NO128970B - - Google Patents

Description

Stabilisert testanordning for påvisning av bilirubin, og fremgangsmåte ved fremstilling av denne.

Oppfinnelsen angår en stabilisert testanordning som hurtig forandrer farve når den bringes i kontakt med bilirubin, og en frémgangsmåte for fremstilling av en slik testanordning.

En rekke forbindelser, spesielt de som forekommer i kroppsvæsker som blod.og urin, er påvisbare•ved en farvereaksjon som forekommer når .de kobles med en diazoforbindelse. En slik forbindelse som er av spesiell interesse for bestemmelse av en persons fysikalske tilstand, er bilirubin.

Påvisningen av bilirubin i kroppsvæsker er blitt utfort; siden ca. 1883 da Ehrlich innforte diazoreaksjonen for påvisning av bilirubin i urin. Siden den tid er en rekke væskesystem.er for diazoreaksjonen blitt anvendt for påvisning av bilirubin i urin og serum. Disse systemer omfatter en rekke varias joner"hva-- gjelder diazoforbindelsene og de andre reagenser som"anvendes for denne bestemmelse. Slike systemer er imidlertid hovedsakelig avhengige av den rodfiolette azobili-rubinfarve som dannes når' bilirubin'reagerer med et diazoniumsalt,

og farven kan måles visuelt eller spektrometrisk.

Selv om disse væskesystemer gir en helt ..nbyaktig bestemmelse av bilirubin, er de som regel vanskelige å anvende fordi diazoniumsalt-opplosningene i disse systemer er ustabile og derfor gjor det nbd-vendig med en ny fremstilling for hver prove av fluidum som skal under-søkes . Den nodvendige tid for at den påvisende farveforandring skal bli fullstendig, er forholdsvis lang idet den korteste tid er ca. 30 minutter, og av og til tar det hele flere timer. Undersøkelses-resultatene er derfor ikke så hurtig tilgjengelige som onskelig, spesielt ved bestemmelse av bilirubin i barn.

En rekke av disse vanskeligheter unngåes ved å anvende et pro-dukt som* er tilgjengelig i handelen under varemerket 11 ICTOTEST " i form av tbrre tabletter for bestemmelse av bilirubin som beskrevet i US patentskrift nr. 2.85^.317. Disse tabletter omfatter et diazoniumsalt, sulfosalicylsyre og natriumbicarbonat. For anvendelse av denne undersbkelse anbringes 5 dråper urin på en spesiell sterkt absorberende matte. Reagenstabletten anbringes deretter i midten av det fuktede område, og 2 dråper vann får flyte over tabletten. Dersom bilirubin er tilstede, forekommer en farvereaksjon på matten i lopet av ca. 30 sekunder. Selv om "ICTOTEST gir et forholdsvis hurtig og stabilisert system for bestemmelse av bilirubin, er det nodvendig med en lang rekke bestanddeler for avslutning av påvisningsreaksjonen. ;Testanordninger av dyppings- og -avlesningstypen som omfatter ;en kombinasjon av spesielle hurtigreagerende reagenser og et egnet bærermateriale, er utstrakt anvendt spesielt innen medisinen. Slike anordninger anvendes som regel for bestemmelse av pH og påvisning av glucose, protein og lignende i kroppsvæsker. Ved imidlertid å kombinere de kjente undersbkelsessystemer for påvisning av bilirubin med et egnet bærermateriale for fremstilling av en anordning av dyppings- og -avlesningstypen, var den dannede anordning ustabilisert og ga upå-litelige resultater. ;Det taes derfor ved oppfinnelsen sikte på å tilveiebringe en stabilisert testanordning som hurtig forandrer farve når den bringes i kontakt med bilirubin i en opplosning. ;Det taes ved oppfinnelsen også sikte på å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av en enhetlig testanordning som kan anvendes for påvisning av bilirubin i en opplosning. ;Foreliggende oppfinnelse angår en stabilisert testanordning ;for bilirubin, hvilken er kjennetegnet ved at den består av et fortrinnsvis absorberende bærermateriale med en torr rest av en stabil diazoniumsaltopplosning, hvilken rest utgjores av reaksjonsproduktet dannet ved å bringe sammen et organisk polart lbsningsmiddel, et arylamin, vann, et opploselig nitritt, et stabiliseringsmiddel og en sulfonsyre. ;Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte ved fremstilling av testanordningen, og fremgangsmåten er særpreget ved at det i den angitte rekkefolge blandes, ved værelsetemperatur, et polart opplosnings-middel, et arylamin, et opploselig nitritt, et stabiliseringsmiddel og en sulfonsyre for å danne en stabil diazoniumsaltopplosning, hvoretter et bærermateriale bringes i kontakt med diazoopplosningen og torkes slik at det på dette blir igjen en torr rest av diazoniumsaltopplosningen. ;Ved fremstillingen av diazoniums:altopplbsningen anvendes et polart opplbsningsmiddel. Blandingen fremstilles fortrinnsvis av vann og et organisk polart opplbsningsmiddel, som et alkohol, et keton og en ester etc. En alkohol, som methanol og 2-propanol, anvendes fortrinnsvis i et forhold av minst h deler organisk opplbsningsmiddel pr. 1 del vann. Forholdet mellom organisk opplbsningsmiddel og vann velges slik at det i det vesentlige ikke forekommer noen utfelling i den dannede diazoniumsaltopplbsningen. Et hbyt forhold av et hurtigfordampende organisk opplbsningsmiddel er også bnskelig for derved å nedsette tbr-ketiden for et bærermateriale som er blitt bragt i kontakt med oppløs-ningen. ;Et koblbart arylamin som kan diazotiseres tilsettes fortrinnsvis forst til opplbsningsmidlet. Et slik arylamin er fortrinnsvis 2,<L>t—dikloranilin, p-nitroanilin, p-kloranilin, 2, 5-dikloranilin, •+-klor-p-anisidin, 3,3<1->dimethoxy-benzidin og 2-methoxy-5-nitro-anilin. Andre slike arylaminer som kan danne diazoniumforbindelser, kan også anvendes innenfor oppfinnelsens omfan g. ;Et egnet opploselig nitritt som er i stand til å danne salpeter-syrling i et surt vandig medium, blir deretter satt til oppløsningen. Det oppløselige nitritt er fortrinnsvis natriumnitritt, kalium-nitritt eller kalsiumnitritt„ ;Opplbsningen inneholder også en stabiliserende forbindelse. An-vendelsen av et slikt stabiliseringsmiddel har vist seg å være gunstig fordi et eventuelt bunnfall som forekommer ved dannelsen av diazoniumsaltet, dannes i form av et findelt bunnfall som lett opp-loses. Dessuten har stabiliseringsmidlet vist seg å gjore den ferdige testanordning kjemisk mer stabil„ Egnede stabiliseringsmidler omfatter en lang rekke forbindelser,som aromatiske eller alifatiske sulfon» syresalter, sulfater eller sulfonater. Eksempler på slike stabiliseringsmidler er dinatriumsalte,t av 1,5-naf thalendisulf onsyre , natriumsaltet av 2-naf thalensulfonsyre, dinatriumsaltet av ^V-diamino-2,2'-bifenyldisulfonsyre og natriumlaurylsulfat. ;En organisk syre, fortrinnsvis en organisk sulfonsyre, anvendes i blandingen for å oppnå den riktige pH for dannelsen av en diazonium-forbindelse og den etterfølgende koblingsreaksjon mellom denne di-azoniumforbindelse og den koblbare forbindelse. Den organiske sulfonsyre er fortrinnsvis sulfosalicylsyre, sulfaminsyre, hexamin- og p-toluensulfonsyre.- Det bor bemerkes at andre kjente sulfonsyrer og organiske syrer kan anvendes ifolge oppfinnelsen. ;Disse reagenser, et polart opplbsningsmiddel, et arylamin, vann, opploselig nitritt, et stabiliseringsmiddel og en sulfonsyre, bringes sammen for dannelse av den bnskede diazoniumsaltopplbsning« Reagensene bringes fortrinnsvis sammen i den rekkefolge som er blitt angitt ovenfor, selv om rekkefølgen ved sammenblandingen av det polare opplos-ningsmiddel, arylaminet, vannet, det opploselige nitritt og stabiliseringsmidlet ikke er av avgjbrende betydning. Dersom det anvendes flere enn ett stabiliseringsmiddel, kan det annet stabiliseringsmiddel tilsettes etter sulfonsyren. ;Diazofarvestoffer er blitt fremstilt under anvendelse av et lignende reagenssystem som det ovenfor angitte» De i kjente^. systemer fremstilte diazofarvestoffer ble dannet i form av store utfelte partikler som var ønskelige på grunn av at de ikke stbvet. Slike forbindelser ble dannet ved lave temperaturer av ca. 0°C„ Det har nu overraskende vist seg at ved foreliggende fremgangsmåte kan en diazoniumsaltopplbsning dannes ved værelsetemperatur (ca. 23°C) og holdes som en opplosning i det vesentlig fri for bunnfall ved en slik temperatur under anvendelse av lignende reagenser som de som ble anvendt i kjente sy-r. '.erne r . Det. har dessuten vist seg at når et bærermateriale bringes i kJnt&KL med denne diazoniumsaltoppiosning og'deretter tbrkes, dunnes resten uv JJaz:>n'Iumsa 1 toppi6 snlnge n i form av små partikler som lett holdes tilbake av bærermaterialet. ;De forholdsvise, mengder av de .anvendte reagenser for dannelse av diazonlumsaitoppiosningen ligger fortrinnsvis innen de- folgende områder uttrykt, i prosent, vekt/volums ;;Som angitt ovenfor holdes forholdet mellom opplosningsmia.de.. Tg vann fortrinnsvis ved !-t-:l eller derover for å holde d iazoniumsal t,e t. opplost og fremme tørkingen av bærermaterialet. Vektf orholde t. mel i cm syre og arylamin holdes også fortrinnsvis ved ca. 10:1„ ;Det kan anvendes et egnet bærermateriale som er i stand tii å holde tilbake den torre rest av diazoniumsaltopplosningen i. bærermaterialet. Dette bærermateriale anordnes fortrinnsvis på en sl.ik må'..e at det'lett kan bringes i kontakt med en væske som antas å inneholde den kobl bare forbindelse som skal påvises. Bærermaterialet. for tes-.-anordningen kan være en integrerende del av. en s torre del som tjer.er for håndtering av anordningen, eller den kan være en adskilt del som er festet til en storre del for håndtering av anordningen. El slikt, bærermateriale kan omfatte et absorberende materiale som dyppes i eller på annen måte bringes 1 kontakt med diazoniiimsaltopplosnin^c-Mi og deretter torkes. Egnede bærermaterialet' omfatter f .eks. et porøst materiale, som filtrerpapir, glassf iborp ..pi r eller en polypropylen-* filt. Bærermaterialet kan også omfatte en polymer gel som på forhånd er blitt blandet med undersokelsesopplosningen og torket for dannelse av en halvgjennomtrengelig rnembranstruktur. Gel kan dannes ved for-dampning av opplbsni ngsmldle t og kan inneholde et tver r.bi ndingsm Ldde i .

Den samlede konstruksjon av testanordningen er ikke av av-gjørende betydning forutsatt at ved denne tilveiebringes en egnet .in-ordning for å bringe det område som omfatter den torre rest av diazoniumsaltopplosningen,' i kontakt med den væske som skal undr rstfkoi?.

En testanordning kan også fremstilles vod å jmpropnorv ot -.-!.vkkv filtrerpapir, som virker som bærermateriale, med diazoniumsaltopplbsningen, og deretter torke dette. Det impregnerte papir torkes fortrinnsvis ved en moderat temperatur av ca. 65 - 70°C under luftsirkulasjon. Temperaturen bor ikke være for hby da dette antas å ha en skadelig virkning på diazoniumforbindelsene. Det torkede bærermateriale kan deretter oppdeles i små deler og festes til en storre håndteringsanordning for å lette håndteringen.

Eksempel 1

Det ble fremstilt en opplosning ved i en glassbeholder å bringe de folgende forbindelser sammen i den angitte rekkefolge- og under kontinuerlig blanding: 20,0 ml methanol, 0,2 g 2,1+-dikloranilin, 20,0 ml destillert vann, 0,1 g natriumnitritt, 0,6 g dinatriumsalt av 1,5-nafthalendisulfonsyre, 1,5 g natriumlaurylsulfat, 2,0 g sulfosalicylsyre og 60,0 ml methanol..

Forbindelsene ble brakt sammen ved værelsestemperatur (ca. 23°C), og oppløsningens temperatur ble holdt ved rundt værelsetemperatur uten ytterligere temperaturregulering mens oppløsningen ble dannet.

Eksempel 2

Det ble fremstilt en opplosning som beskrevet i eksempel 1, men med den unntagelse at 0,05 g 2, ^--dikloranilin og 0,5 g sulf osalicyl-syre ble anvendt. Oppløsningen hadde i det vesentlige de samme egenskaper som opplosningen ifolge eksempel 1.

Eksempel ~\

Det ble fremstilt en opplosning som beskrevet i eksempel 1, men med den unntagelse at 0,5 g 2 ,>+-dikloranilin og 5,0 g sulfosalicylsyre ble anvendt. Opplosningen hadde i det vesentlige de samme egenskaper som opplosningen ifolge eksempel 1.

Eksempel ^- 10

Forskjellige oppløsninger ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1, med den unntagelse at en av de folgende forbindelser ble anvendt istedenfor 2,<!>+-dikloranilinet: p-nitroanilin, p-kloranilin, 2,5-dikloranilin, ^-klor-o-anisidin, 3,3<1->dimethoxybenzidin, og 2-methoxy-5-nitroanilin .

De fremstilte opplbsningers egenskaper var,i det vesentlige de samme som for opplosningen ifolge eksempel 1.

Eksempel 11

Det ble fremstilt en opplosning som beskrevet i eksempel 1, men med den unntagelse at hexaminsyre ble anvendt istedenfor sulfosalicylsyre. Den dannede opplosning hadde i det vesentlige de samme egenskaper som opplosningen ifolge eksempel 1.

Eksempel 12

Det ble fremstilt en-opplosning som beskrevet i eksempel 1, men med den unntagelse at sulfaminsyre ble anvendt istedenfor sulfosalicylsyre. Den dannede opplosning hadde i det vesentlige de samme egenskaper som opplosningen ifolge eksempel 1.

Eksempel 1^

Det ble fremstilt en opplosning som beskrevet i eksempel 1, men med den unntagelse at p-toluensulfonsyre ble anvendt istedenfor sulfosalicylsyre. Den dannede opplosning hadde i det vesentlige de samme egenskaper som opplosningen ifolge eksempel 1.

Eksempel lh

En strimmel av filtrerpapir (Eaton and Dikeman No. 6<1>+1) ble neddykket i opplosningen ifolge eksempel 1 og straks fjernet fra denne. Papiret ble deretter torket i ca. 8-10 minutter ved ca. 65-70°C under luftsirkulasjon over papiroverflaten. Det torkede papir hadde en kremhvit farve.

Bilirubinundersokelsesopplosninger ble fremstilt fra en pato-logisk urinprove fra en pasient som viste tegn på gulsott. Urinen fra pasienten ble behandlet med "ICTOTEST" og ga en kraftig reak-sjon som anga en hoy konsentrasjon av bilirubin. Urinen ble også undersokt ved anvendelse av en modifisert metode ifolge E.G. Godfried, Biochem. J. 28, 2056-2060, 193^+ for bilirubin og viste seg å inneholde ca. 10 deler pr. million. Den patologiske urin ble fortynnet videre med normal urin til konsentrasjoner av 5, 2,5 og 1 deler pr. million. Hver opplosning ble undersokt med testanordningen ifolge oppfinnelsen fremstilt som angitt ovenfor, og det ble dannet forskjellige nyanser av blekrod. En dypere blekrbd farve som nærmet seg blekrod-lavendel, ble dannet med oppløsningene med hoyere konsentrasjoner .

Prover av blodserum ble på lignende måte tatt fra normale pasienter og pasienter med gulsott. Bilirubininnholdet i disse sera, som bestemt med en "Auto Analyzer", var mellom 1 og 180 deler pr. million. Testanordningene fremstilt som angitt ovenfor, ble brakt i kontakt med disse sera, og farver ble dannet som varierte fra blekrod til lavendel ved konsentrasjoner av 10 deier pr. million og" derbver. Farve fo rand r inge n var proporsjonal-med konsentrasjonen av 'bilirubin

i oppløsningene.

Eksempel 15

Strimler av glassfiberpapir (Gelman Type A-1306 og Type E-74-8) ble behandlet istedenfor filtrerpapir ved fremgangsmåten ifolge eksempel l^.Det dannede,; torkede glassfiberpapir-hadde i det vesentlige samme utseende som papiret ifolge eksempel l<>>+„ Ved kontakt med undersokelsesopplosningene ifolge eksempel 1^ oppsto det farve for-andringer som angitt i eksempel 1^„-

E ksempel 16

Fremgangsmåten ifolge eksempel 1^ ble fulgt, men med den unntagelse at en polypropylenfi.lt (Polypropylene MDSE No. Po-8llO fri American Felt Company) ble anvendt istedenfor filtrerpapir. Den torkede grunnmasse hadde i det vesentlige samme farve og viste samme farvereaksjon som angitt i. eksempel 1<>>+ ved kontakt med undersokelsesopplosningene „

Eksempel 17

En opplosning ble fremstilt med de ifolge eksempel i anvendte forholdsvi.se mengder-. Et 10,16 cm bredt ark av Eaton & Dikeman No. ^M. filtrerpapir ble fort gjennom denne opplosning og torket i ca. 10 minutter ved ca. 65 - 70°C under luftsirkulasjon. Etter torkirig ble papiret bragt i kontakt med en trykkomfintlig klebemiddeloverflate

på et dobbeltsidig, trykkomf intlig.,. forsterket klebebånd av . celiu-losefi.bre, spaltet på langs til strimler med en bredde av 5?1 mm og oppspolet til. ruller. En rull ble deretter' anbragt på en akse, og et vokspapirlag eller -foring ble fjernet f"ra den ytre klebeoverfiate til det dobbeltsidige, trykkomfintlige bånd bundet til papiret. Den eksponerte overflate til det trykkomfintlige bånd ble kontinuerlig bundet over heie rullens lengde.til en overflate av et 8,3 cm bredt ark av poly s ty rorifi im med en tykkelse av 0,5 mm. Det trykkomf Intlige bånd ble fast, hund ot til filmen. Laminatet ble over strimlens lengde oppdelt i strimler med ert lengde av 511 mm. Den på denne måte dannede anordning ble hr tgt i kontakt med undersokelsesopplosningene i£olge eksempel l<!>t-, og det oppsto en farve forandring som angitt i. eksempel lhe

Claims (6)

1. , Stabilisert testanordning for bilirubin, karakterisert ved at den består av et fortrinnsvis absorberende bærermateriale med en tørr rest av en stabil diazoniumsaltoppløsning, hvilken rest utgjøres av reaksjonsproduktet dannet ved å bringe sammen et organisk polart løsningsmiddel, et arylamin, vann, et oppløselig nitritt, qt stabiliseringsmiddel og en sulfonsyre.

2. Testanordning ifølge krav 1, karakterisert ved at stabiliseringsmidlet er et aromatisk eller alifatisk sulfonsyresalt, sulfat eller sulfonat.

3- Testanordning ifølge krav 1-2, karakterisert ved at det aromatiske sulfonsyresalt består av dinatriumsaltet av 1,5-nafthalendisulfonsyre, natriumsaltet av 2-nafthalensulfonsyre eller dinatriumsaltet av 4,4'-diamino-2,2 *-bifenyIdisulfonsyre.

4- Test anordning ifølge krav 1-3, karakterisert ved at stabiliseringsmidlet er natriumlaurylsulfat.

5. Testanordning ifølge krav 1 - 4> karakterisert ved at det polare løsningsmiddel er methanol, arylaminet er 2,4-dikloranilin, det oppløselige nitritt er natriumnitritt, stabiliseringsmidlene er dinatriumsaltet av 1,5-nafthalendisulfonsyre og natriumlaurylsulfat, og sulfonsyren er sulfosalicylsyre.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av testanordning ifølge krav 1-5, karakterisert ved at det i den angitte rekkefølge blandes, ved værelsetemperatur, et polart løsningsmiddel, et arylamin, et oppløselig nitritt, et stabiliseringsmiddel og en sulfonsyre for å danne en stabil diazoniumsalt-oppløsning, hvorefter et bærermateriale bringes i kontakt med diazooppløsningen og tørkes slik at det på dette blir igjen en tørr rest av diazoniumsaltoppløsningen.