NO173214B - Fremgangsmaate for fremstilling av en monobromert perfluorcarbonemulsjon - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en monobromert perfluorcarbonemulsjon som kan tilføre oxygen til animalsk vev med størrelsestabilitets-egenskaper i den ikke-frosne tilstand i en utstrakt tidsperiode, og som er resistent mot angrep av dyreorganismer i dyrets kroppsvæsker.

Mono-bromerte, cykliske og acykliske perfluorcarboner i vandige emulsjoner med en mindre mengde av et emulgeringsmiddel er kjent for medisinske anvendelser omfattende dyr, inkludert mennesker, både for "radiotetthet" og oxygenavgivelse. Oxygen er f.eks. meget løselig i perfluoroctylbromider. Se

US patenter 3 818 229, 3 975 512 og 4 073 879. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot forbedringer ved bruken av slike bromfluorcarboner hvor oxygentransportegenskapene, såvel som lagringsegenskapene for emulsjonene, er øket, mens toksisi-teten er ytterligere minsket eller helt avtatt.

Tidligere er det gjort forsøk på å bruke emulgerte fluorcarboner som et oxygentransportmiddel eller -bærer, som f.eks.

i en bloderstatning, men dette har støtt på visse vanskelig-heter. Renhet, ikke-toksisitet, kjemisk og biologisk inerthet og utskillingsevne, er nødvendige egenskaper. Det emulgerte fluorcarbon må kunne steriliseres, fortrinnsvis ved hjelp av varme, ha langvarig størrelse- og funksjonsstabilitet i fluid eller ikke-frossen tilstand, kunne anvendes industrielt, holde seg i tilstrekkelig lang tid i blodstrømmen når det anvendes intravaskulaert og elimineres raskt fra kroppen. Konvensjonelt har det vært antatt at de fluorcarboner som har en rask eli-mineringstid fra kroppen, ikke danner stabile emulsjoner, og at de fluorcarboner som danner stabile emulsjoner, tilbakeholdes for lenge i kroppen. Ikke-bromerte perfluorcarboner viser et direkte forhold mellom emulsjonsstabilitet og molekylvekt og et motsatt forhold mellom molekylvekt og utskillelseshastig-heter fra dyrekroppen. Begge typer av fluorcarboner er inade-kvate, og forsøk på å kombinere mengder av begge typer har bare kombinert problemene fra hver av dem.

For intravenøs bruk antas det å være viktig å ha liten partikkelstørrelse. Lagring i lengre tidsperioder som f.eks.

en måned og lenger av fluorcarbon-bloderstatninger, eller "syntetisk blod", har imidlertid hittil resultert i konglomer-ering av fluorcarbonpartiklene i emulsjonen til større partikler, spesielt etter varmesterilisering. For en generell diskusjon av egenskapene og en oversikt over de anstrengelser og problemer som er forbundet med å oppnå disse egenskapene hos fluorcarbon-bloderstatninger, se "Reassessment of Criteria for the Selection of Perfluoro Chemicals for Second-Generation Blood Substitutes: Analysis of Structure/Property Relation-ship" av Jean G. Riess, 8 Artificial Organs, 34-56 (1984).

Større partikkelstørrelser er farlig ved intravenøs bruk ved at de har en tendens til å samle seg i lungen, milten og noen andre organer, forstørrer dem og setter deres funksjon i fare. På den annen side er det ønskelig å ha en tilstrekkelig partikkelstørrelse hos fluorcarbonpartiklene for at de skal samle seg i tumorer og andre områder der fluorcarbonene anvendes som kontrastøkningsmedium. Større partikkelstørrelser er heller ikke betenkelig når de anvendes i andre, ikke-venøse systemer i kroppen, som f.eks. ventrikler og hulrom for cerebrospinal-væsken.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at

a. det rensede emulgeringsmiddel dispergeres i en bufret, vandig løsning av glycerol, og tilsettes eventuelt stabiliseringsmidler,

b. ved en forhåndsbestemt, målt hastighet innblandes fra 20 til 125% vekt/volum monobromert perfluorcarbon inn i dispersjonen av emulgeringsmiddel og løsning, og c. den resulterende blanding føres i en rekke strømmer i separate baner, og disse strømmene rettes mot hverandre ved et trykk på minst 280 kg/cm<2>.

De bromfluorcarbonemulsjoner som er funnet egnet for bruk som et oxygentransportmedium, omfatter mono-bromerte perfluorcarboner med en mindre mengde av et emulgeringsmiddel og omfatter eventuelt ytterligere en forbindelse som antas å være anvendbar for stabilisering av bromfluorcarbonpartik-kelens membran. Denne forbindelse er steroidhormoner, cholesterol, tocoferoler og blandinger derav. Et ni-a-fluorert corticosteroid i kombinasjon med cholesterol som er emulgert sammen med et fosfatidylcholin til partikler av et perfluoroctylbromid med formelen CF3 (CF2) 6CF2Br eller C8F17Br, eller av et beslektet, bromert perfluorcarbon som f.eks. et perfluor-hexylbromid (C6F13Br) eller et perfluorseptobromid (C7F15Br), sammen med et tocoferol som en antioxydant, foretrekkes.

Det er funnet at partikkelstørrelsestabilitet kan bibe-holdes med emulsjoner på fra 20 til 125% vekt/volum av bromfluorcarbon uten uønsket viskositet. I foreliggende beskrivelse vil uttrykket "vekt/volum" eller "w/v" anvendes og skal forstås å bety forholdet 100 g pr. 100 cm 2 eller milliliter, eller ekvivalente uttrykk eller matematiske identiteter derav. Emulsjoner med konsentrasjoner på fra 20 til 100% vekt/volum har en tiksotrop viskositetsprofil mindre enn den som helt humant blod har. Perfluoroctylbromid utskilles raskt fra dyrekroppen, hvilket antas å være forårsaket av den lipotrope natur til det bromerte perfluorcarbon. I alle tilfeller og uansett dets høye molekylvekt og stabilitet, har mono-bromert perfluorcarbon en relativt høy utskillelseshastighet fra dyrekroppen.

I noen anvendelser der høye bromidkonsentrasjoner, som f.eks. når emulsjonen skal anvendes som et kontrastøkende medium, eller hvor det er behov for en høy oxygentransport i et intravaskulært system hvor stor volumtilsetning må minskes, foretrekkes emulsjoner med stor konsentrasjon. Selv om det ikke er sikkert, antas det at disse egnede og stabile emulsjonene med høy bromfluorcarbonkonsentrasjon er mulige på grunn av (1) den relativt høye molekylvekten til det bromerte perfluorcarbon og (2) den gode bindingen mellom brom og det fosfolipid-emulgeringsmiddel som er omtalt nedenfor.

Det foretrukne emulgeringsmiddel er et fosfolipid, et anionisk, overflateaktivt middel eller et fluorert, overflateaktivt middel. Egnede fosfolipider omfatter lecithin, som f.eks. fosfatidylcholin. Fosfolipider er vanlige og biologisk godtatte elementer i blodet og blir ikke så lett fagocytert av makrofager eller andre organismer i dyrets kroppsvæsker. Den resulterende emulsjon er således resistent mot angrep av makrofager og andre organismer i dyrekroppen.

Foretrukne, anioniske, overflateaktive midler omfatter polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymerer, som f.eks. Pluronic<®>. Egnede, fluorerte, overflateaktive midler omfatter XM010 og XM020.

Fosfolipidemulgeringsmidlet skal tilsettes i området på fra 2 til 14 g vekt/volum, idet den foretrukne mengde er 6 g vekt/volum for konsentrasjoner på 75% vekt/volum bromfluorcarbon og 7 g til 10 g vekt/volum for konsentrasjoner på 100% bromfluorcarbon. Fosfolipidet lecithin har både hydrofile og hydrofobe eller lipofile egenskaper og er således et passende emulgeringsmiddel for perfluorcarbonpartikkelen.

Ifølge en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse gjøres ytterligere en forbindelse til en del av partikkelen i emulsjonen. Tilleggsbestanddelen antas å være effektiv når det gjelder å gjøre den diskontinuerlige partikkelmembranen mere forenelig med og sterkere med hensyn på emulsjonens kontinuerlige, vandige fase. Tilleggsbestanddelen kan være en tocoferol, et steroidhormon, en cholesterol eller fortrinnsvis en kombinasjon av disse tre bestanddelene. Egnede steroidhormoner omfatter fluorerte corticosteroider, fluorerte androgener og ikke-fluorerte hormoner, som f.eks. progesteroner og østro-gener. Det foretrukne steroid er et som fluoreres enten i ni-a- eller seks-a-stillingene, som f.eks. ni-a-fluor-16-a-methylprednisolon, ni-a-fluor-16—|3—methylprednisolon, ni-a-fluor-16-a-hydroxyprednisolon og seks-a-fluor-16-a-methyl-prednisolon, eller kombinasjon av disse corticosteroidene. Mens den virkelige reaksjonen som finner sted i membranstrukturen ikke er kjent, antas det at affiniteten for fluor i det fluorerte corticosteroid til fluor i bromfluorcarbonet skaper en mer forenelig og pålitelig binding mellom steroidet og perfluorcarbonpartikkelen slik at det dannes en mer stabil membran for perfluorcarbonpartikkelen i emulsjonens diskontinuerlige fase.

Det antas at cholesterol på de røde blodlegemenes celle-membraner fjernes for å forbindes med membranen til fluorcarbonpartiklene, som danner en nær forbindelse med og har en affin-itet for fluorcarbonpartiklene. Det antas at fluorcarbonpar-tikler med et signifikant belegg av cholesterolene vil hindre fjerning av cholesterol fra de røde blodlegemene. Omtrent på lignende måte øker tocoferoler og steroidhormoner stabili-teten til perfluorcarbonpartikkelens membran.

Steroidene ni-a-fluor-16-a-methylprednisolon og ni-a-fluor-16-p<->methylprednisolon og andre tilleggsbestanddeler dersom noen kombineres med dem, skal tilsettes i en mengde på fra 0,5 mg til 5 mg (eller 0,0001 til 0,005%) vekt/volum i emulsjonen. 6 ganger denne mengde av steroidet ni-a-fluor-16-a-hydroxy-prednisolon og kombinerte, ytterligere bestanddeler kan anvendes. 3 ganger det angitte område kan anvendes dersom steroidet seks-a-fluor-16-a-methylprednisolon og eventuelle tilleggsbestanddeler anvendes. Den aktuelle mengde av tilleggsbestanddelen eller -bestanddelene er en funksjon av den på-tenkte dose, og av mengden bromfluorcarbon i den ferdige emulsjon. I foreliggende beskrivelse anvendes uttrykket "bioforenelig" for å angi den mengde eller kvantitet som er forenelig med, og over hvilken toksisitet oppstår i det biologiske system som emulsjonen som inneholder det bioforenelige element, tilføres til. Det er bioforenelige grenser for steroider og cholesteroler. Det kan være at tilleggsmengder eller -kvanti-teter av steroidene og cholesterolene er bioforenelige, men det angitte område er funnet å være tilstrekkelig til å oppnå partikkelstørrelsestabiliteten og den effektive foreneligheten med røde blodlegemer og andre bestanddeler i blodstrømmen og andre væskesystemer i dyrekroppen.

Andre næringsstoffer kan tilsettes til den ferdige emulsjon, som f.eks. glucose, aminosyrer, proteiner og lipider.

Oxygen er meget løselig i perfluorcarbonene og spesielt de mono-bromerte perfluorcarboner ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved bruk av foreliggende oppfinnelse som et oxygentransportmedium er det viktig å bibeholde oxygenet som en del av perfluorcarbonpartikkelen i en rimelig tidsperiode for å transportere oxygenet gjennom det vaskulære system eller for å øke intravaskulær oppholdstid. Det er funnet at tocoferoler, som f.eks. a-tocoferol, og vannløselige analoger av tocoferoler, er egnede antioxydanter som vil forsinke rask oxydasjon.

Andre antioxydanter som er anvendbare, er ascorbinsyre og calciumascorbat. Tilsetning av antioxydanter til emulsjonen i en mengde på fra 0,01 til 0,5% vekt/volum er funnet nyttig for å forsinke oxydasjonen av lipidemulgeringsmidlet, hvilken minsker emulsjonens stabilitet. Antioxydanter stanser også frie radikaler som f.eks. superoxyd eller hydroxylatomer som er skadelige for biologiske systemer.

For indre bruk i et dyr, inkludert mennesker, for kontrast-økning og for oxygentransport i annet enn i blodstrømmen, som f.eks. i det cerebrospinale system, i øyet og i tracheobronki-ale passasjer, kan større partikkelstørrelser tolereres, og faktisk til og med foretrekkes. Slike større partikkelstørr-elser kan gi en jevnere fordeling av gassen, som f.eks. oxygenet. Partikkelstørrelser på mindre enn 400 nanometer diameter for hoveddelen, i størrelsesorden på 95% av partiklene, med en medianpartikkeldiameter på mindre enn 150 nanometer foretrekkes imidlertid for bruk i blodstrømmen. Effektiv oxygenavgivelse eller deoxygenering forekommer primært i blod-strømmen i kapillarene, og den lille bromfluorcarbonpartikkel-størrelsen er fordelaktig for å gi oxygen til disse kapillarene. For disse størrelser for bruk i blodstrømmen, og til og med for emulsjonene som skal anvendes i ikke-vaskulære systemer, er det meget viktig å bibeholde partikkelstørrelseegenskapene stabile over utstrakte tidsperioder, minst mer enn én måned og av størrelsesordenen 18 måneder og mer.

Oppfinneren har oppnådd partikkelstørrelser for perfluorcarbonemulsjoner i kommersielt brukbare mengder med meget små størrelser eller diametre i størrelsesorden på hundreder av nanometer ved bruk av konvensjonelle partikkelfraksjonaliser-ingsmetoder, som f.eks. de homogeniseringsteknikker hvor det anvendes Gaulin-blander. Brom-perfluorcarbonemulsjoner som er fremstilt ved hjelp av en slik teknikk, synes å være passende stabile når konsentrasjonen av brom-perfluorcarbonet er relativt liten, av størrelsesorden på mindre enn 50% vekt/volum. Forsøk på bruk av Gaulin-blandemaskinen for å fremstille kommersielt brukbare mengder av brom-perfluorcarbonemulsjoner med vekt/volum-konsentrasjoner på 50%, 75% og mer og med en medianpartikkeldiameterstørrelse på mindre enn 200 nanometer, var ikke vellykket. Disse brom-perfluorcarbonemulsjoner med høyere konsentrasjoner ble observert å ha en medianpartikkel-diameterstørrelse på mer enn 200 nanometer.

Mono-bromerte perfluorcarbonemulsjoner i en vandig fase

med et fosfolipidemulgeringsmiddel med langvarig stabilitet for en liten partikkelstørrelse, er funnet når emulsjonen frem-stilles eller genereres ved bruk av et flerstrøms slagapparat. Den vandige fase ble bufret med natrium-monofosfat og natrium-difosfat i en slik mengde at det oppnås en resulterende emulsjon med pH på mellom 6,8 og 7,2. Den vandige fase forelå ytterligere i en løsning av glycerol for å regulere den resulterende emulsjonens osmolaritet for bruk i blodstrømmen. Denne bufrede løsning av vandig fase i glycerol betegnes noen ganger som bæreren.

Bromfluorcarbonet ble innmålt med en forhåndsbestemt, målt hastighet i bæreren eller den vandige fase hvori emulgerings-midlet er innblandet. Den resulterende blanding ble plassert i en strømningsbane som ble delt i en rekke strømningsbaner. Strømmene ble rettet slik at de støtte på hverandre med hastigheter over 450 m/sekund i reaksjonsflater i et hulrom under et trykk på 2 80 kg/cm 2 eller mer. De resulterende bromfluorcarbon-partikler hadde størrelsesegenskaper på mer enn 95% mindre enn 350 nanometer diameter, med en midlere diameterstørrelse på mindre enn 150 nanometer, og disse størrelsesegenskapene ble signifikant bibeholdt stabile i opp til 16 måneder, og selv etter sterilisering, som f.eks. med varme eller ved filtrering.

Foreliggende oppfinnelse kan forstås bedre med henvisning til følgende illustrerende eksempler.

Eksempel I

Utvekslingsoverføringer ble utført på hunnrotter som veide 180 til 220 g. Rottene ble bedøvet, og polyethylenkatetere ble innført i den venstre eller høyre halsvene og carotid-arterien. Etter å ha kommet seg fra bedøvelsen, ble rottene plassert i en atmosfære som var anriket med 50 til 60% oxygen. Blod ble uttatt gjennom kateteret i carotid-arterien, og en sammenlign-bar mengde av den bromerte perfluorcarbonemulsjon omfattende 25% vekt/volum perfluoroctylbromid, 4% vekt/volum lecithin, 0,04% vekt/volum L-a-tocoferol, 2,21% vekt/volum glycerol, 0,012% vekt/volum natrium-difosfat, 0,057% vekt/volum natrium-monofosfat og den vandige fase. Overføringen ble fortsatt inn-til det røde blodlegemetallet for rotten var redusert til 50% av basisverdien. Rottene ble holdt i den oxygenanrikede atmosfære i 24 timer, hvoretter de ble fjernet til den ordinære atmosfære. Alle rottene overlevet i mer enn én måned.

Eksempel II

Forsøket fra eksempel I ble gjentatt, bortsett fra at

den bromerte perfluorcarbonemulsjon omfattet 50% vekt/volum perfluoroctylbromid. Alle andre parametre var like. Alle rottene overlevet i mer enn én måned.

Eksempel III

Til Balb C-mus ble den bromerte perfluorcarbonemulsjon administrert intravenøst i doser på 4 5 g pr. kg kroppsvekt,

og den bromerte perfluorcarbonemulsjon ble administrert intra-peritonealt i doser på 100 g pr. kg kroppsvekt. Emulsjonen omfattet 100% vekt/volum perfluoroctylbromid, 9,1% vekt/volum lecithin, 0,02% vekt/volum 6-a-fluor-16-a-methylprednisolon, 0,2% vekt/volum a-tocoferol, 1,0% vekt/volum glycerol,

0,012% vekt/volum natriumdifosfat, 0,057% vekt/volum natrium-monofosfat og den vandige fase. Etter 7 dager var leveren og milten forstørret, men peritonealhulen viste ingen tegn på inflammasjon, og lungene var normale og fylt med oxygen. Det var ingen tegn på blødning eller lungestuvning, eller på inflammasjon i vevene i bukveggen.

Eksempel IV

En mono-bromert perfluorcarbonemulsjon omfattende 100% vekt/volum perfluoroctylbromid, 9,1% vekt/volum lecithin, 0,02% vekt/volum 6-a-fluor-16-a-methylprednisolon, 0,2% vekt/volum a-tocoferol, 1,0% vekt/volum glycerol, 0,012% vekt/volum natriumdifosfat, 0,057% vekt/volum natrium-monofosfat og den vandige fase ble fremstilt ved først å fremstille bæreren for den kontinuerlige eller vandige fase ved å blande inn lecithinet, 6-a-fluor-16-a-methylprednisolonet, a-toco-ferolen, glycerolen, natriumdifosfatet og natrium-monofosfatet.

Perfluoroctylbromidet ble tilsatt med tilmålt hastighet

i bæreren under blanding. Den resulterende emulsjon ved 10°C ble ført gjennom et mikrofluidiseringsapparat i den metoden som er beskrevet her, hvor en rekke strømmer av emulsjonen støtte mot hverandre med hastigheter over 4 50 m/sekund 15 ganger. Partikkelstørrelsesfordelingen ble analysert i en Nicomp sub-um partikkelstørrelsemåler fremstilt av Pacific Scientific Co., Anaheim, California. Denne analysator be-stemmer relative mengder av partikler med forskjellige størr-elser ved hjelp av en metode med dynamisk lysspredning. Det ble oppnådd resultater overensstemmende med følgende tabell I, hvor den første kolonnen representerer partiklenes diameter i nanometer, og den andre kolonnen representerer en kvantitativ verdi for den relative mengde av partiklene som er påvist ved til-svarende partikkelstørrelser

Emulsjonen ble så sterilisert ved 90°C i 15 minutter. Etter sterilisering ble emulsjonspartikkelstørrelsesegenskapene målt på Nicomp partikkelstørrelsemåler. Resultatene, angitt i tabell II nedenfor hvor kolonner representerer de samme egenskapene som angitt i tabell I, viste ingen signifikant nedbryt-ning eller forandring av partikkelstørrelsesegenskapene:

Eksempel V

Emulsjonspartikkelstørrelsens stabilitet over en utstrakt tidsperiode ble undersøkt ved å analysere partikkelstørrelse- fordelingen i en Nicomp sub-um partikkelstørrelsemåler identi-fisert ovenfor for eksempel IV. Den bromerte perfluorcarbonemulsjon ble først fremstilt ved hjelp av de metodene som er beskrevet ovenfor, og omfattet 25% vekt/volum perfluoroctylbromid, 4% vekt/volum lecithin, 0,04% vekt/volum L-oc-tocoferol, 2,21% vekt/volum glycerol, 0,012% vekt/volum natriumdifosfat, 0,057% vekt/volum natrium-monofosfat og den vandige fase. Emulsjonen ble analysert like etter fremstillingen, og de relative mengdene av emulsjonens partikkelstørrelse er angitt i følgende tabell III hvor skala og kolonner representerer de samme egenskaper som er angitt i tabellene i eksempel IV:

Emulsjonen ble lagret ved 4°C selv om temperaturen ble for-andret for forskjellige tolkninger under lagringstiden, idet den ofte var vesentlig høyere. En andre og i det vesentlige identisk analyse ble utført ved bruk av Nicomp partikkel-størrelsemåleren som beskrevet ovenfor, omtrent 15 måneder og

22 dager etter den analyse som er angitt i tabell III. Resultatene av denne andre analyse er angitt i den følgende tabell IV hvor skala og kolonner representerer de samme egenskaper som angitt i tabellene i eksempel IV:

Den foranstående, detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen og foretrukne utførelsesformer, når det gjelder produkter, preparater og fremgangsmåter, er illustrerende bare for spesi-elle utførelsesformer. Det skal imidlertid forstås at fag-mannen lett kan komme på ytterligere utførelsesformer. De ut-førelsesformer som er beskrevet her, sammen med disse ytterligere utførelsesformer, anses å være innenfor foreliggende oppfinnelses område.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en monobromert perfluorcarbonemulsjon som kan tilføre oxygen til animalsk vev med størrelsestabilitetsegenskaper i den ikke-frosne tilstand i en utstrakt tidsperiode, og som er resistent mot angrep av dyreorganismer i dyrets kroppsvæsker,karakterisert vedfølgende trinn: a. det rensede emulgeringsmiddel dispergeres i en bufret, vandig løsning av glycerol, og tilsettes eventuelt stabiliseringsmidler, b. ved en forhåndsbestemt, målt hastighet innblandes fra 20 til 125% vekt/volum monobromert perf luorcarbon inn i dispersjonen av emulgeringsmiddel og løsning, og c. den resulterende blanding føres i en rekke strømmer i separate baner, og disse strømmene rettes mot hverandre ved et trykk på minst 280 kg/cm<2>.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedfølgende trinn: a. renset fosfolipidemulgeringsmiddel dispergeres i en bufret, vandig løsning av glycerol inneholdende en bioforenelig mengde av en forbindelse valgt fra klassen omfattende steroidhormoner, cholesterol, tocoferol og kombinasjoner derav, b. i det dispergerte emulgeringsmiddel og løsningen innblandes med en forhåndsbestemt, målt hastighet fra 20 til 125% vekt/volum monobromert perfluorcarbon, og c. den resulterende blanding føres i en rekke strømmer i separate baner, og disse strømmene føres mot hverandre ved trykk på minst 280 kg/cm<2>.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat den resulterende blanding føres mange ganger i en rekke strømmer i separate baner, og disse strømmene rettes deretter mot hverandre ved et trykk på minst 280 kg/cm<2>.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3,karakterisert vedat blandingen i de separate banene i passeringstrinnet strømmer med hastigheter over 450 m/sekund.