NO143906B - Forbindelser for abortfremkallende anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser for abortfremkallende anvendelse, i det følgende også angitt som å ha livmorutdrivende virkning, og hvilke forbindelser er oppnådd fra ekstrakter av zoapatelplanten.

Foreliggende forbindelser er kjennetegnet ved

den generelle formel:

hvor R er gruppen (i) eller gruppen (ii)

Zoapatelplanten er en busk ca. 2 meter høy som gror vilt i Mexico. Rent botanisk er det latinske navnet Montanoa tomentosa ifølge Cervantes, Kurvblomstfamilien, under-familie Heliantheae, og en annen art er Montanoa floribunda. Planten er mer detaljert beskrevet i Las Plantas Medicinales de Mexico, tredje utgave, Ediciones Botas (1944) .

Planten har i århundreder vært brukt i form av en

"te" eller andre vandige råpreparater, primært som et fødselsfremmende middel eller som et middel for å frembringe menstruasjon hos mennesker. Dens bruk er angitt i litte-raturen, men definitive kjemiske og farmakologiske under-søkelser har ikke vært utført.

Den vanlige bruken av zoapatelplanten er at man ty-pisk drikker en bitter "te" som er fremstilt fra plantens blader ved å koke disse i vann på samme måte som man frem-stiller en vanlig te. Kvinner tar denne drikk vanligvis etter å ha mistet en menstruasjonsperiode, og således sann-synligvis er gravid, skjønt det er kjent at mange kvinner' som allerede vet at de er gravide drikker teen for å av-slutte et uønsket svangerskap. "Teen" inneholder åpenbart en blanding av komplekse forbindelser hvorav mange er uønskede og unødvendige for å frembringe den ønskede effekt og noen kan ha skadelig virkning på brukeren. Naturlige planteforbindelser er kjent for vanligvis å ha meget kompleks sammensetning. Mange forbindelser med like kjemiske og fysikalske egenskaper så vel som forbindelser med sterkt forskjellige egenskaper, kan normalt finnes i planten og det er ofte vanskelig å separere og identifisere de enkelte forbindelser. Det er tidligere ikke kjent noen metode for å isolere de aktive forbindelser fra zoapatelplanten.

Nevnte "te" har bitter smak og er vanskelig å ad-ministrere fordi det er nødvendig med store volumer av blandingen. Ifølge kjente rapporter har bruken av planten resultert i alvorlige ulykker i form av intense og hyppige smerter uten at fødsel har blitt fremkalt. I tillegg til dette har den fremkalt tretthet, brennende tørste, puste-besvær og i alvorligere tilfeller døden. (Las Plantas Medicinales de Mexico, tredje utgave, Ediciones Botas, 1944) .

Det er klart ut fra den tidligere kjente teknikk

at forskjellige materialer har blitt oppnådd fra planten og benyttet ved forskjellige anledninger. De sammensetninger som tidligere har vært benyttet har således vari-ert med hensyn til deres fysikalske og fysiologiske egenskaper fordi de resultater som er oppnådd ved deres bruk ikke har vært reproduserbare. Siden de oppnådde resultater har ledet til motstridende konklusjoner, er det klart at flere forskjellige sammensetninger med varierende egenskaper tidligere har blitt isolert. Bruken av foreliggende forbindelser resulterer ikke i noen bivirkninger og de oppnådde resultater er reproduserbare. Det skulle dermed være klart at foreliggende forbindelser adskiller seg

fra de som har vært oppnådd ved hjelp av tidligere kjente metoder. Søkeren har isolert et materiale fra zoapatelplanten som ikke forårsaker noen bivirkninger ved administra-sjon og dette materiale har en renhet som er tilstrekkelig til å kunne brukes til preparering av kontrollerte doser.

Forut for foreliggende oppfinnelse har ingen greid

å isolere og identifisere den livmorutdrivende eller abortfremkallende faktor som antas å være tilstede i zoapatelplanten. Man har således gjort mer enn bare å rense en tidligere kjent sammensetning. På grunn av at de resultater som er oppnådd med de tidligere kjente sammensetninger er motstridende, er de resultater som oppnås gjennom foreliggende forbindelser ikke de samme som de som oppnås med de kjente sammensetninger fordi forbindelsenes resultater er reproduserbare. Det er således tilveiebrakt materialer som ikke har vært beskrevet i den tidligere teknikk og som ikke har noen av de uønskede egenskaper som kjennetegner nevnte kjente sammensetninger.

Det første ekstraktet av hvilket det rensede livmorutdrivende materialet oppnås, fremstiltes fra zoapatelplanten ved en serie ekstraksjons- og rensingstrinn. I en fremgangsmåte ble bladene først suspendert i vann, og blandingen holdt på 98-100°C i flere timer. Den varme blandingen ble filtrert, og den faste rest vasket med varmt vann. Blandingen ble filtrert på nytt og filtratene slått sammen. De samlede vandige ekstrakter ble ekstrahert flere ganger med et organisk oppløsningsmiddel.

Etter separasjon av det vandige og det ikke-vandige lag, ble det organiske oppløsningsmiddel fjernet på vanlig kjent måte. Egnede oppløsningsmidler for den organiske ekstraksjon er vann-ublandbare alifatiske estere slik som etylacetat og butylacetat; alifatiske hydrokarboner så som pentan, heksan og heptan; klorerte hydrokarboner så som kloroform, karbontetraklorid og metylenkloridf aromatiske hydrokarboner så som benzen og toluen; vann-ublandbare alifatiske alkoholer så som butanol, penta-

nol og heksanol. Det foretrukne oppløsningsmiddel er etylacetat. Den rest som oppnås etter fjerning av det

organiske oppløsningsmiddel blir så ekstrahert flere ganger med et varmt organisk oppløsningsmiddel, f.eks. benzen eller toluen. Oppløsningsmidlet blir igjen fjernet, og resten vasket flere ganger med et varmt organisk oppløs-ningsmiddel, fortrinnsvis ved koking under tilbakeløp i heksan. Som et ytterligere rensingstrinn kan den oppnådde rest oppløses i et egnet oppløsningsmiddel, f.eks. aceton og utrøres med et adsorpsjonsmiddel så som trekull. Den rest som oppnås ved filtrering og fjerning av oppløs-ningsmiddel, brukes som utgangsmateriale for fremstilling av de rensede livmorutdrivende materialer, som omfattes av foreliggende oppfinnelse.

Som et resultat av de ovenfor angitte ekstraksjo-

ner oppnås et ekstrakt med abortfremkallende virkning og med redusert- innhold av urenheter.

Med livmorutdrivende middel forstås et middel som

gjør at livmoren hos varmblodige dyr trekker seg sammen eller støter ut sitt innhold. Slike midler brukes van-

ligvis for å frembringe menstruasjon, for å utstøte eller resorbere et foster, for å indusere abort eller i situa-

sjoner hvor innholdet i livmoren skal drives ut, det være seg et foster eller selve livmorkaken.

Tilstedeværelsen av livmorutdrivende materialer i råekstraktet bestemmes ved å bruke de metoder som anven-

des for påvisning av livmorkontraksjoner og avbrudd av svangerskap i forskjellige typer hunndyr. I prøver som ble utført med råekstraktet, kunne man påvise livmorkontraksjoner når man anvendte 150-500 mg pr. kg kroppsvekt av ekstraktet. Avbrudd av svangerskap hos marsvin kunne man observere når råekstraktet ble tilført i doser på

300-500 mg/kg kroppsvekt.

De rensede forbindelser ifølge foreliggende oppfin-

nelse oppnås ved først å oppløse råekstraktet oppnådd ved ovenfor angitte metode i et vann-ublandbart organisk oppløsningsmiddel, hvoretter man filtrerer den resulte-

rende oppløsning og vasker filtratet med en vandig oppløs-

ning av en svak base, f.eks. natriumbikarbonat, kalium-bikarbonat, natriumkarbonat eller kaliumkarbonat for å

fjerne vannoppløselige og sure urenheter. Det er foretrukket å bruke en mettet oppløsning av basen. Egnede organiske oppløsningsmidler er lavere alifatiske etere så som dietyleter, di-n-propyleter, diisopropyleter, metyl n-butyleter, etyl n-butyleter, og dibutyleter; lavere alifatiske estere så som metylacetat, etylacetat, butylacetat, etylpropionat og andre langkjedede estere så som amylacetat, heksylacetat og lignende, klorerte hydrokarboner så som kloroform, karbontetraklorid og metylenklorid samt aromatiske hydrokarboner så som benzen, toluen, xylen.

De organiske oppløsningsmidler fjernes på vanlig kjent måte, fortrinnsvis i vakuum, og det semi-rene ekstrakt renses så ved kromatografi på et adsorberende materiale, f.eks. kiselsyre, silisiumdioksydgel eller flori-sil ved å bruke en blanding av polare og ikke-polare opp-løsningsmidler som elueringsmiddel. Det foretrukne adsorpsjonsmiddel er kiselsyre. Man kan enten bruke nøytral eller sur kiselsyre, det er foretrukket å bruke nøytral syre. Det materialet som skal kromatograferes blir fortrinnsvis først oppløst i et egnet oppløsningsmiddel og det foretrukne oppløsningsmiddel er kloroform, hvoretter oppløsningen tilsettes kolonnen av det adsorberende materiale som er pakket i et egnet oppløsningsmiddel, hvoretter kolonnen elueres med en blanding av et polart og et ikke-polart oppløsningsmiddel. 'Polare oppløsningsmidler som kan brukes innbefatter lavere alkylalkoholer så som etanol, metanol, propanol, isopropanol og butanol, lavere alkylestere så som etylacetat og butylacetat; alifatiske ketoner så som aceton, metyletylketon og metylisobutyl-keton. Ikke-polare oppløsningsmidler er klorerte hydrokarboner så som kloroform, metylenklorid og karbontetraklorid, samt alifatiske hydrokarbonoppløsningsmidler så som pentan, heksan og heptan, foruten aromatiske hydrokarboner slik som benzen og toluen. Den foretrukne opp-løsningsmiddelblanding er isopropanol-kloroform. Frak-sjonene oppsamles og fordampes til tørrhet ved temperatu-rer varierende fra romtemperatur til ca. 4 0°C. Sammensetningen på de oppsamlede fraksjoner undersøkes ved hjelp av tynnsjiktskromatografi eller gasskromatografi. Alter-nativt kan oppløsningen av råekstraktet kromatograferes direkte uten å fjerne oppløsningsmidlet. Oppløsningen kan konsentreres før det kromatografiske trinn for å lette håndteringen.

Som et resultat av ovennevnte rensing oppnår man

et livmorutdrivende materiale som inneholder minst tre hovedkomponenter i blanding, noe som kan påvises ved gass-kromatograf i . Tilstedeværelsen av livmorutdrivende materialer i blandingen bestemmes ved å bruke metoden som an-vendes for å påvise livmorkontraksjoner og avbrudd av svangerskap hos forskjellige typer husdyr. Avbrudd av svangerskap hos marsvin kunne observeres når man tilførte blandingen i doser på 75-100 mg/kg kroppsvekt. Livmorkon-traks joner kunne påvises når man brukte 2,5-5,0 mg/kg kroppsvekt av blandingen.

De fraksjoner som inneholder de livmorutdrivende materialer kombineres og kromatograferes gjennom en kolonne av en polymer gel sammensatt av organiske, polymere forbindelser som sveller i organiske oppløsningsmid-ler. Egnede polymere materialer som kan brukes er polyme-rer så som vinylacetat-sampolymer, kryssbundet dextran og polystyrengeler. Egnede oppløsningsmidler er benzen, toluen, tetrahydrofuran og cykloheksan. Det foretrukne polymere materialet er vinylacetat kopolymer. Kolonnen elueres med et organisk oppløsningsmiddel, fortrinnsvis det som resten er oppløst i. En rekke fraksjoner blir vanligvis oppsamlet, og disses sammensetning undersøkes ved hjelp av gasskromatografi eller tynnsjiktskromatografi.

Som et resultat av dette oppnår man minst to kjemisk di-stinkte abortfremkallende forbindelser, noe som kan påvises ved gasskromatografi og spektralanalyse. De livmorutdrivende egenskaper hos de isolerte forbindelser kan bestemmes ved å måle graden av livmorkontraksjon samt hvor-vidt svangerskapet blir avbrutt eller ikke hos forskjellige typer hunndyr. Hvis det er ønskelig, kan mindre urenheter fjernes fra de rensede forbindelser ved videre kromatografi på adsorpsjonsmidlet, f.eks. på kiselsyre eller fldri-sil. Kolonnen elueres med et organisk oppløsningsmiddel eller en blanding av oppløsningsmidler, kloroform-isopropanol er ofte den beste blandingen, og sammensetningene på fraksjonene følges ved hjelp av tynnsjiktskromatografi.

De rensede abortfremkallende forbindelser er effektive når de tilføres i doser varierende fra 1,0 mg til 100 mg/kg kroppsvekt. Den aktuelle dose vil være av-hengig av det dyr som skal behandles. Forbindelsene kan tilføres i kjente preparatformer, f.eks. så som oppløs-ninger, suspensjoner og faste doseringsformer.

De følgende eksempler illustrerer fremstilling av foreliggende forbindelser.

Fremstilling av utgangsmaterialet

10 kg zoapatelblader og 120 1 vann ble tilsatt en tank av rustfritt stål på 100 1 og hvor nevnte tank kunne oppvarmes ved hjelp av damp. Bladningen ble holdt på 98-100°C i 2,5 timer under periodevis omrøring. Den varme blandingen ble filtrert gjennom stoff og ga en klar og mørk te, ca. 100 1 i volum. Den faste rest i tanken ble vasket med 16 1 varmt vann, filtrert og filtratet ble kombinert med den ovennevnte te. De samlede vandige ekstrakter ble ekstrahert med 120 1 etylacetat. Blandingen ble kraftig omrørt og ble hensatt for sedimentasjon. Topp-laget av skum ble blåst av for å bryte emulsjonen, og for å få utskilt så mye etylacetat som mulig. Ytterligere 80 1 etylacetat ble tilsatt blandingen og ovennevnte fremgangsmåte gjentatt. De samlede etylacetatekstrakter ble fordampet ved 50°C under vakuum. Resten ble ekstrahert med tre porsjoner av varm benzen (10 liter totalt, temperatur 75-80°C). Benzenekstraktene ble fordampet ved 50°C under vakuum og resten vasket tre ganger med totalt 8 1 heksan under koking med tilbakeløp. Den heksanvaskede rest ble oppløst i 2 1 aceton, 10 g "Nuchar" ble tilsatt og blandingen ble omrørt i en time ved romtemperatur. Trekullet ble fjernet ved filtrering og filtratet fordampet ved destillasjon ved 30°C under vakuum og ga 69 g av et rå-ekstrakt.

Eksempel 1

Råekstraktet ble brukt som utgangsmateriale (50 g) og ble oppløst i 5 1 eter, og den resulterende oppløsning filtrert og vasket med en mettet natriumbikarbonatoppløs-ning (500 ml). Eteren ble tørket over vannfritt natrium-sulfat, filtrert og konsentrert til tørrhet, og ga .44,6 g av en lys gul olje. Denne olje ble oppløst i 400 ml kloroform og oppløsningen ble tilsatt en kolonne som målte 12,5 cm x 120 cm og som inneholdt 2,5 kg nøytral kiselsyre pakket i kloroform. Kolonnen ble eluert med. kloroform, kloroform-isopropanol-blandinger og tilsammen ble 110 fraksjoner oppsamlet. Fraksjonene ble fordampet til tørrhet i vakuum ved en temperatur under 4 0°C. Kolonnen ble eluert på følgende måte:

Sammensetningen av fraksjonene ble undersøkt ved tynnsjiktskromatografi (silisiumdioksydgel, isopropanol-kloroform (1:12,5) og gasskromatografi 3% "0V17" (metyl-silikon-fenylsilikon (1:1)) og ved å bruke et programmert forsøk (150-250°). Fraksjonene 78-84 ble kombinert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum og man fikk 5,1 g av en oljeaktig rest som inneholdt minst tre hovedkomponenter, noe som kunne påvises ved gasskromatografi.

3,2 g av nevnte rest ble så oppløst i 50 ml benzen og oppløsningen ble tilsatt til en kolonne (12,5 cm x 87 cm) pakket med 2 kg "OR-PVA Merck-O-Gel 2000" (en vinylacetat-sampolymer som sveller i organiske oppløsnings-midler) fremstilt i benzen. Kolonnen ble eluert med benzen og man samlet opp totalt 47 fraksjoner. Tynnsjiktskromatografi og gasskromatografi ble brukt for å undersøke sammensetningen på fraksjonene.

Fraksjonene 23-33 inneholdt 1,73 g (54%) av det påsatte materialet. A) Fraksjonene 24-25 ble fordampet og ga en forbindelse som en"olje og med en vekt på 0,251 g, og denne oljen hadde følgende spektralkarakteristika:

I.R. (ren) 2,90 y, 5,96y og 6,21 y

N.M.R. 52s"<L>3 6,115,48, 4, 25, 4,13, 3,56, 2,11

2,08, 1,48, 1,13 og 1,01 ppm. hvilket gjelder når gruppen R i foreliggende forbindelse har betydningen (ii) ovenfor. B) Fraksjon 31 ble fordampet og ga en forbindelse som en olje som veide 0,326 g og som hadde føl-gende spektralkarakteristika:

I.R. (ren) 2,91 y og 5,88 y

N.M.R. tmS<1>"3 3'41' 4'26' 4,15, 3,58, 3,18, 2,18,

1,76, 1,67, 1,15 og 1,04 ppm hvilket gjelder når gruppen R har betydningen (i) ovenfor.

Følgende generelle fremgangsmåte ble brukt for å påvise livmorkontraksjoner hos forskjellige typer hunndyr.

Fremgangsmåte I

Voksne hunnkaninger fra New Zealand ble bedøvet med natriumpentobarbital og ovarieektomisert. Etter en rekon-valesentperiode på en uke, ble kaninene behandlet med 5 yg daglig subkutant med 178-estradiol i 6 påfølgende dager fulgt av 1,0 mg/døgn subkutant med progesteron i 7 påføl-gende døgn. Livmoren og egglederne hos kaninene ble gjen-nomdynket 7 2 timer etter siste dose av progesteron ved hjelp av remgangsmåten til Heilman et al, (Fertil. Steril. 23: 221-229) med små modifikasjoner. Egglederen og livmoren ble behandlet med en mengde på 53 ul/min. Livmoren ble behandlet med et rør som gikk 1,0 cm inn i livmorens hulrom fra eggledersiden. Livmoren ble så ombundet ved ut-løpet. Et annet rør ble satt 1,0 cm inn i livmoren gjennom et lite snitt i vagina for å oppsamle perfusat. Det materiale som skulle undersøkes ble tilført i.v. gjennom halsvenen i et middel som inneholdt polyetylenglykol 200, polyetylenglykol 4 00, etanol og en fosfatbuffer. Røret ble forbundet til en P23-Dc Stathan-transducer som igjen var koplet til en Grass Modell 5-polygraf og sammentrek-ningen av livmoren ble målt.

Intravenøs tilførsel av forbindelsen oppnådd fra fraksjon 31 er meget effektiv for å indusere livmorkontraksjoner og for å avslappe egglederen i 72-timers progesteron-tilbakesatte kaniner i doser varierende fra 1,0-4,0 mg/kg kroppsvekt. Forbindelsen fra fraksjonene 24-25

er effektive når den blir tilført i en dose på 25-40 mg/kg kroppsvekt.

Følgende generelle fremgangsmåte ble brukt for å påvise avbrudd av svangerskap etter at befruktning har skjedd.

Fremgangsmåte II

Voksne hunnmarsvin av Hartley-rasen ble kontinuer-lig parret monogamt med hanner til man fant en vaginal plugg (kopulasjonsplugg) i buret. Man anså dette tidspunkt for å være første døgn av svangerskapet. Grupper på 5-6 hunner ble gitt prøvematerialene intraperitonealt i en væske som er beskrevet i fremgangsmåte I på det 22. døgn av svangerskapet. Marsvinene ble obdusert mellom 25. og 45. døgn av svangerskapet og undersøkt for tegn til re-sorpsjon eller abort.

Intraperitoneal tilførsel av materialet fra fraksjon 31 var effektivt med hensyn til avbrudd av svangerskap når materialet ble tilført i en dose på 25-85 mg/kg kroppsvekt.

Claims (1)

1. Forbindelse for abortfremkallende anvendelse, karakterisert ved den generelle formel:

   hvor R er gruppen eller gruppen