprette cellelinjer. Kort-tidskulturer av normale modne rottef ibroblaster ble opprettet fra xifisternae av 8 ukers gamle F344 rotter ved å anvende den samme enzymatiske prosedyre. Føytale lungefibro-blaster ble isolert fra 14 til 16 dagers gamle F344 rottefetuser uten enzymatisk behandling. Lungene ble finkuttet og plassert i kultur for å tillate utvekst av fibroblaster. Disse cellelinjer ble opprettholdt ved lav passasje (mindre enn passasje 7) i AMEM pluss 10% FBS, og med mindre annet ble bekreftet, ble de rutinemessig dyrket på 10 mm vevskulturplater (Corning Glass, Corning, NY).

Melanom cellelinjer SK-MEL-19, SK-MEL-75, DXl og HS929

ble tatt fra J. Fogh (Memorial Sloane- Kettering Cancer Center, New York, NY), Cellelinjene MDA286 og MDA436 var fra R. Cailleau (U.T. M.D. Anderson Hospital og Tumor Institute i Houston, Houston, TX.). Musekjertelvevtumorceller 66, 67, 168,1 og 4526 ble tatt fra G. Heppner (Michigan Cancer Foundation, Detroit, MI.)

Immuniseringsprogrammer

(i) ln vivo: 8 uker gamle F344 rotter ble immunisert i.d.

med en 1:1 (v/v) emulsjon som inneholdt D2 fraksjonen beskrevet ovenfor, og Freund's komplett Adjuvans. Hver rotte ble gitt totalt 0,4 ml på i.d. steder (0,1 ml/sted). Immuniseringer ble gjentatt to ganger i uken ved injeksjon av 0,1 ml antigen i Freund's Inkomplett Adjuvans inn i alle resulterende granulomer.

En slutt i.d. dose ble gitt 4-5 dager før fjerning av milten

eller cervix lymfeknutene for sammenføring. Alternativt ble rottene immunisert ved i.p. injeksjon av antigen etter lignende prosedyrer.

(ii) In vitro: Fremgangsmåten som ble anvendt, var en modifikasjon av den opprinnelig beskrevne av Luben og Mohler

(1980), Mol. Immunol., 17: 935. Thymocyt-kondisjonert medium

ble oppnådd ved dyrking av 10 dager gamle rottethymocyter i 48 timer i DMEM pluss 2% kaninserum (Quadroma, Inc., Escondido,

CA) ved en konsentrasjon på 2 x 10^ celler/ml. Etter sentrifugering ble det kondisjonerte medium lagret ved -70°C. For immunisering ble en enkelt celle suspensjon fremstilt fra milten av en ubehandlet F344 rotte. Splenocytene ble inkubert i 5

dager med 10 ml tymocytkondisjonert medium og antigen, i DMEM med 2% kaninserum. Etter 5 dager ble de resulterende blastceller ført sammen med Y3 Agl.2.3 myelomceller ved å bruke standard-prosedyrer.

Hybridomproduksjon■> Milt eller lymfeknuteceller ble fremstilt ved passasje gjennom et finmasket nett ned i 5 ml medium. Cellene ble vasket to ganger i serumfritt medium og levedyktighet

av cellene ble bestemt ved trypan blå eksklusjon. Miltceller (2 x IO<8>) ble blandet med IO<8> Y3 Ag 1.2.3 celler og celleblandingen ble pelletert ved sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter. Pellet ble forsiktig resuspendert ved tilsetning av 2 ml 50% polyetylenglykol 1450 (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) i DMEM justert til pH 7,2 i løpet av 1 minutt. Fusjons-blandingen ble rystet i 1 minutt til, fortynnet med 8 ml DMEM

og sentrifugert i 5 minutter *ed 500x g. Cellene ble resuspendert i 200 ml DMEM som inneholdt 20% FBS, IO-<4> M hypoxantin (Sigma, St. Louis, MO), 4 x 10- 7 M aminopterin (sigma) og 1,6 x 10- 5 M thymidin (HAT medium), (Sigma). Aliquote mengder (1 ml) ble fordelt på Costar 24-brønnplater (Costar, Cambridge, MA), som var blitt sådd

ut 24 timer i forveien med 2 x 10 4 bestrålte (30 Gy, gammastråling) rottefibroblaster pr. brønn. Etter 24 timers inkubering ved 37°C

under standard kultur betingelser ble HAT medium (1 ml) tilsatt. Cellefusjonene ble inkubert i 7-14 dager før seleksjon for tilstedeværelse av hybrider.

Seleksjon for spesifikt antistoff. Hybridomkulturer ble testet for produksjon av spesifikt antistoff ved å bruke en ELISA. Monolag av målceller ble dyrket til sammenflytning i 96-brønners mikrotestplater, fiksert ved 0,5% glutaraldehyd, og lagret ved

-20°C i PBS som inneholdt 1,0% bovin serumalbumin (BSA).

Prøver av hybridomkultur supernatanter (50ul/brønn) ble inkubert med målcellene i time ved romtemperatur. Målcellene ble vasket 3 ganger med PBS pluss 0,05% BSA.

Biotinylert geite/rotte IgG (Vector Labs., Burlingame, CA) fortynnet 1/1000 i PBS som inneholdt 1% BSA, ble tilsatt (50 pl/ brønn), og ble inkubert med cellene i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble vasket tre ganger, fulgt av tilsetning av streptavidin-brodannende reagens (Bethesda Research Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD) (50 ul/brønn) fortynnet 1/1000 i PBS pluss 1% BSA, og inkubering ble gjort i et tillegg på 45 minutter ved romtemperatur.

Platene ble vasket seks ganger med PBS pluss 0,05% BSA. Bundet antistoff ble kvantisert ved å anvende o-fenylen-diamin

(1 mg/ml) reagens (100 ul/brønn), som ble oppløst i 0,1 M citrat-buffer, pH 4,5 og 0,012% hydrogenperoksyd» Etter 15 minutters inkubering i mørke ble absorbans ved 450 nm bestemt ved å bruke en Titertek Multiscanner (Flow Laboratories, McLean, VA). I alle målinger ble en Y3 Agl.2.3 kultur supernatant anvendt som negativ kontroll. Supernatanter ble betraktet å være positive for gp580 spesifikt monoklonalt antistoff (MAb) hvis de hadde en absorbans som var lik eller større enn to standard avvik over bakgrunnen. Hybridomer fra positive brønner ble klonet to ganger ved begrensende fortynning ved å anvende bestrålte rottefibroblaster som forceller.

Andre MAb bindingsmålinger anvendte 12 5I-merkete, affinitetsrensete antistoffer mot rotte F(ab')2> (Dr. C.J. Dean, Chester Beatty Research Institute, Sutton, Surrey, England). Prøver fra kultursupernatanter eller renset MAb ble inkubert i 1 time ved 4°C med sammenflytende monolag av levende celler eller ved romtemperatur med fikserte celler dyrket i 96-brønners mikrotestplater. Bundet MAb ble bestemt ved inkubering med 5 x 1GS cpm/

brønn av <125> I-merket sau/rotte F(ab')2 i 1 time ved 4°C. (levende

celler) eller ved romtemperatur (fikserte celler). Cellene ble vasket med PBS og lysert med 200 ul 2 N NaOH. Radioaktivitet ble bestemt ved å telle i en Beckman Model 8000 gammateller.

Rotter av MAb oppklaring ved MTLn3 celler in vitro.

Eksponensielt voksende kloner av MTLn3 celler i 96 brønn-plater ble vasket en gang i AMEM som inneholdt 5% FBS og inkubert på is i 1 time med 50 ul/brønn av kultursupernatant (10 ug/ml antistoff). Platene ble vasket tre ganger med AMEM, og hver plate ble delt i fire seksjoner. For å bestemme mengden av MAb

125 bundet i utgangspunktet ble en seksjon inkubert med 30 ul I-merket sau/rotte F(ab')2 i 1 time ved 4°C. De gjenværende seksjoner ble inkubert ved 37°C i en atmosfære av 95% luft og 5% C02 i 0 til 32 timer. Ved konstante intervaller ble en seksjon behandlet som beskrevet ovenfor. Etter grundig vasking ble cellene lysert, og radioaktiviteten bestemt som beskrevet ovenfor.

Plater for binding av MAb GP21:56 til rgp580

Renset rgp580 ble immobilisert over natten på Immunotech I plater (A/S Nunc, Kamstrap, Denmark) ved følgende fremgangsmåte. En løsning av rgp580 (1 ug/ml) ble først ultralyd-behandlet og alikvote mengder ble pipetert (50 ul/brønn) på mikrotestplater. Platene ble vasket tre ganger med PBS og så inkubert med PBS pluss 1% BSA i 1 time ved romtemperatur. Platene ble lagret ved -20°C i PBS pluss 1% BSA.

Kinetiske studier. Klonete MTLn3 celler ble vasket en gang med PBS pluss 1% BSA og inkubert med 12 5I-merket GP21:56 (1 Ci/mg) ved 4°C. For bestemmelse av metningsbinding ble MTLn3 celler (8 x 10 4 ) inkubert med x 125 I-merket GP21:56 (4,2 x 10 4CPM), og alikvote mengder ble tatt med konstante intervaller opptil 1-1/2 timer. De alikvote mengder ble vasket 3 ganger med PBS/BSA-buffer, og radioaktiviteten ble bestemt som beskrevet ovenfor. Ikke-spesifikk binding ble estimert ved å måle den bundete radioaktivitet når prøvene ble inkubert i nærvær av 1000 ganger overskudd av umerket antistoff. Dissosiasjonshastigheten ble bestemt ved å inkubere MTLn3 celler i 1 time med"<12>5I-merket GP21:56 som ovenfor; 1000 ganger overskudd av kaldt antistoff

ble så tilsatt, og alikvote mengder fjernet over en periode på 1-1/2 timer. Cellene ble vasket tre ganger med PBS/BSA-buffer,

og den celleassosierte radioaktivitet ble bestemt ved standard-prosedyren.

Rensing av MAb. MAb ble isolert fra kultursupernatanter ved affinitetskormatografer ing etter konsentrer ing ved hjelp av ammonium-sulfat (40% metning) precipitering. Immunosorbent-kolonnen ble laget ved å binde en anti-rotte K kjede MAb, Mark 1; H. Bazin, Brussels, Belgium) til AffiGel 10 (10 mg protein/ml kuler).

Eluering av MAb GP21:56 fra immunosorbent kolonnen ble utført

med 3 M kaliumtiocyanat, og fraksjonene (1 ml) ble oppsamlet og umiddelbart nøytralisert med 0,1 Hepes buffer, pH 8,0. Protein-konsentrasjoner ble bestemt ved å bruke Bradford målingen som beskrevet i Bradford (1976), Anal, Biochem., 72: 248, og renheten av MAb ble målt ved polyakrylamidgelelektroforese i natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE). Antistoffisotypet ble identifisert ved dobbell diffusjonsanalyse i bløt agar ved å bruke antisera mot rotte IgG^, ^9G2a' I(^G2b' I<^G2c ^ IgM (Miles Laboratories Inc., Naperville, IL). Rensete antistoffer ble merket med I

(ICN Pharmaceuticals, Irvine, CA) til en spesifikk aktivitet på 2 Ci/mg ved kloramin-T metoden.

immunoperoksidaseprosedyrer. Vevsprøver av 13762NF adenofcar-cinomsubkloner ble oppnådd fra tumorer dyrket subkutant (s.c.)

i melkekjertelfettputer fra F344 rotter 23 dager etter injeksjon av IO<6> tumorceller/rotte. Vevene ble hurtigfrosset i nitrogen i væskeform og lagret ved -20°C inntil anvendelse. Kryostatsnitt (4 um tykke) ble anvendt til immunoperoksidasemerking. Prose-

dyren anvendte Vectastain ABC anti-rotte IgG kit (Vector Laboratories, San Francisco, CA) med Diaminobenzidin (DAB) (1 mg/ml i Tris-HCl, pH 7,2) som substrat.

Snitt ble motfarvet med Meyers hematoxylin og undersøkt i

et Leitz fotomikroskop.

Immunoblotting. Western blot ble utført hovedsakelig som beskrevet av Towbin et al. '1979), P. N. A. S., 76: 4350. Proteiner ble elektroforetisk overført over natten fra 2-17,5% DATD kryss-bundete,denaturerende polyakrylamigradientgeler til nitrocellulose-papir ved 50 volt og 0,29 amp. Antigen ble påvist ved inkubering

125

av flekken med I-merket antistoff i 3 timer og så utføring av autoradiografer ing ved å bruke Kodak X-OMAT AR film.

b. Dannelse og spesifisitet av MAb GP21:56

En rekke forskjellige in vivo og in vitro immuniseringsprosedyrer ble anvendt for å produsere MAb mot rgp580 (se tabell IV). Ubehandlete rotter ble tilført dose enten intradermalt (i.d.)

eller intraperitonialt (i.p.) med rgp580, og både milten og cervicale lymfeknuter ble anvendt som en kilde for B blastceller for sammenføring med Y3 Agl.2.3 myelomcellene. I tillegg ble in vitro immuniseringsprosedyrer anvendt for å øke sannsynlig-

heten for produksjon av hybridomer med den ønskete spesifisitet.

Fra totalt 27 fusjoner hvor man anvendte disse immuniserings-teknikker fikk man et utbytte på bare en MAb (betegnet GP21:56)

som viste spesifikk ELISA reaktivitet med MTLn3 celler i den primære seleksjonsmåling. Frekvensen av hybrider dannet pr.

fusjon var lav. Gjennomsnittlig var bare 20-25% av brønnene positive for vekst, selv om dette i noen grad var avhengig av immuniseringsprogrammet og utgangsmaterialet for B blastceller.

I noen fusjoner var få eller ingen hybrider påvisbare.

Frekvensen av hybrider dannet ved spesifisitet mot rgp580

var signifikant lavere sammenlignet med frekvensen av andre antigener. Som kontroll ble milt fra en ubehandlet rotte anvendt, og man fant at antall brønner med fibridomvekst vanligvis var av størrelsesorden på 16-20%, men andre antigener enn rgp580 ga opptil 100% av brønner som er positive for hybridvekst. Den lave frekvens av hybrider dannet mot rgp580 antyder at dette antigen er av lav immunogenisitet i den seksuelt reproduserende vert.

På grunn av begrensende mengder av rgp580 ble hybrider opprinnelig valgt på grunnlag av deres reaktivitet med MTLn3 celler. Under disse betingelser var bare MAb GP21:56 reaktiv.

3inding- av MAb GP21:56 til renset rgp580. ELISA beskrevet i det foregående avsnitt, antydet at MAb GP21: 56 gjenkjenner en epitop som er til stede på rgp580. For å bekrefte dette ble evnen til MAb GP21:56 til å gjenkjenne renset rgp580 bestemt i en fast-fase antistoffbindingsmåling ved å anvende immobilisert rgp580 som antigen. Binding av affinitets-renset MAb GP21:56

(100 ug/ml) ble bestemt i triplikatprøver. MAb GP21:56 bandt seg spesifikt til rgp580, mens MAb med spesifisitet for andre celle-overflate antigener uttrykt på 13762NF adenokarcinomet ikke bandt seg til rgp580.

Binding av MAb GP21:56 til uklonete og klonete 13762NF cellelinjer. Den foregående måling viste at MAb GP21-.56 reagerte med renset rgp580. Ved å bruke forskjellige sublinjer av 13762NF melkekjerteladenokarcinom ble det oppnådd kvantitative data om reaktiviteten av MAb GP21:56 med disse klonete cellelinjer.

En direkte bindingsmåling til glutaraldehydfikserte MTLn3, MTF7, MTC og MTPa celler ble anvendt, og bundet MAb ble påvist ved å

125

bruke I-merket sau/rotte F(ab')2- Det kan sees fra figur 5

at ved høye MAb konsentrasjoner er bindingsprofilen av MAb GP21:56 til 13762NF cellene relatert til det metastatiske potensial og de cellulære mengder av rgp580 av disse cellekloner. Resultatene indikerte at det var tre ganger mengden av MAb GP21:56 bundet til MTLn3 i forhold til MTF7 eller MTC celler, og det var lite binding til foreldre MTPa celler. En alternativ forklaring på disse resultater er at det var redusert tilgjengelighet av rgp580 epitopen for binding av GP21:56 som en følge av fikseringsprosessen

eller at ekspresjonen av tilleggs "maskerende" proteoglykaner på celleoverflaten forhindret binding av MAb. Imidlertid reagerte NP40 ekstrakter av ufiksert 13762NF med GP21:56 på

samme måte med intakte celler, og de kjemiske mengder av rgp580 ekstrahert fra forskjellige 13762NF cellekloner, samsvarte med MAb bindingsdata.

I tillegg var bindingen av MAb GP21:56 den samme på levende, ufikserte celler og fikserte celler. Anvendelse av cellelinjene beskrevet ovenfor, pluss foreldrelinje MTLy (en uklonet cellelinje etablert fra en lymfeknutemetastase) ble også testet.

MTLy er høyt metastatisk. MAb GP21:56 hadde hovedsakelig det samme mønster for reaktivitet for forskjellige fikserte og levende 13762NF cellekloner, selv om den aktuelle binding av MAb GP21:56 til levende celler var omtrent 40% lavere enn til fikserte MTLn3 eller MTLy celler.

Identifisering av MAb GP21:56 antigenet. Beviser som bekrefter spesifisiteten av GP21:56 for rgp580, ble demonstrert ved immuno-12 5

blotting av I-merket affinitetsrenset GP21:56 til SDS polyakrylamidgeler som inneholdt cellelysater av 13762NF klonene og renset rgp580. I disse eksperimenter ble GP21:56 bundet til høymolekylvektkomponenten, identifisert som rgp580.

Spesifisitet av MAb GP21:56 binding til in vitro dyrkete cellelinjer. For å opprette spesifisiteten av MAb GP21:56 ble bindingen av denne MAb testet mot en rekke etablerte cellelinjer ved å bruke en ELISA. Cellelinjer av rotte, mus og menneske-opprinnelse ble anvendt, og resultatene viste at GP21:56 hadde spesifisitet for de klonete cellelinjer fra det 13762NF rotte-melkek jerteladenokarcinom. Veldig lite reaktivitet ble sett på andre dyrkete rottetumorceller eller normale fibroblaster, og det var neglisjerbar binding av GP21:56 til etablerte muse- eller menneskem^lkekjerteltumorce<1>ler eller til menneskemelanomcelle-linjer. Imidlertid er en veldig god reaktivitet blitt sett mellom GP21:56 og mennesketumorbiopsisnitt, spesielt med de mennesketumorer som har brystopprinnelse. I tillegg ble kryss-reaktivitet ikke observert med fetal rottelunge eller lever-fibroblaster.

Metningsbinding av MAb GP21:56 til MTLn3 celler.

Affiniteten av GP21:56 for rgp580 antigenet uttrykt på MTLn3 celler, ble bestemt ved måling av assosiasjon og dissosiasjons-kinetik av binding av x"l-merket GP21:56. MAb GP21:56 hadde en relativt lav assosiasjonshastighet med MTLn3 celler; omtrent 1 time krevdes for metningsbinding. Starthastigheten for dissosiasjon for GP21:56 bundet til MTLn3 celler var langsom, med veldig lite frigjøring i løpet av den 1-1/2 timers måling. Disse data indikerer at GP21:56 ikke har høy affinitet for det cellulære antigen, men når det er bundet har det en sterk bindingsgrad.

Modulering av celle- bundet MAb GP21:56. Hastigheten av oppklaring av MAb GP21:56 fra overflaten av dyrkete MTLn3

celler ble bestemt ved å følge skjebnen til overflate-bundet MAb. Kultursupernatant (lOug/ml MAb) ble inkubert med MTLn3 celler i 1 time, og MAb som var igjen på celleoverflaten, ble så kvantifisert med <1>25I-merket sau/rotte Ffab'^ ved forskjellige tidspunkter, opp til 32 timer. Halveringstiden av overflate-bundet GP21:56 på MTLn3 celler in vitro ble estimert å være av størrelsesorden på 24 timer.

Reaktivitet av MAb GP21:56 med 13762NF tumor i vevssnitt. For å bestemme fordelingen av rgp580 på tumorer som vokser in situ og å bekrefte reaktiviteten av MAb GP21-.56 tumorvev fra seksuelt reproduserende F344 rotter ble fordelingen av bundet MAb undersøkt. Tumorer dannet fra s.c. injeksjon av 10^ MTLn3, MTF7, MTLn2, eller MTPa celler ble fjernet ved 23 dager og frosset ned. MAb reaktivitet ble bestemt ved å bruke immunoperoksidase merkingsprosedyrer. MAb GP21:56 viste stor men heterogen binding til MTLn3 celler. Ikke alle MTLn3 celler var reaktive, men hovedsakelig reagerte mer enn 50% av cellene med MAb. Det meste av reaktiviteten ble funnet å være assosiert med celleoverflaten og ekstracellulær matrix. MTF7, MTLn2 og MTPa tumorer hadde mye lavere prosenter av GP21:56-reaktive celler. Omtrent 20% av cellene i MTF7 og MTLn3 tumorer var reaktive med GP21:56, mens MTPa tumorer hadde veldig få GP21:56 reaktive celler. I alle 13762NF sublinjene som ble undersøkt, var lokali-seringen av GP21:56 heterogen og i det vesentlige assosiert med celleoverflaten.

Eksempel III: Isolering og karakterisering av hgp580

Ved å anvende teknikker som ligner de som blir anvendt i isoleringen av rgp580, er et protein betegnet hgp580, som viser lignende karakteristika som rgp580, blitt identifisert og isolert fra et menneskecellemateriale. Dette glykoprotein er biokjemisk adskillbart fra rgp580, imidlertid er det blitt bestemt at hgp580 er en tumorassosiert "markør" og er funksjonell på

samme måte i utviklingen av mennesketumorimmunodiagnostiske reagenser. Det er blitt bestemt at antigenfremstilling gjort mot hgp580, er generelt foretrukket i forhold til de som er fremstilt mot rgp580 i mennesketumorimmunodiagnostikk. Fag-

menn på området vil oppdage at små variasjoner mellom teknikker anvendt for hgp580 og de som er beskrevet for rgp580 hovedsakelig representerer-ikke vesentlige variasjoner, og med mindre annet er angitt.

a. Isolasjon av hgp580

Vev og celler. Rotte 13762NF cellelinjene og klonene ble dyrket i AMEM med 10% fetalbovinserum, ikke noe antibiotika,

i en fuktig atmosfære ved 37°C som beskrevet i eksempel I. Menneskebrystkarcinomtumorer ble tatt fra Department of Pathology, M.D.. Andersom Hospital og Tumor Institute etter kirurgisk fjerning eller autopsi.

Isolering av hgp580. En fremgangsmåte som er blitt anvendt for rensing av hgp580, følger i grunntrekkene fremgangsmåten som er beskrevet for isolasjonen av rgp580.

I korte trekk ble tumorer finkuttet og ekstrahert med

(5 volumer pr. g vevsnettovekt) 4 M guanidin hydroklorid og 4% Zwittergent 3-12 i 0,1 M natriumacetat pH 6,0 som innehold<4->protease inhibitorer (5 mM EDTA, 2 mM L-tosylamid 2-fenyletylklor-metylalkali, 50 mM L-aminoheksanoisk syre, 5 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid, 5 mM benzamidin-HCl, og 10 enheter/ml aprotinin) i 12 timer ved 4°C. Ekstraktene ble filtrert gjennom Whatman 1 papir og så underkastet gelfiltrering på en Sephadex G-50 kolonne (50 x 4 cm) ekvilibrert med ekstraksjonsbuffer som ekskluderer Zwittergenten. Hulromsvolumfraksjonene ble oppsamlet, og cesium-

klorid tilsatt (0,55 g CsCl/g løsning). Prøvene ble sentrifugert 48-60 timer ved 35.000 rpm i en Beckman TI 50,2 rotor ved 9°C. Gradientene ble så fraksjonert til åtte like fraksjoner og deres tetthet bestemt. Fraksjoner med en tetthet mellom 1,55-1,45 g/ml ble oppsamlet og påført en kalibrert Sepharose CL-2B kolonne (100 x 2 cm) ekvilibrert med 4M guanidin hydroklorid i 0,1 M natriumacetat, pH 5,8. Romvolumsfraksjonene ble så oppsamlet, dialysert og lyofilisert. Aliquote mengder av fraksjonene ble så kjemisk merket med 12 5I og kloramin T for protein eller periodat- L3h] borhydrid for sialinsyre.

Videre rensing ble oppnådd ved ionebyttekromatogra-

fering på en Sephacel DEAE kolonne (5x1 cm) ekvilibrert med 8 M urea, 0,2% Triton-X-100 og 50 mM Tris HC1, pH 6,8. Eluering ble utført med en natriumkloridgradient (0 til 1 M> fulgt av vask i sterkt saltvann (3 M). De passende fraksjoner som bestemt ved radioaktive profiler, ble så oppsamlet, dialysert og lyofilisert .

Forbedret fremgangsmåte for isolering av hgp580. - I en forbedret fremgangsmåte for isolering av hgp580 ble tumorvev vasket i PBS og så finkuttet og ekstrahert i en løsning av 4 M guanidin HC1, 1% Zwittergent 3-12, 0,1 M natriumacetat, pH 6,2,

i nærvær av protease inhibitorer. Etter en over natten ekstrak-sjon på omtrent 18 timer ble løsningen filtrert gjennom et finmasket nylonfilter og så påført en preparativ Sephadex G-50 kolonne (4 x 50 cm) ekvilibrert med 8 M urea, 5 mM natriumklorid og natriumacetat pH 7,0. Hulromsvolumfraksjonene ble oppsamlet og så påført en DEAE-Sephacel kolonne i den samme buffer, med unntak av at den inneholdt 0,2% CHAPS. Kolonnen ble vasket med ekvilibreringsbuffer og så eluert med en økende lineær natrium-klor idgradient . De forskjellige toppfraks joner ble oppsamlet, fortynnet tre ganger (v/v) med 8 M urea og påført en DEAE Sephacel kolonne { ? ml). Materialet ble så eluert med et lite volum 4 M guanidin HC1. Eluenten ble så underkastet gelfiltreringskromatografering på en kalibrert Sepharose CL-2B kolonne (2 x 100 cm)

i 4 M guanidin HC1, 0,2% CHAPS, og 0,1 M natriumacetat pH 5,8. Hulromsvolumfraksjonene ble oppsamlet og representerer renset hgp580 og blir målt for renhet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese fulgt av sølvfarging.

b. Kjemisk karakterisering av hgp580

Analyse av hgp580 ved polyakrylamingelelektroforese i natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) ble utført ved to fremgangsmåter. For glykoproteinpåvisning ble SDS-PAGE utført ved å bruke en 7% akrylamid flytende gel og en 3% akrylamid overlagsgel. Gelene ble fiksert, behandlet med 50 mM H9SO. i 1 time ved 80°C for å desialylere glykoproteinet og ble så overlagt med <125>I-merket peanuttagglutinin, vasket og tørket. For å oppnå migrering av glykoproteinene inn i polyamidgelet ble en lineær gradient anvendt med N,N-diallyltartardiamid (DTD) som det kryssbindende stoff heller enn N,N-metylenbisakrylamid. Overlagsgelen ble

125

dannet av 2% DATD akrylamid. Geler som inneholdt I-merket materiale, ble underkastet autoradiografer ing ved å anvende Kodak X-Omat AR film med intensiveringsskjermer. For geler

som inneholdt <3>H-merkete prøver, ble de avfargede geler behandlet meed Enhance (New Enland Nuclear, Boston, MA) før tørking og ble så utsatt for røntgenfilmen.

Virkning av forskjellige nedbrytningsenzymer på rgp580

125

og hgp580 ble bestemt ved inkubering av I-merket glykoprotein i 100 ml DPBS i 1 time ved 37°C. Enzymene som ble målt, var trypsin, pepsin, pronase, papain (aktivert med 1 mM B-merkaptoetanol), et chymotrypsin, Subtilopeptidase A (ved 1 og 10 mg(ml), chondcoitinase ABC (1 enhet/ml), Streptomyces hyaluronidase (100 TRU/ml), Vibrio cholerae neuraminidase (100 m enheter/ml)

og B-Galaktosidase (10 enheter/ml). Prøvene og en ubehandlet kontroll ble så underkastet SDS-PAGE analyse på en 2 til 17,5% DATD akrylamidgel, tørket og utsatt for røntgenfilm. Den resulterende film ble densitometrisk kartlagt på en Beckman DU-8

ved å anvende gelkartleggingsutstyr.

Sialinsyremengdene ble kjemisk merket med periodat-[<3>h]

og så ble de 0-bundete (binding av karbohydrat til serin eller treonin) oligosakkarider frigjort ved behandling med 50 mM NaOH

i 1 m NaBH4 ved 45°C i 24 timer under en N2 atmosfære. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av eddiksyre, og prøven ble passert gjennom en Dowex 50 (H<+>) kolonne. Sialinsyren som inneholdt oligosakkarider, ble analysert i en 3io Gel P6 kolonne ekvilibrert med en 50 mM pyridiniumacetat, pH 5,3.

Aminosyreanalyse av rgp580 og hgp580 ble utført på en LK3 modell 401 aminosyreanalysator med norleucin som indre standard. Prøvene ble lyofilisert i syrevaskete rør og så hydrolysert med Gdn HC1 i 24 timer ved 100°C.

Resultatene av den komparative karakterisering av hgp580 er vist i tabell V. Som beskrevet der har hgp580 mange felles biokjemiske egenskaper med rgp580. Imidlertid er de to adskillbare på grunnlag av aminosyreanalyser. Resultatene av aminosyreanalysene vist i tabell V, representerer gjennom-snittet fra fire eksperimenter og anses å ha en usikkerhet

- 10%.

Eksempel IV: Utvikling av monoklonale antistoffer mot hgp580

Monoklonale antistoffer som viser spesifisitet for mennesketumorceller, er blitt dannet ved å bruke et hgp580 antigen preparat på en veldig lik måte som beskrevet ovenfor for rgp580 antigenet. I en foretrukket utførelsesform, beskrevet som følger, blir hybridomer utviklet ved å anvende miltceller fra rotter immunisert med et preparat som inneholder hgp580, og miltcellene ble ført sammen med en rottemyelomcellelinje. Imidlertid kan andre cellesystemer, for eksempel muse/musehybrider, på en vellykket måte anvendes til produksjon av hybridomer. Alle variasjoner mellom de følgende prosedyrer for dannelse av monoklonale stoffer mot hgp580 og prosedyrene tidligere beskrevet for rgp580 er ikke viktige, men representerer' heller bearbeid-elser .

a. Materialer og fremgangsmåter

Dyr. Innavlete 8 uker gamle Fischer (F344/CDL) rotter

(RT1<1>) ble tilført av Harland Sprague Dawley, Houston, Texas. Rotter ble foret med standard gnagerfor og uklorert springvann

ad libitum og opprettholdt under retningslinjer fremsatt av University of Texas System Cancer Center og Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council.

Celler og cellelinjer. Rottemyelom Y3AG1,2.3 (RT1<V>) ble tatt fra C. Milstein, MRC Laboratories, Cambridge, England, og ble opprettholdt i spinnerkultur i antibiotikafritt Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og 20 mM Hepes høyglukose pluss 10% fetal bovinserum (FBS), (Hyclone, Logan, UT).

Klonete sublinjer av 13762NF rottemelkekjerteladenokarcinom (MTLn3, MTLn2, MTF7, MTC og uklonet MTPa ble oppnådd og ble dyrket som beskrevet ovenfor. Alle cellelinjer ble selektert rutinemessig og funnet å vare frie for mykoplasma og virus-forurensing.

Tilleggscellelinjer ble etablert fra rottemelkekjerteladenokarcinom R32-30Ac (RT1<1>), DMBA-1 (RT1<1>), rottemelkekjerteladenokarcinom MNU-F344-(RT1<1>) og rottefibrosarcom CSE (RT1<1>). Kort-tidskulturer av voksne og fetale rottefibroblaster ble oppnådd som beskrevet ovenfor. Menneskemelan<p>mlinjer ble tilført av J. Fogh (Sloane Kettering Cancer Center, NY, NY), MDA-436 ble oppnådd fra R. Cailleau, og menneskebrysthjernemetastaser fra Department of Neuro-oncology, M.D. Anderson Hospital, Houston, Texas.

Hybridom- produksjon. Hybridomer ble dannet ved å bruke miltceller fra rotter immunisert i.d. med hgp580 fulgt av fremgangsmåten beskrevet ovenfor for rgp580. Miltceller ble fremstilt ved passasje gjennom et finmasket nett ned i 5 ml medium. Cellene ble vasket to ganger i serumfritt medium, og levedyktigheten bestemt ved trypan blå eksklusjon. Miltceller (2 x 10 ) ble blandet med 10 Y3AG1.2.3 rottemyelomceller, og celleblandingen ble pelletert ved sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter. Pelleten ble forsiktig resuspendert ved tilsetning av 2 ml 50% polyetylenglykol 1450 (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ)

i DMEM, justert til pH 7,2 over en 1 minutters periode. Fusjons-

blandingen ble rystet i enda 1 minutt, fortynnet med 8 ml DMEM.

og sentrifugert i 5 minutter ved 500 x g. Cellene ble resuspendert

-4

i 200 ml DMEM som inneholdt 20% FBS 10 M hypoxantin (Sigma),

4 x 10<-7>M aminopterin (Sigma) og 1,6 x 10 ^M tymidin (HA medium: Sigma). Alikvote mengder (1 ml) ble fordelt i Costar 24 brønn-plater (Costar, Cambridge, MA) som var blitt sådd ut 24 timer i forveien med 2 x IO<4> bestrålte (30 Gy, gammastråling) rottefibroblaster/brønn. Etter 24 timers inkubering ved 37°C i standard kultur betingelser ble 1 ml HAT medium tilsatt. Fusjonene ble inkubert i 7-14 dager under betingelsene ovenfor før seleksjon for tilstedeværelse av hybrider.

Seleksjon for spesifikt antistoff. Hybridomer ble tester for produksjon av spesifikt antistoff ved å bruke en ELISA måling som følger. For å teste antistoffer mot hgp580, ble renset antigen ultralydbehandlet og så immobilisert over natten på Immunotech-1 plater (50 ul/brønn; A/S Nunc, Kamstrap, Danmark). Platene ble vasket tre ganger med Dulbeccos fosfatbuffret saltvann (DPBS) og en gang i 1 time med PBS pluss 1% bovinserum albumin (BSA). Platene ble lagret ved -20°C i BSA inneholdende buffer inntil anvendelse. Prøvene av hybridomkultursupernatant (50ul/brønn) ble inkubert med hgp580 i 1 time ved romtemperatur.

Platene ble vasket tre ganger med PBS pluss 0,05% BSA. Bio-tinylert-geite/rotte-IgG (Vector Labs., Burlingame, CA) fortynnet 1/1000 i PBS pluss 1% BSA ble tilsatt (50 ul/brønn) og inkubert med cellene i 1 time ved 25°C. Platene ble vasket tre ganger fulgt av tilsetning av streptavidin brodannelsesreagens (50 ul/ brønn) fortynnet 1/1000 i PBS pluss 1% BSA (Bethesda Research Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD), ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 45 minutter ved 25°C. Platene ble vasket seks ganger med PBS pluss 0,05% BSA og bundet antistoff ble kvantifisert ved å bruke 0-fenylendiamin (1 mg/ml) løst i 0,1 M sitratbuf f er, pH 4,5, hvortil.' 0,012% hydrogenpecoksyd var tilsatt (100 ul/brønn). Etter en 15 minutters inkubering i mørke ble absorbans ved 450 nm bestemt ved å bruke en Titertek Multiscanner (Flow Laboratories). I alle målinger ble Y3Agl.2.3 kultursupernatant anvendt som negativ kontroll. Supernatanter ble betraktet som positive hvis de hadde en absorbans lik eller større enn to standardavvik over bakgrunnen. Hybridomer fra positive brønner ble klonet to ganger ved begrensende fortynning ved å bruke bestrålete rottefibroblaster som forceller.

125

Tilleggs immunoassays anvendte I-merkete affimtet-rensete antistoffer mot rotte F(ab')2 (°r. C-J- Dean Chester Beatty Research Institute Sutton, Surrey, England).50 ul fortynninger av monoklonale antistoffer ble inkubert i 1 time ved 4°C med monolag av levende celler eller ved 25°C med fikserte celler, dyrket til sammenflytning på 96 brønners mikrotestplater.. Bundet monoklonalt antistoff ble kvantifisert etter grundig

5 125

vasking ved inkubering med 5 x 10 cpm/brønn av I-merket sau/rotte F(ab')2 i 1 time ved enten 4°C (levende celler) eller 25°C (fikserte celler). Cellene ble vasket med medium og lysert med 200 ul 2N NaOH. Radioaktivitet ble bestemt ved å telle i en Beckman model 8000 gammateller.

Rensing og radiomerking av monoklonale antistoffer. Monoklonale antistoffer ble isolert fra kultursupernatanter ved affi-nitetskromatografer ing etter konsentrasjon ved hjelp av ammonium-sulfat (40% metning) precipitering. Anti-rotte K kjede MAb,

Mark 1, (H. Bazin, Brussels, Belgia) ble bundet til Affigel-10

(10 mg protein/ml kuler) idet man anvendte produsentens instruksjoner for å rense positive monoklonale antistoffer. Eluering av monoklonale antistoffer fra den absorberende kolonne ble oppnådd med 3M kaliumtiocyanat, og fraksjoner (1 ml) ble samlet og øyeblikkelig nøytralisert med 0,1M Hepes buffer, pH 8,0. Monoklonale antistoffer ble målt for renhet ved polyakrylamidgelelektroforese i natriumdodecylsulfat (SDS PAGE) og når det

125

krevdes ble de radiomerket med Iodin (ICN Pharmaceutical Inc., Irvine, CA) ved kloramin-T metoden, spesifikk aktivitet på omtrent 2 uci/ug.

Immunoblotting. Immunoblot ble utført hovedsakelig ved fremgangsmåten til Towbin et al (1979) P. N. A. S., 26: 4350 ved å anvende de allerede beskrevne modifikasjoner. Proteiner ble elektroforetisk overført over natten fra 2-17,5% DATD kryss-bundete, denaturerende polyakrylamidgradientgeler til nitro-cellulosepapir ved 50 volt og 0,29 amp. Antigen ble påvist ved å anvende Vectastain alkalinsk fosfataseprosedyren i henhold til produsentens instruksjoner (Vector Labs, San Francisco, CA).

Immunoperoksidaseprosedyre. Vevsprøver (menneske og rotte) ble hurtigfrosset i væske N ? og så lagret ved -20°C inntil anvendelse: 4 um kryostatsnitt ble anvendt i immunoperoksidase-merkingsprosedyrene. Fremgangsmåten som ble fulgt, var Vectastain ABC anti rotte IgG prosedyren (Vector Laboratories, San Francisco, CA) med diaminobenzidin som substrat (1 mg/ml i Tris-HCl, pH 7,2) fortynnet 1:1 med 0,02% hydrogenperoksyd.

b. Eksempelvise anti- menneske gp580 monoklonale antistoffer.

Tabell Vi demonstrerer en prøve av positive hybridomkloner

som er blitt dannet mot enten rgp580 eller hgp580 og som viser immunoreaktivitet mot hgp580 antigenet. Basert på dens høye titer av antistoff-produksjon ble klon HGR1:69 valgt til antistoff karakteriseringsstudier.

Hybridomkloner HGR1:69 (ATCC avsetning nr. HB9041) og GP21:56 (ATCC avsetning nr. HB9046) ble avsatt med den amerikanske type-kultursamiing 20. mars 1985 under Budapest-traktaten.

Eksempel V: Påvisning av mennesketumorer

Monoklonale antistoffer produsert i henhold til fremgangs-måtene fremsatt ovenfor, kan på en vellykket måte anvendes i målingsprogrammet for identifisering og påvisning av mistenkte mennesketumorer. Generelt er immunodiagnostiske fremgangsmåter vel kjent for fagmenn på området. Disse monoklonale antistoffr immunopåvisningssystemer av den foreliggende oppfinnelse kan på

en passende måte tilpasses til å påvise tumorceller i en rekke prøvetyper. For eksempel kan tilstedeværelse av tumor antigen hgp580 påvises i vandige prøver slik som blod, urin, svette,

serum, plasma, plauravæske eller bukvæske og kan utføres ved en av de tallrike immunopåvisningsteknikker som generelt er kjent innen faget, og for eksempel radioimmunoassays ("RIA") og enzymbundete immunosorbent assays ("ELISA"). Alternativt kan tumorceller som er til stede i faste vev, slik som mennekse-vevsbiopsier, påvises ved å bruke velkjente immunohistologiske målinger.

a. Foreslått fast fase radioimmunoassay for kvantifisering og påvisning av gp580 i vandige prøver.

Tilstedeværelse av sirkulerende hgp580 kan vise seg å være

en verdifull diagnostisk indikator enten på tilstedeværelse av en tumor et eller annet sted i pasientens kropp eller alternativt som en diagnostisk middel for å følge utviklingen av kjemoterapi eller begynnelse til tilbakefall. Den følgende fremgangsmåte er en foreslått tilnærming for anvendelse av de monoklonale antistoffer av den foreliggende oppfinnelse for påvisning og kvantifisering .

av sirkulerende hgp580 antigener i vandige prøver.

En foretrukket utførelsesform av den vandige prøvemåling anvender en standard radioimmuno-assay tilnærming for kvantifisering av hgp580 antigen. I korte trekk blir immunokuler fremstilt ved å binde affinitetsrensete monoklonale antistoffer til Affi-Gel 10

(1 ml Affi-Gel 10 med 20 mg. protein) ved å følge fabrikantens instruksjoner. Immunokuler fremstilt på denne måten brukes for i utgangspunktet å binde alt hgp580 til stede i en gitt prøve aliquote mengde.

For å utføre denne startbindingen av hgp580 fra en prøve aliquote mengde blir immunokuler (10 pl sammenpakket volum) sammen med 100 ml RIA buffer (0,5 % bovinserum albumin, 0,19% Triton X-100, 0,02% azid i DPBS, pH 7,4), standard antigen fortynninger (eller vandige prøver slik som serumprøver fra pasienter), 100 ul normalt menneskeserum og protease-inhibi£orer blandet sammen i 1,5 ml polystyrenrør. Bindingen blir fullført ved å rotere rørene over natten ved 4°C fulgt av vasking av de antigen-belastete immunokuler seks ganger med RIA buffer.

Mengden av hgp580 bundet til immunokulene kan så kvanti-fiseres ved for eksempel å anvende et biotinylert monoklonalt antistoffpreparat og radiomerket streptavidin, idet man drar fordel av avidin/biotin-reaksjonen. I korte trekk blir biotinylerte monoklonale antistoffer fremstilt ved at det monoklonale antistoff (1 mg/ml i 0,1 M Hepes, pH 8,0) reagerer med 1 mg/ml D-biotin N-hydroxyl succinimidester ("NHS-biotin") i vannfri

DMSO i 4 timer ved 0°C ved et NHS-biotin: monoklonalt antistoff forhold på 1:8 v/v). Etter at biotinylering er fullført, kan de biotinylerte antistoffer frigjøres fra NHS og ubundet biotin ved ultrafiltrering med en Centrifree Micropartition Unit og YM-30 membraner. En anvendbar vaskebuffer er 100 mM Hepes og 0,05% azid, pH 8,0.

Ti mikrogram av biotinylerte antistoffer tilsettes til de antigen belastete og vaskete immunokuler, og inkuberes i fire timer ved romtemperatur. Immunokulene blir så vasket seks ganger med RIA buffer og inkubert i et tillegg på fire timer med 5 ug 125 I-streptavidm, vasket 6 ganger med RIA buffer og bundet radioaktivitet bestemmes i en autogammateller. Iodering av streptavidin kan på en passende måte utføres ved kloramin-T metoden. Ved å sammenligne standardkurver dannet med kjente antigen konsentrasjoner med de som er dannet med pasientprøver, kan konsentrasjonen av hgp580 til stede i pasientprøven bestemmes.

b. Påvisning av hgp580 antigen på menneskevevbiopsier

Monoklonale antistoffer av den foreliggende oppfinnelse kan også på en vellykket måte anvendes for å påvise tilstedeværelse av tumorceller i menneskevevbiopsier. I en foretrukket utfør-elsesform blir tumorvevsprøver frosset i væskenitrogen og lagret i lufttette beholdere ved -20°C inntil anvendelse. Fortrinnsvis blir kryostatsnitt, omtrent 4 um tykke, anvendt i alle immunohistologiske målinger. Den foretrukne målingsfremgangsmåte som anvendes, er Vectastatin ABC anti-rotte igG eller anti-muse IgG

prosedyrer, hvorav begge er vel kjent for fagmenn på området,

idet man bruker enten pepperotperoksidase eller alkalinsk fosfatase som enzymmarkør.

I korte trekk blir vevssnittene fiksert i aceton og endogen enzymaktivitet inhibert ved å bruke enten 0,3% H202 i metanol (for peroksidase-merking) eller 20% eddiksyre (for fosfatase-merking). Antistoff (supernatant, ascites eller affinitets-renset) blir lagt lagvis på objektglasset, inkubert i 1 time, vasket og vevene inkubert i 30 minutter med biotynilert-anti-rotte (eller muse) IgG i henhold til produsentens instruksjoner. Avidin-enzymkompleks ble så lagt lagvis på objektglasset etter grundig vasking med buffer og inkubert med vevet i 1 time. Ved dette tidspunkt er de egnete enzymsubstrater fremstilt. Vevene vaskes og inkuberes med enzymet i 5 til 30 minutter, vaskes og motfarves med Mayers hematoxylin. Tilstedeværelse av tumorceller i biopsivevet indikeres ved at det viser seg en positiv enzymreaksjon som er mikroskopisk observerbar på objektglasset.

Tabell VII viser resultater som er blitt oppnådd fra seleksjon av forskjellige vevsprøver på måten ovenfor, ved enten å anvende et representativt monoklonalt antistoff utviklet mot rgp580 (GP21:56) eller et utviklet mot hgp580 (HGR1:69). Antistoffer fremstilt mot enten rotte eller humant antigen viser seg å virke like godt i identifiseringen av mennesketumorer.

Det vil videre forståes av fagmenn på området at disse monoklonale antistoffer viser en preferanse for tumorer av brystopprinnelse og spesielt metastatiske tumorer som har en brystvevopprinnelse.

Eksempel VI: Antistoffer mot gp580 som inhibitorer for tumor-kolonisering og metastaser

Rottetumor-målinger ble utformet for å demonstrere effektivi-teten av de monoklonale antistoffer av den foreliggende oppfinnelse i forebyggelse eller inhibering av lungekolonisering og spontane metastaser av tumorceller. I en måling ble affinitets-renset G<g>21:56 injisert intravenøst inn i den jugulare vene av metofan-anesteserte rotter (100 ug/rotte), 24 timer før injeksjon av IO<6> MTLn3 celler subkutant inn i melkekjertelfettpute av hver rotte. På samme tid som tumorceller ble injisert ble hver rotte gitt et tillegg på 100 ug antistoff intravenøst inn i jugularvenen.

Tumoren ble tillatt å vokse in. vitro i 30 dager, og i løpet av denne tiden ble antistoff administrert intravenøst ved en konsentrasjon på 50 ug/rotte tre ganger i uken. Etter 30 dager ble dyrene avlivet ved inhalering av metofan og undersøkt makroskopisk for nævær av åpenbare metastaser i lungen, inguinale og lumbale lymfeknuter, nyrer og tymus. Et antistoff som ikke kryssreagerer med gp580, ble anvendt i kontrollgruppen.

Som demonstrert ved resultatene i tabell VIII minsket et antistoff som var rettet mot det tumor-assosierte protein, gp580, på en signifikant måte forekomsten av spontane metastaser. I et lignende studium ble antistoffenes evne til å forhindre lungekolonisering ved injiserte tumorceller testet. F344 rotter ble anestesert ved metofan inhalering og 50 ug affinitetsrenset MAb ble injisert intravenøst inn i jugularvenen av hver rotte.

Øyeblikkelig etter injisering av MAb, ble 5 x 10 4 MTLn3 celler injisert i.v. inn i jugularvenen. Dyrene ble avlivet 23-30 dager senere, og hvert dyr ble undersøkt for åpenbare metastaser. Mengden av tumor til stede i lungen av hvert dyr ble bestemt ved å telle antall synlige tumorkolonier i hver lunge. De passende ikke-reaktive MAb ble anvendt som kontroller. Monoklonalt antistoff MT10:21 er et monoklonalt antistoff som ikke reagerer med gp580. Imidlertid er det tenkt at dette antistoff kan reagere med andre metastase-assosierte antigener.

Data som er vist i tabell IX demonstrerer igjen den potensielle anvendbarhet i reduksjon av spontane metastaser, spesielt de som går til lungen. Et slikt funn reiser videre muligheten for anvendelse av slike antistoffer som for eksempel adjuvanser til cancerkirurgi, som noen onkologister føler fremmer fjern-elsen av metastatiske tumorer. I tillegg kan slike antistoffer og gp580 antigenet føre til utvikling av immuniseringsprogrammer for forebyggelse av metastaser.

Selv om den foreliggende oppfinnelse er beskrevet utifrå spesifikke utførelsesformer, vil fagmenn på området forstå at teknikkene som er anvendt, hovedsakelig er velkjente fremgangsmåter med tallrike variasjoner og utførelsesformer. Egnete variasjoner vil være åpenbare for fagmenn på området. For eksempel, selv om de nåværende monoklonale antistoffer primært er beskrevet i form av rotte/rottehybrider, er muse/musehybrider på samme måte egnet som illustrert i tabell VI. På samme måte vil dyktige molekylære biologer og proteinbiokjemikere oppdage at tallrike variasjoner i protein isolasjonsteknikker som er beskrevet, kan anvendes til vellykket isolasjon av gp580. Alle slike variasjoner er betraktet å være innen rekkevidden av den foreliggende oppfinnelse og de vedlagte krav.

Claims (11)

1. Hovedsakelig rent humant tumor gp580 antigen for in vitro diagnose, karakterisert ved at det omfatter et gluko-protein som har en molekylvekt som er identifiserbar på SDS-PAGE på omtrent 550 kilodalton, er isolerbart fra celle-membranfraksjoner av melkekjertelkarcinomceller; i det vesentlige resistent mot behandling med trypsin eller hyaluronidase og i det vesentlige følsomt for behandling med pronase; eller ved at det viser vesentlig binding til peanøttagglutinin etter behandling med neuraminidase, og er et hgp580 antigen som har omtrent det følgende antall av hver av de angitte aminosyrerester pr. 1000 aminosyrerester av glykoproteinet:

2. Hovedsakelig rent humant tumor gp580 antigen ifølge krav 1, anvendbart ved dannelse av mennesketumor-rettete antistoffer, karakterisert ved at antigenet kan fremstilles ved A. (a) ekstrahering av løselige proteiner, inkludert gp580, fra en tumor som inneholder gp580 antigenet; (b) ekstraktet underkastes geleksklusjonskromatografi på Sephadex G-50; (c) oppsamling av ekskludatet; (d) ekskludatet underkastes anionbytter-kromatografi på DEAE-Sephacel; (e) eluering av fraksjonene som binder seg til anionbytterharpiksen; (f) eluatet underkastes geleksklusjonskromatografi på Sepharase CL-2B; (g) samling av de ekskluderte fraksjoner; eller B. (a) ekstrahering av løselige proteiner, inkludert gp580 fra en tumor som inneholder gp580 antigenet; (b) ekstraktet underkastes geleksklusjonskromatografi på Sephadex G-50; (c) oppsamling av ekskludatet; (d) eksludatet underkastes densitetsgradientsentrifugering på cesiumklorid; (e) fraksjonering av den ekvilibrerte densitetsgradient; (f) de gp580-inneholdende fraksjoner underkastes gel-eksklusj onskromatograf i på Sepharose CL-2B; og (g) oppsamling av de ekskluderte fraksjoner.

3. Antistoff, karakterisert ved at det kan binde til antigenet i henhold til krav 1 eller 2 og i det vesentlige har samme affinitet til antigenet som de monoklonale antistoffer rotte GP21:56, rotte HGR1:69, rotte HGR1:70, mus HGM1:4, mus HGM1:9, mus HGM1:34, mus GMN1:39, mus HGM1:39, mus HGM1:43, mus HGM1:47, mus HGM1:54, mus HGM1:60, mus HGM1:77, mus HGM1:78, mus HGM1:84.

4. Antistoff i henhold til krav 3, karakterisert ved at antistoffet videre er et monoklonalt antistoff.

5. Antistoff i henhold til krav 4, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er GP21:56 eller HGR1:69, fremstilt av ATCC-deponeringer henholdsvis HB 9042 eller HB 9041.

6. Kontinuerlig hybrid cellelinje, karakterisert ved at den produserer et antistoff i henhold til kravene 3-5.

7. Kontinuerlig hybrid cellelinje som produserer antistoff ifølge krav 3, som er reaktivt mot hgp580-antigen ifølge krav lkarakterisert ved at den er fremstilt ved følgende trinn: (a) sammenføring av miltceller fra en rotte med myelom-celler fra en rotte hvor rotten som gir miltcellene, er blitt tilført en antigen blanding som omfatter et gp580 antigen; (b) dyrking av cellene i et selektivt medium; (c) testing for nærvær av det ønskede antistoff; og (d) kloning av celler som produserer det ønskede antistoff.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et hovedsakelig rent gp580-antigen, ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at den omfatter: A. (a) ekstrahering av løselige proteiner, inkludert gp580, fra en tumor som inneholder gp580; (b) ekstraktet underkastes geleksklusjonskromatografi på Sephadex G-50; (c) oppsamling av ekskludatet; (d) eksludatet underkastes anionbytte-kromatografi på DEAE-Sephacel; (e) eluering av fraksjonene som binder seg til anionbytterharpiksen, (f) eluenten underkastes geleksklusjonskromatografi på Sepharose CL-2B, og (g) samling av de ekskluderte fraksjoner; eller B. (a) ekstrahering av løselige proteiner, inkludert gp580, fra en tumor som inneholder gp580; (b) ekstraktet underkastes geleksklusojnskromatografi på Sephadex G-50; (c) oppsamling av ekskludatet; (d) ekskludatet underkastes densitetsgradient-sentrifugering på cesiumklorid; (e) fraksjonering av den ekvilibrerte densitetsgradient; (f) de gp580-inneholdende fraksjoner underkastes gel-eksklusj onskromatograf i på Sepharose CL-2B; og (g) oppsamling av de ekskluderte fraksjoner.

9. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 3, som har en spesifisitet for antigenet i henhold til krav 1 eller 2, ved en in vitro diagnostisk fremgangsmåte for påvisning av nærvær av metastatiske mennesketumorceller i en prøve, hvori man bringer prøvene i kontakt med dette, og påviser materialer bundet av antistoffet.

10. Anvendelse i henhold til krav 9, hvor prøven er en vandig prøve omfattende: a) blanding av prøven med et antistoff som har spesifisitet for antigenet i henhold til krav 1 eller 2, under betingelser som vil fremme spesifikke antigen/antistof f -reaksjoner ; og b) påvisning av antigen/antistoff-reaksjonen; eller når prøven er en ikke-vandig prøve: a) belegges prøven lagvis med et antistoff som har spesifisitet for antigenet i henhold til krav 1 eller 2; b) inkuberes prøven som er lagt i lag, under betingelser som vil fremme spesifikke antigen/antistoff-interaksjoner; og c) påvises antigen/antistoff-interaksjonen.

11. Anvendelse av a) et antigen som definert i henhold til krav 1 eller 2; eller et antistoff som har spesifisitet for dette ; og b) et immunopåvisningsreagens i et diagnostisk sett for in vitro påvisning av kreft.