NL8001661A - Werkwijze en reagentia voor het gelijktijdig aantonen van verschillende merktekens omtrent hepatitis. - Google Patents

Description

- b * ·< * 70 2bj

Titel: Werkwijze en reagentia voor het gelijktijdig aantonen van verschillende merktekens omtrent hepatitis.

De uitvinding heeft betrekking op een verbetering van de vaste fase-immunoproeflmethoden voor het aantonen en bepalen van antigenen en antilichamen (merktekens) betreffende hepatitis.

Er bestaan tenminste twee verschillende typen virus-hepatitis.

5 Hepatitis A wordt naar men aanneemt veroorzaakt door het hepatitis A antigeen (HAVAg) en wordt gewoonlijk gekenmerkt door een incubatieperiode van 2-6 weken, milde prodromata en een betrékkelijk lichte clinische ziekte. Deze ziekte wordt gewoonlijk doorgegeven via besmet voedsel of dranken, maar kan ook worden doorgegeven door systemische 10 besmetting. Hepatitis A wordt gewoonlijk aangeduid als infectieuze hepatitis en komt vrij frequent voor.

Het hepatitis B virus is naar men aanneemt de meest waarschijnlijke verwekker van serumhepatitis. Een hepatitis B-infectie wordt gewoonlijk doorgegeven via bloedprodukten of besmette instrumenten, 15 zoals naalden, maar kan ook langs andere weg worden doorgegeven. Vroeger nam men aan, dat de incubatieperiode voor hepatitis B 6 weken tot 6 maanden bedroeg. Kort geleden zijn echter ook incubatieperioden van slechts 2 weken beschreven. De ziekte kan mild of asymptomatisch wezen, maar ook symptomatisch, waarbij zelfs ernstige verschijnselen kunnen 20 optreden. Prodromata omvatten o.m. arthralgiën, arthritis, uitslag, koorts, anorexie, vermoeidheid en pruritis al of niet met geelzucht.

Tenminste drie verschillende antigeen-antilichaamsystemen kunnen met hepatitis-virus gepaard gaan: het oppervlakte (HB_Ag:anti-HB ), het kern (HB Hg:anti-HB ), en het e-antigeen (HB Ag:anti-HB ). Het hepa-

Cv 6 6, 25 titis B-oppervlakteantigeen (HBgAg) wordt in bloed gevonden in de vorm van 22 nm bolletjes en als verlengde ovalen, met een diameter van 22 nm en een variabele lengtenen is naar men aanneemt de eiwitbekleding van het hepatitis B-virus.

Een h2 nm deeltje met DM en een DM-polymerase wordt be- 30 schouwd als het infectieuze virus (Dane-deeltje). Het oppervlak van een

Dane-deeltje is nagenoeg gelijk of zelfs identiek met HB Ag. In opper- s vlakteactieve middelen wordt het Dane-deeltje afgebroken tot een elec-tronendichte kern van 27 nm, HBcAg. Dit laatste wordt waargenomen in nuclei van hepatocyten bij patiënten met serumhepatitis gedurende de 35 acute infectieperiode.

800 1 6 61 -2- (

V

Zo mag van patiënten met virus hepatitis type B worden verwacht, dat zij antilichamen jegens oppervlakte-antigeen (anti-HBs) produceren en tevens tegen de eiwitkern (anti-EB ). HB_Ag in serum is een c s consistent merkteken voor de aanwezigheid van hepatitis B virus en anti- 5 EB verschijnt gewoonlijk tijdens de vroege viremie, vaak begeleid door antigeenemie (HBsAg), op het hoogtepunt van de leverdisfunctie en lang voor het verschijnen van anti-HB . Anti-HB wordt gewoonlijk in verhand s c gebracht met een langdurige circulatie van HB_Ag waardoor wordt gesug- s gereerd, dat anti-HBc steeds wordt geproduceerd in reactie op een ac-10 tieve veimeerdering van het virus.

In 19T2 werd het hepatitis e antigeen (HBgAg) ontdekt en beschreven. Dit e-merktëken werd gevonden bij HB Ag-positief serum en treedt s meer algemeen bij serum- of chronische HBsAg-dragers met actieve leverziekte op, dan bij gezonde dragers. Bij patiënten bleek tijdens de in-15 cubatieperiode van hepatitis B dit e-antigeen vlak na het verschijnen van HBsAg op te treden en voor een clinisch aantoonbare leverbeschadi-ging. Zijn aanwezigheid in. dit soort sera zou dus logischerwijze een aanduiding zijn voor een slechte prognose en voortschrijdende lever- beschadiging. Omgekeerdzou de aanwezigheid van e-antilichaam (anti-HB ) € 20 een indicatie kunnen zijn voor een goede prognose. Deze correlaties zijn niet absoluut, maar toch wel bruikbaar als clinische gids.

Aangezien de serologische merktekens voor hepatitis in een consistente volgorde tijdens het verloop van de infectie, de acute ziekte en het herstel optreden, kan een analyse van twee of meer van 25 deze merktekens een waardevol hulpmiddel zijn cm het verloop van de ziekte na te gaan.

Eeh proef op meer dan een merkteken kan tevens een belangrijke controle zijn op HBsAg in bloeddonors of patiënten bij pogingen cm het aantal hepatitis type-B gevallen te beperken. Een dergelijke behoefte 30 is genoemd door Goldfield in Am. J. Med. Sci., 270,-335-^2 (1975), die bij een nauwkeurig nagaan van ontvangers van bloed dat negatief reageerde op HB Ag, niettemin bewijs kreeg cmtrent blootstelling aan

S

hepatitis antigeen bij 7 van de b65 patiënten. Hieruit volgt, dat een methode die het mogelijk maakt meer dan een merkteken cmtrent hepatitis 35 B aan te tonen, het optreden van valse negatieven vermindert of zelfs 80 0 1 661 t -3- verhindert. Evenzo vermindert in vele gevallen een positieve respons op twee proeven de mogelijkheid omtrent valse positieven.

Hoewel de reagentia en methoden die hieronder nader zijn beschreven overeenkomen met "bekende handelsprodukten en "bekende proce-5 dtires voor het aantonen van de diverse merktekens omtrent virus hepatitis, is eerder nooit "beschreven of gesuggereerd, dat deze merktekens gelijktijdig kunnen worden aangetoond. De uitvinding "betreft nu reagentia en een methode voor het gelijktijdig aantonen in een monster van tenminste twee verschillende merktekens die de "blootstelling aan 10 hepatitis virus bewijzen.

Deze methode omvat het in contact brengen van een monster met een vaste drager die is bekleed met tenminste twee verschillende, niet complementaire immuno-reagentia, die complementair zijn voor de onbekende merktekens; het incuberen van dit monster met de be-15 klede drager gedurende ten hoogste 2¼ uren; het afscheiden van de beklede vaste drager van het monster; het wassen van de beklede vaste drager; het in contact brengen van de gewassen vaste drager met een vloeistofreagens dat tenminste twee verschillende hepatitis merkstoffen of immuno-reactanten bevat, elk zo geselecteerd, dat ze of reageren 20 danwel concurreren met èen van de onbekende hepatitis-merkstoffen en elk is gemerkt met gemakkelijk aantoonbare etiketten; het afscheiden van de vaste fase van het vloeistofreagens en het bepalen van de aanwezigheid van geëtiketteerde merkstoffen op de vaste drager door het aantonen van elk,,specifiek etiket.

25 De volgende voorbeelden geven de bereiding en het gebruik van karakteristieke reagentia binnen de uitvinding weer. Het eerste voorbeeld cmschrijft de werkwijze voor het bereiden van een vaste drager bekleed met twee verschillende niet complementaire immuno-reagentia die complementair zijn voor merktekens die blootstelling aan hepatitis 30 bewijzen. Meer specifiek is een vaste drager (korrel) bekleed met twee verschillende, niet complementaire immuno-reactanten en wel zo, dat beide hun reactiviteit hebben behouden en kunnen combineren met complementaire merktekens in een onbekend monster.

Bij het eerste voorbeeld is een polystyreenkorrel bekleed met 35 een antilichaam jegens HB Ag en met een kernantigeen, HB Ag. Het anti- s c 800 t 6 61 -u- lichaam behoudt hierbij zijn aantrekkingskracht en kan goed reageren met elk HB_Ag in het onbekende manster en het aangehechte kemantigeen behoudt eveneens zijn antigene activiteit en kan goed reageren met elk antilichaam jegens de kern (anti-HBc) in het onbekende monster. De 5 crux van de uitvinding is dat beide immunoreacties gelijktijdig optreden met een enkel vaste fase-reagens.

Voorbeeld I

Bereiding van een beklede drager.

Een preparaat met HB Ag werd verkregen door Dane-deeltjes te ex- v 10 poneren aan een vloeistof van 2#’s 2-mercaptoithanol (2-ME) en 5%'s

Tween 80 in tris-EDTA-zout (TSE) buffers en wel 2 uren bij 37°C. Déze oplossing werd 10-voudig verdund met 5% 2ME-TSE en een nacht bewaard voor verdunning tot de uiteindelijke concentratie van 1:8000 in TSE.

Afzonderlijk werden polystyreenkorrels van 6 mm bekleed met een 1:2000 15 verdunning aan anti-HB -serum (cavia) in met fosfaat gebufferde zout- s oplossing (PBS) door 2 uur te impregneren. De korrels werden verwijderd, gewassen en gedroogd. Het kempreparaat werd vervolgens uitgegoten over de beklede korrels en men liet het kernantigeen gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur aan de korrel hechten. Hierna werden de korrels uit de . 20 bufferoplossing verwijderd, gewassen, bekleed met een 10%'s saccharose-oplossing om het aangehechte materiaal te stabiliseren en aan de lucht gedroogd.

Hoewel polystyreenkorrels de voorkeur genieten vanwege hun gemakkelijke bekleedbaarheid en hanteerbaarheid, kan elke vaste drager 25 met macro- of microafmetingen vervaardigd uit een reeks kunststoffen, metaal of glas even goed worden gebruikt.

Hoewel het ook mogelijk is, de korrels eerst te bekleden met kemantigeen en vervolgens met anti-HB_, werd waargenomen, dat eerst bekleden met cavia-anti-HBs-serum de aanhechting van kemantigeen dui-30 delijk bevordert.

Het is tevens van belang, dat andere combinaties van niet complementaire immuno-reagentia betreffende hepatitis virus eveneens kunnen worden gebruikt. De immunoreactanten moeten vanzelfsprekend niet complementair zijn andat een complementaire aantrekking de antigene 35 eigenschappen en de aantrekkingskracht van het reagens zouden verminderen.

800 1 6 61 -5-

Het volgende voorbeeld geeft de bereiding van een iloeistoffase-reagens weer met daarin een immunoreactant, anti-HBs, voorzien van een radioactief merkteken (125 J) en een antigeen-HBc, voorzien van een reactief enzymmerkteken (mierikswortelperoxidase).

5 Hoewel de uitdrukkingen "merkteken" en fimmunoreactant" verwissel baar zijn, wordt bij voorkeur de uitdrukking "merkteken') gebruikt voor het antigeen of antilichaam en hun equivalenten in het onbekende monster. Daarentegen wordt de uitdrukking "immunoreactant" liefst gebruikt voor het antigeen of antilichaam op de drager.

10 In de volgende voorbeelden zijn de antigenen en antilichamen op de vaste dragers dus altijd complementair met een van de onbekende merktekens en worden dus aangeduid als immunoreactanten.

Bij het vloeistoffasereagens is het gemerkte oppervlak-antilichaam complementair voor het onbekende merkteken HBsAg en wordt derhalve even-15 eens aangeduid als gemerkte immunoreactant. Het gemerkte kernantilichaam is daarentegen identiek met het merkteken, dat men wenst aan te tonen en wordt derhalve aangeduid als gemerkt merkteken.

Voorbeeld II

Geëtiketteerd antilichaamreagens 20 De jodering (125 J) van antilichamen jegens HBsAg (anti-HBs) omvat de toevoeging van ca. 0-,1 cm^ van een 0,5 M fosfaatbuffer met pïï 7,5, een gering volume van 5-6 mei Na 125 Js en 100 mg gezuiverd anti-HB_ aan een flesje, bij regeling van de pH op 7,5-8,0 en menging van

O

alle bestanddelen. Aan dit mengsel werd nog 50 microliter van een vers

O

25 bereide oplossing van chloramine T (35 mg in 10 cm 0,05 M fosfaatbuffer met pH 7s5) toegevoegd. Na nogmaals mengen liet men de reactie 60 seconden bij kamertemperatuur verlopen. 50 microliter van een vers bereide

O

oplossing van natriummetasulfiet (35 mg in 10 cm 0,05 M fosfaatbuffer met pH 7,5) werden aan dit mengsel toegevoegd cm het chloramine T 30 te reduceren en daarbij de reactie af te breken.

De doelmatigheid van de reactie werd nagegaan door 5 microliter van het mengsel aan te brengen op een strook Whatman No. 1 papier en het mengsel in 70$'s methanol te chrcmatograferen. Het gejodeerde eiwit -— bleef op de oorsprong staan, terwijl het vrije 125 J met het oplosmiddel 35 migreerde. Het percentage 125 J in het eiwit wordt gerekend als het per- 800 1 6 61 V- -6- centage reactieefficiëncy.

Het onzuiver gejodeerde antilichaam werd gezuiverd met Sephadex G-50 gelkolonmen onder toepassing van 0,1 mol trisbuffer met daarin 0,9$ natriumchloride en een pïï van 7,8. Deze kolan werd voorbehandeld met 5 een gering volume van een 30$'s waterige oplossing van runderserumal-bumine gevolgd door een gelijk volume 0,1 mol trisbufferoplossing met 0,9$ natriumchloride en pH 758. Het gejodeerde antilichaam werd aan de bovenkant van de kolan toegevoegd en doorgewassen met een gebufferde tris-zcutoplossing. Het gemerkte antilichaam werd het eerst uit de 10 kolan opgevangen.

De conjugatie van antilichaam aan hepatitis B-kera aan mieriks-wortelperoxidase (HRP) bracht een activering van de peroxidase met natriummetaperjodaat met zich mee. De overmaat perjodaat en bijprodukten werden van de actieve peroxidase gescheiden door gelfiltratie (Sepha-15 dex C—25) kolan. De geactiveerde peroxidase liet men vervolgens reageren met het antilichaam anti-EB, . Deze reactie verliep spontaan. Natrium-boorhydride werd vervolgens toegevoegd αα de binding tussen peroxidase en antilichaam te stabiliseren, waarna aceton werd toegevoegd on het restant natriumboorhydride te ontleden.

20 Bij gebruik volgens de uitvinding werden de twee geëtiketteerde antilichamen verdund in een verdunningsmiddel met daarin 50$ foetaal kalverserum, 15$ normaal menselijk serum,-0,005 M EDTA, 0,1$ Tween-20 en 0,01 $ thiomersal in PBS.

Het zal duidelijk zijn, dat een reeks aantoonbare etiketten kan 25 worden gebruikt. De enige eis is natuurlijk dat ze duidelijk verschillend aantoonbaar moeten zijn. Elk van een reeks isotopen kan even goed worden gebruikt als 125 J. Het is niet nodig, dat een merkteken of immunoreactant radioactief gemerkt is en de ander enzymatisch of fluorescerend andat verschillende isotopen zelf verschillend aantoonbaar 30 zijn. OvereenkoEStig kunnen alle gemerkte canponenten van het reagens even gemakkelijk verschillende enzymen toepassen, die verschillende substraten nodig hebben om te kunnen worden aangetoond.

Van belang is nog, dat elk van de antilichamen en antigenen van hepatitis A en B kan worden gemerkt om voor de uitvinding te kunnen 35 worden gebruikt. De enige immunochemische eis is, dat de gemerkte 800 1 6 61 -7- caaponenten niet complementair zijn jegens elkander of de aan te ·> tonen merktekens.

Voorbeeld III

Gelijktijdige aantoning van HB Ag en anti-HB

s c 5 Serummmonsters met daarin de onbekende hepatitis merktekens werden toegevoegd aan afzonderlijke uitdiepingen in een reactie-schoteltje en een volgens voorbeeld I beklede polystyreenkorrei aan elk monster toegevoegd, waarna men 2 uren bij U5°C liet incuberen. De korrels werden vervolgens uit de uitdiepingen verwijderd, met water 3 10 gewassen om overmaat reagens te verwijderen en toegevoegd aan 0,2 cm van een vloeistoffasereagens, bereid -volgens voorbeeld II. De vaste en vloeistoffase werden 1 uur bij k5°C geincubeerd. De vaste fase werd vervolgens van het antilichaamreagens verwijderd en viermaal gewassen met water on overmaat reagens te verwijderen. De 15 gewassen korrels werden vervolgens in reageerbuizen met o-fenyleen-

O

diamine (30 mg in 10 cm 0,1 M citraatbuffer met pH 5 >5) gebracht en 30 minuten hiermede geincubeerd. Hierna werd de enzymreactie af- 3 gebroken door een toevoeging van 1 cm 1 M HC1 en de buizen visueel onderzocht op de aanwezigheid of afwezigheid van kleur resulterend 20 uit een reactie van het enzymetiket met het substraat. Een afwezigheid of een geringe kleur duidde op aanwezigheid van anti-HB in V» het onbekende monster welk anti-HBc had geconurreerd met het gemerkte merkteken voor wat betreft de reactieve plaatsen op de beklede drager. Vervolgens werd de radioactiviteit op de korrel ge-25 teld in een gammateller en de CEM-cijfers opgenamen. Radioactiviteit op de korrel duidde on1 aanwezigheid van HB_Ag in het onbekende — _______ _ S· - monster dat zich had gehecht op het aangehechte antilichaam en zo een bindingspiaats verscnarce voor net radioactief gemerkte antilichaam.

30 De uitvinding kan op iedere voorbeschreven wijze worden uitgevoerd.

800 1 6 61

Claims (12)

1. Werkwijze voor het simultaan aantonen in een monster van tenminste twee verschillende merktekens die blootstelling aan hepa-titis-virus bewijzen, welke methode omvat: a) het in contact brengen van een monster met een vaste fase^bekleed 5 met tenminste twee verschillende, niet complementaireimmunoreactanten die complementair zijn jegens de onbekende merktekens; b) het incuberen van dit monster met de beklede vaste fase gedurende 1-2¼ uren; c) het afscheiden van de beklede vaste fase van het monster; 10 d) het wassen van de beklede vaste fase ter verwijdering van ongebonden monster; e) het in contact brengen van de gewassen vaste drager met een vloei-stofreagens met daarin tenminste twee verschillende hepatitis merk= tekens of immunoreactanten, elk zo geselecteerd, dat hij? ofwel reageert 15 of concurreert met een van de onbekende hepatitis merktekens, en elk is voorzien van een aantoonbaar duidelijk etiket; f) het afscheiden van de vaste fase van het gemerkte reagens; g) en het bepalen van de aanwezigheid van gemerkte merktekens of immunoreactanten op de vaste drager door aantoning van de betreffende 20 etiketten.

2. Werkwijze voor het gelijktijdig aantonen in een monster van hepatitis B-oppervlakteantigeen en antilichaam tegen hepatitis B-kernantigeen, met het kenmerk, dat men a) het monster in contact brengt met een vaste fase3bekleed met 25 zowel hepatitis B-kernantigeen als antilichaam jegens hepatitis B- oppervlakteamtigeen ,* b) het monsternet de beklede vaste fase gedurende 1 tot 2U uren in-cubeert; c) de beklede vaste fase van het monster scheidt; 30 d) de beklede vaste fase wast ter verwijdering van ongebonden monster; e) de gewassen vaste drager in contact brengt met een vloeistofreagens dat antilichamen jegens hepatitis B-oppervlakteantigeen alsmede hepatitis B-kernantigeen bevat, elk gemerkt met aantoonbare verschillende etiketten, 35 f) de vaste fase scheidt van het gemerkte antilichaamreagens en 800 1 6 61 * V -9- g) de aanwezigheid van gemerkte antiliehamen op de vaste drager "bepaald door aantoning van de afzonderlijke etiketten.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het antilichaam jegens oppervlakteantigeen radioactief is gemerkt en het antilichaam 5 jjgena kemantigeen met een enzym is gemerkt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3» met het kenmerk, dat het radioactief merkt eken 125 J en het enzym mierikswortelperoxaidaseis.

5. Reagens voor het gelijktijdig aantonen in een monster van tenminste 2 verschillende merktekens die blootstelling aan hepatitis-virus be- 10 wijzen, met het kenmerk, dat een vaste drager is bekleed met tenminste twee verschillende, niet complementaire immunoreactanten die wel complementair zijn jegens de onbekende merktekens.

6. Reagens volgens conclusie 5» met het kenmerk, dat de vaste drager is bekleéd met hepatitis B-kemantigeen en met een antilichaam jegens 15 hepatitis B-oppervlakteantigeen.

7. Reagens voor het gelijktijdig aantonen in een monster van tenminste twee verschillende merktekens die blootstelling aan hepatitis--virus bewijzen, met het kenmerk, dat dit reagens tenminste twee verschillende hepatitis-merktekens of immunoreactanten bevat,- elk zo ge- 20 seiecteerd, dat ze ofwel reageren danwel concurreren met een onbekend hepatitis merkteken en elk is gemerkt met aantoonbare verschillende etiketten.

8. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het reagens antiliehamen tegen hepatitis B-oppervlakteantigeen bevat alsmede 25 hepatitis B-kemantigeen.

9. Reagens volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het antilichaam tegen hepatitis B-qppervlakteantigeen radioactief is gemerkt.

10. Reagens volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat het radioactieve merkteken 125 J is.

11. Reagens volgens conclusie 8 , met het kenmerk, dat het antili chaam jegens hepatitis B-kemantigeen gemerkt is met een enzym.

12. Reagens volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat dit enzym mierikswortelperoxidase is. 800 1 6 61