NO170810B - Monoklonalt antistoff av igm-klassen for bruk in vitro ogfremgangsmaate for in vitro deteksjon og diagnose av cancer eller cystisk fibrose - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et monoklonalt antistoff av IgM-klassen for bruk in vitro, og det særegne ved det monoklonale antistoff i henhold til oppfinnelsen er at det har en spesifikk reaktivitet med et colorektalt tumorassosisert glykoprotein (antigen) med en molekylvekt i området fra 820.000 til 960.000, isoelektriske punkter i områdene 4,5 til 5,0 og 5,1 til 5,9, særlig omtrent 4,9 henholdsvis omtrent 5,4, og minst en antigenisk determinant reaktiv med det monoklonale antistoff CCK061 fremstilt av den hybride cellelinje ATCC HB87 86, hvor reaktiviteten av antigenet med det monoklonale antistoff CCK061 kan ødelegges ved behandling av antigenet med proteinase K.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for in vitro deteksjon og diagnose av cancer eller cystisk fibrose i pasient, ved hjelp av immunoanalyse, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er anvendelse av det nevnte monoklonale antistoff.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Den potensielle rolle til monoklonale antistoffer ved diagnose og behandling av cancer har vært i fokus for mye av den senere tids undersøkelser og forventninger. Av spesiell interesse er deres bruk ved immuno-analyser for å overvåke forløpet av sykdom. Av spesiell interesse er også de potensielle anvendelser av monoklonale antistoffer for tumor-avbilding på grunn av deres evne til å binde til tumor-assosierte antigener in vivo.

Utviklinger i monoklonal antistoff-teknologi har også gjort det mulig å undersøke den antigeniske kompleksitet av humane tumorer. Spesifikt tillater den nøyaktige immuno-reaktivitet av monoklonale antistoffer identifisering og differensiering av distinkte celleoverflate-antigener som uttrykkes av humane tumorer. Karakteriseringen av slike distinkte tumor-assosierte antigener tilveiebringer således et middel til mer fullstendig utnyttelse av monoklonale antistoffer for cancer-diagnose og maksimalisering av fordelene ved monoklonal antistoff-teknologi.

Hittil er bare et begrenset antall tumor-assosierte antigener velkarakterisert. Ytterligere vil ikke alltid visse tumor-assosierte antigener nyttige som diagnostiske prognostiske markører -være tilstede i alle pasienter eller under alle trinn og manifestasjoner av sykdommen. Følgelig eksisterer det et behov for ytterligere identifisering og karakterisering av særlige tumor-assosierte antigener.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelse og karakterisering av et nytt antigen tilstede i humanvev og cancerøse humane cellelinjer, spesielt human coloncarcinom og colon carcinom celle-linje. Følgelig er oppfinnelsen basert på at et distinkt tumor-assosiert antigen fremviser reaktivitet overfor det monoklonale antistoff CCK061. Dette fremstilles ved hjelp av den hybride cellelinje ATCC HB 8786.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer antistoffer med spesifisitet for det antigen som er definert heri. Oppfinnelsen muliggjør anvendelse av slike antistoffer for in vitro deteksjon og diagnose av cancer ved hjelp av immunohistokjemiske og immuno-analysemetoder ved in vitro deteksjon og diagnose av cancer eller cystisk fibrose i mennesker.

Som indikert ovenfor anvendes ved den foreliggende oppfinnelse et nytt tumor-assosiert antigen, reaktivt overfor det monoklonale antistoff CCK061, utviklet av den hybride cellelinje ATCC med deponeringsnr. HB 8786 anvendbart for karakterisering av dette tidligere ikke-beskrevne antigen.

De fysiologiske og immunologiske egenskaper av dette antigen og spesielt dets reaktivitet med det monoklonale antistoff CCK061, tillater dets karakterisering og differensiering fra andre antigener tilstede i cancerøse humane cellelinjer og humant vev, inklusive humant tumorvev. Følgelig er de identifiserende karakteristikker og egenskaper av antigenet anvendt ved den foreliggende oppfinnelse som følger: a) Antigenet er tilstede i humane colon carcinom cellelinjer. Standard enzym-tilknyttede immunoabsorbent bindingsanalyse-prosedyrer (ELISA) under anvendelse av monoklonalt antistoff CCK061 indikerer nærvær av antigen i colon carcinom-cellelinjer, men ikke i andre cellelinjer som bryst-cancinom, prostata-carcinom, blære-carcinom, adeno-carcinom i lungen og melanom-cellelinjer. b) Antigenet fremstilles i cytosolen av normalt colon-vev og colon-carcinom. Reaktiviteten av CCK061 med

plasma-membraner renses fra humant colon-vev og humant colon-carcinom vises ved konvensjonelle ELISA-metoder. Ved sammenligning fremviser CCK061 ingen reaktivitet med membraner som er renset fra andre normale eller tumor-vev, inklusive bryst-carcinom, prostata-earcinom, adeno-carcinom av lunge og melanom.

c) Standard immunehistokiemiske prosedyrer viser at nærværet av antigen i normalt colon, colon-carcinom

øsofagal carcinom og gastrisk carcinom er en sterk reaktivitet med CCK061 som vist ved immunoperoksydase-farging av slikt vev. En svak reaktivitet eller reaktivitet vises med bryst-carcinom, adeno-carcinom fra lunge, prostata-carcinom og melanom.

d) SDS - polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE)

og Western immuno-avsetnings-analyse viser at

antigenet har en molekylvekt i området 820.000 til 960.000. Modifisering av antigenet ved behandling med proteinase K før SDS-PAGE og Western immuno-avsetnings-analyse ødelegger antigenets reaktivitet med CCK061 og indikerer at antigenet er et protein.

e) Antigenet er av glykoprotein-natur. Metabolisk

14

merking av colon carcinom-celler med C glukosamin og immuno-utfelling av antigenet med

CCK061 ved hjelp av standard prosedyrer viser at antiget inneholder en karbohydrat-komponent.

f) Isoelektrisk fokusering av antigenet i oppløsning indikerer isoelektriske punkter innenfor områdene 4,5

til 5,0 og 5,1 til 5,9, og topper ved omtrent 4,9 og omtrent 5,4.

Ved oppsummering av det foregående er antigenet, som kan avledes fra en kilde valgt fra humant vev eller en cancerøs human cellelinje, karakterisert som et glykoprotein med en molekylvekt i området 820.000 til 960.000 og med isoelektriske punkter i områdene fra 4,5 til 5,0 og 5,1 til 5,9. Mer spesifikt er antigenet karakterisert ved isoelektrisk punkt ved omtrent 4,9 og omtrent 5,4. Videre uttrykkes det tumor-assosierte glykoprotein av normal colon og colon-carcinom og er tilstede i human colon-cancinom-cellelinjer.

Av spesiell viktighet ved å skjelne dette antigen fra

andre antigener, inklusive andre tumorassosierte antigener, er spesifisiteten av monoklonalt antistoff CCK061 for i det minste en determinant av antigenet karakterisert heri. Ytterligere tilveiebringer den spesifikke reaktivitet av CCK061 for antigenet som definert i det foregående et middel for isolering og rensing av antigenet fra andre materialer av human opprinnelse, og endelig karakterisering av antigendeterminantene. Et slikt renset antigen og determinanter derav er nyttig ved fremstilling av monoklonale og polyklonale antistoffer for diagnostisk anvendelse under anvendelse av metoder som er vel kjent på området. F.eks. kan murine hybridomer som fremstiller monoklonale antistoffer oppnås. I andre tilfeller kan antigenet anvendes for å stimulere en immunrespons i en kanin, geit eller annet dyr hvorfra serumpolyklonale antistoffer kan bli oppnådd. I tillegg

kan antigenet anvendes for karakterisering av antistoffer av interesse, f.eks. monoklonale antistoffer eller antistoffer tilstede i humant vev, blod eller andre kroppsvæsker.

Monoklonale antistoffer som beskrevet i det foregående kan fremstilles generelt ved å følge metoden til Kohler og Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)). I samsvar med den foreliggende oppfinnelse blir en mus eller en annen passende vert immunisert med det rensede antigen avledet fra humant tumorvev eller en oppløselig fraksjon av slikt vev fra et humant coloncarcinon eller en cancerøs colorektal human cellelinje. Etter immuniseringen blir miltcellene i den immuniserte mus fusjonert med cellene fra en passende muse-myelomlinje til å oppnå en blanding av hybrid-cellelinjer. Hybrid-cellelinjene dyrkes i et passende medium og deretter blir de hybrid-cellelinjer som frembringer et antistoff med spesifikk reaktivitet overfor antigenet som karakterisert heri selektert og klonet og det produserte antistoff utvinnes.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør in vitro deteksjon og diagnose av cancer i mennesker, spesielt colorektalt carcinom. Karakterisering av det særegne tumorassosierte glykoprotein som angitt heri tillater dets deteksjon i pasient-vevsprøver ved immunohistokjemiske metoder og/eller pasient-fluid-prøver ved in vitro immuno-analyser. En bestemmelse av nærværet og/eller mengden av det tumorassosierte antigen i pasient-prøver ved hjelp av immunohistokjemiske og/eller immuno-analyser er av diagnostisk nytte og kan være indikasjoner på eller ha korelasjoner med forløpet av en sykdomstilstand.

Immunohistokjemiske metoder for deteksjon av antigener i pasient-vevsprøver er vel kjent på området og behøver ikke beskrives detaljert. Kort sagt blir i oppfinnelsens sammenheng en vevsprøve oppnådd fra en mistenkt cancerpasient bragt i kontakt med et antistoff med spesifisitet for det tumorassosierte glykoprotein karakterisert som det monoklonale antistoff CCK061. De seter hvormed antistoffet bindes bestemmes deretter ved selektiv farging av vevsprøven ved hjelp av standard immunohistokjemiske prosedyrer.

Lignende er metoder for in vitro deteksjon av antigeniske substanser i pasient-væskeprøver ved immuno-analyser vel kjent på området og behøver heller ikke beskrives detaljert. For oppfinnelsens formål bringes en pasient-væskeprøve i kontakt med i det minste et antistoff, med spesifikk reaktivitet overfor det nevnte tumorassosierte glykoprotein og antistoffet bundet til prøvekomponentene bestemmes. Kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av nærværet av antigenet kan gjennomføres ved konkurrerende eller ikke-konkurrerende immuno-analysemetoder. Monoklonale antistoffer kan passende anvendes på betingelse av at slike antistoffer har den nødvendige spesifisitet for det nevnte antigen under anvendelse av det monoklonale antistoff CCJ061. Ytterligere er de immunoanalyser som foretrukket anvendes såkalte to-seters immunometriske analyser som anvender monoklonale antistoffer som selekteres til å binde til ikke-interfererende determinanter av antigenet karakterisert heri.

Det er ellers uventet oppdaget i det minste en determinant av antigenet karakterisert heri uttrykkes ved hjelp av mucin-antigener assosiert med den genetiske lidelse cystisk fibrose. Mer spesifikt er det funnet at monoklonalt antistoff CCK061 er nyttig for deteksjon av forhøyede seruminnhold av mucin-antigener som indikerer cystisk fibrose. CCK061 er således nyttig for deteksjon av cystisk fibrose i pasienter som genetisk ikke er i stand til å fremstille påvisbare mengder av sialosylerte Le<a> antigener assosiert med lidelsen ettersom CCK061 er reaktiv med mucin-antigener urelatert til Lewis blod-gruppesystemet. Følgelig muliggjør den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for deteksjon av cystisk fibrose ved å bringe en serumprøve i kontakt med monoklonalt antistoffserum CCK01 og bestemme bindingen av CCK061 til prøvekomponenter ved hjelp av en immunoanalyse hvor et annet antistoff, i stand til å binde med mucin-antigener assosiert med cystisk fibrose, anvendes. Foretrukket er immuno-analysen en 2-seters immunometrisk analyse og det annet antistoff er et monoklonalt antistoff selektert slik at CCK061 og det annet antistoff binder til ikke-interfererende determinanter av serum-mucin-antigene assosiert med cystisk fibrose.

Den foreliggende oppfinnelse illustreres ved hjelp av etterfølgende eksempler.

EKSEMPEL I

Fremstilling av monoklonalt antistoff CCK061

For fremstilli ng av hybrid—cellelinjen ATCC med deponeringsnr. HB 8786 som utvikler monoklonalt antistoff CCK061 ble

hunmus Balb/c (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) immunisert intraperitonealt med 200 fag tumor-cytosol oppnådd fra en obduksjonsprøve av colon-carcinom 5 ganger med 14 døgns mellomrom. 3 døgn etter den 5. immunisering ble milten fjernet fra musen og en enkel cellesuspensjon ble fremstilt.

Cellefusjonen ble gjennomført i henhold til prosedyren

til Kohler og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975).

1 x 10 g splenocyter ble fusjonert i 1,0 ml av et fusjonsmedium omfattende 35% polyetylen-glykol (PEG 1500)

i AP-MEM medium (Flow Laboratories, Inglewood, California) med 2,5 x 10 7 P3.65 3 myelom-celler. Etter fusjonen ble cellene dyrket i HAT-medium (hypoxantin, aminopterin, thymidin) ved 37°C i en fuktet 5% C02 inkubator.

Antistoffer fremstilt av hybridomene ble selektert ved

hjelp av en enzym-tilknyttet immunoabsorbent-bindings-analyse (ELISA) på cytosol-preparater av det immuniserende colon-carcinom overfor normal lunge. Antistoffer som viste en 5-gangers eller større reaktivitet

med tumcr-cytosolen ble selektert. Det monoklonale antistoff betegnet som CCK061 ble karakterisert ytterligere og selektert for bruk ved antigen-karakteriseringen som omhandlet heri.

Ant i gen— karakter! sering

Monoklonalt antistoff CCK061 ble anvendt for karakterisering av antigenet som definert i det foregående

ved de prosedyrer som er angitt heri.

Cellelinjene anvendt for antigen-karakterisering, såvel

som for selektering av reaktiviteten av monoklonalt antistoff CCK061 var som følger:

Celler ble dyrket i Autopaw media med 8% heste-serum og 2% føtalt kalve-serum i fuktet 37°C C02 inkubator.

Cellelinje ELISA

Nærværet av antigen reaktivt med monoklonalt antistoff CCK061 i human carcinom-cellelinjer ble bestemt ved hjelp av en enzym-tilknyttet immunoabsorbent bindings-

analyser (ELISA) målt ved absorbsjon ved 490 nm.

Celler oppnådd fra cellelinjene beskrevet i det foregående ble opprettholdt i vevsdyrkings-flasker inntil omtrent 90% sammenløping. Flaskene inneholdende cellene og media ble frosset ved -20°C. Flaskene ble så bragt til romtemperatur og celler fjernet og telt. Cellemengden ble innstilt til 4 x 10^ celler og utplatet nred 2 x 10 celler pr. brønn på en Celeveland glassfiber-filter-mikrotiter-plate. Cellene ble vasket tre ganger med 0,3% gelatin, 1% bovint serumalbumin i fosfat-bufret salt-løsning. 50 ul monoklonalt antistoff CCK06.1 ble tilført pr. brønn og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter fem vaskinger med 0,3% gelatin/fosfat-buffer-saltløsning, ble 50 ul av en 1-4000 fortynning av peroksydase-konjugert geit-anti-muse IgG og IgM tilsatt og inkubert i 1 time. Etter seks vaskinger ble 200 ul 1 mg/ml o-f enylendiamin, 0,03% H2^2 """ 0,1M citrat-f osf at-buf fer tilsatt og inkubert med rysting i mørke i 30 min. Reaksjonen ble stanset med 4N B^SO^ og avlest ved

490nm.

Som vist i tabell I i det følgende var CCK061 reaktivt med colon-carcinom-cellelinjer SW403 og T84 som indikerer nærværet av angjeldende antigen i humane

colon-carcinom cellelinjer. I sammenligning viste CCK061 ingen særlig reaktivitet med cellelinjer som f.eks. bryst-carcinom, prostata-carcinom, blaere-carcinom, adeno-carcinom i lunge og melanom-cellelinjer.

Membran/ Cytosol ELISA

Nærværet av antigen reaktivt med monoklonalt antistoff

CCK061 i rensede membran-fraksjoner av normalt humant vev

og humant tumorvev ble bestemt ved hjelp av en enzym-tilknyttet immunoabsorbent bindings-analyse

(ELISA) som målt ved absorbsjon ved 490 nm.

Membran-cytosol-fraksjoner ble fremstilt fra kirurgiske

og obduksjonsprøver av humant vev samlet i løpet av 10 timer etter døden og lagret ved -80°C. Vevet ble homogenisert i 4 volum av 10 mM tris-HCl pK 7,5, 2mM kalsiumklorid, 2mM fenylmetylsulfonat (homogeniserings-buffer) ved 4°C i en homogenisator av dounce-typen og alle etterfølgende trinn ble gjennomført ved 4°C. Homogenatet ble sentrifugert ved lOOOocg i 5 min. for å fjerne kjerner og intakte celler. Supernatanten bie fjernet og sentrifugert ved 13Q.0Q0xg i 1 time. Supernatanten fra denne høyhastighets-sentrifugering ble fjernet og betegnet som cytosol-fraks ionen. Peileten suspenderes på nytt i et volum av homogeniserings-buffer og påføres på en 40%/20% diskontinuerlig sukrose-gradient i lOmM tris-HCl pK 7,2. Gradienten ble sentrifugert ved 130.000xg i 17 timer. Material fra 40%/20% grensefasen ble avpipettert, fortynnet 5 ganger i homogeniseringsbuffer og sentrifugert i 60 min. ved 25.000xg. Peileten ble suspendert på nytt i homogeni-seringsbuf fer, delt opp i like store porsjoner og lagret ved -80°C.

For å gjennomføre membran/cytosol ELISA ble membran- og cytosol-fraksjonene tørket på 96- brønners flatbunnede polyvinyl-mikrotiterplater (Dynatech, Alexandria, VA) ved 1 jag og 10 pg protein pr. brønn. Platene ble vasket fire ganger med destillert vann og deretter inkubert i

30 min. ved romtemperatur ved 20% hesteserum i fosfat-

bufret saltløsning. Bufferen ble fjernet og primært antistoff tilført i 1 time. Platene ble vasket seks ganger med vanlig vannledningsvann før tilsetningen av

peroksydasekonjugert geit-antimus IgG og IgM

(1:1000 fortynning). Platene ble inkubert i en time og deretter vasket 5 ganger med destillert vann. Fargen ble fremkalt etter tilsetning av 100 ul 1 mg/ml o-fenylen-diamin, 0,03% hydrogen-peroksyd i 0,1M citrat-fosfat-

buf f er pH 5,0. Platene ble inkubert i mørke med omrysting i 30 min. -"Brønnene ble tilsatt 50 ul pr. brønn av 4NH2S04 og avlest ved 490 nm.

Som vist i etterfølgende tabell II var CCK061 reaktivt

med membranfraksjoner av normal colon og colon-carcinom,

men ureaktiv med membraner av andre normale vev og carcinomer, inklusive bryst-carcinom, adeno-carcinom fra lunge, melanom og prostata-carcinom. Følgelig ble antigenet karakterisert ved CCK061 påvist å være tilstede bare i membraner fra colon-carcinom og normal colon.

Immunohistokjemisk bestemmelse

Nærværet av antigen reaktivt med CCK061 i normalt humant

vev og humant tumcr-vev ble bestemt ved immuno-peroksydase-farging av humant vev.

Seksjoner av frosne vev—blokker, oppnådd fra kirurgiske

og obduksjonsprøver samlet innen 10 timer etter døden og lagret ved -80°C ble kuttet opp i 4-6 mikrometer tykkelse med mikrotom/cryostat. Seksjonene, montert på glassplater,

ble hurtig lufttørket og deretter dyppet i aceton. En indirekte immunoperoksydase— analyse' hovedsakelig som beskrevet av Taylor, Arch., Pathol. Lab. Med. 102,

113 (1978) ble anvendt for å farge disse platene.

Seksjonene ble rehydratisert ved inkubasjon i fosfat-

bufret saltløsning (PBS) i 5 min. CCK061 antistoff ble overlagret på seksjonene og inkubert i et fuktig kammer i 1 time. Antistoff ble vasket av seksjonene med PBS og seksjonene ble så neddykket i PBS i 5 min. Seksjonene ble overlagret med en 1:50 fortynning av peroksydase-konjugert geit-antimus IgG og IgM antistoff (Tago Chemicals,

Burlingame, CA) og inkubert i 30 min. i et fuktig kammer. Antistoff ble vasket av med PBS. Fargereaksjonen ble fremkalt med 1 mg/ml av diaminobenzidin og 0,03% H2^2* Platene ble motfarget med hematoksylin-eosin.

Tabell III i det følgende indikerer at CCK061 hadde en sterk reaktivitet med normal colon-mucosa, som målt ved intensiteten av fargingen av vevet, og en svak eller ingen reaktivitet med andre normale vev. CCK061 viste en svak reaktivitet med normalt bryst, lunge og prostata.

Tabell IV i det følgende indikerer en sterk reaktivitet

av CCK061 med colon-carcinom, øsofagalt carcinom og gastrisk carcinom og en svak eller ingen reaktivitet med andre carcinomer. En svak reaktivitet ble påvist med carcinomer som f.eks. bryst-carcinom og adenocarcinom fra lunge.

Biokjemisk analyse av antigen

Protein-naturen og molekylvekten av antigenet karakterisert ved CCK061 ble bestemt ved hjelp av SDS polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og Western immuno-avsetnings-analyse. 20 g cytosol fremstilt som beskrevet ovenfor ble oppløst i gelprøvebuffer (62,5mM tris-KCL pH 6,8, 3% SDS, 10% glycerol, 0,001% bromfenol-blått, 5% merkaptoetanol)

og separert ved hjelp av diskontinuerlig SDS-PAGE som beskrevet av V.K. Laemmli et al, "Nature"227, 680 (1970)

på en 3-15% lineær gradientgel med en 3% laggel. De separerte proteiner ble elektroforetisk overført til nitrocellulose (0,1 m Schleicher og Schtill) ved 250 mamp over natten i henhold til metoden til H. Towbin et al PNAS 76, 4350 (1979). Nitrocellulose-avsetningene ble inkubert med 1% bovint serum-albumin (BSA) i fosfat-bufret saltløsning i 30 min. og deretter inkubert med hybridom-supernatant fortynnet 1/1000 med 3% BSA PBS over natten. Nitrocellulose-strimlene ble vasket med 0,1% tween i PBS i 30 min. med 5 endringer av buffer og inkubert

med 100.000 cpm/ml 125I~merket saue-anti-muse-immuno-globulin i 3 timer. Etter vasking med PBS-"Tween" ble nitrocellulose-strimlene lufttørket og eksponert på røntgen-film (Kodak XAR-5) i 4-72 timer med intensiverende skjerm ved -70°C.

For ytterligere å bestemme naturen av antigenet ble membraner fremstilt som beskrevet ovenfor underkastet følgende behandlinger før SDS-PAGE og Western immunoavsetningsanalyse: a) Natrium-perjodat: 20 ug cytosol-protein ble inkubert i 50 mM natrium-perjodat i 1 time ved 4°C. b) Neuraminidase: 20 ug cytosol ble innstilt til pH 5-6 med eddiksyre og inkubert i 1 time ved 37°c med 10 mU klostridium perfringens neuraminidase. c) Proteinase K: 20 ug cytosol ble inkubert i 2,0 mg/ml proteinase Kil time ved 37°C. d) Mild alkali-behandling: 20 ug cytosol ble inkubert over natten i 0,1N NaOH og deretter nøytralisert med

0.. IN HC1.

Alle reaksjoner ble stanset ved å tilsette gel-prøve-buffer.

Ved hjelp av SDS-PAGE og Western immunoavsetnings-analyse ble molekylvekten av antigenet bestemt å være i området

820.000 til 960.000. Kjemisk og enzym-modifisering av antigenet etterfulgt av SDS-PAGE og Western immunoavsetningsanalyse viste protein-naturen

av antigenet. Spesifikt ble reaktiviteten av antigenet med CCK061 vist å være destruerbar ved behandling av antigenet med proteinase K som beskrevet i det foregående. Tapet av reaktiviteten av antigenet medd CCK061 forekom ikke ved de alternative modifikasjoner som er beskrevet i det foregående.

Bestemmelse av qlykoprotein- naturen

Antigenet karakterisert heri ble bestemt å være av glykoprotein-natur ved immunoutfelling av C 14-glukosamin merkede SW40 3 colon-carcinom-celler.

SW403 celler dyrket i Autopow, 8% heste-serum, 2% føtalt kalve-serum til sammenflyting i 75 cm 2 vevskultur-flasker Media ble så supplert med 50 Ci <14>C-glukosamin (New

England Nuclear, Boston, MA) og inkubert i 18 timer ved

37°C i en fuktet inkubator tilført 5% CO<2> i luft. Cellene ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltløsning

(PBS) og deretter skrapt av fra flasken i 10 ml PBS. Celle-pelleten bie vasket ytterligere tre ganger med PBS

før den ble resuspendert i 1,0 ml lyse-buffer (0,02M tris-HCl pH 8,0, ImM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% deoksycholat,

0,5 mM fenylmetylsulfonat). Etter inkubering på en rotator ved 4 'C i 1 1/2 time ble lysatet sentrifugert i en mikrofuge (16.000xg) i 1 min. og supernatanten dialysert mot PBS (0,02M tris-HCl pH 8, 0,15M NaCl, 0,1% natriumazid).

14

Det C-merkede iysat ble inkubert over natten med CCK061 antistoffet ved 4°c på en rotator. Sepharose-bundet saue-anti-muse-immunoglobulin ble tilsatt blandingen og inkubert i 3 timer ved romtemperatur. Det sepharose-bundne material ble vasket fire ganger med 0,05 tris, 0,15M NaCl, 0,5% NP-40, 0,05% deoksycholat, 0,1% NaN^, lmg/ml BSA

pH 8,1 og ytterligere 4 ganger med samme buffer minus BSA. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gel-elektrophorese som tidligere beskrevet.

Isoelektrisk fokusering

Isoelektrisk fokusering av antigenet karakterisert ved CCK061 ble bestemt under anvendelse av en isoelektrisk fokuseringskolonne som beskrevet.

20 mg colon-carcinom-cytosol fremstilt som beskrevet i det foregående ble fokusert i en 110 ml isoelektrisk fokuseringskolonne forsynt med vannkappe i en 0-47% sukrose-gradient inneholdende am.folytter i pH-området 3,5 - 10. Kolonnen ble forhåndsfokusert ved 600 volt i 12 timer ved 4°C. Prøven ble injisert inn i midten av gradienten og

fokusert ytterligere i 30 timer ved 4°C. 1 ml fraksjoner ble samlet fra kolonnen og pH ble øyeblikkelig bestemt. Fraksjoner dialysert mot lOmM natriumfosfat pH 7,0 over natten. Prøver ble undersøkt for reaktivitet med CCK061 antistoff ved en ELISA-analyse på colon-carcinom-cytosol.

Isoelektrisk fokusering av antigenet ved denne teknikk viste isoelektriske punkter i området 4,5 til 5,0 og 5,1 til 5,9 med topper på omtrent 4,9 og omtrent 5,4.

Claims (4)

1. Monoklonalt antistoff av IgM-klassen for bruk in vitro, karakterisert ved at det har en spesifikk reaktivitet med et colorektalt tumorassosisert glykoprotein (antigen) med en molekylvekt i området fra 820.000 til 960.000, isoelektriske punkter i områdene 4,5 til 5,0 og 5,1 til 5,9, særlig omtrent 4,9 henholdsvis omtrent 5,4, og minst en antigenisk determinant reaktiv med det monoklonale antistoff CCK061 fremstilt av den hybride cellelinje ATCC HB87 86, hvor reaktiviteten av antigenet med det monoklonale antistoff CCK061 kan ødelegges ved behandling av antigenet med proteinase K.

2. Fremgangsmåte for in vitro deteksjon og diagnose av cancer eller cystisk fibrose i en pasient, ved hjelp av immunoanalyse, karakterisert ved anvendelse av det monoklonale antistoff angitt i krav 1.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, for deteksjon av cancer i en pasient, karakterisert ved at en vevsprøve oppnådd fra pasienten bringes i kontakt med et antistoff som angitt i krav 1 med den nevnte spesifikke reaktivitet med antigenet, og de seter på prøven hvortil antistoffet bindes bestemmes ved hjelp av immunohistokjemiske midler, eller ved at en flytende prøve oppnådd fra pasienten bringes i kontakt med minst et antistoff som angitt i krav 1 med den nevnte spesifikke reaktivitet med antigenet og bindingen av antistoffet til komponenter i den nevnte flytende prøve bestemmes ved hjelp av immunoanalyse.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, for deteksjon av cystisk fibrose i en pasient, karakterisert ved at en serumprøve fra en pasient bringes i kontakt med det monoklonale antistoff CCK061 og bindingen av antistoffet til komponenter i prøven bestemmes ved hjelp av immunoanalyse, idet det ved den nevnte immunoanalyse anvendes et ytterligere antistoff som er i stand til å bindes til i det minste et serum mucin-antigen assosiert med cystisk fibrose, idet den nevnte immunoanalyse utføres som en to-seters immunometrisk analyse og at det ytterligere antistoff er et monoklonalt antistoff selektert slik at antistoffet CCK061 og det annet antistoff bindes til ikke-interfererende determinanter i mycin-antigenet.