FI87141B

FI87141B - En ny tumoerassocierad antigen.

Info

Publication number: FI87141B
Application number: FI861692A
Authority: FI
Inventors: Lana Grauer; Joy Koda; Julia Leung
Original assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-22
Publication date: 1992-08-31
Also published as: ATE79632T1; DE3686438D1; NO170810C; FI861692A0; FI861692A; EP0200464A3; AU627084B2; DK185086A; ES557680A0; ES8800604A1; ES554209A0; ES8900247A1; EP0200464B1; DK185086D0; JPS61289897A; NO861577L; FI87141C; DE3686438T2; AU6556990A; EP0200464A2

Description

1 87141

Uusi kasvaimiin liittyvä antigeeni Tämä keksintö koskee antigeenien, erityisesti kasvaimeen liittyvien antigeenien karakterisointia. Toi-5 saalta se koskee vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti tällaisten antigeenien kanssa. Vielä toisaalta se koskee näiden vasta-aineiden valmistusmenetelmiä samoin kuin niiden diagnostista käyttöä.

Monoklonaalisten vasta-aineiden mahdolliseen roo-10 liin ihmisten syövän diagnostisoinnissa ja hoidossa on kohdistunut runsaasti tutkimusta ja spekulointia viime aikoina. Erityisen mielenkiinnon kohteena on niiden käyttö immunologisissa määritysmenetelmissä taudin kulun seuraamiseksi esim. hoidon aikana. Erityisen mielenkiinnon kohteena 15 ovat myös monoklonaalisten vasta-aineiden mahdolliset sovellutukset kasvaimen kuvantamisessa siksi, että nämä vasta-aineet pystyvät sitoutumaan kasvaimeen liittyvään antigeeniin in vivo.

Monoklonaalisia vasta-aineita käyttävän teknologian 20 kehittyminen on myös mahdollistanut ihmiskasvainten antigeenisen monimuotoisuuden tutkimisen. Tarkemmin sanottuna monoklonaalisten vasta-aineiden täsmällinen immunoreaktii-visuus sallii ihmiskasvainten erillisten solujen pinta-antigeenien identifioinnin ja erottamisen. Siten näiden 25 erillisten kasvaimeen liittyvien antigeenien karakterisointi antaa käyttöön keinon täydellisemmin hyödyntää monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöä syövän diagnostisoinnissa sekä maksimoida monoklonaalisia vasta-aineita käyttävän teknologian edut.

30 Tähän päivään mennessä vain rajoitettu määrä kas vaimeen liittyviä antigeenejä on hyvin karakterisoitu. Lisäksi tiettyjä kasvaimeen liittyviä antigeenejä, joita voitaisiin käyttää diagnostisina ja ennustavina merkkiaineina, ei ehkä esiinny kaikilla potilailla tai kaikkien 35 taudin vaiheiden ja ilmenemismuotojen aikana. Niinpä on 2 87141 tarpeen edelleen identifioida ja karakterisoida ainutlaatuisia kasvaimeen liittyviä antigeenejä.

Tämä keksintö perustuu uuden ihmiskudoksessa ja ihmisen syöpäsolulinjoissa, erityisesti ihmisen paksusuoli-5 syöpäkasvaimessa ja paksusuolisyöpäsolulinjoissa esiintyvän antigeenin löytämiseen ja karakterisointiin. Niinpä keksintö koskee tiettyä kasvaimeen liittyvää antigeeniä, jolle on ominaista sen reaktiivisuus monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa.

10 Tämän keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön vasta- aineet, jotka ovat spesifisiä tässä määritellylle antigeenille sekä menetelmät näiden vasta-aineiden valmistamiseksi. Lisäksi keksintö koskee näiden vasta-aineiden käyttöä syövän toteamisessa ja diagnostisoinnissa in vitro immunohis-15 tokemiallisia menetelmiä ja immunologisia määritysmenetelmiä käyttäen. Keksinnön mukaisille menetelmille ja tuotteille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään .

Kuten yllä on viitattu, tämä keksintö antaa käyttöön 20 uuden kasvaimeen liittyvän antigeenin. Keksinnön mukaisesti monoklonaalista vasta-ainetta CCK061, joka on tuotettu hybridisolulinjassa ATCC-talletus nro HB8786, käytetään tämän aikaisemmin kuvaamattoman antigeenin karakterisoinnissa.

25 Tämän keksinnön mukaisen antigeenin fysiokemialliset ja immunologiset ominaisuudet ja erityisesti sen reaktiivisuus monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa sallii sen karakterisoinnin ja erottamisen muista ihmisen syöpäsolu-linjoissa ja ihmiskudoksessa, mukaanlukien ihmisen kasvainko kudos, olevista antigeeneistä. Niinpä tämän keksinnön käyttöön antaman antigeenin tunnusomaiset piirteet ja ominaisuudet ovat seuraavat: a) Antigeeni esiintyy ihmisen paksusuolisyöpäsolulinjoissa. Normaalit ELISA- (enzyme-linked immunoabsorbent 55 bindind assay) menetelmät, joissa käytetään monoklonaalista 3 87141 vasta-ainetta CCK061, osoittavat, että antigeeni esiintyy paksusuolisyöpäsolulinjoissa mutta ei sellaisissa muissa solulinjoissa kuin rintasyöpä-, eturauhassyöpä-, rakkosyö-pä-, keuhkon adenokarsinooma- ja ihosyöpäsolulinjoissa.

5 b) Antigeeniä tuotetaan normaalin paksusuolikudok- sen ja paksusuolisyöpäkudoksen sytosolissa. CCK061:n reaktiivisuus ihmisen paksusuolikudoksesta ja ihmisen paksusuo-lisyöpäkasvaimesta puhdistettujen plasmamembräänien kanssa osoitetaan tavanomaisilla ELISA-menetelmillä. Vertailun 10 vuoksi mainittakoon, ettei CCK061 reagoi muista normaaleista kudoksista tai kasvainkudoksista, mukaanlukien rintasyöpä-, eturauhassyöpä-, keuhkoadenokarsinooma- ja ihosyö-päkudos, puhdistettujen kalvojen kanssa.

c) Normaalit immunohistokemialliet menetelmät osoit-15 tavat, että antigeeni esiintyy normaalissa paksusuolessa, paksusuolisyöpäkasvaimessa, ruokatorven syöpäkasvaimessa ja mahalaukun syöpäkasvaimessa, sillä tällaisen kudoksen immunoperoksidaasivärjäys osoittaa kudoksen reagoivan voimakkaasti CCK061:n kanssa. Rintasyöpä-, keuhkon adenokarsi-20 nooma-, eturauhassyöpä- ja ihosyöpäkudoksesta osoitetaan heikkoa reaktiivisuutta tai ei reaktiivisuutta lainkaan.

d) SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja Western immunoblot -analyysi osoittavat, että antigeenin molekyylipaino on alueella noin 820 000 - noin 960 000.

25 Antigeenin modifiointi proteinaasi K- käsittelyllä ennen SDS-PAGE:a ja Western immunoblot -analyysiä tuhoaa antigeenin reaktiivisuuden CCK061:n kanssa, mikä osoittaa, että antigeeni on proteiini.

e) Antigeeni on luonteeltaan glykoproteiini. Perä- 14 . 30 suolisyöpäsolujen metabolinen leimaus C-glukosamiini11a ja antigeenin saostaminen immunologisesta CCK061:llä normaaleja menetelmiä käyttäen osoittaa, että antigeeni sisältää hiilihydraattiosan.

f) Liuoksessa olevan antigeenin isoelektrinen foku-3j sointi osoittaa isoelektristen pisteiden olevan alueella noin 4,5 - noin 5,0 ja noin 5,1 - noin 5,9 piikkien ollessa noin 4,9 ja noin 5,4.

4 87141

Yllä olevan yhteenvetona, tämän keksinnön mukainen antigeeni, joka voi olla peräisin ihmiskudoksesta tai ihmisen syöpäsolulinjasta, karakterisoidaan glykoproteiiniksi, jonka molekyylipaino on alueella noin 820 000 - noin 960 000 5 ja jonka isoelektriset pisteet ovat alueilla noin 4,5 - noin 5,0 ja noin 5,1 - noin 5,9. Täsmällisemmin sanottuna antigeenille ovat luonteenomaisia isoelektriset pisteet noin 4,9 ja noin 5,4. Edelleen tämän keksinnön mukainen kasvaimeen liittyvä glykoproteiini esiintyy normaalissa paksu-10 suolessa ja paksusuolisyöpäkasvaimessa sekä ihmisen paksu-suolisyöpäsolulinjoissa.

Erityisen tärkeää tämän keksinnön mukaisen antigeenin erottamisessa muista antigeeneistä, mukaanlukien muut kasvaimeen liittyvät antigeenit, on monoklonaalisen 15 vasta-aineen CCK061 spesifisyys ainakin yhtä tässä karakterisoidun antigeenin determinanttia kohtaan. Lisäksi CCK061:n spesifinen reaktiivisuus keksinnön määrittelemää antigeeniä kohtaan antaa käyttöön keinon antigeenin eristämiseksi ja puhdistamiseksi muusta ihmisestä peräisin olevasta mate-20 riaalista ja lopulta sen antigeenisten determinanttien karakterisoimiseksi. Tällaista puhdistettua antigeeniä ja sen determinantteja voidaan käyttää vasta-aineiden tuottamiseen diagnostisia sovellutuksia varten alalla hyvin tunnettuja menetelmiä käyttäen. Voidaan esimerkiksi saada hiiri -25 hybridoomia, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita. Toisissa tapauksissa antigeeniä voidaan käyttää stimuloimaan immuunivaste kanissa, vuohessa tai muussa eläimessä, jonka seerumista voidaan saada polyklonaalisisia vasta-aineita. Lisäksi antigeeniä voidaan käyttää mielenkiinnon 30 kohteena olevien vasta-aineiden, esimerkiksi monoklonaalis-ten vasta-aineiden tai ihmiskudoksessa, veressä tai muissa ruumiin nesteissä olevien vasta-aineiden karakterisoimi-seen.

Tämän keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön monok-35 lonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä karakterisoidulle antigeenille, sekä menetelmät niiden valmistamiseksi.

5 87141

Edullisesti nämä monoklonaaliset vasta-aineet ovat IgG-luokan vasta-aineita ja reagoivat immunologisesti tämän keksinnön mukaisen kasvaimeen liittyvän glykoproteiinin kanssa oleellisesti samalla tavalla kuin monoklonaalinen 5 vasta-aine CCK061. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia ihmisen syövän, erityisesti paksu- ja peräsuolisyövän toteamisessa ja diagnostisoinnissa. Lisäksi näitä vasta-aineita voidaan käyttää keksinnön käyttöön antaman antigeenin eristämisessä ja puhdista-10 misessa edelleen sekä sen täsmällisten determinanttien karakterisoinnissa.

Yllä kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valmistaa yleisesti Kohlerin ja Milsteinin (Nature 256 (1975) 495 - 497) menetelmän mukaisesti. Tämän keksinnön 15 mukaisesti hiiri tai muu sopiva isäntä immunisoidaan keksinnön mukaisella puhdistetulla antigeenillä tai ihmisen paksusuolisyöpäkasvainkudoksen liukoisella fraktiolla. Immunisoinnin jälkeen immunisoidun hiiren pernasolut fuusioidaan sopivan hiiren myeloomasolulinjan solujen kanssa 20 hybridisolulinjojen seoksen saamiseksi. Hybridisolulinjoja viljellään sopivassa väliaineessa, minkä jälkeen valitaan ja kloonataan ne hybridisolulinjat, jotka tuottavat tässä karakterisoidun antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa vasta-ainetta, ja tuotettu vasta-aine otetaan talteen.

25 Tämä keksintö esittää menetelmät ihmisten syövän, erityisesti paksu- ja peräsuolisyövän, toteamiseksi ja diagnostisoimiseksi in vitro. Keksinnön mukaisen ainutlaatuisen kasvaimeen liittyvän glykoproteiinin karakterisointi siten, kuin tässä on julkaistu, sallii sen osoittamisen 30 potilaan kudosnäytteistä immunohistokemiallisia menetelmiä käyttäen ja/tai potilaan nestenäytteistä in vitro immunologisia määritysmenetelmiä käyttäen. Tämän keksinnön mukaisen kasvaimeen liittyvän antigeenin läsnäolon ja/tai määrän määrittämistä potilasnäytteissä immunohistokemiallisten 35 ja/tai immunologisten määritysmenetelmien avulla voidaan käyttää diagnostisoinnissa ja se saattaa osoittaa sairauden etenemistä tai korreloida sen kanssa.

6 87141

Immunohistokemialliset menetelmät, joita käytetään antigeenien osoittamiseksi potilaan kudosnäytteistä, ovat alalla hyvin tunnettuja, eikä niitä tarvitse kuvata yksityiskohtaisesti. Lyhyesti, tämän keksinnön yhteydessä epäil-5 lyn syöpäpotilaan kudosnäyte saatetaan yhteen tässä karakterisoidulle kasvaimeen liittyvälle glykoproteiinille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Erityisen edullista on käyttää monoklonaalista vasta-ainetta CCK061.

Sitten ne kohdat, joihin vasta-aine sitoutuu, määritetään 10 kudosnäytteen valikoivalla värjäyksellä immunohistokemial- lisia menetelmiä käyttäen.

Samalla tavalla menetelmät antigeenisten aineiden osoittamiseksi in vitro potilaan nestenäytteistä immunologisia määritysmenetelmiä käyttäen ovat alalla hyvin tunnet-15 tuja, eikä niitä tarvitse toistaa. Tämän keksinnön tarkoituksiin potilaan nestenäyte saatetaan yhteen ainakin yhden tämän keksinnön mukaisen kasvaimeen liittyvän glykoprote-iinin kanssa spesifisesti reagoivan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja näytekomponentteihin sitoutunut vasta-aine 20 määritetään. Keksinnön mukaisen antigeenin kvalitatiiviset ja ja/tai kvantitatiiviset määritykset voidaan suorittaa kompetetiivisia immunologisia määritysmenetelmiä käyttäen. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan sopivasti käyttää sillä ehdolla, että näillä vasta-aineilla on vaadittu spesi-25 fisyys tämän keksinnön käyttöön antamalle antigeenille.

Edullisesti käytetään monoklonaalista vasta-ainetta CCK061. Lisäksi edulliset käytettävät immunologiset määritysmenetelmät ovat kaksipaikkaisia two-site) immunometrisiä määritysmenetelmiä, joissa käytetään monoklonaalisia vasta-ainei-30 ta, jotka valitaan siten, että ne sitoutuvat tässä karakterisoidun antigeenin toisiaan häiritsemättömiin determinantteihin.

7 871 41

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää erityisesti ihmisten paksu- ja peräsuolisyövän diagnostisointiin in vivo. Menetelmät kasvaimen paikallistamiseksi ja toteamiseksi voidaan suorittaa antamalla epäillylle 5 syöpäpotilaalle ennalta määrätty, vaikuttava määrä vasta-ainetta, joka reagoi spesifisesti tämän keksinnön mukaisen kasvaimeen liittyvän glykoproteiinin kanssa, ja osoittamalla vasta-aineen sijaintikohdat normaaleja kuvantamismenetelmiä käyttäen. Vasta-ainetta, edullisesti CCK061:tä, anne-10 taan potilaalle farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantaja-aineessa ja leimattuna edullisesti gamma-säteilyä lähettävällä radionuklidilla vasta-aineen osoittamiseksi.

Syövän hoidossa syöpäpotilaalle annetaan ennalta määritetty, vaikuttava määrä keksinnön karakterisoimalle 15 kasvaimeen liittyvälle antigeenille spesifistä monoklonaa-lista vasta-ainetta, edullisesti CCK061, farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa ja konjugoituna sopivan kasvaimen paikalle annostelua varten valitun terapeuttisen aineen, esimerkiksi radioisotooppien, edullisesti beeta-partikke-20 leita lähettävien radionuklidien, lääkeaineiden, solumyrkkyjen tai biologisten proteiinien kanssa.

Edelleen syövän diagnostisoinnin in vivo yhteydessä alan asiantuntijoille on itsestään selvää, että vasta-ainevalmisteitä, jotka sisältävät keksinnön mukaisel-25 le kasvaimeen liittyvälle antigeenille spesifisten vasta-aineiden tai niiden fragmenttien seoksia, voidaan tietyis-sä tapauksissa käyttää kasvainten toteamisen ja paikallis-: : tamisen parantamiseksi.

' Edelleen olemme yllättäen keksineet, että ainakin : : 30 yksi tässä karakterisoidun antigeenin determinantti esiin tyy geneettiseen sairauteen, rakkulaiseen fibroosiin liittyvissä limakalvoantigeeneissa. Täsmällisemmin sanottu- 8 87141 na olemme havainneet, että monoklonaalista vasta-ainetta CCK061 voidaan käyttää rakkulaista fibroo-sia osoittavien kohonneiden seerumin limakalvoanti-geenien osoittamisessa- CCK061 on erityisen käyttökelpoi-5 nen rakkulaisen fibroosin osoittamisessa potilaissa, jotka geneettisistä syistä eivät pysty tuottamaan osoitettavia määriä tautiin liittyviä sialysoituja Lea-antigeeneja, sillä CCK061 reagoi niiden limakalvoantigeenien kanssa, jotka eivät liity Lewis-veriryhmäsysteemiin. Niinpä tämä 10 keksintö esittää menetelmän rakkulaisen fibroosin osoittamiseksi saattamalla seeruminäyte yhteen monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa ja määrittämällä CCK061:n sitoutuminen näytekomponentteihin sellaisen immunologisen määritysmenetelmän avulla, jossa käytetään toista vasta-15 ainetta, joka pystyy sitoutumaan rakkulaiseen fibroosiin liittyviin limakalvoantigeeneihin. Edullisesti immunologinen määritysmenetelmä on kaksipaikkainen immunometrinen määritysmenetelmä ja toinen vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, joka on valittu siten, että CCK061 ja toinen 20 vasta-aine sitoutuvat rakkulaiseen fibroosiin liittyvien seerumin limakalvoantigeenien toisiaan häiritsemättömiin determinantteihin.

Tämä keksintö tulee paremmin ymmärretyksi seuraa-vien rajoittamattomien esimerkkien perusteella.

25 Esimerkki I

Monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 valmistus Hybridisolulinjan ATCC-talletus nro HB8786, joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta CCK061, valmistamiseksi naaraspuoliset Balb/c-hiiret (Charles River Breeding 30 Laboratories, Wilmington, MA) immunisoitiin ruiskuttamalla vatsaonteloon 200 ^ug kasvainsytosolia, joka oli saatu paksusuolisyöpäkasvaimen ruumiinavausnäytteestä, 5 kertaa 14 päivän välein. 3 päivää viidennen immunisoinnin jälkeen hiirien pernat poistettiin ja yksi solususpensio valmis-35 tettiin.

9 871 41

Solujen fuusioiminen tehtiin Kohlerin ja Mils-teinin, Nature 256, (1975) 495 - 497, menetelmän mukaisesti.

g 1 x 10 (pernasolua) fuusioitiin 1,0 ml:ssa fuusioväliainet-ta, joka sisälsi 35 % polyetyleeniglykolia (PEG 1500) AP-5 MEM-väliaineessa (Flow Laboratories, Inglewood, Kalifornia) 7 2,5 x 10 P3.653-myeloomasolun kanssa. Fuusion jälkeen soluja viljeltiin HAT-väliaineessa (hypoksantiini, aminop-teriini, tymidiini) 37°C:ssa kostutetussa 5 % CO^ -inku-baattorissa.

Hybridoomien tuottamat vasta-aineet seulottiin ELISA- (enzyme-linked immunoabsorbent binding assay) menetelmällä immunisointiin käytetyn paksusuolisyöpäkasvaimen sytosolipreparaattien vs. normaalin keuhkon suhteen. Vasta-aineet, jotka reagoivat 5-kertaisesti tai enemmän kasvain-15 sytosolin kanssa, valittiin. Monoklonaalinen vasta-aine, joka nimettiin CCK061:ksi, karakterisoitiin edelleen ja valittiin käytettäväksi tässä käyttöön annetun antigeenin karakterisoimi seen.

Esimerkki II

20 Antigeenin karakterisointi

Monoklonaalista vasta-ainetta CCK061 käytettiin tämän keksinnön mukaisen antigeenin karakterisointiin tässä julkaistuja menetelmiä käyttäen.

Solulinjat, joita käytettiin antigeenin karakteri-25 sointiin samoin kuin monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 reaktiivisuuden seulomiseen, olivat seuraavat: 10 871 41

Solulinj a Lähde SW403 ja SW620 paksusuolisyöpä Amerikkalainen tyyppivil- jelmäkokoelma, Rockville, Maryland.

5 T84-paksusuolisyöpä Tri H. Masui, Kalifornian

Yliopisto San Diegon Syö-päkeskuksessa, San Diego, Kalifornia.

10 SKMel-ihosyöpä Amerikkalainen tyyppivil- jelmäkokoelma, Rockville, Maryland.

15 Calu-3 -keuhkon Amerikkalainen tyyppivil- adenokarsinooma jelmäkokoelma, Rockville,

Maryland.

T47D-rintasyöpä Tri Renato Dulbecco, Salk- 20 instituutti, La Jolla,

Kalifornia.

Ml4-ihosyöpä Tri Ralph Reisfeld, Scripps

Kliniikka ja Tutkimussäätiö, La Jolla, Kalifornia.

25 H 907 -rakkosyöpä Tri K.E. Hellström, Fred

Hutchinson Syöväntutkimus-keskus, Seattle, Washington.

30 PC-3 eturauhassyöpä Tri Mark Glassey, Kalifor nian Yliopisto San Diegossa, La Jolla, Kalifornia.

Solut kasvatettiin Autopaw-väliaineessa, joka sisälsi 8 % hevosen seerumia ja 2 % fetaalia vasikan seerumia kostu- 35 tctussa, 37°C:isossa CC>2-inkubaattorissa.

11 87141

Solulinj a-ELISA

Monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa reagoivan antigeenin läsnäolo ihmisen syöpäsolulinjoissa määritettiin ELISA- (enzyme-linked immunoabsorbent binding assay) mene-5 telmällä mitattuna absorbanssin 490 nm:ssä perusteella.

Yllä kuvatuista solulinjoista saatuja soluja ylläpidettiin kudosviljelypulloissa, kunnes saavutettiin noin 90 %:n yhtenäisyys (confluent). Solut ja väliaineen sisältävät pullot jäädytettiin -20°C:ssa. Sitten pullot saatettiin 10 huoneenlämpötilaan ja solut poistettiin ja laskettiin. Solu- g jen määräksi säädettiin 4 x 10 solua ja ne pipetoitiin pitoisuuksina 2 x 10 solua kuoppaa kohti Cleveland-lasikuitu-suodatinmikrotiitterilevylle. Solut pestiin 3 kertaa liuoksella, joka sisälsi 0,3 % gelatiinia ja 1 % naudan seerumin 15 albumiinia fosfaatilla puskuroidussa keittosuolassa. 50 ^,ul monoklonaalj sta vasta-ai net La CCKO 0.1 lisättiin kuoppaa koh-U ja levyä inkuboil.iin yksi luuli h ih »m» m n 1 ämpöt. i lasso. Kun levy oli pesty 5 kertaa liuoksella, joka sisälsi 0,3 % gelatiinia fosfaatilla puskuroidussa keittosuolassa, lisät-20 tiin 50 ^ul 1 - 4000 kertaisesti laimennettua, peroksidaa-silla konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG:tä ja -IgMrää, ja levyä inkuboitiin 1 tunti. Kun levy oli pesty 6 kertaa, kuoppiin lisättiin 200 ^ul liuosta, joka sisälsi 1 mg/ml o-fenyleenidiamiinia, ja 0,03 % m°l/l sitraatti- 25 fosfaattipuskurissa, ja levyä inkuboitiin ravistellen pimeässä 30 minuuttia. Reaktio pysäytettiin 4 N t^SO^rlla ja absorbanssi 490 nm:ssa luettiin.

Kuten alla olevassa taulukossa I on esitetty, CCK061 reagoi paksusuolisyöpäsolulinjojen SW403 ja T84 kanssa, 30 mikä osoittaa, että keksinnön mukainen antigeeni esiintyy ihmisen paksusuolisyöpäsolulinjoissa. Vertailun vuoksi mainittakoon, ettei CCK061 osoittanut mainittavaa reaktiivisuutta sellaisten solulinjojen kuin rintasyöpä-, eturauhassyöpä-, rakkosyöpä-, keuhkon adenokarsinooma- ja ihosyöpä-35 solulinjojen kanssa.

i2 871 41

Membraani/sytosoli-ELISA

Monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa reagoivan antigeenin läsnäolo normaalin ihmiskudoksen ja ihmisen kasvainkudoksen puhdistetuissa kalvofraktioissa määritet-5 tiin ELISA- (enzyme-linked immunoabsorbent binding assay) määrityksellä mitattuna absorbanssin 490 nm:ssa perusteella.

Membraani/sytosoli-fraktiot valmistettiin kymmenen tunnin kuluessa kuolemasta talteenotetuista ja -80°C:ssa säilytetyistä ihmiskudoksen kirurgisista ja ruumiinavaus-10 näytteistä. Kudos homogenoitiin neljään tilavuuteen puskuria, joka sisälsi 10 mmo3/l Tris-HCl:a, pH 7,5, 2 mmol/1 kalsiumkloridia, 2 mmol/1 fenyylimetyylisulfonaattia, (homogenointipuskuri) 4°C:ssa Dounce-homogenisaattorissa ja kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin 4°C:ssa. Homoge-15 naatti sentrifugoitiin nopeudella 1000 x g 5 minuuttia tumien ja kokonaisten solujen poistamiseksi. Supernatantti poistettiin ja sentrifugoitiin nopeudella 130 000 x g yksi tunti. Tämän suurella nopeudella suoritetun sentrifugoinnin supernatantti poistettiin ja nimettiin sytosoli-fraktioksi. 20 Sakka suspendoitiin yhteen tilavuuteen homogenointipuskuria ja laitettiin 40 % /20 % risen epäjatkuvan sakkaroosigradi-entin päälle 10 mmol/1 Tris-HCl:ssa, pH 7,2. Gradienttia sentrifugoitiin nopeudella 130 000 x g 17 tuntia. 40 %/20 % -välifaasissa oleva materiaali pipetoitiin talteen, laimen-25 nettiin 5-kertaisesti homogenisointipuskuri11a ja sentrifugoitiin 60 minuuttia nopeudella 25 000 x g. Sakka suspendoitiin homogenointipuskuriin, jaettiin osiin ja pantiin säiliöön -80°C:een.

Membraani/sytosoli-ELISA:n suorittamiseksi kalvo-30 ja sytosolifraktiot kuivattiin 96-kuoppaisilie tasapohjaisille polyvinyylimikrotiitterilevyille (Dynatech, Alexandria, VA) pitoisuuksina 1 ^ug ja 10 ^ug proteiinia kuoppaa kohti, mainitussa järjestyksessä. Levyt pestiin neljä kertaa tislatulla vedellä, jonka jälkeen niitä inkuboiliin 35 jo minuuttia huoneenlämpötilassa fosfaatilla puskuroidussa keittosuolassa olevan 20 % hevosen seerumin kanssa. Puskuri i3 871 41 poistettiin ja ensimmäinen vasta-aine lisättiin yhdeksi tunniksi. Levyt pestiin 6 kertaa vesijohtovedellä ennen peroksidaasilla konjugoidun vuohen anti-hiiri-IgG:n ja -IgM:n (1:1000 laimennos) lisäystä. Levyjä inkuboitiin 5 yksi tunti, jonka jälkeen ne pestiin 5 kertaa tislatulla vedellä. Väri kehittyi, kun kuoppiin lisättiin 100 ^ul liuosta, joka sisälsi 1 mg/ml o-fenyleenidiamiinia ja 0,03 % vetyperoksidia 0,1 ml/1 sitraatti-fosfaattipusku-rissa, pH 5,0. Levyjä inkuboitiin pimeässä ravistellen 10 30 minuuttia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 ^ul kuop paa kohti 8 mol/1 H2S°4 3a absorbanssi 490 rutussa luettiin.

Kuten alla olevassa taulukossa II on esitetty, CCK061 reagoi normaalin paksusuolen ja paksusuolisyöpäkas-vaimen kalvofraktioiden kanssa, muttei reagoinut muista 13 normaaleista kudoksista ja syöpäkasvaimista, mukaanlukien rintasyöpä-, keuhkon adenokarsinooma-, ihosyöpä- ja eturau-hassyöpäkasvaimesta peräisin olevien kalvojen kanssa. Niinpä CCK061:n karakterisoima antigeeni osoitettiin vain pak-susuolisyöpäkasvaimesta ja normaalista paksusuolesta.

2 0 Immunohistokerniallinen määritys CCK061:n kanssa reagoivan antigeenin läsnäolo normaalissa ihmiskudoksessa ja ihmisen kasvainkudoksessa määritettiin ihmiskudoksen immunoperoksidaasivärjäystä käyttäen. Osa jäädytetyistä kudospaloista, jotka oli saatu 25 kymmenen tunnin kuluessa kuolemasta talteenotetuista ja -80°C:ssa säilytetyistä kirurgisista ja ruumiinavausnäyt-teistä, leikattiin 4-6 mikrometrin leikkeiksi mikrotomi/-kryostaati11a. Lasilevyille kiinnitettyinä leikkeet kuivattiin nopeasti ilmassa, jonka jälkeen levyt kastettiin 30 asetoniin. Epäsuoraa immunoperoksidaasimcnetelmää, joka suoritettiin oleellisesti, kuten Taylor, Arch. Pathol. Lab. Med. 102. 102 (19/8) 113, on kuvannut, käytettiin näiden levyjen vär jäänti seen. Leikkeet kostutettiin uudelleen i nku-boimalla niitä fosfaatilla puskuroidussa keittosuolassa 35 (PBS) 5 minuuttia. CCK061-vasta-aine levitettiin leikkeiden päälle ja levyjä inkuboitiin kosteassa kammiossa yksi tunti.

14 871 41

Vasta-aine pestiin leikkeistä PBS:llä, jonka jälkeen leikkeet upotettiin PBS:ään 5 minuutiksi. Leikkeet peitettiin peroksidaasilla konjugoidun vuohen anti-hiiri-IgG- ja -IgM-vasla-ai neeri (Tacjo Chemicals, Burlingame, CA) 1:50 laimen-r, nuku o LI a, ja ui i Lei iukuboiL.iin 10 in i nuuU, i a kosteassa kammiossa. Vasta-aine pestiin pois PBSrllä. Värireaktio kehitettiin liuoksella, joka sisälsi 1 mg/ml diaminobentsidii-nia ja 0,03 % Levyt vastavärjättiin hematoksyliini- eosiinilla.

10 Alla oleva taulukko III osoittaa, että CCK061 rea goi voimakkaasti normaalin paksusuolen limakalvon kanssa mitattuna kudoksen värjäytymisen voimakkuuden perusteella ja heikosti tai ei lainkaan muiden normaalien kudosten kanssa. CFK061 osoitti heikkoa reaktiivisuutta normaalin 15 rinta-, keuhko- ja eturauhaskudoksen kanssa.

Alla oleva taulukko IV osoittaa CCK061:n reagoivan voimakkaasti paksusuolisyöpä-, ruokatorvisyöpä- ja mahalauk-kusyöpäkasvaimen kanssa mutta reagoivan heikosti tai ei lainkaan muiden syöpäkasvainten kanssa. Heikkoa reaktiivi-20 suutta esiintyy sellaisten syöpäkasvainten kuin rintasyövän ja keuhkon adenokarsinooman kanssa.

Antigeenin biokemiallinen analyysi CCK061:n karakterisoiman antigeenin proteiini luonne ja molekyylipaino määritettiin SDS-polyakryyliamidigeeli-25 elektroforeesilla (SDS-PAGE) ja Western immunoblot -analyysillä. 20 g yllä kuvatulla tavalla valmistettua sytosolia liuotettiin geelinäytepuskuriin (62,5 mmol/1 Tris-HCl, pH 6,8, 3 % SDS, 10 % glyseroli, 0,001 % bromi fenolisini-nen, 5 i merkaploetunoli) ja erotettiin epäjatkuvaa SDS-30 PAGE:11a kuten V.K. Laemmli et ai., Nature 227 (1970) 680, ovat kuvanneet, 3 - 15 % lineaarista gradienttigeeliä ja 3 %:sta konsentroimisgeeliä käyttäen. Erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti (0,1 mm Schleicher ja Schuell) 250 mA:n virtaa käyttäen yli yön Towbin et ai. n, PNAS 76 (1979) 4350, menetelmän mukaisesti. Nitroselluloosa- 15 87141 kopioita inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi 3 % naudan seerumin albumiinia (BSA) fosfaatilla puskuroidussa keittosuolassa 30 minuuttia, jonka jälkeen niitä inkuboitiin yli yön hybridoomasupernatantin kanssa, joka oli laimennettu 5 1/1000 3 % BSA -PBS -liuoksella. Nitroselluloosaliuskat pestiin 0,1 % Tween:llä PBS:ssä 30 minuutin ajan vaihtaen 125 puskuria 5 kertaa ja niitä inkuboitiin I:llä leimatulla lampaan anti-hiiri-immunoglobuliinilla, 100 000 cpm/ml, kolme tuntia. PBS-Tween -liuoksella tehdyn pesun jälkeen 10 nitroselluloosaliuskat kuivattiin ilmassa ja altistettiin röntgen-fiImilie (Kodak XAR-5) 4-72 tunniksi vahvistus-levyä käyttäen -70°C:ssa.

Antigeenin luonteen edelleen määrittämiseksi yllä kuvatulla tavalla valmistetut kalvot käsiteltiin seuraa-15 villa tavoilla ennen SDS-PAGE:a ja Western immunoblot -analyysi ä: a) Natriumperjodaatti: 20 ^,ug sytosoliproteiinia inkuboitiin 50 mmol/1 natriumperjodaatissa yksi tunti 4°C:ssa.

20 b) Neuraminidaasi: 20 ^ug:n sytosolia pH säädettiin pH 5 - 6:ksi etikkahapolla ja sitä inkuboitiin yksi tunti 37°C:ssa 10 mU:n Clostridium perfringens neuraminidaasia kanssa.

c) Proteinaasi K: 20 ^ug sytosolia inkuboitiin 25 2,0 mg/ml proteinaasi K:ta sisältävässä liuoksessa yksi tun ti 37°C:ssa.

d) Käsittely laimealla emäksellä: 20 ^ug sytosolia inkuboitiin yli yön 0,1 mol/1 NaOH:ssa, jonka jälkeen liuos neutraloitiin 0,1 mol/1 HCl:lla.

30 Kaikki reaktiot pysäytettiin lisäämällä geelinäyte- puskuria.

SDS-PAGE:n ja Western immunoblot -analyysin perusteella antigeenin molekyylipainon määritettiin olevan alueella noin 820 000 - noin 960 000. Antigeenin kemiallinen 35 ja entsymaattinen modifiointi ja sen jälkeiset SDS-PAGE- ja Western immunoblot -analyysit osoittivat antigeenin pro- 16 87141 teiiniluonteen. Täsmällisemmin sanottuna antigeenin reaktiivisuuden CCK061:n kanssa osoitettiin tuhoutuvan, kun antigeeniä käsiteltiin proteinaasi K:11a yllä kuvatulla tavalla. Yllä kuvatut vaihtoehtoiset modifikaatiot eivät johtaneet 5 antigeenin reaktiivisuuden CCK061:n kanssa häviämiseen. Glykoproteiiniluonteen määrittäminen Tässä karakterisoitu antigeeni määritettiin luonteeltaan glykoproteiiniksi saostamalla immunologisesti 14 C-glukosamiini11a leimatut SW403-paksusuolisyöpäkasvain-10 solut.

SW403-soluja, kasvatettiin yhtenäiseksi Autopow- väliaineessa, joka sisälsi 8 % hevosen seerumia ja 2 % 2 fetaalia vasikan seerumia, 75 cm :n kudosvi1jelypulloissa.

14

Sitten väliaineeseen lisättiin 50 ^uCi C-glukosamiinia 15 (New England Nuclear, Boston, MA) ja seosta inkuboitiin 18 tuntia 37°C:ssa,kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5 % CO^ita ilmassa. Solut pestiin kolme kertaa fosfaatilla puskuroidulla keittosuolalla (PBS), jonka jälkeen ne raaputettiin pullosta 10 ml:aan PBS:ää. Solusakka pes-20 tiin vielä kolme kertaa PBS:llä, ennen kuin se suspendoi-tiin 1,0 ml:aan hajoittamispuskuria (0,02 mol/1 Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 % deoksikolaatti, 0,5 mmol/1 fenyylimetyylisulfonaatti). Inkuboinnin jälkeen pyörivällä alustalla 4°C:ssa 1 - i tuntia lysaatti sentri-25 fugoitiin mikrofuugissa (16 000 x g) yksi minuutti ja supernatantti dialysoitiin TBS:ää (0,02 mol/1 Tris-HCl, 14 pH 8, 0,15 mol/1 NaCl, 0,1 % natriumatsidi) vastaan. C:llä leimattua lysaattia inkuboitiin yli yön CCK061-vasta-aineen kanssa 4°C:ssa pyörivällä alustalla. Seokseen lisättiin 30 Sepharoseen sidottua antihiiri-immunoglobuliinia ja seosta inkuboitiin 3 tuntia huoneenlämpötilassa. Sepharoseen sitoutunut materiaali pestiin 4 kertaa liuoksella, joka sisälsi 0,05 mol/1 Tris:ä, 0,15 mol/1 NaCl:a, 0,5 % NP-40:tä, 0,05 deoksikolaattia, 0,1 % NaN^:a ja 1 mg/ml BSA:ta, pH 35 8,1, ja vielä 4 kertaa edellä kuvatulla puskurilla, josta 87141 17 puuttui BSA. Näytteet analysoitiin SDS-polyakryyliamidi-geenielektroforeesilla kuten aikaisemmin on kuvattu.

Isoelektrinen fokusointi CCK061:n karakterisoiman antigeenin isoelektrinen 5 fokusointi tehtiin kuvatulla tavalla isoelektristä foku sointia pylväässä käyttäen.

20 mg paksusuolisyöpäkasvainsytosolia, joka oli valmistettu yllä kuvatulla tavalla, fokusoitiin vesijääh-dytysvaipalla varustetussa 110 ml:n isoelektrisen foku-10 soinnin pylväässä 0-47 %:ssa sakkaroosigradientissa, jo ka sisälsi pH-alueen 3,5 - 10 amofolyytit. Pylvästä esi-fokusoitiin 600 voltin jännitettä käyttämällä 12 tuntia 4°C:ssa. Näyte ruiskutettiin gradientin keskelle ja näytettä fokusoitiin vielä 30 tuntia 4°C:ssa. 1 ml:n frak-15 tiot kerättiin pylväästä ja fraktioiden pH määritettiin välittömästi. Fraktiot dialysoitiin 10 mmol/1 natrium-fosfaattia, pH 7,0, vastaan yli yön. Näytteet fraktioista analysoitiin niiden reaktiivisuuden CCK061:n kanssa suhteen paksusuolisyöpäkasvain-ELISA-määrityksellä.

20 Tällä menetelmällä suoritettu antigeenin isoelekt rinen fokusointi osoitti isoelektriset pisteet, jotka olivat alueilla noin 4,5 - 5,0 ja noin 5,1 - 5,9 piikkien ollessa noin 4,9 ja noin 5,4.

is 87141

Taulukko I

Monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 reaktiivisuus ihmis-solulinjojen kanssa 5

Solujinja Abs4gQ

SW403-paksusuolisyöpä 0,49 T47D-rintasyöpä 0,03 10 PC-3-eturauhassyöpä 0,08 H907-rakkosyöpä 0,01

Calu-3-keuhkon adenokarsinooma 0,03

SkMel-ihosyöpä 0,03 M14-ihosyöpä 0,05 15 SW620-paksusuolisyöpä 0,01 T84-paksusuolisyöpä 0,40

Taulukko II

Monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 reaktiivisuus ihmis-20 kudoksen kalvopreparaattien kanssa

Kasvainkalvot Abs4gQ Normaalit kalvot Abs^gg

Paksusuolisyöpä 2,05 Paksusuoli 2,81 25

Paksusuolisyöpä 0,78 Maksa 0,01

Rintasyöpä 0,00 Keuhko 0,00

Rintasyöpä 0,03 Haima 0,00

Keuhkon adenokarsinooma 0,03 Perna 0,00 30

Keuhkon adenokarsinooma 0,01 Rinta 0,00

Keuhkon levy- epiteelisyöpä 0,01 Rakko 0,00

Keuhkon pieni-3 r>

Soininen syöpä 0,00 Aivo 0,00 19 87141

Keuhkon pienisoluinen syöpä 0,00

Ihosyöpä 0,01

Eturauhassyöpä 0,01 5 Eturauhassyöpä 0,00

Taulukko III

CCK061:n immunohistologinen reaktiivisuus normaalin 10 kudoksen kanssa

Kudos Positiivisten tulosten luku- määrä/tutkittujen näytteiden lukumäärä_ 15 Voimakas reaktiivisuus

Paksusuoli (vain limakalvo) 4/4

Heikko reaktiivisuus

Rinta 1 /4

Keuhko 3/5 20 Kohdunkaula (vaihteleva) 2/2

Ruokatorvi (vaihteleva) 2/2

Eturauhanen 1/4

Munanjohdin (vaihteleva) 1/2

Kilpirauhanen 1/2 25 Haima 1/2

Ei reaktiivisuutta

Maksa 0/2

Maha 0/2

Munuainen 0/2 30 Rakko 0/1

Kohtu 0/1

Ohutsuoli 0/2

Kives 0/2 20 87141

Taulukko IV

CCK061:n immunohistologinen reaktiivisuus kasvainkudoksen kanssa 5

Kudos Positiivisten tulosten luku- määrä/tutkittujen näytteiden lukumäärä_

Voimakas reaktiivisuus

Paksusuolisyöpä 15/18

Ruokatorvisyöpä 2/2

Mahalaukkusyöpä 2/2

Heikko reaktiivisuus

Rintasyöpä (maitotiehyet 15 (luminal ducts)) 3/7

Keuhkon adenokarsinooma 1/4

Levyepiteelisyöpä 2/4

Haimasyöpä 2/4

Ei reaktiivisuutta 2q Keuhkon pienisoluinen syöpä 0/4

Eturauhassyöpä 0/4

Maksasyöpä 0/2

Ihosyöpä 0/1

Aivosyöpä 0/2 25 Munuaissyöpä 0/2

Edellä olevan keksinnön kuvauksen tarkoitus on valaista ja selittää esimerkein keksintöä. Alan asiantuntijoille on selvää, että muutokset ja modifikaatiot ovat mahdollisia keksinnön hengen ja piirin siitä muuttumatta.

2q Tarkoitus on, että seuraavat patenttivaatimukset tulkitaan siten, että ne sisältävät kaikki tällaiset muutokset ja modifikaatiot.

Claims

2i 87141

1. Antigeeni, joka on peräisin ihmiskudoksesta tai ihmisen syöpäkasvainsolulinjasta, tunnettu sii- 5 tä, että mainittu antigeeni on glykoproteiini, jonka mo-lekyylipaino on alueella noin 820 000 - noin 960 000 ja isoelektriset pisteet alueilla noin 4,5 - noin 5,0 ja noin 5,1 - noin 5,9 ja että se on reaktiivinen hybridoo-masolulinjan ATCC HB8786 tuottaman monoklonaalisen vasta-10 aineen CCK061 kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen antigeeni, tunnettu siitä, että isoelektriset pisteet ovat noin 4,9 ja noin 5,4.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen antigeeni, 15 tunnettu siitä, että sen reaktiivisuus monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa voidaan tuhota käsittelemällä antigeeniä proteinaasi K:11a.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen antigeeni, tunnettu siitä, että se on kasvaimeen liittyvä 20 antigeeni, joka esiintyy paksu- ja peräsuolisyöpäkasvai- messa.

5. Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että immunisoidaan hiiri tai muu sopiva isäntä jonkin 25 patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella antigeenillä; fuusioidaan immunisoidun hiiren tai muun sopivan isännän pernasolut sopivien hiiren myeloomasolujen kanssa, jolloin saadaan hybridisolulinjojen seos; viljellään hybridisolulinjoja sopivassa väliai- 30 neessa; valitaan ja kloonataan hybridisolulinjät, jotka tuottavat vasta-ainetta, joka reagoi spesifisesti mainitun antigeenin kanssa; sekä otetaan talteen näin tuotettu monoklonaalinen vas-35 ta-aine; 87141 ja haluttaessa vasta-aineeseen yhdistetään radio-isotooppi, myrkky tai lääkeaine sopivan konjugoivan aineen läsnäollessa.

6. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu 5 siitä, että se reagoi spesifisesti jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen antigeenin kanssa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on hiiren vasta-aine.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on IgM-luo-kan vasta-aine, jonka reaktiivisuus tuhoutuu, kun antigeeniä käsitellään proteinaasi K:11a.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen monoklonaalinen 15 vasta-aine, tunnettu siitä, että kasvaimeen liitttyvä antigeeni esiintyy paksu- ja peräsuolisyöpäkas-vaimessa.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se valmistetaan 20 patenttivaatimuksen 5 mukaisella menetelmällä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on hybridoomasolulinjan ATCC HB8786 tuottama CCK061.

12. Menetelmä syövän toteamiseksi ja diagnostisoi- 25 miseksi epäillyssä syöpäpotilaassa, tunnettu siitä, että potilaalta saatu kudosnäyte saatetaan yhteen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka reagoi spesifisesti jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen antigeenin kanssa, ja että näytteen kohdat, joihin vasta-aine 30 sitoutuu, määritetään immunohistokemiallisin menetelmin.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on CCK061.

14. Menetelmä syövän toteamiseksi ja diagnostisoimiseksi in vitro epäillyssä syöpäpotilaassa, t u n - 35. e t t u siitä, että potilaasta saatu nestenäyte saate- li 87141 taan yhteen ainakin yhden monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka reagoi spesifisesti jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen antigeenin kanssa ja että vasta-aineen sitoutuminen nestenäytteen komponentteihin määritetään 5 immunologisella määritysmenetelmällä.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on CCK061.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunologinen määritysmene- 10 telinä on kaksipaikkainen immunometrinen määritysmenetelmä ja että vasta-aineet ovat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on valittu siten, että ne sitoutuvat antigeenin toisiaan häiritsemättömiin determinantteihin.

17. Menetelmä rakkulaisen fibroosin osoittamiseksi 15 in vitro, tunnettu siitä, että potilaan seerumi- näyte saatetaan yhteen monoklonaalisen vasta-aineen CCK061 kanssa ja määritetään vasta-aineen sitoutuminen näytteen komponentteihin immunologisella määritysmenetelmällä, jossa immunologisessa määritysmenetelmässä käyte- 20 tään toista vasta-ainetta, joka pystyy sitoutumaan ainakin yhteen rakkulaiseen fibroosiin liittyvään limakal-voantigeeniin.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunologinen määritysmene- 25 telmä on kaksipaikkainen immunometrinen määritysmenetelmä ja että toinen vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, joka on valittu siten, että vasta-aine CCK061 ja toinen vasta-aine sitoutuvat limakalvoantigeenin toisiaan häiritsemättömiin determinantteihin. 30 87141