NO164844B - Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. - Google Patents
Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. Download PDFInfo
- Publication number
- NO164844B NO164844B NO884721A NO884721A NO164844B NO 164844 B NO164844 B NO 164844B NO 884721 A NO884721 A NO 884721A NO 884721 A NO884721 A NO 884721A NO 164844 B NO164844 B NO 164844B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- procedure
- concentration
- extract
- enzymes
- accordance
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000009066 Hyaluronoglucosaminidase Human genes 0.000 claims abstract 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 23
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 3
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000012432 intermediate storage Methods 0.000 claims description 2
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 claims 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 abstract description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 4
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 241000238070 Pandalus borealis Species 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101000588395 Bacillus subtilis (strain 168) Beta-hexosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Fremgangsmåte ved utvinning av verdifulle bioaktive komponenter som f.eks. enzymene alkalisk fosfatase, hyaluronidase og chitinase fra krepsdyr, særlig reker, ved å ekstrahere disse med et vannbasert ekstraksjonsmedium og å underkaste ekstraksjonslaken følgende arbeidstrinn: rensing ved sentrifugering eller filtrering, oppkonsentrering, utfelling og fjerning av uønskede substanser, samt isolering av de ønskede komponenter.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved utvinning av enzymer, som alkalisk fosfatase, fra krepsdyr (crustacea av Phylum Arthropoder), særlig reker.
Enzymer anvendes i høyren form ved forskning og analyse innen biokjemi og klinisk kjemi. Det foreligger et stadig økende -behov for enzymer i høyren form som utviser høy enzymaktivitet .
Det er kjent fra bl.a. DD-PS 246686 A, JP 78030784 B og JP 74043153 B å utvinne enzymer, slik som alkalisk fosfatase fra indre organer som kalvemage, tarmer og placenta, samt fra innmaten av kalvetarmer. Disse kjente fremgangsmåter krever kompliserte arbeidstrinn samt anvendelsen av relativt store mengder organiske løsningsmidler for å overføre enzymene i en vannoppløselig form. Dette gjør fremgangsmåtene kostnadsin-tensive og krever dessuten ytterligere arbeidstrinn for å rense brukte løsningsmidler slik at de kan resirkuleres.
Det er nå funnet at det på meget enkel og rimelig måte kan utvinnes høyrene enzymer fra krepsdyr, særlig reker, med tilsvarende god enzymaktivitet som kommersielt tilgjengelige produkter. Dette baserer seg på at det er funnet overraskende høye enzymkonsentrasjoner av f.eks. alkalisk fosfatase, hyaluronidase og chitinase i laker som fremkommer ved ekstraksjon av krepsdyr. Det er funnet konsentrasjoner i stør-relsesorden 1,5-3,0 mg protein/ml lake i en lake som fremkommer ved vanlig tining av blokkfrosne ferske reker før videre-prosessering.
En fordel ved fremgangsmåten i hht. oppfinnelsen er at enzymene kan hentes ut av råmaterialet, dvs. krepsdyr ved enkel ekstraksjon med et ekstraksjonsmiddel som i det vesentlige er vann, slik at enzymene foreligger i oppløst form hvilket medfører at de kan isoleres på enkel og rimelig måte ved oppkonsentrering, utfelling og frafiltrering av uønskede substanser.
En annen fordel med fremgangsmåten i hht. oppfinnelsen er at det er mulig å arbeide med et meget lavt aktivitetstap for enzymene, slik at hovedmengden av enzymene som finnes i ekstraksjonslaken lar seg isolere ved denne fremgangsmåten.
En ytterligere fordel med fremgangsmåten i hht. oppfinnelsen er at det mulig å utvinne kommersielt verdifulle produkter fra et avfallsprodukt som eventuelt ellers måtte underkastes rensetrinn for å unngå en miljøforurensning.
En ytterligere fordel ved foreliggende oppfinnelse er at krepsedyrenes næringsverdi på ingen måte forringes.
Ved fremgangsmåten i hht. oppfinnelsen ekstraheres enzymene med i hovedsak vann fra ferskt eller konservert råstoff bestående av hele krepsdyr, særlig reker, eller hele deler derav. I hht. foreliggende fremgangsmåte underkastes ekstraksjonslaken et eller flere av de følgende arbeidstrinn en eller flere ganger i uavhengig rekkefølge: rensing, oppkonsentrering, utfelling og/eller fjerning av uønskede substanser samt isolering og eventuelt standarisering og stabilisering av de rensede enzymer. Ytterligere trekk ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå av de vedlagte krav.
Det konserverte råstoff kan foreligge i frossen form (i blokk eller enkeltvis), kjemisk konservert f.eks.-, i saltlake, konservert ved fermentering, ensilering, tørking, bestråling
eller tilsetting av konserveringsmidler.
Fremgangsmåten i hht. oppfinnelsen kan utføres med et ekstraksjonsmiddel som i det vesentlige består av rent vann i 1-12 timer, i et temperaturområde fra 1-35°C. Det er foretruk-ket å arbeide i temperatur intervallet 10-25°C, særlig ved ca. 15°C.
Rensetrinnene omfatter grovrensing av den første ekstraksjonslaken for å fjerne uoppløst partikulært materiale f.eks. ved filtrering eller sentrifugering under dannelse av et råekstrakt, og finrensing av enzymene ved hjelp av kromato-grafiske teknikker som ionebytterkromatografi, affinitets-kromatografi, gelfiltrering eller liknende. Valg av benyttet metode vil avhenge av de enkelte enzymers biologiske og fysikalsk-kjemiske karakteristika.
Kolloidalt materiale kan fjernes fra råekstraktet ved tilsetning av filterhjelpemiddel, som f.eks. polyakrylamidbas-erte polykationer eller polyanioner, og ved utfelling og/ eller frafiltrering under dannelse av et klargjort ekstrakt.
Oppkonsentrering omfatter i hht. oppfinnelsen oppkonsentrering både av råekstrakt og klargjort ekstrakt og kan gjen-nomføres f.eks. ved membranfiltrering (cross flow filtering) eller inndamping ved redusert trykk. Det er hensiktsmessig å foreta oppkonsentrering flere ganger i løpet av utvinnings-prosessen og å gjennomføre en 1-50 gangers oppkonsentrering hver gang.
For å fremstille standariserte enzymer med ønsket konsentrasjon og aktivitet kan det klargjorte ekstrakt eksempelvis underkastes diafiltrering/ultrafiltrering og hvis nødvendig også et rekromatograferingstrinn.
Det endelige produkt kan foreligge i fastfeller flytende form. Stabilisering av de rensede enzymene-i flytende form kan skje ved nedfrysing eller ved tilsetting av f.eks salter, syrer og/eller baser (for pH-justering) eller andre vanlige stabiliserende stoffer. Produktet kan overføres i fast form ved hjelp av vanlige tørkemetoder som eksempelvis frysetørk-ing.
For å fremstille et produkt med ønsket aktivitet pr. gram tørrstoff, tilsettes vanlig brukte fortynnere eller bærere.
Det skal i det følgende beskrives en foretrukken utførelses-form under henvisning til den vedlagte figur. Blokkfrosne ferske reker ekstraheres (1) i minst 8 timer med vann (temperatur 15°C). Det dannede ekstrakt underkastes en grovfiltrering (2) f.eks. på en roterende sil med poreåpning 0,5mm. Filtratet oppkonsentreres (3) 10 ganger.-i:et cross-flow-filtreringssystem. Hvis ønsket eller nødvendig fryses eller frysetørkes ekstraktet for mellomlagring-'(4) , og det må da tines eller oppløses og tempereres (5) før det kan videre-behandles. Partikulært materiale flokkuleres i en tank (6) under tilsetning av flokkuleringshjelpemiddel, eksempelvis polyakrylamidbasert polykation i en konsentrasjon på 0,1 g/liter ekstrakt, og det frafiltreres (7) deretter på filterpresse. Det klargjorte filtrat oppkonsentreres (8) igjen 10 ganger i et cross flow-filtreringssystem. Enzymene bindes til 10 liter Q-Sepharose i en kolonne (9) med et overflateareal på 500cm<2> med en hastighet på 8 l/time. Kolonnen er ekvilibrert med tris-HCl buffer (pH 7,2 , 1 mM MgCl2) . De ønskede enzymer elueres ned fra kolonnen med tris-HCl buffer tilsatt 0,1-0,5 M NaCl.
I det følgende skal oppfinnelsen belyses nærmere ved hjelp av noen eksempler:
Eksempel 1. Alkalisk fosfatase fra reke ( Pandalus borealis) 12 tonn reker ekstraheres med 2500 liter vann, temperatur 15°C i 8 timer. Det samlede proteininnhold i ekstraktet utgjør ca. 2,5 mg protein/ml. Innholdet av alkalisk fosfatase i dette ekstraktet er ca. 2,0 Units pr. mg. protein. Måle-metode er i hht. standardmetode der prinsippet er hydrolyse-hastigheten av p-nitrofenylfosfat i dietanolaminbuffer ved 37°C. (Ref. Mossner et al., Hoppe-Seyler Z. Physiol. Chem., 361.543 (1980)).
Ekstraktet grovfiltreres gjennom en roterende sil (Rotosieve) med poreåpning 0,5mm.
Filtratet konsentreres 10 ganger ved ultrafiltrering i et cross flow filtreringssystem med hollow fiber polysulfon cartridge med en molekylær cut off på 10 000 dalton. Denne oppkonsentrering foregår uten vesentlig aktivitetstap (mindre enn 10%). Sluttvolumet etter denne oppkonsentrering er ca. 250 liter.
Kolloidale partikler fjernes fra det konsentrerte ekstraktet ved direkte filtrering etter tilsats av et polyakrylamidbasert polykation. Det anvendes ca. 0,1 gram polykation/liter ekstrakt. Etter flokkulering og frafiltrering av de flokkulerte partikler på et rammefilter konsentreres det klargjorte ekstrakt ytterligere opp. En oppkonsentrering på 10 ganger i cross flow filtreringssystem med hollow fiber polysulfon cartridge med molekylær cut off på 10 000 dalton anvendes. Sluttvolumet etter denne oppkonsentrering er ca. 2 0 liter.
Alkalisk fosfatase bindes til 10 liter Q-Sepharose (fast flow) i en kolonne med overflateareal på ca. 500 cm<2> med en hastighet på 8 liter/time. Kolonnen er på forhånd ekvilibrert med tris-HCl buffer (pH 7,2 , ImM MgCl2) . Fremmedprotein elueres med tris-HCl buffer (pH 7,2 , ImM MgCl2) tilsatt 0,25M NaCl. Alkalisk fosfatase elueres med.<5> tilsvarende buffer tilsatt 0,4M NaCl. Eluatet inneholdene alkalisk fosfatase konsentreres til ønsket sluttkonsentrasjon og diafUt-reres deretter mot en 0,03M trietanolaminbuffer (pH 7,6, 3M NaCl, 0,001M ZnCl2) .
Eksempel 2. H<y>aluronidase fra reke ( Pandalus borealis)
12 tonn reker ekstraheres med 2500 liter vann med temperatur 15°C i 8 timer. Det samlede proteininnhold i ekstraktet er ca. 2,5mg/ml. Innholdet av hyaluronidase i dette ekstraktet er ca. 2,5 units/mg protein. Hyaluronidaseaktiviteten måles som reduksjon i turbiditet ved innkubering med hyaluronsyre og påfølgende tilsats av albumin. (Ref. Tolksdorf et.al., J.Lab.Clin.Med, 34, 74 (149)).
Ekstraktet grovfiltreres over en roterende sil med poreåpning 0,5mm. Filtratet konsentreres ca. 10 ganger ved ultrafiltrering i et cross flow filtreringssystem med hollow fiber polysulfon cartridge med en molekylær cut off på 10 000 dalton. Det skjer ikke vesentlig aktivitetstap over dette konsentreringstrinnet. Sluttvolumet etter oppkonsentreringen er 250 liter.
Kolloidale partikler fjernes fra det konsentrerte ekstraktet ved direkte filtrering etter tilsats av et polyakrylamidbasert polykation. Det anvendes ca. 0,1 gram filtreringshjel-pemiddel pr. liter ekstrakt. Etter flokkulering og frafiltrering av partiklene på filterpresse, konsentreres filtratet ytterligere 10 ganger i et cross flow filtreringssystem med hollow fiber polysulfon cartridge med en molekylær cut off på ca. 10 000 dalton. Sluttvolumet etter denne oppkonsentreringen er ca. 20 liter.
Hyaluronidase bindes til ca. 10 liter Q-Sepharose (fast flow) i en kolonne med et overflateareal på 500 cm<2> med en hastighet på 8 liter/time. Kolonnen er på forhånd ekvilibrert med tris-HCl buffer (pH 7,2, ImM MgCl2) .
Hyaluronidase elueres med tris-HCl buffer (pH 7,2, ImM MgCl2) tilsatt 0,2 5M NaCl. Eluatet som inneholder hyaluronidase oppkonsentreres til ønsket sluttkonsentrasjon og frysetørkes deretter.
Eksempel 3. Chitinase fra reke ( Pandalus borealis).
12 tonn reker ekstraheres med 2500 liter vann med temp. 15°C i 8 timer. Det samlede proteininnhold utgjør ca. 2,5mg
protein/ml ekstrakt. Innholdet av chitinase i dette ekstrakt er ca. 6-8 units/mg protein. Chitinase blir målt som frigjort N-acetyl-glucosamin etter spaltning av kolloidalt chitin med chitinase og N-acetyl-glucosaminidase (Ref. Kono et al., Bull. of the Jap. Soc.of Sci.Fish., 53 (1) 131-136 (1987)).
Ekstraktet grovfiltreres igjennom en roterende sil med poreåpning 0,5mm. Filtratet konsentreres ca. 10 ganger ved ultrafiltrering med en hollow fiber polysulfon cartridge med en molekylær cut off på 10 000 dalton. Det skjer ikke vesentlig aktivitetstap over oppkonsentreringstrinnet. Sluttvolumet etter oppkonsentrering er på ca. 250 liter.
Kolloidale partikler fjernes fra det konsentrete ekstraktet ved direkte filtrering etter tilsats av et polyakrylamidbasert polykation. Det anvendes 0,1 gram filtrerhjelpemiddel pr. liter konsentrat. Etter flokkulering og frafiltrering av de flokkulerte partikler i en filterpresse, oppkonsentreres det klargjorte konsentrat ytterligere, ca. 10 ganger i et cross flow filtreringssystem med hollow fiber polysulfon cartridge med en molekylær cut off på ca. 10 000 dalton.
Sluttvolumet etter denne oppkonsentrering er på ca 2 0 liter.
Chitinase bindes til 10 liter Q-Sepharose (fast flow) i en kolonne med overflateareal pa ca. 500 cm med en hastighet på 8 liter/time. Kolonnen er på forhånd evilibrert med tris-HCl buffer (pH 7,2, ImM MgCl2) . Chitinase elueres med tris-HCl buffer (pH 7,2, ImM MgCl2) over en saltgradient fra 0,1-0,5M NaCl. Eluatet som innholder chitinase konsentreres til ønsket sluttkonsentrasjon og frysetørkes.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte ved utvinning av enzymer, karakterisert ved å ekstrahere et ferskt eller konservert råstoff bestående av hele krepsdyr (crustacea av phylum arthropoder), og/eller hele deler derav i 1-12 timer med et ekstraksjonsmedium som i det vesentlige består av vann, ved en temperatur i området 1-35°C, særlig 10-25°C, og å underkaste den derved dannede ekstraksjonslake et eller flere av de følgende arbeidstrinn en eller flere ganger i uavhengig rekkefølge: rensing ved filtrering, sentrifugering eller kromatografi, oppkonsentrering, utfelling og/eller fjerning av uønskede substanser, isolering, standarisering og stabilisering av de rensede enzymer.
2 . Fremgangsmåte i hht. krav 1,
karakterisert ved å ekstrahere reker.
3. Fremgangsmåte i hht. krav 1 eller 2, karakterisert ved å ekstrahere blokkfrosne, ferske reker slik at disse tines.
4 . Fremgangsmåte i hht. krav 3,
karakterisert ved å gjennomføre ekstraksjonen i 8 timer, med vann som har en en temperatur på 15°C.
5 . Fremgangsmåte i hht. krav 4,
karakterisert ved å underkaste ekstraktet som kan ha vært frysetørket eller frossent for mellomlagring, de følgende arbeidstrinn i denne
rekkefølge: grovfiltrering på roterende sil med pore-størrelse 0,5mm, oppkonsentrering 1-20 ganger, særlig 10 ganger, i et cross flow filtreringssystem, tilsetning av filtrerhjelpemiddel, særlig polyakrylamidbasert polykation i en størrelsesorden på 0,05-0,15 gram/liter ekstakt, særlig 0,1 gram/liter ekstrakt, filtrering på en filterpresse, oppkonsentrering 1-50 ganger, særlig 10 ganger, i et cross flow filtreringssystem, kolonnekromatografisk isolering av de bioaktive komponenter.
6. Fremgangsmåte i hht. et av kravene 1-5, karakterisert ved at enzymet alkalisk fosfatase utvinnes.
7. Fremgangsmåte i hht et av kravene 1-6, karakterisert ved at enzymet hyaluronidase utvinnes.
8. Fremgangsmåte i hht et av kravene 1-6, karakterisert ved at enzymet chitinase utvinnes.
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO884721A NO164844C (no) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. |
| EP19890310311 EP0366296A3 (en) | 1988-10-24 | 1989-10-09 | Method for the preparation of a biologically active substance |
| ZA897677A ZA897677B (en) | 1988-10-24 | 1989-10-09 | Method for the preparation of a biologically active substance |
| US07/420,001 US5061627A (en) | 1988-10-24 | 1989-10-11 | Method for preparing enzymes from crustaceans |
| NZ230985A NZ230985A (en) | 1988-10-24 | 1989-10-12 | Extracting biologically active compounds from crustacea |
| AU42982/89A AU637584B2 (en) | 1988-10-24 | 1989-10-18 | Method for the preparation of a biologically active substance |
| IS3514A IS3514A7 (is) | 1988-10-24 | 1989-10-23 | Aðferð til að vinna líffræðilega virk efni |
| CA002001242A CA2001242A1 (en) | 1988-10-24 | 1989-10-23 | Method for the preparation of a biologically active substance |
| DK524489A DK524489A (da) | 1988-10-24 | 1989-10-23 | Fremgangsmaade til fremstilling af biologisk aktive forbindelser, specielt enzymer |
| JP1273899A JPH02171185A (ja) | 1988-10-24 | 1989-10-23 | 生理活性物質の調製方法 |
| FI895025A FI895025A0 (fi) | 1988-10-24 | 1989-10-23 | Foerfarande foer framstaellning av en biologiskt aktiv substans. |
| SU894742338A RU1838406C (ru) | 1988-10-24 | 1989-10-23 | Способ получени биологически активных компонентов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO884721A NO164844C (no) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO884721D0 NO884721D0 (no) | 1988-10-24 |
| NO884721L NO884721L (no) | 1990-04-25 |
| NO164844B true NO164844B (no) | 1990-08-13 |
| NO164844C NO164844C (no) | 1990-11-21 |
Family
ID=19891357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO884721A NO164844C (no) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5061627A (no) |
| EP (1) | EP0366296A3 (no) |
| JP (1) | JPH02171185A (no) |
| AU (1) | AU637584B2 (no) |
| CA (1) | CA2001242A1 (no) |
| DK (1) | DK524489A (no) |
| FI (1) | FI895025A0 (no) |
| IS (1) | IS3514A7 (no) |
| NO (1) | NO164844C (no) |
| NZ (1) | NZ230985A (no) |
| RU (1) | RU1838406C (no) |
| ZA (1) | ZA897677B (no) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0691819B2 (ja) * | 1991-05-27 | 1994-11-16 | 工業技術院長 | デアセチラーゼの製造方法 |
| CA2180826A1 (en) | 1994-01-13 | 1995-07-20 | Richard J. Ii Stoner | Organic disease control system |
| GB2293824B (en) * | 1994-10-04 | 1998-11-18 | Ashok Meluttukez Krishnapillai | Extraction and purification of hyaluronidase from crustacean waste |
| US5866120A (en) * | 1995-11-22 | 1999-02-02 | Advanced Corneal Systems, Inc. | Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase |
| US6610292B2 (en) | 1995-11-22 | 2003-08-26 | Ista Pharmaceuticals, Inc. | Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders |
| US5998173A (en) * | 1996-02-20 | 1999-12-07 | The University Of Bristish Columbia | Process for producing N-acetyl-D-glucosamine |
| WO1999040989A1 (en) * | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Trustees Of Tufts University | Natural products from terrestrial and marine sources, and drug discovery based thereon |
| DE69928087D1 (de) * | 1998-03-09 | 2005-12-08 | Ista Pharmaceuticals Inc | Verwendung von glyceraldehyde als hornhaut härtungsmitteln |
| MXPA03011987A (es) | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Osio Sancho Alberto | Metodo para el tratamiento de la presbicia induciendo cambios en el poder y fisiologia corneal. |
| CN111290143B (zh) | 2012-08-10 | 2023-03-31 | 奥西奥公司以约利亚健康公司名义经营 | 隐形眼镜和为个体的眼睛测定隐形眼镜的适配的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3075886A (en) * | 1960-09-19 | 1963-01-29 | Baxter Laboratories Inc | Purification of enzymes |
| JPS59501908A (ja) * | 1982-10-25 | 1984-11-15 | ヘルグレン・ラルス・グスタ−ヴ・インゲ | クリーニング用酵素組成物 |
| SE454566B (sv) * | 1984-04-24 | 1988-05-16 | Lars G I Hellgren | Farmaceutisk komposition innehallande en verksam mengd av vattenlosliga proteinaser som extraherats fran ett vattenlevande djur valt av ordningen euphausiaceae eller slektet mallotus |
| SE456245B (sv) * | 1986-07-09 | 1988-09-19 | Pharmacia Ab | Enzympreparation innehallande krillhyaluronidas |
-
1988
- 1988-10-24 NO NO884721A patent/NO164844C/no unknown
-
1989
- 1989-10-09 ZA ZA897677A patent/ZA897677B/xx unknown
- 1989-10-09 EP EP19890310311 patent/EP0366296A3/en not_active Withdrawn
- 1989-10-11 US US07/420,001 patent/US5061627A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-12 NZ NZ230985A patent/NZ230985A/xx unknown
- 1989-10-18 AU AU42982/89A patent/AU637584B2/en not_active Ceased
- 1989-10-23 RU SU894742338A patent/RU1838406C/ru active
- 1989-10-23 DK DK524489A patent/DK524489A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-10-23 FI FI895025A patent/FI895025A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-10-23 CA CA002001242A patent/CA2001242A1/en not_active Abandoned
- 1989-10-23 IS IS3514A patent/IS3514A7/is unknown
- 1989-10-23 JP JP1273899A patent/JPH02171185A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5061627A (en) | 1991-10-29 |
| NO164844C (no) | 1990-11-21 |
| NO884721L (no) | 1990-04-25 |
| EP0366296A2 (en) | 1990-05-02 |
| EP0366296A3 (en) | 1991-09-11 |
| ZA897677B (en) | 1990-07-25 |
| DK524489D0 (da) | 1989-10-23 |
| AU4298289A (en) | 1990-04-26 |
| IS3514A7 (is) | 1990-04-25 |
| AU637584B2 (en) | 1993-06-03 |
| DK524489A (da) | 1990-04-25 |
| RU1838406C (ru) | 1993-08-30 |
| NZ230985A (en) | 1991-09-25 |
| JPH02171185A (ja) | 1990-07-02 |
| CA2001242A1 (en) | 1990-04-24 |
| FI895025A0 (fi) | 1989-10-23 |
| NO884721D0 (no) | 1988-10-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2198317C (en) | Method for preparing pancreatin which contains low amounts of residual organic solvent and product thereof | |
| US4623723A (en) | Process for separating ribonucleic acids from a solution containing deoxyribonucleic acids | |
| CN111793145A (zh) | 一种提高硫酸软骨素钠联产胶原蛋白肽质量与收率的工艺 | |
| NO164844B (no) | Fremgangsmaate ved utvinning av enzymer fra krepsdyr. | |
| EP1545235A1 (en) | Method for production of peptides/amino acids produced by said method and use of the same | |
| RU2409291C1 (ru) | Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород | |
| US2808362A (en) | Preparation of hyaluronidase | |
| US20060014256A1 (en) | Sodium chondroitin sulfate, chondroitin-sulfate-containing material and processes for producing the same | |
| US4552845A (en) | Method for separating lysozyme from egg-white | |
| US6080844A (en) | Process for the recovery and purification of a recombinant protein from a cell | |
| JPH04222593A (ja) | 多糖類の抽出法 | |
| CA1221046A (en) | Method for separating lysozyme from egg-white | |
| US4315923A (en) | Process for the production of organ extracts with high herparin content | |
| RU2280076C1 (ru) | Ферментный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов и способ его получения | |
| US2954321A (en) | Process for preparing heparin | |
| CN111926050A (zh) | 河豚精囊胶原蛋白肽的提纯工艺 | |
| DE1927517A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von L-Asparaginase | |
| JPH02286082A (ja) | キチン分解酵素の分離精製方法 | |
| JPS61181394A (ja) | リボ核酸の単離取得方法 | |
| KR102580940B1 (ko) | 연어과 어류의 살로부터 고순도 디엔에이의 추출 방법 | |
| US20220204922A1 (en) | Purified fish proteases with high specific activities and its process of production | |
| SU843915A1 (ru) | Способ получени суммарного гистонаиз жиВОТНОгО СыРь | |
| RU2265052C2 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
| RU2269913C1 (ru) | Способ получения хитина | |
| JP4224313B2 (ja) | アミラーゼ阻害物質の調製方法 |