NO175214B

NO175214B -

Info

Publication number: NO175214B
Application number: NO862100A
Authority: NO
Priority date: 1984-09-27
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1994-06-06
Also published as: US4708934A; JPS62500560A; DE3587506T2; DK241486A; WO1986002099A1; HU195857B; EP0201511A1; NO862100L; DE3587506D1; CA1341037C; FI94361B; FI100993B1; FI862216A; RU1802814C; JP2594037B2; ATE92522T1; NO175214C; AU594026B2; DK241486D0; HUT41444A

Description

Den intracellulære prosessering (spalting og/eller modifisering av funksjonelle grupper) av prekursorformer av native proteiner, etter deres translasjon fra nukleinsyrekodende sekvenser, har blitt klart dokumentert.

Generelt kan celler fra pattedyr og andre eukaryotiske celler foreta visse post-translatoriske prosesserende trinn, mens prokaryoter ikke kan det. Enkelte prokaryoter, såsom E. coli blir mye brukt som vertsorganismer for dannelse av pattedyrproteiner via rekombinant DNA (rDNA) teknologi, fordi de lett kan dyrkes i "batch" fermentering og fordi de generelt er godtkarakterisert. Imidlertid krever mange pattedyrproteiner, dannet ved genetisk manipuleringstekno-logi, en viss form for post-translatorisk behandling og dette må ofte oppnås ved å bruke innviklede in vitro kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter som er kostnads-begrensende for produksjonsformål i stor skala.

En type behandlingsaktivitet innbefatter spesifikk amidering (omdannelse av -COOH-grupper til -CONH2-grupper) av den karboksylterminale aminosyre i et protein. Mange naturlig forekommende hormoner og peptider inneholder slik modifisering, noe som ofte er essensielt hvis proteinet skal være biolog-isk aktivt. Et eksempel er kalsitonin, hvor substitueringen av et ikke-amidert prolinresiduum for det amiderte prolin av den native form, resulterer i 3.000 ganger reduksjon av bio-logisk aktivitet.

Det middel som frembringer denne C-terminal (alfa) amidering gjenkjenner et glycinresiduum som umiddelbart følger amino-syren som skal amideres (R-X-gly, hvor R er hoveddelen av proteinet, X er residuet som amideres og "gly" er glycin-residuet). Glycinet spaltes og overfører faktisk aminenheten til den endelige aminosyre for derved å amidere den.

Enzymatiske blandinger i stand til å amidere karboksylterminalen av peptider og proteiner, har blitt beskrevet fra et flertall kilder. Feks rapporterte A.F.Bradbury et al, Nature 298, 1982, s. 686-688, en a-amiderende enzymaktivitet å være tilstede i svinehypofyse. I. Husain og S.S. Tate, FEBS Letters, Vol. 152, 2, 1983, s. 277-281, beskrev en a-amiderende aktivitet å være tilstede i bovinhypofyse-neurosekretoriske granuler.

Eipper et al, PNAS, Vol. 80, 1983, s. 5144-5148, rapporterte en a-amiderende enzymaktivitet å være tilstede i de bakre, mellomliggende og fremre lapper av rottehypofyse.

Gomez et al, FEBS Letters, Vol. 167, 1, 1984, s. 160-164, bestemte at rottehypotalamus også inneholdt en a-amiderende enzymaktivitet.

A.F. Bradbury og D.G. Smythe i Peptides Structure and Func-tion: Proceedings of the Eight American Peptide Symposium; s. 249-252 (1983), V.J. Editors Hruby og D.H. Rich beskrev tilstedeværelsen av en a-amiderende enzymaktivitet i tyroide kjertler hos rotte.

R.E. Mains et al, Endocrinology, Wol. 114, 1984, s. 1522-1530, rapporterte at en murin cellelinje avledet fra den bakre hypofyselapp (ATT-20), inneholdt en a-amiderende enzymaktivitet som tydligvis minket med tiden i kultur.

Kjertler eller organer kjent for å inneholde amiderte peptider, kan inneholde et enzym som er i stand til å katalysere amideringsreaksjonen. Feks har lavere former for liv, såsom hai (Saualus acanthias) ha blitt rapportert av T.L. 0'Donnhue et al, Peptides 3, 1982, s. 353-395, å inneholde amiderte peptider i hypofyseekstrakter. R.H. Scheller et al, Cell, Vol. 32, 1983, s. 7-22, rapporterte tilstedeværelsen av amideringssignalpeptider i havsneglen Apylsia. Til tross for den tilsynelatende brede fordeling av denne aktivitet i naturen, har lite informasjon blitt publisert angående dets fysiokjemiske karakteristika. Dette kan være pga de meget

lave nivå av enzym tilstede i disse neuroendokrine organer.

Tidligere har rensingen og karakteriseringen av det a-amiderende enzym ikke blitt publisert. Fysiokjemiske egenskaper av delvis rensede enzympreparater har imdlertid blitt rapportert.

De første til å rapportere en omtrentlig molekylvekt for det a-amiderende enzym var A.F. Bradbury et al, Nature, Vol 298, 1982, s. 686-688. Ved å bruke "Sephadex G-100", antydet de en minste tilsynelatende molekylmasse på ca 60.000 dalton.

Senere studier har antydet molekylmassen til enzymet å være mellom 60.000 og 70.000 dalton. Disse innbefatter I. Husain og S.S. Tate, FEBS Letters, Vol. 152, 2, 1983, s. 277-281; B.A. Eipper, PNAS, Vol.. B.A. , 167, 1, 1984, s. 160-64, og J.S. Kizer et al, PNAS, Vol. 81, 1984, s. 3228-3232.

Eipper et al, PNAS, Vol. 80, 1983, s. 5144-48 har rapportert at i tillegg til molekylært oksygen, kreves to kofaktorer for maksimal enzymaktivitet: disse er askorbinsyre og kobber (II) ion.

Den kjemiske reaksjon som resulterer i amideringen av karboksylterminalen av et peptid, krever en kilde for amino-gruppen. A.F. Bradbury et al, Nature, Vol. 298, 1982, s. 686-688, demonstrerte at glycin spaltes og donerer amino-enheten til den endelige aminosyre som resulterer i amideringen av denne. Kravet for glycin som aminogruppedonor har blitt bekreftet av andre forfattere.

A.E.N. Landymore et al, BBRC, Vol. 117 1, 1983, s. 289-293, demonstrerte at D-alanin også kunne virke som aminodonor i amideringsreaksjonen. Senere arbeid av Kizer et al, PNAS, Vol. 81, 1984, s. 3228-3232, viste to distinkte enzymaktivi-teter i rottehjerne som var i stand til å katalysere den a-amiderende reaksjon. Enzymformen med høyere molekylær masse (70.000 dalton) har en spesifisitet begrenset til glycin ved den karboksylterminale ende av substratet. Enzymet med lavere molekylær masse aksepterer et substrat med 3-alanin som den karboksylterminale aminosyre.

pH-optiraum for det a-amiderende enzym ekstrahert og delvis renset fra svinehypofyse, ble rapportert av A.F. Bradbury og D.G. Smythe, BBRC, Vol. 112, 2, 1983, s. 372-377 til å være ca 7,0. B.A. Eipper et al, PNAS, Vol. 80, 1983, s. 5144-5148 bekreftet disse resultater ved å rapportere et pH-optimum på 7 for et a-amiderende enzym sam var delvis renset fra rotte-hypofyse. De bemerket også at enzymaktiviteten falt raskt ved pH-nivå under 6,5 eller over 7,5.

I alle tidligere nevnte publikasjoner inneholdt ekstraktene og de delvis rensede enzyxnblandinger i tillegg proteolytiske enzymer som brøt ned det potensielle substrat og produkter, såvel som det a-amiderende enzym.

Foreliggende oppfinnelse omhandler en enzymatisk blanding omfattende et a-amiderende enzym sem angitt i krav l's ingress, en fremgangsmåte for fremstilling av en slik blanding ifølge krav 8, samt en anvendelse derav for fremstilling av et a-amidert produkt.

Mer spesielt omhandler oppfinnelsen en slik blanding sam er angitt i krav l's karakteriserende del. Blandingen kan spesielt inneholde renset peptidylglycin a-amiderende mono-oksygenase sam er et enzym ekstra-herbart fra medulære tyroid-carcinoma og sam har molekyl masse på ca 60.000 - 65.000 daltons, og sam har blitt renset

for å oppvise et enkelt homogent veldefinert bånd ved elektroforetiske fremgangsmåter utført på SDS/polyakrylamidgeler og som har en spesifikk enzymatisk aktivitet på minst 50 mU pr mg protein. 1U = omdannelse av 1 millimol Dansyl-D-Tyr-Val-Gly-COOH til 1 millimol Dansyl-D-Tyr-Val-CONH2pr min ved 37"C og pH 7,0. Det er også inkludert i oppfinnelsen anvendelse av en slik blanding for fremstilling av et a-amidert produkt fra peptid- eller polypeptidsubstrater,

inneholdende et terminalt glycinresiduum ved å reagere substratet med oksygen i nærvær av det fri eller immobiliserte opprensede enzym, askorbat og kobber, og der er også inklu-

dert fremgangsmåten for dens fremstilling som angitt i krav 8.

Det har nå blitt funnet at homogent opprenset cx-amiderende

enzym kan erholdes gjennom en multisteg-prosedyre som benyt-ter en kombinasjon av størrelsesutskillelse og ionebyttekro-matografi fra faste tumorvevekstrakter, tumorcellelinjer og vevskulturmedia fra slike cellelinjer.

Enzymet har blitt ekstrahert fra rotte-medulære tyroid-carcinoma utviklet i WAG/Rij Wistar-rotter, som beskrevet av B.A. Roos et al, Endocrinolgy, 1979, Vol. 150, #1, s. 27-32. Dette vev har blitt deponert som IVI-10028. Enzymet har også blitt ekstrahert fra andre kilder, spesielt menneske- og rotte-medulære tyroid-carcinoma-cellelinjer. Rottecellelin-jen 77(74) ble avledet fra rotte-medulær tyroid-carcinoma-tumorer ved serial passasje, som beskrevet av M. Muszynski et al, JBC, 1983, Vol. 258, s. 11678-83. Denne cellelinje har blitt deponert som IVI-10029. En human cellelinje HTT 54(34) ble utviklet av B.A. Roos ved VA Medical Center i Cleveland, Ohio ved å bruke humane medulære tyroid-carcinoma- celler for den primære kultur. Den humane cellelinje HTT 54(34) har blitt deponert som IVI-10031. Definerte vevskulturmedia fra både humane og rottecellelinjer har blitt vist å inneholde vesentlige nivåer av a-amiderende enzymaktivitet noe som indikerer at en del av enzymet utskilles fra cellene.

Enzymet erholdes og renses ved først å utsette råmaterialet for anionebytterkromatografi. Prøven kan feks bli påsatt som masse på en preparativ anionbyttekolonne, såsom et DE-52 resin fra Whatman, Limited. Det a-amiderende aktivitetsinne-holdende produkt utsettes så for størrelsesutskillelseskro-matografi på et resin med passende utskillende egenskaper, feks en "Sephacryl S-200 superfine" kolonne som er til-gjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals. Den aktivitetsinne-holdende eluantfraksjon blir så utsatt for ionebytterkroma-tografi ved å bruke en sterk anionebyttemasse. Et resin som kan brukes er Mono Q HR5/5 sterkt anionbytteresin fraPharmacia Fine Chemicals, og én eller flere passasjer gjennom kolonnen kan kreves for homogen opprensing av enzymet. Hvert rensesteg kan overvåkes for både protein-innhold og nivå av a-amiderende aktivitet. Denne informasjon brukes for å regne ut den spesifikke aktivitet til enzymet, og virker som indikator for den relative renhet av enzymet.

Det resulterende enzym er peptiylglycin a-amiderende mono-oksygenase (rottekilde: IVI-10032; human kilde: IVI-10033) som har en molekylær masse på ca 60.000 - 65.000 daltons. Den har blitt renset slik at den oppviser en spesifikk enzymatisk aktivitet (antall enheter av a-amideringsaktivitet pr mg protein) på minst ca 25 mU og fortrinnsvis minst ca 50 mU/mg protein. Det har også blitt renset -for å oppvise et enkelt homogent veldefinert bånd etter elektroforese på natriumdodecylsulfat/polyakrylamidgeler (SDS-PAGE).

Det rensede peptidyl-glycin a-amiderende mono-oksygenase brukes for å amidere a-karboksylgruppen til et polypeptid med et terminalt glycinresiduum, hvor glycinet virker som en aminogruppedonor. Substratpeptidet eller polypeptidet kan være renset fra naturlige kilder, syntetisert fra dets enkelte aminosyrer eller dannet ved rekombinante DNA-teknikker. Det glycinterminerende polypeptid kombineres med oksygen i nærvær av en effektiv mengde av enzymet. Mengden av enzym som kreves avhenger av flere variable velkjente i faget, innbefattende spesielt, men ikke begrenset til, de følgende: Den spesifikke aktivitet av et gitt enzym, mengden og den kjemiske natur til substratet som skal konverteres, tiden hvor omdannelse skal finne sted og temperatur og pH til reaksjonsblandingen. Fagmannen vil gjenkjenne andre variable som kan ha innvirkninger på den nøyaktige mengde enzym som kreves i en gitt situasjon. Oksygen anvendes vanligvis i støkiometrisk mengde, men overskudd av oksygen innvirker ikke på reaksjonen. Tilstedeværelse av kobberioner er også krevet og kan tilføres ved hjelp av ethvert kobber-salt, hvis anion ikke innvirker ugunstig på reaksjonene. Når enzymet har en spesifikk enzymatisk aktivitet på ca 1 mU/mg protein, inntreffer maksimal oc-amidering med en konsentrasjon på 4,7 jjm kobber ioner. Ettersom renheten av enzymet økes, minker konsentrasjonskravene for de eksogene kobberioner. Den enzymatiske aktivitet kan også økes ved hjelp av ethvert salt, så lenge kationet av saltet ikke innvirker ugunstig på reaksjonen. For å rense et enzym med en spesifikk enzymatisk aktivitet på ca 50 mU/mg protein, inntrer maksimal aktivitet av a-amideringen ved ca 5,5 mm askorbat. a-amideringsaktivitet kan økes ved tilsetning av katalase. a-amideringsreaksjonens pH-optimum er mellom 6,5 og 7,5.

Siden peptidylglycin a-amiderende mono-oksygenase har blitt tilstrekkelig renset, er det nå mulig å erholde monoklonale antistoffer rettet mot enzymet ved standard prosedyrer. Monoklonale antistoffer tillater enzymgjenvinnende prosedyrer fra medulære tyroid-carcinoma å lette eller i det hele tatt erstattes av immunoabsorpsjons-opprensingsprosedyrer. Enzymet har også blitt tilstrekkelig opprenset for å tillate dets aminosyresekvens å bli bestemt. Denne informasjon er nødvendig for å tillate isolering av det genetiske materiale som koder for enzymet og dets etterfølgende inkorporering i en passende encellet organisme eller vertscelle, isolert fra en multicellulær organisme som ikke inneholder DNA som koder for peptidylglysin a-amiderende enzym. Dette oppnås ved standart rekombinant DNA-prosedyrer som funnet i E.F. Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982; eller R. Wu, ed., Methods in Enzymo-logy, Vol. 68, Academic Press, 1979. De resulterende celler som inneholder det heterologe DNA som koder for peptidyl-glycin a-amiderende enzym, tillater fremstilling av til-strekkelige mengder av enzymet for å utføre in vitro post-translasjonal a-amidering og tillater teoretisk disse celler å utføre denne modifisering av et peptid eller polypeptid in vivo.

Den a-amiderende aktivitet av det rensede enzym ifølge foreliggende oppfinnelse, ble demonstrert ved å bruke et substrat av radio-iodinert D-Tyr-Val-Gly, et peptid hvis sekvens etteraper karboksylterminalen av den melanocytt-stimulerte hormonprekursor. Assays ble utført i 100 inM TES (N-tris/hydroksymetyl/metyl-2-aminoetansulfonsyre)buffer, pH 7,0ved 37°C i 3 timer. Produktet (125<I>/Tyr-Val-NH2) ble separert fra substratet ved kationebyttekromatografi. Den amiderende enzymaktivitet ble også demonstrert ved å bruke et syntetisk substrat som etterapet sekvensen av karboksylterminalen til kalsintonin, (Tyr<25>Gly<33>)-kalsitionin (26-32) .

Selv om foreliggende oppfinnelse har blitt beskrevet i sam-menheng med foretrukne utførelsesformer derav, kan variasjo-ner med modifikasjoner være innlysende for fagmannen.

Claims

1. Enzymatisk blanding omfattende et alfa-amiderende enzym som er i stand til å katalysere omdannelsen av et peptidyl-substrat til et peptidyl-amid hvor peptidylamidet har en amino-gruppe på stedet for en C-terminal aminosyre i substratet, karakterisert vedat den enzymatiske blanding er tilstrekkelig ren med hensyn på det alfa-amiderende enzym til å oppvise en spesifikk aktivitet på minst 25 mU pr. mg protein som er tilstede i den enzymatiske blanding, og hvor den enzymatiske blanding er i stand til å katalysere alfa-amidering av et peptidyl-substrat fra naturlig kilde, uten at proteolytisk degradering av substrat, produkt eller alfa-amiderende enzym finner sted.

2. Enzymatisk blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat blandingen inneholder minst et alfa-amiderende enzym fra en kilde valgt fra gruppen omfattende medullære thyroid-carcinom-svulster, celle-linjer av medullær-thyroid-carcinom og vevskultur-medier fra slike cellelinjer.

3. Enzymatisk blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke aktivitet er minst 50 mU pr. mg protein som er tilstede.

4. Enzymatisk blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat det alfa-amiderende enzym er tilstede ved en renhet som er tilstrekkelig til å oppvise et enkelt homogent bånd på SDS-PAGE.

5. Enzymatisk blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat det alfa-amiderende enzym er erholdt fra rotte.

6. Enzymatisk blanding ifølge krav 1, karakterisert vedat det alfa-amiderende enzym har en molekylvekt på mellom 60.000 og 65.000 kDa og er et pattedyr-enzym.

7. Enzymatisk blanding ifølge krav 1,karakterisert vedat det alfa-amiderende enzym har en molekylvekt på mellom 60.000 og 65.000 kDa og er et rotte eller et humant enzym.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av den enzymatiske blanding ifølge krav 1, karakterisert vedat en uren prøve av et alfa-amiderende enzym blir underkastet et første og et andre kromatograferings-trinn, hvor det andre kromtograferings-trinn blir utført på den del av eluanten fra første elueringstrinn som oppviser aktivitet som er karakteristisk for det alfa-amiderende enzym, hvor et av de nevnte kromatograferingstrinn er størrelses-ekskluderende kromato-grafi som er i stand til a skille fra hverandre proteiner med en molekylvekt på omkring 65.000 Dalton, og det andre kromatograferings-trinnet er sterk anionebytter-kromatogra-fering.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat den urene prøve er valgt fra gruppen omfattende medullære thyroid-cacinom-tumorer, cellelinjer av medullær thyroid-carcinom og vevskultur-medier fra slike cellelinjer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat en sterk anionebytter-kromatografering blir utført etter størrelsesutskillelses-kromatogra f eringen.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den ytterligere omfatter et ekstra anionebytter-kromatograferingstrinn før nevnte størrelses-ekskluderende kromatograferingstrinn.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat det anvendes en uren prøve erholdt fra rotte som utgangsmateriale.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat den urene prøve er et alfa-amiderende enzym som har molekylvekt mellom 60.000 og 65.000 kDa og er et pattedyrenzym.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat den urene prøve er et alfa-amiderende enzym som har molekylvekt mellom 60.000 og 65.000 kDa og er et rotte eller et humant enzym.

15. Anvendelse av den enzymatiske blanding ifølge ethvert av kravene 1-7 for fremstilling av et alfa-amidert produkt.

16. Anvendelse ifølge krav 15 hvor den enzymatiske blanding inneholder minst ett alfa-amiderende enzym fra en kilde valgt fra gruppen omfattende medullær thyroid carcinom-tumorer, celle-linjer av medullære thyroide carcinomer og vevskulturmedier fra slike cellelinjer.

17. Anvendelse ifølge krav 15 hvor den spesifikke aktivitet er minst 50 mU pr. mg totalt protein.

18. Anvendelse ifølge krav 15 hvor det alfa-amiderende enzym er tilstede i den enzymatiske blanding ved en renhet som er tilstrekkelig til å oppvise et enkelt homogent bånd på SDS-PAGE.

19. Anvendelse ifølge krav 15 hvor det alfa-amiderende enzym er erholdt fra rotte.

20. Anvendelse ifølge krav 15 hvor substratet settes i kontakt med den enzymatiske blanding i nærvær av minst én substans valgt fra gruppen omfattende kopper-ioner, molekylært oksygen og et reduksjonsmiddel.

21. Anvendelse ifølge krav 15 hvor substratet settes i kontakt med den enzymatiske blanding i nærvær av en reaksjons-økende konsentrasjon av katalase.

22. Anvendelse ifølge krav 15 hvor substratet settes i kontakt med den enzymatiske blanding i nærvær av et reduksj onsmiddel.

23. Anvendelse ifølge krav 22 hvor reduksjonsmiddelet omfatter ascorbat.

24. Anvendelse ifølge krav 15 hvor den enzymatiske blanding omfatter peptidyl glycin alfa-amiderende mono-oksygenase, og hvor substratet innbefatter et glycin-residuum ved C-terminalen av en peptidkjede.

25. Anvendelse ifølge krav 15 hvor substratet er valgt fra gruppen omfattende naturlig forekommende peptider, substrater dannet ved rekombinante DNA-teknikker og substrater dannet ved in vitro syntese av sammenhengende aminosyrer.

26. Anvendelse ifølge krav 15 hvor substratet er kalsitonin.