PL100003B1 - Sposob oczyszczania ekstraktow zawierajacych substancje dzialajaca oczyszczajaco na macice - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania ekstraktów, zawierajacych substancje, dzialajaca oczysz¬ czajaco na macice, otrzymanych z rosliny zoapatle, z których otrzymuje sie czyste zwiazki o wysokiej aktywno¬ sci.Roslina zoapatle jest krzewem wysokosci okolo 2 m dziko rosnacym w Meksyku. Biologiczna jej nazwa wedlug Cervantes'a, brzmi Montanoa tomentosa, rodzina Compositae, rzad Heliantheae. Inna odmiana tej rosliny nosi nazwe Montanoa floribunda. Roslina ta zostala szczególowo opisana w trzecim wydaniu „Los Plantas Medicinales de Mexico" — Ediciones Botas (1944). Roslina ta jest w uzyciu od wieków, stosuje sie ja w postaci „herbatki" lub innych surowych wodnych preparatów, przede wszystkim jako srodek inicjujacy poród lub menstruacje u kobiet. Takie zastosowanie jest opisane w literaturze, jednakze dotychczas nie przeprowadzono pelnych badan chemicznych ani farmakologicznych. Dotychczasowe nieliczne badania typu podstawowego pro¬ wadzily do sprzecznych rezultatów.Obecnie, w ludowym zastosowaniu, uzywa sie doustnie naparu z rosliny zoapatle, który ma smak gorzkiej „herbatki". Napar przyrzadza sie przez wygotowanie lisci tej rosliny w wodzie. Zazwyczaj kobieta wypija ten srodek w sytuacji, gdy opóznia sie wystapienie miesiaczki, a wiec gdy przypuszczalnie jest w ciazy, jednakze wiadome jest, ze wiele rzeczywiscie ciezarnych kobiet stosuje ten napój w celu przerwania niepozadanej ciazy.Jest oczywiste, ze „herbatka" zawiera mieszanine zlozonych zwiazków chemicznych, sposród których nie wszystkie sa pozadane i konieczne w celu osiagniecia zamierzonego skutku. Substancje naturalne roslinnego pochodzenia maja na ogól niezwykle skomplikowany zlozony sklad. Rozdzielenie i identyfikacja skladników tych substancji sa zazwyczaj niezwykle trudne, glównie ze wzgledu na duze podobienstwo ich wlasciwosci chemicznych i fizycznych, choc podobne trudnosci wystepuja równiez w przypadku zwiazków o calkowicie odmiennychwlasciwosciach. y ¦ Wyodrebnianie substancji aktywnych z rosliny zoapatle nie bylo dotychczas znane.Sposób wedlug wynalazku pozwala na wyodrebnienie z ekstraktów rosliny zoapatle czystych zwiazków aktywnych, stanowiacych srodki, dzialajace oczyszczajaco na macice, o wysokiej aktywnosci.2 100003 Sposobem wedlug wynalazku oczyszcza sie ekstrakty, otrzymane z rosliny zoapatle przez poddanie czesci' rosliny, zawierajacych substancje czynne, obróbce woda w podwyzszonej temperaturze^ oddzielenie fazy wodnej, zawierajacej co najmniej czesc tych substancji, od fazy stalej, a nastepnie poddanie fazy wodnej obróbce orga¬ nicznym rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda, lub ekstrakty otrzymane przez poddanie czesci rosliny, zawierajacych substancje czynne, obróbce rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszajacym sie z woda, oddzielenie fazy organicznej, zawierajacej co najmniej czesc substancji dzialajacych oczyszczajace na macice, od fazy stalej, a nastepnie poddanie fazy organicznej obróbce woda.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze otrzymany ekstrakt rozpuszcza sie w nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku organicznym, przemywa otrzymany roztwór wodnym roztworem slabej zasady, oddziela faze organiczna od fazy wodnej, chromatografuje roztwór na kolumnie, wypelnionej adsorbentem, eluuje $je kolumne mieszanina polarnego i niepolarnego rozpuszczalnika, laczy sie frakcje, zawierajace substancje dzialaja¬ ce oczyszczajaco na macice i usuwa z nich rozpuszczalnik, a pozostalosc rozpuszcza sie w nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku organicznym, po czym chromatografuje sie roztwór na kolumnie, wypelnionej organicz¬ nym zelem polimerycznym, eluuje sie kolumne niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym i zbiera frakcje, zawierajace substancje dzialajace oczyszczajaco na macice.W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie ekstrakcje woda, przy czym zawsze po tej obróbce lub przed nia prowadzi sie ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym. Przykladowo, korzystny sposób obejmuje nastepujaca obróbke partii materialu roslinnego, korzystnie lisci, zawierajacych substancje, dzialajace oczyszczajaco na maci¬ ce: a) ekstrahowanie Msci rosliny woda i nastepnie ekstrahowanie rozpuszczalnikiem organicznym wodnego ekstraktu, b) ekstrahowanie lisci rosliny rozpuszczalnikiem organicznym, a nastepnie ekstrahowanie woda ekstraktu organicznego.Okreslenie substancja, dzzialajaca oczyszczajaco na macice, oznacza srodek powodujacy, ze macica zwie- v rzat cieplokrwistych ulega skurczom lub wydala swa zawartosc. Srodki takie stosowane sa zazwyczaj w celu wywolania menstruacji, usuniecia zasniadu graniastego, wydalenia lub resorbowania plodu, przerwania ciazy lub zapoczatkowania opóznionego porodu, badz tez w sytuacjach, gdy zawartosc macicy, plód lub lozysko, powin¬ no byc usuniete.Ekstrakcje substancji czynnej korzystnie prowadzi sie metoda przedstawiona w punkcie a). Korzystnymi typowymi rozpuszczalnikami w tym sposobie sa nie mieszajace sie z woda alifatyczne estry o krótkich lancu¬ chach weglowych, takie jak octan metylu, octan etylu, octan butylu i inne estry alifatyczne o dluzszych lancu¬ chach weglowych, weglowodory alifatyczne takie jak pentan, heksan i heptan, chlorowane weglowodory, takie jak chloroform, czterochlorek wegla, chlorek metylenu, weglowodory aromatyczne, takie jak. benzen, toluen, ksylen i tym podobne, wyzsze alkohole alifatyczne nie mieszajace sie z woda, takie jak butanol i pentanol.Istotna czescia procesu jest ekstrakcja woda. Nalezy przy tym zwrócic uwage, ze dobre rezultaty uzyskuje sie stosujac w tym etapie mieszaniny wody i mieszajacych sie z woda rozpuszczalników organicznych. Takwiec wodne froztwory etanolu lub metanolu moga byc z powodzeniem stosowane w etapie ekstrakcji woda, po lub przed którym nastepuje ekstrakcja organiczna. Ponadto wprowadzac mozna szereg etapów posrednich i rózno¬ rodnych technik, a korzystne skutki wprowadzenia tych innowacji zostana wykazane ponizej w szczególowym opisie wynalazku.Odpowiednia ilosc, rzedu okolo 3,5 kg lisci rosliny zoapatle, suszonych badz swiezych, wyselekcjonowa¬ nych i umytych zimna woda, ewentualnie rozdrobnionych na male czastki, poddaje sie ekstrakcji woda, korzys¬ tnie goraca i rozpuszczalnikiem organicznym, jak to okreslono w sposób ogólny powyzej. Korzystnie jest prowa¬ dzic ekstrakcje wodna w temperaturze 25—100°C, przy czym korzystne jest utrzymanie mieszaniny wstanie wrzenia przez okolo 10 minut lub dluzej. Wydluzenie czasu ekstrakcji powyzej 2 godzin jest zazwyczaj zbedne i nieekonomiczne. Nastepnie warstwe wodna, która stanowi ciemno zabarwiony roztwór, oddziela sie od stalych pozostalosci roslinnych. Tak otrzymany roztwór wodny mozna bezposrednio poddac ekstrakcji rozpuszczalni-* kiem organicznym. W praktyce korzystne jest stosowanie równych objetosci odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego i roztworu wodnego w etapie ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym, który prowadzi sie dogod¬ nie w zakresie temperatur od nieco wyzszej od temperatury pokojowej do temperatury wrzenia danego rozpusz¬ czalnika organicznego. Korzystnie ekstrakcje prowadzi sie w temperaturze wrzenia stosowanego rozpuszczalnika organicznego.Ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym prowadzi sie az do otrzymania pozadanej ilosci substancji, zazwyczaj 1—2 godziny.Ekstrakty organiczne laczy sie i odparowuje do sucha, korzystnie pod obnizonym cisnieniem, w temperatu¬ rze korzystnie w zakresie 30—80°C.100003 3 Jak przedstawiono wyzej, ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym moze poprzedzac ekstrakcje wode.W takim przypadku podane wyzej warunki prowadzenia poszczególnych etapów postepowania pozostaja niezmie¬ nione zarówno w przypadku ekstrahowania lisci, jak i ekstrahowania wyciagu z lisci. Ponadto produkt, otrzyma¬ ny w wyniku podwójnej ekstrakcji, moze byc dalej traktowany odpowiednim rozpuszczalnikiem w celu podwyz¬ szenia jakosci wytwarzanego materialu. Aspekt ten omówiono w przykladach, zwlaszcza w przykladzie I.W wyniku wyzej przedstawionego postepowania otrzymuje sie ekstrakt, dzialajacy oczyszczajaco na maci¬ ce,o znacznie obnizonej w stosunku do materialu wyjsciowego zawartosci zanieczyszczen.Obecnosc substancji, dzialajacej oczyszczajaco na macice, w surowym ekstrakcie stwierdza sie dzieki zasto¬ sowaniu metod, wykorzystywanych w celu wykrywania skurczów macicy lub przerywania ciazy u zwierzat plci zenskiej. W badaniach prowadzonych na surowym ekstrakcie, skurcze macicy wykrywa sie przy podaniu dawek 150—500 mg ekstraktu/kg wagi zwierzecia. Przerwanie ciazy u swinek morskich obserwuje sie po podaniu dawek 300-500 mg surowego ekstraktu/kg wagi zwierzecia.Produkt otrzymany w powyzszy sposób, posiada uzyteczna aktywnosc biologiczna, lecz obok skladników aktywnych zawiera pewne niepozadane substancje.Otrzymany ekstrakt stosuje sie jako surowiec wyjsciowy do otrzymywania czystych zwiazków aktywnych.Oczyszczona substancje, dzialajaca oczyszczajaco na macice, otrzymuje sie nastepujaco. Ekstrakt wyjscio¬ wy, z którego wyodrebnia sie substancje aktywna, otrzymuje sie z rosliny zoapatle w wyniku szeregu ekstrakcji i wieloetapowego oczyszczania. Wjednym ze sposobów, liscie rosliny rozdrabnia sie i rozprasza w wodzie naste¬ pnie mieszanine ogrzewa sie w temperaturze okolo 98—100°C przez kilka godzin. Goraca mieszanine saczy sie i dodatkowo stala pozostalosc przemywa goraca woda, a nastepnie przesacze laczy sie. Polaczone wodne wycia¬ gi ekstrahuje sie kilkakrotnie rozpuszczalnikiem organicznym. Po rozdzieleniu warstw, wodnej i organicznej, warstwe organiczna usuwa sie w znany sposób. Odpowiednimi do ekstrakcji organicznej rozpuszczalnikami sa nie mieszajace sie z woda estry alifatyczne, takie jak octan etylu, octan butylu, weglowodory alifatyczne, takie jak pentan, heksan i heptan, chlorowane weglowodory, takie jak chloroform, czterochlorek wegla, chlorek metylenu, weglowodory aromatyczne, takie jak benzen i toluen oraz nie mieszajace sie z woda alkohole alifatyczne, takie jak butanol, pentanol, heksanol i tym podobne. Korzystnym rozpuszczalnikiem jest octan etylu. Pozostalosc po usunieciu rozpuszczalnika organicznego jest ekstrahowana kilkakrotnie goracym rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak benzen lub toluen. Rozpuszczalnik usuwa sie ponownie, a pozostalosc przemywa kilkakrotnie goracym rozpuszczalnikiem, korzystnie heksanem w stanie wrzenia. Dodatkowy etap oczyszczania polega na tym, ze tak otrzymany material rozpuszcza sie w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak np. aceton i miesza sie z substan¬ cja absorbujaca, np. weglem aktywowanym. Pozostalosc, otrzymana w wyniku przesaczenia i odparowania roz¬ puszczalnika, stosuje sie jako material wyjsciowy, z którego wyodrebnia sie zwiazki czynne, dzialajace oczysz¬ czajace na macice.Oczyszczone zwiazki aktywne otrzymuje sie przez rozpuszczenie surowego ekstraktu w rozpuszczalniku organicznym, nie mieszajacym sie z woda, przesaczeniu otrzymanego roztworu, przemyciu przesaczu wodnego roztworem lagodnej zasady, takiej jak np. kwasny weglan sodu, kwasny weglan potasu, weglan sodu lub weglan potasu, w celu usuniecia zwiazków rozpuszczalnych w wodzie oraz zanieczyszczen o charakterze kwasnym. Ko¬ rzystne* jest stosowanie nasyconego roztworu zasady. Odpowiednimi rozpuszczalnikami organicznymi sa nizsze etery alifatyczne, takie jak eter dwuetylowy, eter dwu-n-propylowy, eter dwuizopropylowy, eter metylo-n-buty- lowy, eter etylo-n-butylowy i eter dwubutylowy, nizsze estry alifatyczne, takie jak octan metylu, octan etylu, octan butylu, propionian etylu i inne estry o dlugich lancuchach weglowych, takie jak octan amylu, octan heksylu i tym podobne, chlorowane weglowodory, takie jak chloroform, czterochlorek wegla, chlorek metylenu, weglowodory aromatyczne, takie jak benzen, toluen, ksylen i tym podobne.Rozpuszczalnik organiczny usuwa sie nastepnie w znany sposób, korzystnie pod obnizonym cisnieniem.Tak otrzymany wstepnie oczyszczony ekstrakt jest dalej oczyszczany metoda chromatografii na adsorbencie, takim jak np. kwas krzemowy, silikazel lub florisil, przy czym jako eluent stosuje sie mieszanine rozpuszczalni¬ ków polarnych i niepolarnych. Korzystnym adsorbentem jest kwas krzemowy. Mozna stosowac zarówno oboje¬ tna, jak i kwasna postac kwasu krzemowego, lecz korzystnie stosuje sie postac obojetna. Material, który ma byc poddany rozdzieleniu chromatograficznemu, korzystnie najpierw rozpuszcza sie w odpowiednim rozpuszczalni¬ ku, korzystnie w chloroformie, a nastepnie wprowadza na kolumne, wypelniona substancja adsorbujaca, w odpo¬ wiednim rozpuszczalniku, po czym kolumne eluuje sie mieszanina rozpuszczalników polarnych i niepolarnych.Mozna stosowac takie rozpuszczalniki polarne, jak nizsze alkohole alifatyczne, np. etanol, metanol, propanol, izopropanol, butanol i tym podobne, nizsze estry alkilowe, takie jak octan etylu, octan butylu i tym podobne, ketony alifatyczne, takie jak octan, keton metylowoetylowy, keton metylowo-izobutylowy i tym podobne.Stosowane rozpuszczalniki niepolarne obejmuja chlorowane weglowodory, takie jak chloroform, chlorek metyle-4 100003 nu, czterochlorek wegla, weglowodory alifatyczne, takie jak pentan, heksan, heptan i tym podobne, weglowodo¬ ry aromatyczne, takie jak benzen, toluen i tym podobne. Korzystnie stosuje sie mieszanine izopropanolu i chlo¬ roformu. Zbierane frakcje odparowuje sie do sucha, stosujac temperatury w zakresie od temperatury pokojowej do okolo 40°C. Mieszanine zebranych frakcji analizuje sie metoda chromatografii cienkowarstwowej lub chroma¬ tografii gazowej. Roztwór surowego ekstraktu moze byc równiez chromatografowany bezposrednio bez usuwania rozpuszczalnika. Mozna równiez roztwór zatezyc przed poddaniem go chromatografowaniu, w celu ulatwienia prowadzenia wszelkich operacji.W wyniku stosowania tej metody oczyszczania otrzymuje sie substancje, dzialajaca oczyszczajaco na maci¬ ce, która jest mieszanina co najmniej trzech glównych skladników, co wykazuje analiza chromatograficzna.Obecnosc substancji aktywnejv, w mieszaninie jest stwierdzana za pomoca prób biologicznych, pozwalajacych na obserwowanie skurczów macicy lub przerwania ciazy u zwierzat rodzaju zenskiego pod wplywem dzialania tej substancji. Przerwanie ciazy u swinek morskich nastepuje po podaniu mieszaniny badanej w ilosci 75-100 mg/kg wagi swinki. Skurcze macicy wystepuja pod wplywem dzialania badanej mieszaniny w ilosci 2,5—5,0 mg/kg wagi. Frakcje zawierajace substancje aktywna, laczy sie i chromatografuje na kolumnie z polimerycznym zelem, którym jest organiczny material polimeryczny, ulegajacy pecznieniu w rozpuszczalniku organicznym. Odpowie¬ dnim materialem polimerycznym sa takie polimery, jak kopolimery octanu winylu, usieciowany dekstran i zele polistyrenowe. Odpowiednimi rozpuszczalnikami sa takie rozpuszczalniki, jak benzen, toluen, ezterowodorofu- ran, cykloheksan i tym podobne. Korzystnie stosuje sie kopolimery octanu winylu. Kolumne eluuje sie rozpusz¬ czalnikiem organicznym, korzystnie tym samym, w którym rozpuszcza sie oczyszczona substancje. Zazwyczaj zbiera sie szereg frakcji, których sklad ustala sie za pomoca chromatografii gazowej lub cienkowarstwowej.W wyzej opisanym procesie otrzymuje sie co najmniej dwa odrebne pod wzgledem chemicznym zwiazki, dzialajace oczyszczajaco na macice, co potwierdza analiza spektralna i chromatografia gazowa. Ich dzialanie okresla sie przez pomiar intensywnosci wystepowania skurczów macicy oraz stopien skutecznosci przerywania ciazy u zwierzat. Jesli jest to pozadane, drobne zanieczyszczenia moga byc usuniete z oczyszczanych zwiazków na drodze dalszej chromatografii na adsorbentach, takich jak np. kwas krzemowy lub florisil. Kolumne eluuje sie rozpuszczalnikiem organicznym lub mieszanina rozpuszczalników, zazwyczaj mieszanina chloroform-izopropanol, przy czym sklad zbieranych frakcji ustala sie metoda chromatografii cienkowarstwowej.Oczyszczone zwiazki dzialajace oczyszczajaco na macice sa skuteczne, jesli podaje sie je w ilosciach 1,0—100 mg/kg wagi zwierzecia. Dawkowanie uzaleznione jest od indywidualnych cech zwierzecia, któremu srodek jest podawany. Zwiazki podaje sie w postaci preparatów, przygotowanych zgodnie z ogólnie przyjetym w farmakologii sposobem. Korzystnymi postaciami tych preparatów sa roztwory, zawiesiny i preparaty stale.Próby, pozwalajace na stwierdzenie wystepowania skurczów macicy u zwierzat rodzaju zenskiego, przepro¬ wadza sie nastepujaco.Dojrzale króliki nowozelandzkie plci zenskiej usypia sie pentobarbitalem sodu i poddaje operacji usuniecia jajników. Po okresie 1 tygodniowej rekonwalescencji przez kolejnych 6 dni królikom podaje sie podskórnie /ug/4?ien 170-estradiolu, a przez dalszych 7 dni równiez podskórnie 1,0 mg/dzien progesteronu. W 72 godziny po podaniu ostatniej porcji progesteronu, jajowody i macice królików splukuje sie zmodyfikowana w pewnym stopniu metoda Heilman*a i innych (Fertil Steril. 23 i 221—229). Splukiwanie macicy i jajowodów prowadzi sie z szybkoscia 53 ml/min. Macice splukuje sie poprzez rurke, wnikajaca w nia na glebokosc 1,0 cm od strony jajowodów. Macica byla podwiazana w punkcie polaczenia z jajowodem. Inna rurke wpiowadza do macicy na glebokosc 1,0 cm poprzez niewielkie naciecie w pochwie, w celu odbierania plynu splukujacego. Badana sub¬ stancje wprowadza sie dozylnie poprzez zyle szyjna w nosniku, zawierajacym glikol etylenowy 200, glikol polietylenowy 400, etanol i bufor fosforanowy. Rurka dblaczona jest do transformatora P23-De Stathan, który z kolei polaczony jest z poligrafem Graso Model 5. W ten sposób dokonuje sie pomiarów stopnia skurczenia macicy.Podawanie dozylne zwiazku wyodrebnionego z frakcji 31 w przykladzie XI, jest skuteczne pod wzgledem wywolywania skurczów macicy i relaksowania jajowodów u królików, którym 72 godziny przed badaniem usu¬ nieto progesteron, przy czym skuteczne dawki wynosza 1,0-4,0 mg/kg wagi. Zwiazek otrzymywany z frakcji 24—25 w przykladzie XI, jest skuteczny w dawkach 25-40 mg/kg wagi.Próby na przerywanie ciazy prowadzi sie nastepujaco. Dojrzale swinki morskie z gatunku Hartle'a trzyma sie w klatkach parami (dwuplciowymi) tak dlugo, az zaobserwuje sie slady spólkowania. Moment ten uwaza sie za pierwszy dzien ciazy. Badana substancje podaje sie grupom 5—6 swinek plci zenskiej dootrzewnowo w nosni¬ ku, opisanym w poprzednim doswiadczeniu, w 22 dniu ciazy. Zwierzeta usmierca sie w okresie miedzy 25 a 45 dniem ciazy i bada skutecznosc srodka na resorpcje lub przerwanie ciazy.Zwiazek wyodrebniony z frakcji 31 jest przy podaniu dootrzewnowym skutecznym srodkiem przerywaja¬ cym ciaze przy dawce 25—85 mg/kg.100003 5 Przyklad I. 2 kg suchych lisci ogrzewa sie do wrzenia w chloroformie w ciagu 1 godziny. Po przesa- czeniu ekstrakt chloroformowy odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35-50°C i otrzymuje 196 g ciemnej pólstalej masy, która nastepnie ekstrahuje sie goracym roztworem etanolu i wody, uzytych w proporcji 1:2. Otrzymany roztwór ponownie ekstrahuje sie chloroformem, warstwe chloroformowa oddziela sie i odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac syrop o barwie zólto-brazowej.Syrop ten rozpuszcza sie w eterze i roztwór przemywa nasyconym, wodnym roztworem kwasnego weglanu wodu, 5% roztworem wodorotlenku sodu, woda i suszy nad bezwodnym siarczanem sodu. Po odparowaniu eteru otrzymuje sie surowy ekstrakt w postaci zóltego oleju w ilosci 11,9 g.Przyklad II. 634 g suchych lisci ogrzewa sie do wrzenia z 4 litrami wody, w ciagu jednej godziny.Ekstrakt oddziela sie przez dekantacje i ekstrahuje nastepnie chloroformem. Warstwe chloroformowa suszy sie i filtruje, a rozpuszczalnik odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 4,55 g pólstalej masy. Warstwe wodna ekstrahuje sie dalej octanem etylu i otrzymana warstwe organiczna suszy nad bezwodnym siarczanem sodu, filtruje oraz odparowuje z niej rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 1,99 g substancji.Produkty obu tych operacji, otrzymane z ekstraktu chloroformowego i ekstraktu octanu etylu, stanowia konco¬ wy surowy ekstrakt.Przyklad III. 140 g suchych lisci rosliny zoapatle i 2,5 litra wody ogrzewa sie do wrzenia w ciagu 1 godziny pod chlodnica zwrotna. Wodny ekstrakt zateza sie nastepnie do objetosci 250 ml i ekstrahuje cztero¬ krotnie za pomoca 750 ml octanu etylu. Ekstrakty laczy sie i suszy nad bezwodnym siarczanem sodu. Nastepnie usuwa sie rozpuszczalnik pod próznia i otrzymuje 1,3 g ciemno zabarwionej substancji, która ekstrahuje sie 100 ml chloroformu, calosc filtruje sie i odpedza chloroform pod próznia. W wyniku tych operacji otrzymuje sie 0,840 g surowej substancji.Przyklad IV. 966 g surowych lisci rosliny zoapatle ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w ciagu trzech godzin z taka iloscia heksanu, aby cala ilosc lisci byla nim przykryta. Po przefiltrowaniu oraz odpedzeniu rozpuszczalnika do suchej pozostalosci otrzymuje sie 56,8 g surowego ekstraktu o barwie ciemnozielonej.Przyklad V. 350 g suchych lisci rosliny zoapatle miesza sie z heksanem i ogrzewa do rozpoczecia wrzenia od 15 do 20 minut. Warstwe heksanowa oddziela sie przez dekantacje, odfiltrowuje i miesza z taka sama iloscia wody (okolo 700 ml). Warstwy rozdziela sie i roztwór heksanowy ponownie miesza z taka sama iloscia wody. Po rozdzieleniu warstw powtarza sie raz jeszcze powyzsze operacje. Ekstrakty wodne laczy sie poddaje trzykrotnej ekstrakcji równoobjetosciowa iloscia octanu etylu. Otrzymane roztwory laczy sie i odparowuje do sucha, otrzymujac 6,6 g surowego ekstraktu w postaci ciemnego, brazowo-zóltego syropu.Przyklad VI. 1 kg suchych lisci rosliny zoapatle ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna z 15 litrami wody przez 3 godziny (w temperaturze 92°C) pod cisnieniem 585 mm Hg. Warstwe wodna dekantuje sie i przesa¬ cza przez gaze, a do roztworu dodaje okolo 700 g wegla aktywowanego i pozostawia tak dlugo, az nastapi flokulacja. Mieszanine miesza sie przez 2 godziny, a nastepnie przesacza pod próznia, uzyskujac klarowny roz¬ twór. Odsaczona czesc stala mieszaniny suszy sie w temperaturze pokojowej przez 3 dni, a nastepnie rozprasza w 3 litrach benzenu. Benzen oddestylowuje sie, usuwajac równoczesnie okolo 200 ml wody i wyodrebnia sie 3 g surowego ekstraktu w postaci oleju.Przyklad VII. 2 kg swiezych lisci rosliny zoapatle zalewa sie woda w ilosci 10—12 litrów i gotuje przez godzine. Mieszanine przesacza sie przez gaze na goraco i ochladza* Wyciag wodny nastepnie dwukrotnie ekstrahuje sie dwiema objetosciami octanu etylu, po czym rozpuszczalnik odpedza pod próznia w temperaturze 50°C, otrzymujac 12 g ciemnej, zielonej substancji. Mase te miesza sie z 500 ml benzenu i ogrzewa do wrzenia przez 15 minut. Warstwe benzenowa dekantuje sie i pozostalosc przemywa benzenem az do calkowitego wydzie¬ lenia substancji. Benzenowe ekstrakty laczy sie i odparowuje do sucha w temperaturze 50°C pod próznia. Uzys¬ kana brazowa mase ekstrahuje sie nastepnie kolejnymi porcjami heksanu tak dlugo, az po kolejnej ekstrakcji otrzymuje sie bezbarwny rozpuszczalnik. Pozostalosc, okolo 8 g ma konsystencje gestego syropu. Material ten rozpuszcza sie w acetonie (100 ml lub mniej) i dodaje do roztworu 5 g wegla aktywowanego (Darco). Mieszanine miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu godziny, az nastapi sklaczkowanie zawiesiny. Mieszanine przesacza sie nastepnie i przesacz odparowuje do sucha pod próznia lagodnie ogrzewajac (temperatura 30°C), otrzymujac 4—6 g surowego ekstraktu.Przyklad VIII. Surowy ekstrakt, otrzymany w sposób przedstawiony w przykladzie VII, (4,33 g) roz¬ puszcza sie w 500 ml eteru i otrzymany roztwór przesacza i przemywa nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu (50 ml). Roztwór eterowy osusza sie na bezwodnym siarczanem sodu, przesacza i odparowuje do sucha, otrzymujac 3,4 g jasnozóltego oleju, który nastepnie rozpuszcza sie w benzenie (50 ml ) i otrzymany roztwór wprowadza sie do kolumny o wymiarach 2 m x 10 cm, wypelnionej 2 kg OR-PVA Merck-O-Gel 2000 (nazwa handlowa produktu firmy E.M.Merck Inc. — kopolimer octanu winylu, ulegajacy specznieniu w rozpuszczalni¬ kach organicznych). Kolumne eluuje sie benzenem i zbiera nastepujace frakcje po odparowaniu rozpuszczalnika:6 100003 Frakcja 1 1 2 3 4 Objetosc (litry) ,1 3,1 ,3 4,3 Pozostalosc (gramy) 0,320 0,305 1,1 0,330 Substancje z frakcji nr 3 (1,1 g) rozpuszcza sie w benzenie (10 ml) i roztwór wprowadza do wypelnionej silikazelem (60 g) suchej kolumny o wymiarach 1 m x 20 mm. Kolumne eluuje sie mieszanina benzenu i octanu etylu (w stosunku 4:1). Zbiera sie 125 frakcji po 125 ml kazda, a nastepnie zmienia eluent na mieszanine benzenu i octanu etylu w stosunku 1:1. Pozadana substancja zawarta byla we frakcjach 28—31, jak to wykazala chromatografia cienkowarstwowa. Z frakcji nr 28 usuwa sie rozpuszczalniki, otrzymujac 0,046 g wstepnie oczyszczonej substancji. Frakcje 20—31 rozpuszcza sie w chloroformie i pozostalosc wprowadza na 5 plytek chromatografii cienkowarstwowej i chromatogramy rozwija 6 razy za pomoca benzenu i trzy razy za pomoca mieszaniny benzen-octan etylu (w stosunku 4:1). Glówny skladnik wyodrebnia sie i wymywa octanem etylu. Po usunieciu rozpuszczalnika otrzymuje sie wstepnie oczyszczony material.Przyklad IX. Surowy ekstrakt, otrzymany w sposób przedstawiony w przykladzie VII, (4,5 g) roz¬ puszcza sie w 50 ml eteru, a otrzymany roztwór przesacza i przemywa nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu (50 ml). Roztwór eterowy osusza sie nad siarczanem sodowym i odparowuje do sucha. Otrzymana pozosta¬ losc (3,6 g) rozpuszcza sie w chloroformie (25 ml) i wprowadza na kolumne o wymiarach 40 mm x 4 m, wypel¬ niona obojetnym silikazelem (200 g) w chloroformie. Kolumne eluuje sie chloroformem i mieszanina chloro- form-izopropanol, zbierajac 25 ml frakcje. Po piec takich 25 ml frakcji laczy sie, otrzymujac jedna frakcje 125 ml. Laczy sie 75 frakcji o objetosci 125 ml i odparowuje do sucha pod próznia w temperaturze ponizej 40°C. Eluenty zmienia sie w nastepujacy sposób.-' Frakcje o objetosci 125 ml 1—18 chloroform 19—30 izopropanol:chloroform (1:99) 31-44 izopropanol:chloroform(l:49) 45-51 izopropanol:chloroform(3:97) 52—66 izopropanol:chloroform (1:24) 67—75 izopropanol:chloroform(l:19) Erakcje analizuje sie, stosujac chromatografie cienkowarstwowa w sposób, przedstawiony w przykladzie VIII. Na podstawie uzyskanych wyników analizy, frakcje 49—66 laczy sie i usuwa z nich rozpuszczalnik, uzysku¬ jac oleista pozostalosc (0,725 g). Pozostalosc te oczyszcza sie metoda chromatografii cienkowarstwowej. Chro¬ matogramy rozwija sie mieszanina izopropanol-chloroform (2:23) i glówny skladnik wymywa mieszanina meta- nol-chloroform (1:3). Rozpuszczalnik odpedza sie nastepnie, otrzymujac 540 mg pozostalosci. 400 mg tej otrzy¬ manej substancji chromatografuje sie ponownie w podobny sposób, otrzymujac wstepnie oczyszczony material (268 mg) w postaci oleju.Przyklad X. Surowy ekstrakt (1 g) otrzymany w sposób przedstawiony w przykladzie VII, miesza sie ostroznie z eterem (5 ml) w 15 ml naczynku. Otrzymany roztwór miesza sie z kwasnym weglanem sodu (2 ml) przez 1 minute, mieszanine odparowuje i eter odpedza. Roztwór kwasnego weglanu sodu przemywa sie dwoma dodatkowymi 2 ml porcjami eteru. Ekstrakty eterowe laczy sie, po czym odpedza rozpuszczalnik. Sucha pozo¬ stalosc miesza sie z niewielka iloscia stosowanego w chromatografii cieczowej silikazelu o nazwie Pellosil (pro¬ dukt firmy Reeve Angel and Co., Clifton, NJersey) i mieszanine wprowadza na czolo kolumny wstepnej o wy¬ miarach 100 mmx 10 mm,wypelnionej Pellosilem (chromatograf cieczowy firmy du Pont 830). Kolumne eluuje / sie roztworem dioksanu w heksanie o stopniowo zwiekszajacej sie zawartosci dioksanu od 2,5% do 7,5% przy cisnieniu 28 kg/cm2. Eluent o zawartosci dioksanu 2,5% stosuje sie przez 30 minut, 5% - przez 30 minut i o za¬ wartosci dioksanu 7,5 przez dalsze 30 minut. Polaczone frakcje (w których poszukiwana substancje wykrywa sie * metoda absorpcji promieniowania U.V. przy dlugosci fali 254 mm) analizuje sie metoda chromatografii gazowej i chromatografii cienkowarstwowej. Po odbieraniu przez 10 minut frakcji z zawartoscia dioksanu 7,5% zbiera sie frakcje, uzyskane przez nastepne 20 minut, laczy je i odparowuje do sucha w atmosferze azotu w temperaturze 50°C, otrzymujac wstepnie oczyszczony material.100003 7 Przyklad XI. Do stalowego zbiornika o objetosci 378,53 litrów, wyposazonego w zewnetrzny plaszcz grzewczy (za pomoca pary), zaladowuje sie 10 kg lisci rosliny zoapatle i 113,56 litrów wody. Mieszanine ogrzewa sie w temperaturze 98- 100°C przez 2,5 godziny, mieszajac okresowo. Goraca mieszanine saczy sie przez gaze, otrzymujac okolo 95 litrów przejrzystej ciemnej herbatki. Stala pozostalosc przemywa sie w zbiorniku 15,13 litrów wody, przesacza i przesacz laczy z uprzednio otrzymana herbatka. Polaczone wodne ekstrakty ekstrahuje sie 113,56 litrów octanu etylu. Mieszanine intensywnie miesza sie i pozostawia do rozdzielenia warstw. Górna spieniona warstwe odprowadza sie przez wyjscie syfonowe w celu unikniecia tworzenia sie emulsji i oddzielenia maksymalnej ilosci octanu etylu. Operacje powtarza sie, stosujac 65,70 litrów octanu etylu. Ekstrakty organiczne laczy sie i odparowuje pod próznia w temperaturze 50°C. Pozostalosc ekstrahuje sie trzema porcjami goracego (75-80°C) benzenu (ogólem 10 litrów). Ekstrakty benzenowe odparowuje sie pod próznia w temperaturze 50°C, a pozostalosc przemywa trzykrotnie wrzacym heksanem (ogólem 8 litrów). Pozostalosc po przemywaniu heksanem rozpuszcza sie w 2 litrach acetonu i dodaje 10 g wegla aktywowanego (Nuchar) i zawiesine miesza przez 1 godzine w temperaturze pokojowej. Wegiel aktywowany usuwa sie przez odsaczenie, a przesacz poddaje destylacji prózniowej w temperaturze 30°C, otrzymujac 69 g surowego ekstraktu. Surowy ekstrakt, bedacy mate¬ rialem wyjsciowym (50 g), rozpuszcza sie w 5 litrach eteru, a otrzymany roztwór przesacza i przemywa nasyco¬ nym roztworem weglanu sodu (500 ml). Eter osusza sie nad bezwodnym siarczanem sodu, przesacza i roztwór zateza do sucha, otrzymujac jasnozólty olej (44,6 g). Olej ten rozpuszcza sie nastepnie w chloroformie (400 ml) i wprowadza do kolumny o wymiarach 10 X 120 cm, wypelnionej 2,5 kg obojetnego kwasu krzemowego w chlo¬ roformie. Kolumne eluuje sie chloroformem i mieszaninami chloroform-izopropanol. Zbiera sie 110 frakcji.Frakcje odparowuje sie do sucha pod próznia w temperaturze ponizej 40°C. Kolumne eluuje sie wedlug poniz¬ szego schematu postepowania: Frakcja 1- 7 8- 30 31- 60 61-105 106-110 Objetosc frakcji (wnd) 650 - 500 500 500 500 Eluent chloroform izopropanol-chloroform (1:41,7) izopropanol-chloroform (1:33,3) izopropanol-chloroform (1:28,6) izopropanol-chloroform (1:25) Sklad frakcji ustala sie metoda chromatografii cienkowarstwowej (silikazel, izopropanol-chloroform w sto¬ sunku 1:12,5) i chromatografii gazowej z zastosowaniem kolumny z wypelnieniem 3% OV 17) (krzemian mety- lu:krzemian fenylu w stosunku 1:1) z zaprogramowanym sposobem wykorzystania (temperatura 150—250°C).Frakcje nr nr 78—84 laczy sie i usuwa z nich rozpuszczalnik przez odparowanie pod próznia, otrzymujac oleista pozostalosc (5,1 g), która zawiera co najmniej 3 glówne skladniki, wykrywane metoda chromatografii gazowej.Czesc tej pozostalosci (3,2 g) rozpuszcza sie w benzenie (50 ml)i roztwór wprowadza do kolumny o wymiarach cm X 10,67 m, wypelnionej 2 kg preparatu OR-PVA Merck-Gel 2000 (kopolimer octanu winylu, peczniejacy w organicznych rozpuszczalnikach, produkowany przez firme E.M. Merck, Inc.) w benzenie. Kolumne eluuje sie benzenem, zbierajac ogólem 47 frakcji. Stosuje sie metode chromatografii cienkowarstwowej i chromatografii gazowej w celu ustalenia skladu poszczególnych frakcji.Frakcja 1 1_ 7 8-45 46-47 Objetosc frakcji (ml) | 1000 1 300 1000 Frakcje 23—33 zawieraly 1,73 g (54%) uzytego materialu.Frakcje 24—25 odparowuje sie, uzyskujac 0,251 g zwiazku o wzorze 2, w postaci oleju o nastepujacej charakterystyce spektralnej: Podczerwien: (urzadzenie wyposazone w siatke dyfrakcyjna) 2,90/i, 5,96 jti i 6,21 m.Widmo NMR (wCDCl3 wzgledem tetrametylosilanu) 6 w ppm.: 6,11, 5,48, 4,25, 4,13, 3,56, 2,11, 2,08, 1,48,1,1311,01.Widmo masowe m/e: 334/M-18/, 225, 140,111,95, 81, 69.8 100003 Nadfiolet - X max. (etanol): ~ 239 nm (e=8500).Jonizacja chemiczna: M* + H = 353, Ciezar czasteczkowy = 352 Frakcje 31 odparowuje sie otrzymujac 0,326 g zwiazku o wzorze 1, w postaci oleju, o nastepujacej charak¬ terystyce spektralnej. Podczerwien: (urzadzenie, wyposazone w siatke dyfrakcyjna) 2,91 ji i 5,88 ju.Widmo NMR (wCDCl3 wzgledem tetrametylosilonu) 6 w ppm: 5,41, 4,26, 4,15, 3,58, 3,18, 2,18, 1,76, 1,67,1,1511,04.Widmo masowe m/e: 320 (M-18), 251, 233, 221, 171, 143, 141,137, 125, 113, 97, 95, 81, 69.Jonizacja chemiczna: M+ + H = 339, Ciezar czasteczkowy = 338. PL PL

Claims (9)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oczyszczania ekstraktów, zawierajacych substancje dzialajaca oczyszczajaco na macice, otrzyma¬ nych z rosliny zoapatle przez poddanie czesci rosliny, zawierajacych substancje czynne, obróbce woda w podwyz¬ szonej temperaturze, oddzielenie fazy wodnej, zawierajacej co najmniej czesc substancji, dzialajacych oczyszcza¬ jaco na macice, od fazy stalej, a nastepnie poddanie fazy wodnej obróbce organicznym rozpuszczalnikiem, nie mieszajacym sie z woda lub przez poddanie czesci rosliny, zawierajacych substancje czynne obróbce rozpuszczal¬ nikiem organicznym, nie mieszajacym sie z woda, oddzielenie fazy organicznej, zawierajacej co najmniej czesc substancji, dzialajacych oczyszczajaco na macice, od fazy stalej, a nastepnie poddanie fazy organicznej obróbce woda, znamienny tym, ze ekstrakt rozpuszcza sie w nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku organicz¬ nym, przemywa otrzymany roztwór wodnym roztworem slabej zasady, oddziela faze organiczna od fazy wodnej, chromatografuje roztwór na kolumnie, wypelnionej adsorbentem, eluuje sie kolumne mieszanina polarnego i niepolarnego rozpuszczalnika, laczy frakcje, zawierajace substancje dzialajace oczyszczajaco na macice i usuwa z nich rozpuszczalnik, a pozostalosc rozpuszcza sie w nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku organicznym, po czym chromatografuje sie roztwór na kolumnie, wypelnionej organicznym zelem polimerycznym, eluuje sie kolumne niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym i zbiera frakcje, zawierajace substancje dzialajace oczysz¬ czajaco na macice.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, zn a mi e n ny tym, ze oczyszcza sie ekstrakty, otrzymane z rosliny zoapatle, takiej jak Montanoa tomentosa lub Montanoa floribunda.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako organiczny rozpuszczalnik, nie mieszajacy sie z woda, stosuje sie weglowodór aromatyczny, chlorowany weglowodór lub eter alifatyczny.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie eter, chloroform lub benzen.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny t y m, ze jako adsorbent stosuje sie kwas krzemowy, zel krzemionkowy lub florisil.

6. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny t y m, ze jako mieszanine polarnego i niepolarnego rozpusz¬ czalnika stosuje sie mieszanine chloroformu z izopropanolem.

7. - Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny t y m, ze jako zel polimeryczny stosuje sie kopolimer octanu winylu.

8. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze jako niepolarny rozpuszczalnik stosuje sie benzen.

9. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny' t y m, ze jako slaba zasade stosuje sie kwasny weglan sodu. ,CHa0H Ha0H CHS CH, CH, wzór f CH, CH, CH, wzór 2 Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl PL PL