NO130520B - - Google Patents

Description

Anordning for semikvantitativ bestemmelse

av glucose i vandige væsker.

Foreliggende =oppf inne Ise angår en anordning av den art som er angitt i kravets ingress. Påvisning og bestemmelse av glu-cosekonsent rasjonen i urin er av stor betydning for diabetikere, som må kontrollere sin diett, og derved sitt inntak av sukker, og i denne henseende ofte må veiledes ved en kontroll av urinens glu-coseinnhold. Bortsett fra den nyttige anvendelse ved en regulær urinprovning på kjente diabetikere, både for pasienter og leger, kan anordningen for bestemmelse av glucose også anvendes effektivt ved rutine-urinanalyser i hospitaler og på legekontorer, for påvisning av diabetes og ved storre -undersokelsesprogrammer i samme hensikt, og for å differensiere mellom glucosuria- og andre melitu-rias og lignende.

Fordi en tidlig diagnose og efterfolgende kontroll er av så ator betydning i forbindelse med sukkersyke, er det av stdrste

betydning at en urinsukkerprbve er rask og enkel nok til at hvilken som helst pasient lett kan utfore den, noyaktig nok for anvendelse ved kliniske undersokeIser og dessuten folsotn nok til at variasjo-ner i pasientenes tilstand kan påvises. Ytterligere må proveanordningen være tilstrekkelig kvantitativ slik at en okning av glucose-konsentrasjonen kan måles noyaktig og derved differensiere mellom forskjellige medisinske tilstander.

Fremgangsmåter for påvisning og bestemmelse av sukker i urin er vel kjent innen den kliniske kjemi. En slik fremgangsmåte utnytter Benedicts kobberreduksjonsprove, en annen anvender en selvoppvarmende alkalisk kobberreduksjonsprove i tablettform, ytterligere en prove er utelukkende basert på effekten av enzymer. Den sistnevnte enzymatiske glucoseprove innbefatter nærvær av gluco-oxidase, et peroxydativt materiale og en kromogen som påvirkes når proveblandingen er i kontakt med en kroppsvæske som inneholder glucose. Slike indikatormaterialer er generelt oxydasjons-reduk-sjonsindikatorer.

Det enzymatiske glucoseprdvesystem som beskrevet ovenfor er vanligvis inkorporert i et bærermateriale som vanligvis omfatter en sugende cellulosestrimmel som inneholder forsokskomposisjo-nen. Det er imidlertid funnet at slike enzymatiske glucoseprdve-anordninger ikke er tilstrekkelig kvantitative, og at de ikke er istand ti 1 å differensiere mellom små forokninger av glucoseinnholdet i kroppsvæsker, som f.eks. urin.

I US patentskrift nr. 3.092.465 er der angitt en indikator for bestemmelse av glucose, eksempelvis i blod, på basis av et bærermateriale impregnert med en bestanddel som utviser peroxydativ aktivitet, glucosidase, samt et indikatormateriale som oxyderes i nærvær av peroxyd, og hvor bæreren er belagt med en semipermeabel film. Den semipermeable film tjener i fd.rste rekke til å forhindre at de farvede bestanddeler, eksempelvis i blod, trenger inn i bæreren og derved maskerer den onskede farvereaksjon. Ifolge ek-semplene i dette patent anvendes o-toluidinhydroklorid som indikator som forandrer farve i nærvær av hydrogenperoxyd; for et slikt indikatormateriale vil de. reaksjoner som finner sted ikke kunne forlope cyclisk, slik som beskrevet nærmere i det efterfolgende.

Der er nu overraskende funnet at man kan unngå en cyclisk reaksjon -i et indikatornrateria le omfattende en .bærer, gluco-oxydase, en peroxydativ forbindelse og et vannopploselig jodsalt når bæreren er belagt med en semipermeabel film som er særpreget ved det som er angitt i kravets karakteriserende del.

Som bemerket ovenfor er der nu funnet at en utmerket semikvantitativ glucoseprove kan erholdes ved å anvende et vannopploselig jodid som et kromogen i et enzymatisk glucoseprovesystem. Imidlertid er anvendelsen av bare et slikt jodid ikke tilstrekkelig til å erholde det bnskede resultat. Der er funnet at hvis en slik proveanordning som omfatter kun glucose-oxydase, peroxydase og et jodidsalt, dyppes i en urinprbve, inneholdende glucose, og derefter oyeblikkelig trekkes opp, vil retensjonen av et overskudd av provevæsken forhindre at luftens oxygen får reagere med prdveblandingen, med det resultat at reaksjonen blir cyclisk, dvs. at det er antatt at når oxygen er utelukket fra å komme i kontakt med reaksjonssonen av et lag av væske over anordningen, vil en del av den frie jod virke som et oxyderingsmidde1 for den reduserte glucose-oxydase, dannet under reaksjonen. Således vil jodidet ikke fungere effektivt som et indika-tormateriale, men delta i gluco-oxydase-glucose-reaksj onen.

Der er nu funnet at hvis der påfdres et middel for å forhindre retensjon av et overskudd av provevæsken på proveanordain-gen, vil jodidet i stedet for å delta i gluco-oxydase-glucosereak-,sjonen, virke som et indikatormateriale hvorved der erholdes ut-merkede semikvantitative resultater.

Det er således funnet at hvis en semipermeabel membran på-—fores på overfla ten-av en enzymatisk glucoseproveanordning, eller en enzymatisk proveblanding er inkorporert med en semipermeabel membran, eller en filmdannende polymerisk substans, vil membranen virke som e"t middel til å forhindre at et overskudd av væske fes-ter seg til prbveanordninge, og derved tillater luftens oxygen å komme i kontakt med reaksjonsblandingen, og folgelig vil jodidet omdannes til fri jod og derved fungere effektivt som et indikator-ma t e r i a 1 e .

De jodidsalter som er anvendbare er de som lett ioniseres i et vandig miljb og danner det karakteristiske jodion. Eksempler på jodidsalter som kan anvendes som indikatormaterialer er kaliumjodid, natriumjodid og a mm on i umj od id . I -tillegg til at saltet rna være ionoserbart, må det også bemerkes at den kationiske del av mo-lekylet ikke må innvirke på den enzymatiske katalyse av glucoseoxy-dasjonen. Av de egnede jodidsalter- vil okonomiske hensyn og spors-målet om tilgjengelighet, indikere at kaliumjodid er det foretrukne salt for anvendelse i forbindelse med fore liggende oppfinnelse.

Prinsippet som danner grunnlaget for den enzymatiske reak-sjonsprove for glucose er vel kjent. Gluco-oxydase katalyserer den aerobe oxydasjon av glucose hvorved dannes gluconsyre og hydrogenperoxyd. Ved denne reaksjon vil hydrogen fjernet fra glucose reagere med luftens oxygen til hydrogenperoxyd. Denne reaksjon kan beskrives ved den folgende skjematiske ligning:

I tillegg til anvendelse av enzymet glucooxydase må syste-met som bemerket tidligere, også omfatte et materiale som utviser

peroxydativ aktivitet. Blant de materialer som utviser denne aktivitet er den foretrukne forbindelse peroxydase i hestereddik eller peroxydase i potet. Imidlertid, i tillegg til disse naturlig fore-kommende peroxydasematerialer kan også anvendes andre organiske materialer som utviser lignende aktivitet. Eksempler på disse andre materialer er blod, rode blodceller alene, lyofilisert blod, urohe-min, metalloporphyriner og lignende forbindelser.

For å erholde en prdveanordning som har den onskede stabi-litet, reaktivitet og sensibilitet bor de tidligere nevnte bestanddeler når de er i kontakt med væsken som skal undersokes, være buf-ret ved en hydrogenionekonsentrasjon fra ca. pH 3,4 til 7,2, og det foretrukne område er pH 5,0" - 6,0. Av de mange buffere som kan anvendes for å holde pH av bestanddelene i det onskede område,er der funnet at sitronsyre-natriumcitratbuffer gir det onskede resultat, og med minimal, påvirkning av den enzymatiske reaksjon som omfattes av prdvesystetnet.

Andre midler kan imidlertid anvendes for å holde en isohyd-risk pH tilstand, slike som fosfat, tartrat- og glutamatbuffersys-temer.

I tillegg til anvendelse av et jodidsalt som kromogen i det foreliggende system' er; det fordelaktig- at en andre indikatorsub-stans inkluderes i proveblandingen. I denne henseende er der funnet at inkludering a:v et blått farvestoff i proveb landingen vil re-sultere i en farveforandring som folge av varierende konsentrasjo-ner av glucose, som går fra blått gjennom forskjellige nyanser av gront til brunt, eftersom konsentrasjonen av glucose oker. Av slike blå farvestoffer er dat funnet fordelaktig å anvende et kromogen som går fra blått til farveldst når det oxyderes av det hydrogenperoxyd som dannes ved prdveblandingens reaksjon med tilstedeværende glucose. I denne henseende er farvestoffer slike som indigocar-min og "brilliant blue FCF" spesielt godt egnet som kromogener. Andre farvestoffer som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse er an-ilinblått, cyanolblått, patentblått, xylenblått V, og "Comassie

brilliant blue".

I tillegg til de ovenfor nevnte bestanddeler i prbveblan-dingen som deltar aktivt i provereaksjonen, kan andre hjelpestoffer også tilsettes. Slike hjelpestoffer omfatter fortykningsmid-ler som også fungerer som stabilisator for enzymet. I denne henseende er der funnet at en foretrukken proveblanding omfatter anvendelse av slike materialer som polyvinylpyrrolidon, natriumalgin-at, gelatin, okseserumalbumin, polyvinylalkohol og en copolymer av methylvinylether og rna leinanhydrid, slik som beskrevet i US patent nr. 3.453.180, og som kommersielt er kjent under navnet "Gantrez AN". Fremstillingen av en proveblanding som omfatter de aktivs bestanddeler som beskrevet ovenfor og som ytterligere omfatter "Gantrez" og "PVP", er funnet å være eksepsjonelt stabile. Med hensyn til anvendelse av polyvinylpyrrolidon er der funnet at dette materiale sammen med fri jod resulterer i dannelse av et farvekom-pleks, og dervid gir et forbedret indikatorsystem. En slik anvendelse er foretrukket i den foreliggende blanding.

Som%tidligere bemerket er det funnet nodvendig, når der anvendes jodidsa.lt som ind i ka tormater ia lé i den enzymatiske gluco-seprbve, å innbefatte i en slik blanding et middel for å forhindre eller begrense adhesjon av overskudd av væskeproven på proveanordningen. T denne henseende er en semipermeabel membran, slik som ethylcellulose, funnet å forhindre en slik vannretensjon. Andre celluloseforbindeIser og filmdannende substanser som gir samme ef-fekt, kan også utnyttes. Slike forbindelser omfatter cellulose-ethere og celluloseestere, såvelsom andre vannuppplbselige film-dannéride polymere materialer. Ethylcellulose er funnet å.være spesielt fordelaktig for anvendelse i foreliggende oppfinnelse.

Med hensyn til de aktuelle forhold mellom- de aktive bestanddeler er der funnet at et rimelig konsentrasjonsområde kan anvendes. Som en generell retningslinje kan fblgende konsentra-sjonsområder anvendes. De opptitte tall er basert på oppløsningen av de aktive bestanddeler som skal innarbeides i en bærer for disse.

Som tidligere anfort innarbeides prbve-blandingen i eller på en bærer, og å anvende denne kombinasjon som en dyppe- og avlesningsanordning. Dette kan oppnåes ved forskjellige metoder som omfatter impregnering av et sugende materiale med en opplosning av proveblandingen og derefter torking av den impregnerte prdveanordning, klebende feste på overflaten av bæreren en finfordelt blanding av bestanddelene, og lignende. Den foretrukne fremgangsmåte ved fremstilling er impregnering av en sugende bærer med en opplosning eller opplbsninger av proveblandingen, efterfulgt av torking. Når en sugende bærer anvendes, kan bærermaterialet omfattes av mange forskjellige substanser. F.eks. kan anvendes filtrerpapir, trespon, syntetisk plastfibermaterialej ikke-vevede og vevecle tekstiler og lignende ved denne utforelsesform. Det foretrukne sugende materiale er filterpa-pir med tykkelse i området 0,25 - 0,50 mm. Straks bærermaterialet; er blitt impregnert med provekomposisjonen og tbrket, kan den semiper-me-able membran påfores ved at den impregnerte bærer dyppes i en opplosning av et filmdannende polymerisk materiale opplost i et organisk opplosningsmiddel, hvorefter proveanordningen underkastes en fornyet torking. En annen måte for fremstilling av proveanordningen. består kun av å blande proveblandingen med en filmdannende polymer substans og påfbre en slik blanding på en bærer eller anordning for dertne.

Fremgangsmåten ved bruk av proveanordningen ifolge foreliggende oppfinnelse skal beskrives i det følgende. Ved utforelse av en påvisningsprove for glucose blir proveanordningen dyppet i væsken som skal undersokes, som vanligvis er ea urinp-rove, og derefter øyeblik-kelig trukket opp av væsken. Dette må gjores siden pH av den fuktede anordning vanligvis.må domineres av bufferen i provekomposisionen. Hvis proveanordningen fikk forbli i væsken i et lengere tidsrom, er der fare for at bestanddelene i provekomposisjonen kan vaskes ut fra bæreren og inn i væsken. Imidlertid er en slik vaskeeffekt vesentlig forhindret ved anvendelse av den semipermeable membran som beskrevet ovenfor. Farven som fremkommer som folge av tilstedeværende glucose i provevæsken,avleses derefter ved en visuell sammenligning med et tidligere fremstillet farvekart. Forskjellige instrumentelle metoder kan også anvendes for bestemmelse av den oppståtte farve og derved forbedre nøyaktigheten av prdvemetoden ved å eliminere den vi-suelle subjektive bestemmelse av den dannede farve. Imidlertid,som tidligere bemerket,utviser proveanordningen et meget vidt farveom-slagsområde som folge av den nye innforing av to kromogene substanser i den foreliggende proveblanding, hvorved muligheten for en slik sub-jektiv menneskelig feil vesentlig reduseres.

Den aktuelle sammensetning av proveblandingen ifolge foreliggende oppfinnelse illustreres ved det folgende eksempel:

Eksempel

De folgende bestanddeler ble blandet trinnvis for fremstilling av lOO ml opplosning av proveblandingen.

"Whatman 3 MM" papir ble impregnert med den ovenfor nevnte opplosning som fikk renne av, og derefter ble papiret torket i en tun-neltdrker ved 85°C i 7 minutter. Efter at papiret var fjernet fra torketunnellen, ble det impregnerte papir dyppet i en opplosning av 0,85 g ethylcelluiose opplost i lOO ml benzen. Efter at papiret var

fjernet fra den annen impregneringsoppldsning, ble papiret tdrket pånytt, kuttet i små ca. ,5 x 5 mfn kvadrater som ble festet til en-den av strimler av en væskeavstotende plastfilm som var ca. 5 mm bred og ca. 6 cm lang. De på denne måle frems ti Hede proveanord-ninger ble bragt i kontakt med forskjellige urinprover med stigende innhold a-v glucose fra ca. 0 til 2 vekt% med f olgende resultater:

Som det fremgår av de ovenfor gitte resultater oppnåes utmerket kvantifisering av glucoseinnholdet ved anvendelse av proveblandingen fremstillet ifolge foreliggende oppfinnelse. Et kommersielt tilgjengelig produkt i hvilket orthotolidin anvendes som in-dikatormateria le i stedet for et jodidsalt, var delvis istand til å kvantifisere de ovenfor nevnte glucosekonsentrasjoner opp til ikke ratre enn 0,5 vekt% glucose.

Claims (1)

1. Proveanordning for semikvantitativ bestemmelse av glucose

   i kroppsvæske, omfattende et væskeabsorberende bærerelement impregnert med en kombinasjon av glucoseoxydase, en bestanddel som utviser peroxydativ aktivitet, og.et vannopploselig jodidsalt, og even-tuelt et oxyderbart blått farvestoff, og hvor det impregnerte bærerelement er belagt med en semipermeabel film,karakterisert ved at det semipermeable filmbelegg på bære relementet er et tort residuum avsatt ved å mette bærerelemen-tet med en opplosning av 0,5 - 1,0 g av et vannuopplosélig, semi-permeabelt filmdannende polymert materiale, fortrinnsvis en ceil-u-loseester, en celluloseether eller ethylcellulose, i lOO ml av et organisk oppldsningsmiddel.