NO143297B

NO143297B - Dyrefor.

Info

Publication number: NO143297B
Application number: NO770785A
Authority: NO
Inventors: Karl Erik Lennart Bjoerck
Original assignee: Astra Ewos Ab
Priority date: 1976-03-08
Filing date: 1977-03-07
Publication date: 1980-10-06
Also published as: LU76904A1; BE852195A; DK147311C; KE3224A; FR2345940B1; SE420793B; FI62617B; GB1546747A; DE2709390C2; IE45119B1; SE7603075L; NO800912L; NO770785L; FI62617C; FI770708A; NL7702083A; NO149197C; DE2709390A1; IE45119L; DK147311B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører dyrefor omfattende

et antibakterielt system»

Formålet med oppfinnelsen er å tilveiebringe et dyre-f6r omfattende et antibakterielt system, hvilket system utøver en antibakteriell virkning i mage- og tarmkanalen.

Det er tidligere kjent at husdyr, spesielt unge dyr, utsettes for kraftige mage- og tarminfeksjoner som hovedsakelig beror på infeksjoner av E.coli og forskjellige arter av Salmonella. Hittil kjente metoder for å eliminere disse infeksjoner omfatter enten administrasjon av en terapeutisk mengde antibiotika med risiko for dannelse av antibiotika-resistente bakteriearter, eller å foreta en vaksinasjon av bestanden, hvilket leder til store omkostninger siden vaksiner og vaksinasjoner er relativt kostbare. Et annet kjemoterapeu-

tisk aktivt middel som benyttes er blant annet trimetoprimsulfa.

Det er også kjent fra Biochim. Biophys. Acta (1966)

vol. 117, side 63-72, Klebanoff et al, et antibakterielt system bestående av laktoperoksydase-tiocyanat-hydrogenperoksyd, hvor-

ved peroksydet oppnås fra ^ 2°2 e^ er reaksjonen mellom glukose/ glukoseoksydase. Det har imidlertid vist seg at slike systemer ikke gir en tilstrekkelig antibakteriell effekt, hvilket også fremgår fra det nedenstående.

Man har nå overraskende funnet det mulig å unngå de omtalte ulemper og/eliminere bakterieinfeksjoner ved hjelp av foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således til-veiebrakt et dyref6r omfattende i og for seg kjente dyrefor-bestanddeler, og et antibakterielt system som aktiveres i mage-og tarmkanalen, og dette dyref6r er kjennetegnet ved at det antibaikterielle system består av laktoperoksydase, tiocyanat og en fast, vannoppløselig peroksyd-donor fra gruppen bestående av alkaliperkarbonater, jordalkaliperoksyder og karbamidperoksyd.

Ifølge en foretrukken utførelse omfatter dyref6ret tiocyanat i en mengde på minst 16 ppm av den totale sammensetning beregnet som NaSCN, en fast, vannoppløselig peroksyd-donor i en mengde på minst 21 ppm av den totale sammensetning beregnet som natriumperkarbonat, og laktoperoksydase i ren form og/eller av et laktoperoksydaseholdig melkeprodukt i en mengde på minst 1 mg/kg av den totale sammensetning, idet det molare forhold mellom peroksyd-donor og tiocyanat er mindre enn 4:1, fortrinnsvis 1-2:1.

Ifølge en foretrukken utførelse foreligger tiocyanat

i en mengde på 160-3500, fortrinnsvis 160-1750 ppm/kg dyrefor beregnet som NaSCN, peroksyd-donor i en mengde på 210-4 000, fortrinnsvis 210-2000, ppm/kg dyrefor beregnet som Na-perkarbonat, og laktoperoksydase i en mengde på 10-200, fortrinnsvis 10-100 mg/kg.

De ovenfor angitte mengder av aktive bestanddeler er gitt slik at tiocyanat anvendes i en slik mengde at konsentrasjonen derav i fordøyelseskanalen er minst 0,1 mM, en fast vannoppløselig peroksyd-donor i en slik mengde at konsentrasjonen derav i f ordøyelseskanalen uttrykt som ^ 2^ 2 er m:'-nst 0,1 mM og laktoperoksydase i renset form og/eller i form av et laktoperoksydaseholdig melkeprodukt i en slik mengde at konsentrasjonen derav i fordøyelseskanalen er minst 1 mg/l.

Den vannoppløselige peroksyd-donor består fortrinnsvis av natriumperkarbonat som er belagt med et beskyttende lag som er oppløselig i tarmkanalen og hvilket lag fortrinnsvis består av celluloseacetat-ftalat.

Dyr som behandles med foreliggende for er vanligvis griser, kalver og fjærkre, samt pelsproduserende dyr slik som mink og rev. Kjæledyr, slik som katter og hunder kan også behandles .

Mengden av tiocyanat velges slik at man oppnår en konsentrasjon derav på minst 0,1, fortrinnsvis 0,2-0,4 mM, hvorved konsentrasjoner på 0,5-1,0 mM kan være nyttige i visse tilfeller, i fordøyelseskanalen, idet konsentrasjonen ikke bør overskride toksiske konsentrasjoner, (10 mM). Mengden av peroksyd-donor velges slik at en ekvimolar mengde 2°PPn^s'

dvs. at konsentrasjonen av H^ O^ som dannes overskrider minst 0,1, fortrinnsvis 0,2-0,4 mM. Konsentrasjonen av ^ 2°2 skal i hvert ±ilfelle være mindre enn 4 ganger konsentrasjonen av tiocyanat.... Mengden av laktoperoksydase er avhengig av aktiviteten av enzy-

met, men basert på den antagelse at 1 mg inneholder 50 enheter

(U), bør minst 1 mg enzym være tilstede pr. liter fordøyelses-

saf t.

I en oppløsning er således konsentrasjonen av tio-

cyanat minst 0,1 mM, fortrinnsvis 0,2-0,4 mM, konsentrasjonen av peroksyd-donor slik at konsentrasjonen av H202 er 0,1 mM, fortrinnsvis 0,2-0,4 mM, og konsentrasjonen av laktoperoksydase er 1 mg/l (50 U/l).

Konsentrasjonen av sistnevnte materiale kan også varieres, men bør være 1-2 mg/l (50-100 U/l).

1 enhet laktoperoksydase er den mengde laktoperoksy-

dase som danner 1 mg purogallin fra purogallol i løpet av 20

sek. ved pH 6,0 og 20°C.

Mengden av laktoperoksydase i bovinmyse (upasteuri-

sert) eller i ultrafiltrert myse kan naturligvis variere.-

Bovin-melk inneholder, ifølge litteraturen, laktoperoksydase i

en mengde på ca. 3 0 mg/l, hvorved mengden av laktoperoksydase i menneskemelk ifølge litteraturen er ca. 1/30 av den i bovin-

melk. Laktoperoksydase finnes også i andre bovin-melkeprodukter som skummet melk-pulver som også kan benyttes.

Salter av tiocyanat som anvendes er natrium-,

kalium- og ammonium-salter.

LD^q for tiocyanat er 484 mg/kg legemsvekt injisert intravenøst hos mus og 7 64 mg/kg legemsvekt administrert oralt hos rotte.

Oppfinnelsen skal beskrives mer detaljert i det nedenstående under henvisning til de angitte eksempler.

Eksempel 1

Et melkeerstatningsmiddel ble fremstilt fra følgende bestanddeler:

og

21 g natriumperkarbonat

16 g natriumtiocyanat.

Bestanddelene ble grundig sammenblandet i en blande-anordning. Ved bruk tilsettes vann til den tørre blanding inntil man får en 10 % vandig oppløsning (10 % tørrblanding). En slik melkeerstatningsoppløsning administreres normalt i en mengde på

4 liter/dag og pr. kalv (=400 g tørrprodukt pr. dag).

Mengden av natriumperkarbonat kan i et slikt melkeerstatningsmiddel varieres mellom 210 og 420 ppm og mengden av tiocyanat mellom 160 og 320 ppm, slik at man får Na-perkarbonat: NaSCN = 21:16.

E ksempel 2

Et tilsetningsfor for smågriser ble fremstilt fra følgende bestanddeler:

og

210 g natriumperkarbonat

1(50 g natr iumtiocyanat.

Bestanddelene ble blandet grundig i en blander. Foret gis i tørr form direkte på gulvet til grisene fra en alder av 2 dager til en alder av 28 dager. Den daglige dose av et slikt for er ca. 5 g pr. smågris, hvorved mengden ved hver foring er ca. 0,5 g/smågris. Mengden av natriumperkarbonat kan varieres i et slikt for mellom 2100-4 200 ppm og mengden av natriumtiocyanat mellom 1600-3200 ppm, idet forholdet Na-perkarbonat:NaSCN = 21:16.

Eksempel 3

Et for for smågriser ble fremstilt fra følgende bestanddeler. Foret er ment for bruk når man ikke har noe mors-melk eller når tidlig avvenning ønskes.

og

35 g natriumperkarbonat

27 g natriumtiocyanat.

Bestanddelene ble blandet grundig i en blander. Foret gis i tørr form til grisene og det gis ad libitum. Det daglige inntak er omkring 3 0-50 g avhengig av smågrisens alder.

Mengden av natriumperkarbonat kan varieres mellom 350 og 700 ppm, og mengden av NaSCN mellom 270 og 540 ppm, idet forholdet Na-perkarbonat : NaSCN er 21:16.

Eksempel 4

Et vitaminisert mineralsk for for svin (purker) ble fremstilt fra følgende bestanddeler:

og

17 4 g natriumperkarbonat

135 g na tr iumtiocyanat. - ■ -•- - --■--■

Bestanddelene i det mineralske for ble blandet grundig og fortynnet med kjente korn- og protein-kilder. 3 % av det vitaminiserte mineralske for ble benyttet i sluttblandingen. Det vitaminiserte mineralske f6r kan alternativt administreres i mengder på ca. 30-150 g pr. dyr og daglig direkte i trauet uten inkorporering. Mengden av natriumperkarbonat kan varieres mellom 1740 og 3480 ppm, og mengden av NaSCN mellom 13 50 og 2700 ppm, idet forholdet Na-perkarbonat : NaSCN er 21:16.

Eksempel 5

En elektrolyttblanding ble fremstilt fra følgende

bestanddeler:

og

' 97 g natriumperkarbonat

7 5 g natriumtiocyanat

5 g laktoperoksydase (50 U/mg).

Elektrolyttblandingen i grundig blandet tilstand anvendes som følger: 25 g oppløses i 1 liter vann og gis til griser eller kalver i en mengde på ca. 10 % av legemsvekten daglig ved etablert dehydratisering, eller for å hindre dehydratisering.

Mengden av natriumperkarbonat kan varieres mellom 970 og 1940 ppm, og mengden av natriumtiocyanat mellom 750 og 1500 ppm, idet mengden av Na-perkarbonat til mengden av NaSCN er 21:16.

Biologisk effekt

4 reagensrør inneholdende 10 ml myse med et innhold av 21 ppm (0,25 mM) NaSCN, ble inkubert ved 3 0°C, idet mysen var inokulert med Ps.-fluoressens EF 1998. Et rør utgjorde kontroll-prøven. Natriumperkarbonat tilsvarende 0,1 mM, 0,2 mM og 0,3 mM, respektivt, med f^C^ ble tilsatt til de tre andre reagensrørene. Mengden av bakterier ble bestemt ved inokulering, og etter 2 timer inkubasjon. Laktoperoksydase er tilstede i 5 yg/ml. Resultatet er angitt i nedenstående tabell 1.

Som det fremgår fra tabellen, oppnås en meget stor forbedring i antibakteriell effekt når 0,2 mM f^O^ eller mer er tilstede. Allerede tilsetningen av 0,1 mM f^C^ gir imidlertid en betydelig bakterisid effekt.

Ps.-fluoressens EF 1998 ble inkubert ved 30°C i to reagensrør 1) og 2), hvor rør 1) inneholdt 1 g kommersielt melkeerstatningsmiddel omfattende 15% ultrafiltrert mysepulver, 57% mysepulver, 8% fett, 16% animalsk protein og 4% vitaminer og mineraler i 10 ml vann, og inneholdt dermed 50 yg laktoperoksydase, idet 27,5 ppm natriumperkarbonat ble ..tilsatt, og hvor rør 2) inneholde den samme mengde melkeerstatningsmiddel (50 yg laktoperoksydase) og hvorved 21 ppm natriumtiocyanat og 27,5 ppm natriumperkarbonat ble tilsatt.

Mengden av bakterier i de forskjellige reagensrør er angitt i nedenstående tabell 2 hvor resultatene etter 0, 2, 4 og 6 timer er angitt.

Som det fremgår av tabellen, er mengden av bakterier i rør 2) etter 6 timer bare 1/1000 av mengden i rør 1) på samme tid, hvorved ingen eller bare liten vekst har funnet sted i rør 1), men i rør 2) er mikroorganismene drept.

Effekten av det antibakterielle system ble bestemt in vitro. Deretter ble forskjellig E.-colistammer inkubert ved 37°C i en vandig oppløsning av 5 g mysepulver/100 ml, 21 ppm NaSCN og natriumperkarbonat tilsvarende 0,25 mM ^C^. Resultatet fra E.coli-drepingen etter 2 timer er angitt i nedenstående tabell 3.

Flere av de undersøkte E.-colistammer er bestandige overfor antibiotika. Resultatene indikerer således en høy grad av anvendelsesgyldighet for systemet. Dette fremgår også fra det faktum at systemet har virkning på gram-positive bakterier.

Det antibakterielle system ifølge oppfinnelsen, kan videre anvendes i næringsmidler eller matvarer for mennesker samt i farmasøytiske preparater for bruk av mennesker og dyr. Som farmasøytiske preparater kan både faste og flytende sammen-setninger anvendes, idet det antibakterielle system generelt tilsettes til farmasøytiske bærere av forskjellige typer avhengig av type og mengde benyttet.

Et melkeerstatningsmiddel for kalver og inneholdende

45 vekt-% skummet melkepulver ( £.40 mg LP/kg) , 22,5 vekt-% mysepulver, 12,5 vekt-% soyamel, 15,0 vekt-% animalsk fett, 4,5 vekt-% laktose og 0,5 vekt-% vitaminer, b]e benyttet i et forsøk mot E.-coli 9703. Stammen ble inkubert ved +37°C i en 10% vandig oppløsning av melkeerstatningsmiddel inneholdende 5 yg/ml laktoperoksydase. To forskjellige konsentrasjoner av NaSCN og tre forskjellige konsentrasjoner av HO i form av Na-perkarbonat ble benyttet, slik som vist i tabell 4 nedenfor.

Som det fremgår fra tabell 4 gir det antibakterielle system en sterk baktericid virkning i begge de undersøkte konsentrasjoner samtidig som det vises at SCN<-> ikke har noen virkning per se, men bakteriell vekst fortsetter når ingen peroksyd-donor er tilstede.

For å vise at det system som anvendes i foreliggende oppfinnelse med en fast, vannoppløselig peroksyd-donator har en bedre effekt enn tidligere kjente LP-SCN -t^C^-systemer, er følgende to forsøk utført: A. Medium: En 10%-ig oppløsning av pulver av skummet melk inneholdende 0,5 mM SCN tilsatt som natriumtiocyanat og 2 pg/ml laktoperoksydase.

Teststamme: E.coli NCTC 9703.

Antibakteriell test: Oppløsningen av skummet melk ble inkubert

i et vannbad ved 37°C og 0,5 mM H2O2 resp. magnesiumperoksyd ble tilsatt. Flasker inneholdende mediet alene ble inkubert som kontroll. 15 minutter etter tilsetning av peroksydet ble testoppløsningene surgjort ved tilsetning av 0,5 M HC1 til pH 5.0 for å simulere effekten av magesyre. Etter ytterligere 15 minutter ble 10 ml prøver uttatt og inokulert med E.coli NCTC 9703 og inkubert ytterligere ved 3 7°C. Antall overlevende bakterier ble bestemt umiddelbart etter inokulering og etter to timers inkubasjon.

Resultater:

Som det fremgår av resultatene hadde antall bakterier blitt ti-doblet i kontrollprøven, mens det hadde øket med 59% i prøven med H202-tilsetning. I prøven med Mg02 hadde derimot antall bakterier minsket til mindre enn et halvt tusen.

Klebanoff et al diskuterer også tilsetning av ett H202~ utviklende system slik som glukose-glukoseoksydase-systemet.

B. Forsøk ble foretatt for å sammenligne et slikt system med et system som i foreliggende oppfinnelse.

Medium: Semisyntetisk medium bestående av 1.0 g NH^Cl,

1,0 g K2HP04, 0,2 g MgS04 - 7H"20, 10 g FeS04 • 7H20, 10 mg CaCl2, 3,0 g gjærekstrakt (Difco) og 1000 ml vann, dessuten inneholdende 0,25 mM SCN tilsatt som natriumtiocyanat, 0,5% glukose og 2 ug/ml laktoperoksydase.

T eststamme: E.coli NCTC 9703.

A ntibakteriell test: Forsøket ble gjennomført i et anaerobt telt. Mediet ble inokulert med teststammen og en vannholdig

oppløsning av natriumperkarbonat ble tilsatt i en mengde tilsvarende 0,25 mM H202, resp. 0,1 U/ml glukoseoksydase ble tilsatt til forskjellige prøver. Umiddelbart etter inokuleringen og etter to timers inkubasjon ved 3 7°C ble det uttatt prøver og antall overlevende bakterier ble bestemt.

Resultater:

Som det fremgår av resultatene hadde antall bakterier i kontrollprøven øket ca. 20 ganger, og i glukose-glukose-oksydase-prøven ca. 10 ganger, mens antallet i prøven med fast peroksyd-donator minsket med 99 , 99%, dvs. fra 1.40.000 til <35 bakterier/ml. Tilsvarende effekt oppnås med karbamidperoksyd.

Ovenstående to forsøk viser at den faste, vannopp- ... løselige peroksyd-donatoren gir systemet en overlegen effekt dels i forhold til H202 og dels i forhold til H202-utviklende systemer, slik som glukose-glukoseoksydase under anaerobe forhold.

Videre er det vist til CA. 83 (1975) 162316y,

Bjorck et al. som angår antibakteriell effekt i melk av LP-SCN - H202-systemet, der H202 utvikles av glukose-glukoseoksydase.

Som det fremgår fra det ovenstående har et slikt system ingen in vivo effekt ettersom anaerobe forhold.foreligger..

For å illustrere effekten av foreliggende dyrefor in

vivo, har søkeren utført en rekke in vivo forsøk hvorved kalver forsynt med vomfistel ble tilført 2,2 liter melk inokulert med E.coli NCTC 9703. Etter 15 og 45 minutter ble vomprøve uttatt

■og' antall E.c61i bestemt.

Resultater:

Som det fremgår av de ovenfor angitte resulteter gir oppvarmet melk ingen effekt ettersom laktoperoksydase derved er ødelagt, mens oppfinnelsens system LP-SCN -Mg02 gir en kraftig reduksjon av bakterieantallet allerede innen 15 min. fra inokulering og tilførsel ble foretatt.

Peroksyd-donoren kan også bestå av et alkalimetallper-sulfat som under reaksjonen, gir hydrogenperoksyd og sulfat.

Claims

1. Dyrefor omfattende i og for seg kjente dyrefor-bestanddeler, og et antibakterielt system som aktiveres i mage-og tarmkanalen, karakterisert ved at det antibakterielle system består av laktoperoksydase, tiocyanat og en fast, vannoppløselig peroksyd-donor fra gruppen bestående av alkaliperkarbonater, jordalkaliperoksyder og karbamidperoksyd.

2. Dyrefor ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter tiocyanat i en mengde på minst 16 ppm av den totale sammensetning beregnet som NaSCN, en fast vann-oppløselig peroksyd-donor i en mengde på minst 21 ppm av den totale sammensetning beregnet som natriumperkarbonat, og laktoperoksydase i ren form og/eller av et laktoperoksydaseholdig melkeprodukt i en mengde på minst 1 mg/kg av den totale sammensetning, idet det molare forhold mellom peroksyd-donor og tiocyanat er mindre enn 4:1, fortrinnsvis 1-2:1.

3. Dyref6r ifølge krav 2, karakterisert ved at tiocyanat er tilstede i en mengde på 160-3500, fortrinnsvis 160-1750 ppm beregnet som natriumtiocyanat, peroksyd-donoren er tilstede i en mengde på 210-4000, fortrinnsvis 210-2000 ppm, beregnet som natriumperkarbonat, og laktoperoksydase er tilstede i en mengde på 10-200, fortrinnsvis 10-100 mg/kg.

4.. Dyref6r ifølge krav 1-3, karakterisert ved at den faste vannoppløselige peroksyd-donor er natriumperkarbonat.

5, Dyrefor ifølge krav 4, karakterisert ved at natriumperkarbonatet er forsynt med et beskyttende lag som ikke kan oppløses i tarmkanalen.

6.. Dyrefor ifølge krav 5, karakterisert ved at det beskyttende lag består av celluloseacetatftalat.