NO158881B - Fremgangsmaate for fremstilling av antibiotikum x1493a vedfermentering av streptomyces hygroscopius x-14934. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt ionofor polyeterantibiotikum med formelen

og dets salter, ved fermentering av den nye mikroorganisme-stamme Streptomyus hygroscopius X 1493A.

Forkortelsen Me anvendes ovenfor til å angi metyl.

Forbindelsen med formel I og dets salter viser aktivitet som antibakterielt middel og som anticoccidialt middel.

Antibiotikum X-1493A er den betegnelse som er gitt for et krystallinsk antibiotikum fremstilt av en Streptomyces organisme, av hvilken frysetOrkede rør ble deponert hos US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, Illinois. Kulturen har fått identifikasjonsnummeret NRRL 15518.

Antibiotikum X-14934A.er et polyeterantibiptikum og danner en rekke salter. Disse salter fremstilles fra den frie syreform av antibiotikumet ved fremgangsmåter som er vel-kjente for forbindelser av polyetertypen innenfor området; f.eks. ved å vaske den frie syre i løsning med en tilsvarende base eller salt. Eksempler på slike basiske substan-ser som kan danne salter for formålet ved foreliggende

oppfinnelse er alkalimetallbaser såsom natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, litiumhydroksyd o.l.; jordalkalimetall-

baser såsom kalsiumhydroksyd, bariumhydroksyd o.l. og ammoniumhydroksyd. Alkalimetall eller jordalkalimetallsal-ter som er egnet for saltdannelse kan være anioner såsom karbonater, bikarbonater og sulfater.

Eksempler på organiske baser som danner salter med poly-eter forbindelsene er lavere primære, sekundære og tertiære alkylaminer og hydroksyalkylaminer såsom etylamin, isopro-pylamin, dietylamin, metyl-n-butylamin, etanolamin og die-tanolamin.

MORFOLOGISKE KARAKTERISTIKA

Den nye mikroorganismestammen, Streptomyces hygroscopius X-14934 har de følgende karakteristika: 1. Mikroskopiske karakteristika. Kultur X-14934 vokser i agarmediet med forskjellige sammensetninger som har fått et mycel under overflaten, hvilket trenger inn i agaren og ikke fragmenteres med alderen og et luftmycel som partielt differensierer i sporekjeder. Disse kjeder har spiralform og har mer enn 10 sporer i hver. Sporene kan ikke sees enkeltvis p.g.a. av en belg som dekker hele kjeden og blir strukket ved tørking. Sporene er glatt og de måler gjennomsnittlig 0,6 um til 1,1 pm.

Papirkromatografisk analyse av hele cellehydrolysater viser nærvær av LL-diaminopimelinsyre, hvilket bekrefter identifikasjonen av denne organisme som en stamme fra slekten Streptomyces. 2. Makroskopiske karakteristika. I tabellen nedenunder er karakteristika for vekst, sporuleringsgrad og farge av massen i luft og det motsatte mycel i flere medier angitt. Dataene er fastsatt etter 14 dagers inkubering ved 28°C.

3. Fysiologiske karakteristika. Stammen X-14934 forbruker

flukose, L-arabinose, sukrose, i-inositol, mannitol, fruk-tose, rhamnose og raffinose, og mindre effektivt xylose som eneste karbonvekstkilde. Utnyttelse av cellulose er negativ.

Fremstilling av H^ S som angitt ved mørkning i pepton-gjærekstrakt-jern agar (ISP 6) er positiv, og en mørk farge (melanin) utvikles i tyrosin-holdig medium (ISP 7). Nitratreduksjon er negativ. Gelatin, stivelse og kasein-hydrolyse er positiv. Det er ingen vekst ved NaCl konsentrasjoner på 3,5% eller høyere.

4. Sammenligning med kjente Streptomyces arter. På basis

av fargen til sporemassen, formen av sporekjedene, spore-overflate og fremstilling av melanoidpigmenter, samt den hygroskopiske karakteren til.koloniene på noen medier og karbonforbruksforsøkene kan stamme X-14934 henføres til artene Streptomyces hygroscopicus.

Den her beskrevne Streptomyces X-14934 innebefatter alle

stammer av Streptomyces som danner en forbindelse som A.S. MA/S. 15.000.6.84

beskrevet i foreliggende tekst ...• og som ikke definitivt kan avgrenses fra NRRL stammen samt dens subkulturer inne-befattet mutanter og varianter. Etter at identifikasjon av den beskrevne forbindelse er kjent, er det lett å differensiere stammene som fremstiller denne forbindelse fra andre.

Når Streptomyces X-14934 ble dyrket under egnede betingelser, produserer den et antibiotikum X-14934A. En fermen-teringsvæske som inneholder Streptomyces X-14934A fremstilles ved å inokulere sporer eller mycel av organismen som produserer antibiotikumet i et egnet medium og deretter dyrke under aerobe betingelser. For fremstilling av antibiotikumet er dyrking på et fast medium mulig, men for produksjon i større mengder er dyrking i et væskemedium å foretrekke. Temperaturen for dyrking kan varieres over et bredt område, 20-35°C, innenfor hvilket organismen kan vokse, men en temperatur på 26-30°C og en hovedsakelig nøytral pH foretrekkes. I den aerobe dypkultursfermenter-ing av organismen for fremstilling av antibiotikum X-14934A, kan mediet inneholde som karbonkilde en i handelen tilgjengelig glyceridolje eller et karbohydrat såsom glycerol, glukose, maltose, laktose, dekstrin, stivelse osv. i ren eller rå tilstand og som nitrogenkilde et organiske materiale såsom soyabønne mel, distillers' solubles, peanøttmel, bomullsfrømel, kjøttekstrakt, pepton, fiskemel, gjærekstrakt, maisstøpvæske osv. og om ønsket uorga-niske nitrogenkilder såsom nitrater og ammoniumsalter og mineralsalter såsom ammoniumsulfat, magnesiumsulfat o.l. Det kan også inneholder natriumklorid, kaliumklorid, kal-iumfosfat o.l. og bUffringsmidler såsom natriumcitrat, kal-siumkarbonat eller fosfater og spormengder av turigmetall-salter. I ventilerte dypkulturmetoder brukes et antiskummiddel såsom flytende parafin, fettoljer eller silisium-forbindelser. Mer enn en type karbonkilde, nitrogenkilde eller antiskummiddel kan brukes for fremstilling av antibiotikum X-14934A.

Antibiotikum X-14934A har en toksisitet (LD5Q) i mus på A.S.M. A/S. 15.000. 6.84 25 mg/kg (PO) og 7,75 mg/kg (IP) som monohydratnatrium-salt.

De følgende eksempler angir fremgangsmåter for fremstilling av X-14934A:

Eksempel 1

Streptomyces sp. X-14934 dyrkes og holdes på en stivelse-kaseinskråagar med følgende sammensetning (gram/liter destillert vann):

En skråagar inokulert med kulturen X-14934 inkuberes ved 28°C i 7-14 dager. Et stykke agar inneholdende sporer og mycel fra den inkuberte skråkultur brukes for å fremstille vegetativt inokulum ved å inokulere det i en 500-mls Erlenmeyer kolbe inneholdende 100 ml medium med følgende sammensetning (gram/liter springvann):

Det inokulerte medium inkuberes ved 28°C i 4 dager på en roterende ryster som går med 250 opm. To 30 mis porsjoner av den resulterende kultur brukes til å inokulere to 6 liters Erlenmeyerkolber som hver inneholder 2 liter medium med ovenfor beskrevne sammensetning. Disse inokulerte 6 liters Erlenmeyerkolber inkuberes i 4 dager ved 28°C på en roterende ryster ;som går med 250 opm. De fire litere resulterende vegetativ vekstmasse brukes til å inokulere en 378 liters fermentor innehodlende 227 1 produksjonsmedium med følgende sammensetning (gram/liter springvann):

Den inokulerte tank ventileres med trykkluft 84 liter pr. minutt, og røres med røreverk ved 280 opm. Fermenteringen utføres ved 28°C i 9 7 timer.

Eksempel 2

Isolering av X-14934A, natriumsalt

Trinn A: Til hele væsken fra 227 1 fermentering i eksempel 1 satte man etter 139 timers vekst samme volum etylacetat. Etter røring i en time ble løsningsmiddelsjiktet skilt fra, den vandige fase ble igjen ekstrahert med det samme volum etylacetat som forut. De to løsningsmiddel-faser ble slått sammen og konsentrert til 2,6 liter under redusert trykk.

Trinn B: Etylacetatekstrakter ble videre konsentrert til en olje. Oljen ble oppløst i n-heksan og ble ekstrahert fem ganger med et tilsvarende volum av acetonitril etterfulgt av en ekstrahering med acetonitril/metanol (9:1). Acetonitril og acetonitril/metanol (9:1) ekstraktene ble slått sammen og løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk. Den derved erholdte rest ble oppløst i etylacetat og ble i rekkefølge vasket med 1 N HC1, Na2C03 (met-tet ved romtemperatur) og f^O. Løsningsmiddelfasen ble tørket over Na2S04 og konsentrert til en olje (38 g) under redusert trykk.

Trinn C: Den resulterende olje fra trinn B ble oppløst i metylenklorid og ble kromatografert på en metylenklorid-oppslemming pakket 500 g kiselgel (Davison grade 62)

A.S.M. A/S. 15.000. 6.84 kolonne. Kolonnen ble eluert med 2 liter metylenklorid, 4 liter etylacetat/heksan (7:3), 2 liter etylacetat/metanol (95:5) og 2 liter etylacetat/metanol (9:1).

Fraksjoner på 20 ml hver ble oppsamlet og fraksjonsnummerne 490-512 ble slått sammen. Løsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk og resten (8 g) ble rekromatografert på en metylenkloridoppslemmingspakket 250 g kiselgelkolon-ne. Denne kolonnen ble eluert med 2 liter dietyleter, 2 liter dietyleter/etanol (20:0,5). Fraksjoner på 20 ml hver ble oppsamlet.

Trinn D: Fraksjonsnummerne 60-100 fra 250 g kilselgel-kolonnen som er beskrevet ovenfor under trinn C ble slått sammen og løsningsmiddelet^ fjernet under redusert trykk. Krystallisering fra acetonitril/vann, ga krystallinsk antibiotikum X-14934A-Na salt dihydrat. Smp. 156-158°C. Mikroanalyse beregnet for C^gH^g<O>^^Na. 2^0(955, 18): Beregnet: C 60,36, H 8,76, Na 2,41, H20 3,77. Funnet: C 60,62, 60,90; H 8,96, 9,11; Na 2,34, H20 4,52.

Eksempel 3

Fremstiling av X-14934A, rubidiumsalt

En løsning av 100 mg antibiotikum X-14934A-Na salt i metylenklorid ble først vasket med 1 N HC1, etterfulgt av vannvask og deretter fire timer med en vandig løsning RbOH. Løsningsmiddeltasen ble tørket ved filtrering gjen-nom celitt og ble konsentrert under redusert trykk og ble krystallisert fra acetonitril ved tilsetning av vann. Om-krystallisering ga krystaller som var egnet for røntgen-analyse. Beregnet for (C4gH7g015)2Rb( H^ O)2: C

60,25, H 8,53, Rb 4,47, H20 1,88. Funnet: C 59,73, H 8,41, Rb 4,63, H20 1,74.

Den antimikrobielle aktiviteten til antibiotikum X-14934A er vist i den følgende tabell: Organisme Minimum inhiberingskonsentrasjon

(MIC)<*> (MCG/ML) ;ATCC nr. ;;Som vist ovenfor har antibiotikum X-14934A og dets salter den egenskap at den virker forhindrende på veksten av visse grampositive bakterier. Det er anvendelig i vaske-løsninger for sanitærformål samt ved vask av hender og rensing av utstyr, gulver eller møblering i kontaminerte rom eller laboratorier. Det er også anvendelig for å undertrykke veksten av sensitive organismer i platemåling og andre mikrobiologiske medier. ;Antibiotikum X-14934A viser aktivitet mot Treponema hyo-dysenteriae, en kilde til svinedysenteri. Markert aktivitet ble påvist for antibiotikumet ved konsentrasjoner ned til 1 mcg/ml. ;Antibiotikum X-14934A viser aktivitet som coccidiostatisk middel. ;Denne anti-coccidiastatiske aktivitet demonstreres på laboratoriekyllinger som følger: ;Forsøksmetode: ;Dette forsøk anvender to kyllinger pr. drogegruppe. Ti kyllinger ble anvendt som en vektkontroll og ti kyllinger som en infisert kontroll. Drogen gis 48 timer forut for infeksjonen. Et gram av forsøksdrogen blandes i en mekan-isk mikser med en tilstrekkelig mengde kyllingfor til å gi den ønskede dose. Infeksjonen består av ca. 200 000 oocys-ter gitt oralt ved pipette. Prøvene varer elleve dager og de overlevende fugler obduseres og undersøkes for kraft-ige lesjoner i ceca. Forsøksfuglene bedømmes avhengig av antall overlevende og antallet av cecale lesjoner. Resul-tatene er uttrykt som den gjennomsnittlige infeksjonsgrad (A.D.I.). En gjennomsnittlig infeksjonsgrad på mindre enn 2,5 ansees som signifikant. Aktivitet mot E. Tenella ;Aktivitet mot blandet infeksjon<*>"

De coccidiostatiske blandinger i foreliggende oppfinnelse, hvilke som aktiv bestanddel inneholder krystallinsk antibiotikum X-14934A eller dets salter, eller det tørkede ufiltrerte fermentat fremstilles ved å blande den aktive bestanddel med en inert bestanddel. Den inerte bestanddel kan omfatte et forstoff, fyllmaterialer o.l. Med uttrykket "inert bestanddel" menes et materiale som ikke virker som et antiparasittmiddel, f.eks. et coccidiostat, er inaktivt i forhold til den aktive bestanddel og som sikkert kan fordøyes av dyr som behandles, og således er et slikt inert materiale et som er inaktivt for formålet med foreliggende oppfinnelse.

Når den aktive bestanddel gis oralt til coccidioseømfint-lige husfjærkre, spesielt kalkun og kyllinger, som forbe-standdel, kontrolleres sykdommen effektivt ved enten å forhindre den eller kurere den etter at den opptrer. Videre opprettholder det behandlede fjærkre enten sin vekt eller vinner faktisk vekt sammenlignet med kontrollene. Således kontrollerer blandingen ifølge oppfinnelsen ikke bare coccidiose, men hjelper også til å forbedre overfør-ingen av foret til vektøkning.

Den aktuelle konsentrasjon av den aktive bestanddel i dyrefor kan selvfølgelig justeres avhengig av de indivi-duelle behov og kan variere over et stort område. Det be-grensende konsentrasjonskriteriet er at minimumskonsentra-sjonen er slik at en tilstrekkelig mengde aktiv bestanddel tilveiebringes til å bevirke den ønskede kontroll av coccidiose og maksimumskonsentrasjonen er slik at mengden fordøyet blanding ikke fører til noen uønskede bivirknin-ger .

Således inneholder f.eks. en forforblanding eller komplett for tilstrekkelig aktiv bestanddel til å gi ca. 1 ppm til 20 ppm i vektdeler av det daglige forforbruk. Fortrinnsvis brukes ca. 10 ppm til 15 ppm i vektforhold. Generelt er ca. 1 ppm til ca. 15 ppm av den aktive bestanddel tilstrekkelig til å kontrollere og bekjempe coccidiose. Større mengder enn 20 ppm, selv om de er effektive mot coccidiose, viser generelt ikke forbedrede resultater overfor det foretrukne ppm området og kan i noen tilfeller påvirke veksten negativt, likeledes forutnyttelsesgrad og mortali tet.

Den optimale dose vil selvfølgelig variere med dyrets størrelse. Ved bruk av antibiotikum X-14934A ifølge oppfinnelsen for behandling eller forebyggelse av coccidiose, kan den først settes sammen med eller blandes med en for-bestanddel eller bærer til en f6radditiv fdrblanding, et forkonsentrat eller et f<5radditiv supplement. Et f6raddi-tiv, konsentrat eller forblanding er en vare som skal fortynnes for å gi et fullstendig for, dvs. en vare som er ment gitt som en eneste rasjon. Et f6radditivsupplement er en vare som er ment for forbruk av et dyr direkte eller som kan fortynnes videre og gi et fullstendig for eller kan fordøyes og brukes som supplement til andre rasjoner. Foradditiv tilsetninger, konsentrater og f6rblandinger inneholder en relativt stor andel coccidiostater, dvs. den aktive bestanddel, og fremstilles lett ved å sette den aktive bestanddel til en egnet bærer og blande på en måte som gir i det vesentlige jevn fordeling av coccidiostati-kumet i bæreren. Egnede bærere er faste stoffer som er inerte i forhold til den aktive bestanddel og som kan for-døyes sikkert av dyrene som skal behandles. Typisk for slike bærere er fjærkreftfr i handelen, malte korn, korn biprodukter, planteproteinkonsentrater, (soya, peanøtter, osv.) fermenteringsbiprodukter, salt, kalkstein, uorgan-iske forbindelser og lignende eller blandinger derav. Væskedispersjoner kan fremstilles ved å bruke vann eller vegetabilsk olje som fortrinnsvis inneholder en overflate-aktiv bestanddel, emulgeringsmiddel o.l. i væskedispersjon såsom etylendiamintetraeddiksyre, osv. og solubilisatorer. Alle egnede bærere eller strekkmateri aler kan virke som inert bestanddel i den faste form av antiparasittmiddelet forutsatt at det er inert overfor det aktive materialet og ikke toksisk med hensyn til dyret det skal gis til.

Den aktive bestanddel kan blandes til en grøt, pellet eller enhver annen ønsket form med den inerte bærer eller faste strekkmiddelmaterialer ved alle vanlige teknikker. F.eks. kan blandinger formuleres ved å finmale eller pul-verisere den aktive bestanddel og den inerte bestanddel ved bruk av alle i handelen tilgjengelige male eller pul-veriseringsanordninger med eller uten formateriale tilstede. Hvis formateri et ikke er tilstede når maling eller pulverisering utføres, kan det resulterende materialet fordeles i alle vanlige tilgjengelige formaterialer. Typiske f jaer kr ef or som kan gis med den aktive

bestanddel .;fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, kan inneholde flere bestanddeler, f.eks. kan de inneholde høyenergikornprodukter såsom mais, hvete, hveterødt hundemel, milo, havremel eller lignende; middels og lav-energikornprodukter såsom havre, bygg, hvetemel, kliblandinger, standard kliblandinger eller lignende, stabiliserte fett, vegetabilsk protein såsom soyabønnemel, maisgluten-mel, peanuttmel eller lignende; animalsk protein såsom fiskemel, oppløselige fiskeprodukter, kjøttavfall e.l.;

UGF (uidentifisert vekstfaktor) kilder og andre B-vitamin-bærere såsom tørkede melkeprodukter, tørket bryggerigjær, "distillers dried solubles", løselige fermenteringsproduk-ter eller lignende; tørket alfalfamel; og forskjellige spesielle additiver såsom ytterligere riboflavin, vitamin B^2» kalsiumpantotenat, niacin, cholin, vitamin K, vitamin E eller lignende, samt stabilisert vitamin A, vitamin D^ (D-akti-verte dyresteroler); kalsium og fosfortilsetninger såsom dikalsiumfosfat, dampbehandlet beinmel, defluorert fosfat, kalkstein e.l.; jodert salt, mangansulfat, sinkkarbonat,

et antibiotikumforsupplement; metionin eller den hydroksy-analoge derav, og et antioksydant.

Som det fremgår av det ovenstående er de coccidiostatiske blandinger ment for oralt inntak. De kan settes til den normale tilførselsanordning for dyr som skal behandles eller kan gis ved andre metoder såsom innføring av samme i en tablett, pille eller kapsel og trenge den inn i dyret. Administrering av den aktive bestanddel må foretas under

hensyn til det spesifikke dyr under husdyrpraksis.

Et egnet medikament tilsatt fjærkrefér ment som startfor for broilere fremstilles ved å blande 10-15 ppm vektdeler antibiotikum X-14934A i en grunnleggende fjærkrerasjon bestående av:

Bestanddeler:

Lignende for kan fremstilles som inneholder antibiotikum i andre konsentrasjoner som her angitt samt i form av tørket ufiltrert fermentat i en slik mengde at man får de samme konsentrasjoner av aktivt antibiotikum.

Antibiotikum X-14934A viser også aktivitet som forforbe-dringsmiddel hos drøvtyggere. Forbindelsen er aktiv, dvs. forskyver forholdet mellom flyktige fettsyrer og gir økede propionatnivåer, ved konsentrasjoner på ca. 50 ppm.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med

formelen

karakterisert ved at man dyrker en stamme av Streptomyces hygroscopius X-14934 NRRL 15518 i en vandig karbohydratløsning inneholdende en nitrogennærings-kilde under aerobe dypkulturbetingelser og deretter isolerer forbindelsen med formel I fra løsningen ved ekstraksjon og kolonnekromatografi og om ønsket overføres forbindelsen med formel I til et salt, fortrinnsvis et natriumsalt.