FR2459482A1

FR2459482A1 - Procedes et reactifs pour la detection simultanee de differents marqueurs de l'hepatite

Info

Publication number: FR2459482A1
Application number: FR8013217A
Authority: FR
Inventors: Lacy Rasco Overby; Chung-Mei Ling; Richard Henry Decker
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1979-06-14
Filing date: 1980-06-13
Publication date: 1981-01-09
Also published as: GB2051357B; CA1148859A; JPS562558A; JPH02276969A; DE3021891A1; IT1140846B; NL8001661A; ATA309980A; BE883824A; FR2459482B1; GB2051357A; AT368813B; DE3021891C2; JPH0220945B2; CH654113A5; AU5622680A; IT8021874A0; ZA801318B; AU530580B2

Abstract

DANS UN PROCEDE POUR LA DETECTION SIMULTANEE DANS UN ECHANTILLON D'AU MOINS DEUX MARQUEURS DIFFERENTS PROUVANT L'EXPOSITION AU VIRUS DE L'HEPATITE, ON UTILISE UN REACTIF EN PHASE SOLIDE QUI EST REVETU D'AU MOINS DEUX COMPOSES IMMUNOREAGISSANTS NON COMPLEMENTAIRES DIFFERENTS QUI SONT COMPLEMENTAIRES DES MARQUEURS INCONNUS DE L'HEPATITE A DETECTER ET UN REACTIF LIQUIDE CONSTITUE D'AU MOINS DEUX MARQUEURS DIFFERENTS DE L'HEPATITE OU D'AU MOINS DEUX COMPOSES IMMUNOREAGISSANTS DIFFERENTS, CHOISIS CHACUN POUR QU'ILS REAGISSENT OU ENTRENT EN COMPETITION AVEC UN DES MARQUEURS INCONNUS DE L'HEPATITE ET MARQUES CHACUN PAR UNE MARQUE POUVANT ETRE DETECTEE DE FACON DISTINCTE.

Description

2459,482

La présente invention concerne de façon générale une amélioration des procédés immunologiques en phase solide pour la détection et la détermination d'antigènes et d'anticorps (marqueurs) relatifs à l'hépatite et plus particulièrement des procédés et des réactifs pour la détection simultanée de différents marqueurs de l'hépatite. Il existe au moins deux types distincts d'hépatites virales. On considère que l'hépatite A est provoquée par l'antigène de l'hépatite A (HAVAg) et elle est généralement caractérisée par une période d'incubation de 2 à 6 semaines, des prodromes modérés et une atteinte clinique relativement peu importante. La maladie

est généralement transmise par des aliments ou des boissons conta-

minés mais on a également montré qu'elle était transmise par inocu-

lation générale. On appelle souvent l'hépatite A "hépatite infec-

tieuse" et aux Etats-Unis d'Amérique le nombre des cas signalés est

supérieur à 50 000 par an.

On considère que le virus de l'hépatite B est l'agent étiologique le plus probable de l'hépatite sérique". L'hépatite B

est généralement transmise par le sang et ses dérivés ou des ins-

truments contaminés tels que des aiguilles, mais elle peut également être transmise d'autre façon. On a indiqué autrefois que la période d'incubation de l'hépatite B était comprise entre 6 semaines et six mois. Cependant on a confirmé des périodes d'incubation aussi

brèves que deux semaines. La maladie peut être modérée ou asympto-

matique mais lorsque des symptômes snt présents ils peuvent être particulièrement graves. Parmi les prodromes figurent les douleurs

articulaires, l'arthrite, une éruption transitoire, la fièvre, l'ano-

rexie, la fatigue et le prurit associés ou non à un ictère.

On peut associer au virus de l'hépatite B au moins trois systèmes antigène-anticorps distincts: le système de surface (RBsAg: anti-HB5s> le système de "noyau" (PB cAg: anti-MBc) et le système e (B eAg anti-B e). L'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) est présent dans le sang sous forme de sphères de 22 nm et de tubules allongés de 22 nm de diamètre et de longueur variable

et il semble représenter le revêtement protéique du virus de l'hépa-

tite B. On considère que le virus infectieux (particules de Dane) consiste en une particule de 42 nm contenant de l'ADN et une ADN- polymérase. La surface de la particule de Dane est semblable ou identique à l'HBsAg. Dans les détergents, la particule de Dane se dégrade en un noyau à forte densité électronique de 27 nm consti-

tuant l'HB cAg. Cet antigène est présent dans les noyaux des hépa-

tocytes des patients. atteints d'hépatite sérique pendant le stade

d'infection aigué.

Donc on peut prévoir que les patients atteints d'hépa-

tite virale de type B produisent des anticorps dirigés contre l'anti-

gène de surface (anti-HBs) et également contre le noyau protéique (antiHBc). L'HBSAg du sérum s'est révélé un marqueur fidèle de la

présence du virus de l'hépatite B e t l'anti-HBc apparaît générale-

ment lors de la virémie précoce, qui accompagne souvent l'antig4némie (BS Ag), à l'apogée du disfonctionnement hépatique et bien avant l'apparition de l'anti-Hb s. L'anti-HB c est généralement associé à

la circulation prolongée de l'HB sAg ce qui suggère que l'anti-HB-

est produit en réponse à la réplication active du virus.

En 1972, l'antigène e de l'hépatite (HBeAg) a été détecté et caractérisé. Le marqueur e a été trouvé dans le sérum HB Ag-positif et semble être plus couramment présent dans le sérum de porteurs chroniques de l'HB sAg ayant une atteinte hépatique active que chez les porteurs sains. Chez les patients, pendant la période d'incubation de l'hépatite B, l'antigène e apparaît juste après l'apparition de l'HBsAg et avant les manifestations cliniques de l'atteinte hépatique. Logiquement, sa présence dans de tels sérums indiquerait un mauvais pronostic et une altération hépatique en cours

d'évolution. Inversement, la présence d'anticorps e (anti-HBe) indi-

querait un bon pronostic. Ces corrélations ne sont pas absolues mais

peuvent constituer des guides cliniques utiles.

Comme les marqueurs sérologiques de l'hépatite appa-

raissent dans un ordre déterminé régulier au cours de l'infection, de la période aigué et de la guérison, l'analyse de deux marqueurs ou

plus peut être utile pour évaluer l'évolution de la maladie.

Une détermination de plusieurs marqueurs peut également de façon importante permettre un double contrôle de l'HB sAg chez les donneurs de sang ou les patients et permettre ainsi de réduire la fréquence de l'hépatite B. Cette nécessité a été établie par Goldfield et coll; Am. J. Med. Sci., 270: 335-342 (1975), qui au cours de post-observations minutieuses de receveurs de sang HB Ag négatif, ont démontré l'exposition à l'antigène de l'hépatite chez 7 patients sur 465. Il est évident qu'un procédé pour détecter plus d'un marqueur du virus de l'hépatite B aurait réduit ou évité ces réactions faussement négatives. De même dans de nombreux cas, une réponse positive dans deux tests réduit au minimum les risques

d'une réaction faussement positive dans un test.

Bien que les réactifs et les procédés décrits et revendiqués soient semblables aux produits et aux procédés connus du commerce pour la détection de divers marqueurs de l'hépatite

virale, on ne connaissait pas avant l'invention de description ou

de suggestion concernant des techniques pour détecter simultanément

ces marqueurs.

L'invention concerne un procédé et des réactifs utiles

pour détecter simultanément dans un échantillon au moins deux mar-

queurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite.

Le procédé consiste à mettre l'échantillon en contact avec un support solide que l'on a rev8tu d'au moins deux composés

immunoréagissants non complémentaires différents qui sont complé-

mentaires des marqueurs inconnus de l'hépatite, à incuber l'échan-

tillon avec le support solide revêtu pendant une période pouvant

atteindre 24 heures, à séparer le support solide revêtu de l'échan-

tillon, à laver le support solide revêtu, à mettre le support solide lavé en contact avec un réactif liquide constitué d'au moins deux composés immunoréagissants différents ou d'au moins deux marqueurs de l'hépatite différents, choisis chacun de façon à réagir ou à entrer en compétition avec un des marqueurs inconnus de l'hépatite et marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon

distincte, à séparer la phase solide du réactif liquide et à déter-

miner la présence des marqueurs de l'hépatite marqués sur le support

solide par détection de chaque marque distincte.

Les exemples non limitatifs suivant illustrent la

préparation et l'emploi de réactifs caractéristiques de l'invention.

Le premier exemple décrit le procédé de préparation d'un support solide revêtu de deux composés immunoréagissants non complémentaires

différents qui sont complémentaires de marqueurs prouvant l'exposi-

tion au virus de l'hépatite.

Plus particulièrement, on revêt un support solide

(perles) de deux composés immunoréagissants différents non complé-

mentaires de telle sorte que ces deux composés conservent leur réacti-

vité et soient capables de se combiner à des marqueurs de l'hépatite

complémentaires dans un échantillon inconnu.

Dans le premier exemple, on revêt des perles de poly-

styrène d'un anticorps dirigé contre l'HB sAg et de l'antigène de noyau HB Ag. L'anticorps conserve son affinité et réagit avec tout HB Ag de l'échantillon inconnu et l'antigène de noyau fixé conserve son antigénicité et réagit avec tout anticorps dirigé contre le noyau (antiHB c) de l'échantillon inconnu. Le point crucial de l'invention est que les.deux réactions immunologiques s'effectuent simultanément

avec un seul réactif en phase solide.

Exemple 1

Préparation d'un support revêtu Pour préparer une composition de HB cAg, on met des particules de Dane en contact avec une solution à 2% de mercapto-2 éthanol (2-ME) et 5î% de Tween 80 dans du tampon salé au TrisEDTA (TSE) à 370C pendant 2 heures. On dilue cette solution au 1/10 dans du 2-ME à 5% dans le TSE et on laisse reposer pendant une nuit avant

de diluer à la concentration finale de 1/8 000 dans du TSE. Séparé-

ment, on revêt des perles de polystyrène (6,35 mm) avec une dilution au 1/2 0O0 de sérum de cobaye anti-HBs dans du tampon salé phosphaté (PBS) par trempage pendant 2 heures. On retire les perles, on les lave et on les sèche. On verse ensuite la préparation de noyau sur les perles revêtues et on laisse l'antigène de noyau adhérer aux perles pendant deux jours à la température ordinaire. On retire les perles de la solution tampon, on lave, on revêt d'une solution à 10 % de saccharose pour stabiliser les composés adhérents et on sèche à l'air. Bien que l'on préfère des perles de polystyrène car elles sont faciles à revêtir et à manipuler, on peut utiliser dans la

pratique de l'invention tout support solide de dimensions macrosco-

piques ou microscopiques fait en diverses matières plastiques, en

métal ou en verre pouvant être facilement revêtu et utilisé.

Bien que l'on puisse revêtir d'abord les perles de l'antigène de noyau puis les revêtir ensuite de l'anti-HB5, on a constaté que lorsqu'on revêt d'abord les perles du sérum de cobaye

anti-HB, l'adhérence de l'antigène de noyau est fortement accrue.

Il est également important de noter que l'on peut

également utiliser d'autres combinaisons de composés immunoréagis-

sants non complémentaires relatifs au virus de l'hépatite. Bien

entendu les composés immunoréagissants doivent être non complémen-

taires car une attraction complémentaire réduirait l'antigénicité

et l'affinité du réactif.

L'exemple suivant illustre la préparation d'un réac-

tif en phase liquide contenant comme composé immunoréagissant, de l'antiHB, marqué avec un marqueur radioactif ( I) et un marqueur de l'hépatite, l'anti-HB&c marqué par une enzyme réactive (peroxydase

de raifort).

Bien que les termes "marqueur de l'hépatite" et "com-

posé immunoréagissant" puissent être utilisés l'un pour l'autre, on préfère utiliser le terme marqueur de l'hépatite" pour désigner

l'antigène ou l'anticorps et leurs équivalents que l'on désire détec-

ter dans l'échantillon inconnu. On utilise le terme "composé immuno-

réagissant" pour désigner l'antigène ou l'anticorps complémentaires

des marqueurs de l'hépatite à détecter.

Par conséquent, dans les exemples suivants, l'anti-

gène et l'anticorps utilisés sur le support solide sont toujours com-

plémentaires d'un des marqueurs inconnus de l'hépatite et par consé-

quent on les appelle composés immunoréagissants.

Dans le réactif en phase liquide, l'anticorps de surface marqué est complémentaire du marqueur inconnu de l'hépatite

(HBSAg) et on l'appelle donc composé immunoréagissant marqué. Cepen-

dant, l'anticorps de noyau marqué est identique au marqueur de l'hé-

patite à détecter et par conséquent on l'appelle marqueur de l'hépa-

tite marqué.

Exemple II

Anticorps marqué réactif Pour ioder par le 1I, l'anticorps dirigé contre l'HBsAg (anti-HB s) on introduit dans un flacon de 4 ml environ 0,1 ml de tampon phosphate 0,5 M à pH 7,5, un petit volume correspondant à 5-6 mCi de Na 15I, et 100 mg d'anti-HB purifié, on ajuste le pH s à 7,5-8,0 et on mélange tous les ingrédients. On ajoute à ce mélange ,ul d'une solution fraîchement préparée de chloramine T (35 mg dans 10 ml de tampon phosphate 0,05 M à pH 7,5). On mélange à nouveau puis on laisse la réaction s'effectuer à la température ordinaire pendant 60 secondes. On ajoute à la réaction 50Oul d'une solution fraîchement préparée de métasulfite de sodium (35 mg dans 10 ml de tampon phosphate 0,05 M à pH 7, 5) pour réduire la chloramine T et

arrêter ainsi la réaction.

Pour évaluer le rendement de la réaction, on applique ,ul du mélange réactionnel à une bande de papier Whatman n0 1 et on chromatographie le mélange dans du méthanol à 70 %. La protéine iodée demeure à l'origine tandis que le 125I libre migre avec le solvant. On considère que le. pourcentage de 1 I dans la protéine

constitue le pourcentage de rendement de la réaction.

On purifie l'anticorps iodé brut avec une colonne de gel de Sephadex G-50 et du tampon Tris 0,1 M contenant 0,9 % de chlorure de sodium à pH 7,8. On traite au préalable la colonne avec un petit volume d'une solution aqueuse à 30 % de sérum albumine bovine puis avec un volume additionnel égal de tampon Tris 0,1 M contenant 0,9 % de chlorure de sodium à pH 7,8. On place l'anticorps

iodé au sommet de la colonne et on lave avec le tampon Tris salé.

L'anticorps marqué constitue le premier éluat que l'on recueille en

bas de la colonne.

Pour conjuguer l'anticorps dirigé contre le noyau de l'hépatite B à la peroxydase de raifort, on active la peroxydase avec du métaperiodate de sodium. On sépare l'excès de periodate et les sous-produits de la peroxydase active par filtration sur une colonne de gel de Sephadex G-25. On fait ensuite réagir la peroxydase activée avec l'anticorps (anti-HB c). La réaction est spontanée. On ajoute ensuite du borohydrure de sodium pour stabiliser la liaison formée entre la peroxydase et l'anticorps et on ajoute de l'acétone

pour détruire le borohydrure de sodium résiduel.

Lorsqu'on les utilise selon l'invention, on dilue

les deux anticorps marqués dans un diluant ayant la composition sui-

vante sérum foetal de veau 50 % sérum humain normal 15 %

EDTA 0,005 M

Tween-20 0,1 % Thiomersal dans le PBS 0,01 % Il est évident que l'on peut utiliser diverses marques détectables. La seule condition est naturellement que ces marques puissent être détectées de façon distincte. On peut utiliser divers isotopes tout aussi aisément que le I. Il n'est pas nécessaire qu'un des marqueurs de l'hépatite ou composé immunoréagissant ait un marquage radioactif et que l'autre ait un marquage enzymatique ou fluorescent car des isotopes différents peuvent Otre détectés de façon distincte. De même, tous les composants marqués du réactif

peuvent aussi bien être marqués par des enzymes différentes nécessi-

tant des substrats différents pour former des produits réactionnels

pouvant être détectés de façon distincte.

Il convient de noter que l'on pourrait marquer l'un quelconque des anticorps et antigènes de l'hépatite A et B dans la pratique de l'invention. Les seules conditions irmunochimiques sont que les composants marqués ne soient pas complémentaires entre eux

ou avec les marqueurs de l'hépatite à déterminer.

Exemple III

Détection simultanée de l'HB Ag et de l'anti-HB On introduit des échantillons de sérum contenant les marqueurs "inconnus" de l'hépatite dans des godets différents d'une plaque de microtitration, on ajoute à chaque échantillon de sérum une perle de polystèrne revêtue comme dans l'exemple I et on laisse incuber pendant 2 heures à 450C. On retire les perles des godets,

on lave à l'eau pour éliminer tout excès de réactif et on les intro-

duit dans 0,2 ml du réactif en phase liquide préparé comme dans l'exemple Il. On incube la phase solide et la phase liquide pendant une heure à 450C. On sépare ensuite la phase solide de l'anticorps

réactif et on lave 4 fois avec de l'eau pour éliminer l'excès de réac-

tif. On place les perles lavées dans des tubes à essai contenant mg d'ophénylènediamine dans 10 ml de tampon citrate 0,1 M à pH 5,5 et on laisse incuber pendant 30 minutes. Après cette période,

on arrête la réaction enzymatique par addition de 1 ml-d'acide chlo-

rhydrique 1 M et on examine les tubes à l'oeil nu pour rechercher la présence ou l'absence d'une coloration due à la réaction de l'enzyme de marquage et du substrat. L'absence de coloration, ou une coloration faible, indique que l'anti-HBc était présent dans l'échantillon

inconnu et est entré en compétition avec le marqueur marqué de l'hépa-

tite vis-à-vis des sites réactionnels du support revêtu. Ensuite on compte la radioactivité des perles dans un compteur gamma et on note la valeur en cpm. La radioactivité des perles indique la présence d'HB5Ag dans l'échantillon inconnu qui a adhéré à l'anticorps fixé

et formé un site de fixation pour l'anticorps à marquage radioactif.

Bien entendu diverses modifications peuvent être

apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui vien-

nent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs

sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

R E V E N D I C A T I 0 N S

1. Procédé pour la détection simultanée dans un échantil-

lon d'au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) mettre l'échantillon en contact avec une phase solide revêtue d'au moins deux composés immunoréagissants non complémentaires diffé- rents complémentaires des marqueurs inconnus, b) incuber l'échantillon avec la phase solide revêtue pendant une période de 1 à 24 heures, c) séparer la phase solide rev8tue de l'échantillon, d) laver la phase solide revêtue pour éliminer l'échantillon non fixé, e) mettre le support solide lavé en contact avec un réactif liquide constitué d'au moins deux marqueurs différents de l'hépatite ou de deux composés immunoréagissants différents, choisis chacun pour réagir ou entrer en compétition avec un des marqueurs inconnus de

l'hépatite et marqués chacun par des marques pouvant être détec-

tées de façon distincte, f) séparer la phase solide du réactif marque et g) déterminer la présence des marqueurs de l'hépatite marqués ou des

composés immunoréagissants marqués sur le support solide par détec-

tion des marques distinctes.

2. Procédé pour la détection simultanée dans un échantil-

lon de l'antigène de surface de l'hépatite B et d'un anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B caractérisé en ce qu'il consiste à: a) mettre l'échantillon en contact avec une phase solide revêtue d'antigène de noyau de l'hépatite B et d'un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B, b) incuber l'échantillon avec la phase solide revêtue pendant une période de 1 à 24 heures, c) séparer la phase solide revêtue de l'échantillon, d) laver la phase solide revêtue pour éliminer l'échantillon non fixé, e) mettre le support solide lavé en contact avec un réactif liquide contenant un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B et un anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon distincte, f) séparer la phase solide des anticorps réactifs marqués, et g) déterminer la présence des anticorps marqués sur le support solide par détection des marques distinctes.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface a un marquage radioactif et l'anticorps dirigé contre l'antigène de noyau a un

marquage enzymatique.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la marque radioactive est du 125I et l'enzyme est la peroxydase

de raifort.

5. Réactif utile pour la détection simultanée dans un échantillon d'au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un support solide revêtu d'au moins deux composés immunoréagissants non complémentaires différents complémentaires des marqueurs inconnus de l'hépatite.

6. Réactif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le support solide est revêtu d'antigène de noyau de l'hépatite B et d'un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B.

7. Réactif utile pour la détection simultanée dans un

échantillon d'au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposi-

tion au virus de l'hépatite caractérisé en ce qu'il est constitué

d'au moins deux marqueurs différents de l'hépatite ou de deux com-

posés immunoréagissants différents choisis chacun de façon à réagir ou à entrer en compétition avec un marqueur inconnu de l'hépatite et marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon distincte.

8. Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le réactif contient un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B et un anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B.

9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B

a un marquage radioactif.

10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce que

la marque radioactive est du 125I.

11. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps dirige contre l'antigène de noyau de l'hépatite B est marqué par une enzyme.

12. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce

que l'enzyme de marquage est la peroxydase de raifort.